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Bearing---- soporteAdventitious---- accidentalSolely---- únicamenteAccuracy--- exactitudMoreover—ademásBackground--- ambienteEncourage—fomentarStrain-----cepa Tissue--- tejidoRoots---raícesMediated--- mediado
El uso de un marcador selectivo fluorescente, en Agrobacterium Rhizogenespara detectar la transformación de la zanahoria
 
Resumen:
•
Se usó una proteína verde fluorescente (GFP) como marcador selectivo
•
Su uso fue muy efectivo en la zanahoria (Daucus carota L.)
•
Las raíces de la zanahoria fueron inoculadas con varias cepas (A4, A4T,LBA1334 y LBA9402 y todos los genes fueron soportados por el plásmidoPbin-m-gfp5-ER.
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Este método no requiere ningún agente de selección como herbicidas oantibióticos
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Además al usar este procedimiento se reduce tiempo y trabajo
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Los genes transformados se pueden extirpar fácilmente del tejido huéspedpara luego cultivarlos por separadoIntroducción:
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La proteína verde fluorescente (GTP) se extrajo de la medusa Aequoreavictoria
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El GTP no es tóxico para las células y para que se dé la fluorescencia no senecesitan ni sustratos ni co- factores
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El GTP se puede monitorear directamente en células vivas, y esto permiteque las células transformadas se puedan identificar visualmenteMateriales y Métodos:
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De las raíces de la zanahoria se utilizaron 11 genotipos, los cuales sealmacenaron en turbas a 4°C y después se utilizaron para experimentossucesivos
•
Las raíces se compraron en un supermercado
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Antes de inocularse, las raíces se lavaron, se pelaron y se esterilizó lasuperficie por 20 minutos al 15% en hipoclorito de sodio, después se lavótres veces en agua estéril
•
De las 12 a 36 cajas se tomó de cada raíz y se hicieron cortes transversalesde 3mm de delgadez, usando un cuchillo estéril
 
+ Proceso de transformación y las condiciones del tejido
•
Se usaron 4 cepas de Agrobacterium:A4, A4T, LBA1334 y LBA9402, albergadas por el plásmido Pbin-m-gfp5-ER,soportados por el gen de la neomicin fosfotransferasa (nptII), impulsado por el promotor nos y por el gen (gfp), impulsado por el gen promotor 35S en laregión T-DNA.La bacteria creció en un medio semisólido YMB, con un suplemento de 50 mg l
-1
de kanamicina para seleccionar el plásmido binarioEl inoculo fue preparado en base a un cultivo líquido bacteriano, que creció en lanoche a 25°C en un medio MGL y 50 mg l
-1
de kanamicina.Un medio MGL contiene lo siguiente:2.5g l
-1
de extracto de levadura5g l
-1
triptona5g l
-1
manitol5g l
-1
NaCI1.16 g l
-1
glutamato de sodio0.25g l
-1
KH
2
PO
4
0.1g l
-1
MgSO
4
1mg l
-1
biotina, pH= 7La suspensión se centrifugó por 5 minutos, a 15000 rpm y las células recogidas sesuspendieron nuevamente en el medio MS con 30g l
-1
sacarosa, a un pH de 5.8,suplementado 0.2mg l
-1
ácido nafatalenoacetico (NAA) y acetosiringona (AS) avarias concentraciones (0, 25, 50 , 75 y 100
μ
M) y se diluyeron hasta tener unadensidad óptica de 600nm.Los discos con las raíces de la zanahoria se pusieron boca arriba en cajas de Petricon 6% de agar en agua y con 200mg l
-1
de cefotaxima.El inoculo con concentración de 100
μ
l se extendió en la superficie de cada discode zanahoria.Los discos de control se cubrieron con el mismo inoculo pero este sin célulasbacterianas. Todos los discos se guardaron por cuatro semanas en la oscuridad ya 22°C.Para la selección, los discos se iluminaron con una lámpara para luz UV.Las raíces fueron de al menos 2cm de longitud y mostraron un color verdefluorescente, se transformaron putativamente; se extirparon y se pusieron con 1mg l
-1
2,4-D de medio B5 y 400 mg l
-1
de cefotaxima para la producción de callos.
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