Cultivo Celular de Virus:

Se han desarrollado mtodos para el almacenamiento, visualizacin, cuantificacin

(directa e indirecta) y propagacin de virus. Tambin hay mtodos para el diagnstico
de laboratorio de enfermedades virales, muchos de los cuales son mtodos
serolgicos, basados en la deteccin de la respuesta del hospedero a la infeccin.
A lo largo del tiempo, fue posible observar ue el contagio de ciertas enfermedades era
capaz de pasar a travs de filtros ue las bacterias no pod!an pasar. "os filtrados
obtenidos no eran capaces de crecer en medios de cultivos para bacterias, y
eventualmente se demostr e#perimentalmente ue eran infectivos y ue conten!an
virus. A e#cepcin de los virus de viruela, los virus no pueden ser observados con
microscopio ptico. $ventualmente los virus fueron observados con microscopio
electrnico. Algunos de los mtodos importantes usados en los estudios b%sicos de
virus se describen a continuacin.
los virus animales presentan una considerable diversidad en sus caracter!sticas f!sicas.
"a caracter!stica ue m%s refle&a las propiedades del virin es la presencia o ausencia
de la envoltura viral. "os virus no envueltos son, en general, sensibles a la radiacin
ultravioleta, relativamente termoestables y susceptibles al da'o por los cristales de
hielo.
(ebido principalmente a la presencia de la envoltura de membrana, los virus envueltos
se inactivan con solventes lip!dicos (como cloroformo y ter) y detergentes (como el
deso#icolato), son sensibles a la radiacin gama y ultravioleta, relativamente
termol%biles y el da'o ue les produce la formacin de cristales de hielo es m%s
e#tenso ue el ue se produce en los virus no envueltos o desnudos.
Mtodos de propagacin viral:
)ara aislar, caracterizar e identificar virus, as! como para producir vacunas virales, se
necesita una cantidad considerable de part!culas virales. $sto se logra a travs de
diferentes mtodos de propagacin, los cuales se enlistan a continuacin*
Hospederos animales:
$n el pasado, la propagacin de virus en organismos hospederos susceptibles no
infectados era la +nica manera de obtener grandes cantidades de virus. Actualmente el
uso de animales e#perimentales como hospederos para propagacin viral est% limitado
por razones ticas. "a propagacin viral en animales es m%s +til para auellos virus
ue no crecen f%cilmente en cultivos celulares. )or e&emplo* cepas vacunales del virus
de la enteritis hemorr%gica de pavo pueden ser propagadas tanto en aves vivas como
en cultivos celulares. Sin embargo los productos propagados en bazo (de aves vivas)
parecen ser m%s usados ue los propagados en cultivo.
)ara fines diagnsticos la inoculacin de animales es un medio para detectar virus en
muestras cl!nicas, como el virus de la rabia en ratones lactantes.
Huevos embrionados:
Antes del desarrollo de las tcnicas de cultivo de clulas y de te&idos, el uso de huevo
embrionado para propagacin viral fue una de las primeras alternativas al uso de
organismos animales hospederos. $l huevo embrionado es a+n el mtodo preferido
para la propagacin de virus de influenza tipo A y para muchos otros virus aviares. $l
huevo embrionado tambin es +til en la diferenciacin de algunos virus ue producen
lesiones similares, como los virus de la viruela de la vaca y los virus de la pseudo
viruela de la vaca. Aunue el virus de la enfermedad de la lengua azul (,T-) es un
virus de mam!feros, se replica bien en huevo embrionado, por lo ue este sistema se
usa para propagacin viral con fines diagnsticos y de investigacin.
.uando se usa huevo embrionado, uno debe considerar la posible presencia de
anticuerpos maternos (/g0) en el saco vitelino del huevo. )or lo tanto, frecuentemente
es preferible obtener huevo embrionado de parvadas libres de patgenos espec!ficos
(S)1). $l dar pases en embrin de pollos es +til en la atenuacin de ciertos virus para
vacunas de virus vivo modificado.
Cultivo de clulas / tejidos:
$l cultivo de te&idos se refiere al crecimiento y mantenimiento de clulas de te&idos vivos
in vitro. 2ay b%sicamente dos tipos* cultivo de e#plantes y cultivo de clulas. "os
e#plantes son peue'os fragmentos de te&idos del hospedero ue se mantienen en
cultivo, mientras ue el cultivo de clulas se obtiene mediante de la disgregacin de
diferentes te&idos del hospedero en clulas individuales. "a mayor!a de los sistemas
usados en virolog!a son en realidad cultivos celulares y no cultivos de te&idos, aunue
ambos trminos se usan de manera indistinta. "os cultivos celulares se subdividen a su
vez en cultivos primarios, cultivos semi3continuos y cultivos continuos.
Cultivo de explantes:
$stos son cultivos de peue'os fragmentos de te&idos espec!ficos, tomados
directamente del hospedero animal. "os cultivos de e#plantes son +tiles para el
aislamiento viral y se reuieren para el aislamiento de algunos coronavirus. "a
demostracin de latencia de algunos alfa herpesvirus humanos y animales puede
reuerir e#plantes de ganglio nervioso sensitivo (por e&emplo, trigmino).
Cultivos celulares primarios:
$stos se derivan de te&idos frescos ue han sido digeridos enzim%ticamente con
tripsina u otras proteasas, para liberar clulas individuales. .omo resultado, con
frecuencia los cultivos primarios est%n compuestos de muchos tipos celulares
diferentes. $n condiciones in vitro las clulas de los cultivos primarios raramente
pueden dividirse, o se dividen a una velocidad muy ba&a. $s por esto ue tienen un
tiempo de vida limitado, conocido como l!mite de 2ayflic4. A pesar del tiempo de vida
limitado de los cultivos primarios, son ideales para el aislamiento de algunos virus. "os
cultivos primarios raramente sobreviven m%s all% del vigsimo pase in vitro.
Cultivos semi-continuos:
Son tambin conocidos como l!neas celulares diploides, debido a ue contienen el
cromosoma diploide normal caracter!stico de la especie de la ue ellos se
derivan. "os cultivos semi3continuos son cultivos primarios ue tienen algunas
clulas ue pueden ser cuidadas para sobrevivir m%s all% del l!mite de
2ayflic4. "os cultivos semi3continuos tienden a morir entre el 567 y el 867 pase
in vitro. A pesar de esta limitante, los cultivos semi3continuos son +tiles en la
propagacin de una gran variedad de virus. "os cultivos semi3continuos son
por lo general de fibroblastos.
Cultivos celulares continuos:
Se les conoce tambin como l!neas celulares heterodiploides, debido a ue poseen un
n+mero anormal de cromosomas. $stos cultivos se derivan de te&idos normales o
neopl%sicos y se caracterizan por su habilidad para ser propagados in vitro
indefinidamente. (e manera general, las l!neas celulares continuas no son tan
sensibles como las otras para propagacin viral. Sin embargo, facilitan la propagacin a
gran escala de algunos virus para vacunas e investigacin. 9uchas l!neas continuas
est%n disponibles de proveedores como la .oleccin Americana de .ultivos Tipo
(AT.. por sus siglas en ingls).
"a mayor!a de los laboratorios de virolog!a almacenan en congelacin al!cuotas
iniciales de sus cultivos continuos, debido a ue las l!neas celulares ue est%n
continuamente en cultivo pueden sufrir cambios en sus caracter!sticas celulares. "as
causas de estos cambios pueden ser infeccin por 9icoplasma spp., o virus
contaminantes (por e&emplo, circovirus porcino y virus de la diarrea viral bovina).
Concentracin y purificacin de virus:
:na vez ue un virus ha sido propagado adecuadamente, necesita ser recuperado de
las clulas hospederas y los restos de stas, y luego ser purificado. $sto se logra por
varios procesos ue involucran centrifugacin diferencial (a diferentes velocidades),
di%lisis, precipitacin, cromatograf!a y g. $l paso inicial de este proceso es la
centrifugacin diferencial; se usa una velocidad ba&a (<=,666 # g) para uitar restos
celulares y a para concentrar se usa a continuacin, en el caso de vol+menes
peue'os, una velocidad alta de centrifugacin (>6? a @6? # g) y en el caso de
vol+menes mayores, se usa di%lisis y precipitacin o precipitacin con metanol fr!o (3
A67.) o con polietilenglicol. "a purificacin se lleva a cabo mediante cromatograf!a o
centrifugacin usan gradientes de densidad. "os virus envueltos pueden ser purificados
aprovechando su velocidad de sedimentacin en gradientes de sacarosa. "os virus
desnudos pueden ser purificados por centrifugacin a travs de gradientes de cloruro
de cesio.