Polymerase chain reaction

Dari Wikipedia, ensiklopedia bebas

"PCR" beralih ke halaman ini. Untuk kegunaan lain, lihat PCR (disambiguasi) .

Ia telah mengemukakan bahwa Aplikasi PCR akan digabungkan ke dalam
artikel ini. ( Diskusikan ) Usulan sejak Juni 2013.


Sebuah strip delapan tabung PCR, masing-masing berisi campuran reaksi 100 ml
The polymerase chain reaction (PCR) adalah teknologi biokimia dalam biologi
molekuler untuk memperkuat satu salinan tunggal atau beberapa sepotong DNA di beberapa kali lipat,
menghasilkan ribuan sampai jutaan salinan tertentu urutan DNA .
Dikembangkan pada tahun 1983 oleh Kary Mullis ,
[1]

[2]
PCR sekarang menjadi teknik umum dan sering
sangat diperlukan digunakan di laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai aplikasi.
[3]

[4]
Ini
termasuk kloning DNA untuk sekuensing , DNA- berdasarkanfilogeni , atau analisis fungsional dari gen ,
diagnosis penyakit keturunan , identifikasi sidik jari genetik (digunakan dalam ilmu forensik danpengujian
paternitas ), dan deteksi dan diagnosis penyakit menular . Pada tahun 1993, Mullis
dianugerahi Penghargaan Nobel dalam Kimia bersama dengan Michael Smith untuk karyanya pada
PCR.
[5]

Metode ini bergantung pada siklus termal , yang terdiri dari siklus pemanasan dan pendinginan berulang
reaksi untuk mencair DNA danenzim replikasi DNA. Primer (fragmen DNA pendek) yang mengandung
urutan komplementer ke wilayah sasaran bersama dengan DNA polimerase (setelah itu Metode bernama)
merupakan komponen kunci untuk mengaktifkan amplifikasi selektif dan diulang. Sebagai PCR
berlangsung, DNA yang dihasilkan itu sendiri digunakan sebagai template untuk replikasi, pengaturan
menggerakkan reaksi berantai di mana template DNA secara eksponensial diperkuat. PCR dapat
dimodifikasi secara luas untuk melakukan beragam manipulasi genetik .
Hampir semua aplikasi PCR menggunakan DNA polimerase panas-stabil, seperti Taq polimerase , enzim
awalnya diisolasi dari bakteriThermus aquaticus . DNA polimerase ini enzimatis merakit untai DNA baru
dari DNA bangunan-blok, nukleotida , dengan menggunakan DNA beruntai tunggal sebagai template dan
DNA oligonukleotida (juga disebut primer DNA ), yang dibutuhkan untuk inisiasi sintesis DNA.Sebagian
besar metode PCR menggunakan siklus termal , yaitu, bergantian pemanasan dan pendinginan sampel
PCR melalui serangkaian langkah didefinisikan suhu. Pada langkah pertama, dua untai heliks ganda DNA
secara fisik terpisah pada suhu tinggi dalam proses yang disebut leleh DNA . Pada langkah kedua, suhu
diturunkan dan dua untai DNA menjadi template untuk polimerase DNA untuk selektif memperkuat DNA
target. Selektivitas PCR hasil dari penggunaan primer yang komplementer ke wilayah DNA yang
ditargetkan untuk amplifikasi dalam kondisi siklus termal tertentu.


Menempatkan strip dari delapan tabung PCR, masing-masing berisi campuran 100 ml reaksi, ke dalam thermal cycler
Isi
[ hide ]
1 prinsip dan prosedur PCR
o Prosedur 1.1
2 tahap PCR
o 2.1 PCR optimasi
3 Penerapan PCR
o 3.1 isolasi DNA Selektif
o 3.2 Amplifikasi dan kuantifikasi DNA
o 3.3 PCR dalam diagnosis penyakit
4 Variasi pada teknik dasar PCR
5 Sejarah
o 5.1 perang Paten
6 Referensi
7 Pranala luar
Prinsip dan prosedur PCR [ sunting ]


Gambar 1a: A pengendara sepeda termal untuk PCR


Gambar 1b: Sebuah model tiga-suhu thermal cycler tua untuk PCR
PCR digunakan untuk memperkuat wilayah tertentu dari untai DNA (DNA target). Sebagian besar metode
PCR biasanya memperkuat fragmen DNA antara 0,1 dan 10 pasangan basa kilo (kb), meskipun beberapa
teknik memungkinkan untuk amplifikasi fragmen hingga 40 kb dalam ukuran.
[6]
Jumlah produk diperkuat
ditentukan oleh substrat yang tersedia di reaksi, yang menjadi pembatas sebagai reaksi berlangsung.
[7]

. Sebuah PCR dasar menyiapkan memerlukan beberapa komponen dan reagen
[8]
Komponen-komponen
ini meliputi:
DNA template yang berisi wilayah DNA (target) yang harus diperkuat.
Dua primer yang komplementer terhadap 3 ' (tiga perdana) berakhir masing-masing rasa dan anti-
sense untai DNA target.
Taq polymerase atau lain polimerase DNA dengan suhu optimum sekitar 70 C.
Trifosfat deoxynucleoside (dNTP, kadang-kadang disebut "Deoksinukleotida trifosfat"; nukleotida yang
mengandung gugus triphosphate), the-blok bangunan dari mana DNA polimerase mensintesis untai
DNA baru.
Larutan buffer , menyediakan lingkungan kimia yang cocok untuk aktivitas optimum dan stabilitas
polimerase DNA.
Divalen kation , magnesium atau mangan ion, umumnya Mg
2 +
yang digunakan, tetapi Mn
2 +
dapat
dimanfaatkan untuk DNA PCR-dimediasimutagenesis , seperti tinggi Mn
2 +
konsentrasi meningkatkan
tingkat kesalahan selama sintesis DNA
[9]

Monovalen kation kalium ion.
The PCR umumnya dilakukan dalam volume reaksi dari 10-200 ml dalam tabung reaksi kecil (0,2-0,5 ml
volume) dalam thermal cycler . The thermal cycler memanaskan dan mendinginkan tabung reaksi untuk
mencapai suhu yang diperlukan pada setiap langkah dari reaksi (lihat di bawah). Banyak cyclers termal
modern yang memanfaatkan efek Peltier , yang memungkinkan baik pemanasan dan pendinginan blok
memegang tabung PCR hanya dengan membalik arus listrik. Berdinding tipis tabung reaksi memungkinkan
konduktivitas termal yang menguntungkan untuk memungkinkan equilibrium termal cepat. Kebanyakan
cyclers termal telah dipanaskan tutup untuk mencegah kondensasi di bagian atas tabung
reaksi. Thermocyclers tua kurang tutup dipanaskan memerlukan lapisan minyak di atas campuran reaksi
atau bola lilin di dalam tabung.
Prosedur [ sunting ]


Gambar 2:. Skema gambar dari siklus PCR (1) denaturasi pada 94-96 C. (2) Anil pada ~ 65 C (3) Perpanjangan
72 C. Empat siklus yang ditampilkan di sini.Garis biru mewakili template DNA yang primer (panah merah) anil yang
diperpanjang oleh DNA polimerase (lingkaran hijau muda), untuk memberikan produk yang lebih pendek DNA (garis
hijau), yang sendiri digunakan sebagai template PCR berlangsung.
Biasanya, PCR terdiri dari serangkaian perubahan suhu 20-40 diulang, yang disebut siklus, dengan
masing-masing siklus biasanya terdiri dari 2-3 langkah suhu diskrit, biasanya tiga (Gambar 2). Bersepeda
ini sering didahului oleh langkah temperatur tunggal (disebut hold) pada suhu tinggi (> 90 C), dan diikuti
oleh satu terus di akhir perpanjangan produk akhir atau penyimpanan singkat. Suhu yang digunakan dan
lamanya waktu mereka diterapkan pada setiap siklus tergantung pada berbagai parameter. Ini termasuk
enzim yang digunakan untuk sintesis DNA, konsentrasi ion divalen dan dNTP dalam reaksi, dan suhu leleh
( Tm ) dari primer.
[10]

Inisialisasi langkah: Langkah ini terdiri dari pemanasan reaksi untuk suhu 94-96 C (98 C atau jika
polimerase sangat termostabil yang digunakan), yang diselenggarakan selama 1-9 menit. Hal ini
hanya diperlukan untuk polimerase DNA yang memerlukan aktivasi panas dengan hot-start PCR .
[11]

Denaturasi langkah : Langkah ini adalah acara bersepeda reguler pertama dan terdiri dari pemanasan
reaksi 94-98 C selama 20-30 detik. Hal ini menyebabkan leleh DNA dari template DNA dengan
mengganggu ikatan hidrogen antara basa komplementer, menghasilkan molekul DNA beruntai
tunggal.
Annealing langkah : Suhu reaksi diturunkan menjadi 50-65 C selama 20-40 detik memungkinkan anil
primer ke template DNA beruntai tunggal. Biasanya suhu anil adalah sekitar 3-5 derajat Celcius di
bawah Tm dari primer yang digunakan. Ikatan hidrogen DNA-DNA yang stabil hanya terbentuk ketika
urutan primer sangat erat sesuai urutan Template. Polimerase mengikat hibrida primer-template dan
mulai pembentukan DNA.
Perpanjangan / elongasi langkah: Suhu pada langkah ini tergantung pada polimerase DNA yang
digunakan; Taq polymerase memiliki optimum aktivitas suhu 75-80 C,
[12]

[13]
dan umumnya suhu 72
C digunakan dengan enzim ini . Pada langkah ini polimerase DNA mensintesis untai DNA baru
melengkapi untai cetakan DNA dengan menambahkan dNTP yang melengkapi template dalam 5 'ke 3'
arah, kondensasi 5'- gugus fosfat dari dNTP dengan 3'- hidroksil kelompok pada akhir baru lahir
(memperpanjang) untai DNA. Waktu perpanjangan tergantung baik pada polimerase DNA yang
digunakan dan pada panjang fragmen DNA yang akan diamplifikasi. Sebagai ibu jari aturan-of-, pada
suhu optimal, DNA polimerase akan polimerisasi seribu basis per menit. Dalam kondisi optimum, yaitu,
jika tidak ada keterbatasan karena membatasi substrat atau reagen, pada setiap langkah ekstensi,
jumlah target DNA dua kali lipat, yang mengarah ke eksponensial (geometris) amplifikasi fragmen
DNA spesifik.
Elongasi akhir: langkah ini kadang-kadang dilakukan pada suhu 70-74 C selama 5-15 menit setelah
siklus PCR terakhir untuk memastikan bahwa setiap DNA beruntai tunggal yang tersisa sepenuhnya
diperpanjang.
Terus akhir: Langkah ini pada 4-15 C untuk waktu yang tidak tertentu dapat digunakan untuk
penyimpanan jangka pendek reaksi.


Gambar 3: produk PCR bromida bernoda Ethidium setelahgel elektroforesis . Dua set primer yang digunakan untuk
memperkuat urutan target dari tiga sampel jaringan yang berbeda. Tidak ada amplifikasi hadir dalam sampel # 1; pita
DNA dalam sampel # 2 dan # 3 menunjukkan amplifikasi sukses urutan target. Gel ini juga menunjukkan kontrol positif,
dan sebuah tangga DNA yang mengandung fragmen DNA panjang yang ditetapkan untuk ukuran band di PCR
eksperimental.
Untuk memeriksa apakah PCR dihasilkan fragmen DNA diantisipasi (juga kadang-kadang disebut sebagai
amplimer atau amplikon ),elektroforesis gel agarosa digunakan untuk pemisahan ukuran produk
PCR. Ukuran (s) dari produk PCR ditentukan oleh perbandingan dengan tangga DNA (penanda berat
molekul), yang berisi fragmen DNA ukuran dikenal, dijalankan pada gel samping produk PCR (lihat
Gambar. 3).
Tahap PCR [ sunting ]
Proses PCR dapat dibagi menjadi tiga tahap:
Amplifikasi eksponensial: Pada setiap siklus, jumlah produk dua kali lipat (dengan asumsi efisiensi reaksi
100%). Reaksi ini sangat sensitif:. Hanya jumlah menit DNA perlu hadir
[14]

Leveling off stage: Reaksi memperlambat sebagai polimerase DNA kehilangan aktivitas dan konsumsi
reagen seperti dNTP dan primer menyebabkan mereka menjadi pembatas.
Plateau: Tidak ada lagi produk terakumulasi karena kelelahan reagen dan enzim.
Optimasi PCR [ sunting ]
Artikel utama: optimasi PCR
Dalam prakteknya, PCR dapat gagal karena berbagai alasan, sebagian karena kepekaan terhadap
kontaminasi amplifikasi DNA menyebabkan produk palsu. Karena itu, sejumlah teknik dan prosedur telah
dikembangkan untuk mengoptimalkan kondisi PCR.
[15]

[16]
Kontaminasi dengan DNA asing ditujukan
dengan protokol laboratorium dan prosedur yang memisahkan campuran pra-PCR dari DNA kontaminan
potensial.
[8]
Ini biasanya melibatkan pemisahan spasial daerah PCR-setup dari area untuk analisis atau
pemurnian produk PCR, penggunaan plasticware pakai, dan benar-benar membersihkan permukaan kerja
antara setup reaksi. Teknik Primer-desain yang penting dalam meningkatkan hasil produk PCR dan
menghindari pembentukan produk palsu, dan penggunaan komponen penyangga alternatif atau enzim
polimerase dapat membantu dengan amplifikasi daerah panjang atau bermasalah dari DNA. Penambahan
reagen, seperti formamida , dalam sistem penyangga dapat meningkatkan spesifisitas dan hasil
PCR.
[17]
Simulasi komputer dari hasil PCR teoritis ( Electronic PCR ) dapat dilakukan untuk membantu
dalam desain primer.
[18]

Penerapan PCR [ sunting ]
Artikel utama: Aplikasi PCR
Isolasi DNA Selektif [ sunting ]
PCR memungkinkan isolasi fragmen DNA dari DNA genomik oleh amplifikasi selektif dari wilayah tertentu
dari DNA. Ini menggunakan PCR menambah banyak metode, seperti menghasilkan probe
hibridisasi untuk Southern atau utara hibridisasi dan kloning DNA , yang membutuhkan jumlah yang lebih
besar dari DNA, yang mewakili wilayah DNA tertentu. PCR memasok teknik ini dengan jumlah tinggi DNA
murni, memungkinkan analisis sampel DNA bahkan dari jumlah yang sangat kecil dari bahan awal.
Aplikasi lain dari PCR termasuk sekuensing DNA untuk menentukan urutan diketahui PCR-diperkuat di
mana salah satu primer amplifikasi dapat digunakan di Sanger sequencing, isolasi urutan DNA untuk
mempercepat DNA rekombinan teknologi yang melibatkan penyisipan urutan DNA ke dalam plasmid atau
bahan genetik dari organisme lain. Koloni bakteri ( E. coli ) dapat cepat disaring oleh PCR untuk benar
DNA vektor konstruksi.
[19]
PCR juga dapat digunakan untuk sidik jari genetik , teknik forensik yang
digunakan untuk mengidentifikasi seseorang atau organisme dengan membandingkan DNA eksperimental
melalui berbagai PCR berbasis metode.
Beberapa metode PCR 'sidik jari' memiliki kekuatan diskriminatif yang tinggi dan dapat digunakan untuk
mengidentifikasi hubungan genetik antara individu, seperti orang tua-anak atau antara saudara kandung,
dan digunakan dalam pengujian paternitas (Gambar 4).Teknik ini juga dapat digunakan untuk menentukan
hubungan evolusioner antara organisme.
[ rujukan? ]



Gambar 4: Elektroforesis fragmen DNA PCR-diperkuat. (1) Bapa. (2) anak.(3) Ibu. Anak telah mewarisi beberapa, tapi
tidak semua sidik jari dari masing-masing orang tua, memberikan yang baru, sidik jari yang unik.
Amplifikasi dan kuantifikasi DNA [ sunting ]
Karena PCR menguatkan daerah DNA yang target, PCR dapat digunakan untuk menganalisa jumlah yang
sangat kecil dari sampel. Hal ini sering penting untuk analisis forensik , ketika hanya jumlah jejak DNA
tersedia sebagai bukti. PCR juga dapat digunakan dalam analisis DNA purba yang berumur puluhan ribu
tahun. Teknik-teknik PCR berbasis telah berhasil digunakan pada hewan, seperti empat puluh ribu
tahun mammoth , dan juga pada DNA manusia, dalam aplikasi mulai dari analisis Mesir mumi untuk
identifikasi Rusia tsar dan tubuh Raja Inggris Richard III .
[20]

Metode PCR kuantitatif memungkinkan estimasi jumlah urutan tertentu hadir dalam sampel-teknik yang
sering digunakan untuk kuantitatif menentukan tingkat ekspresi gen . kuantitatif PCR adalah alat yang
ditetapkan untuk kuantifikasi DNA yang mengukur akumulasi produk DNA setelah setiap putaran
amplifikasi PCR.
Lihat juga: Penggunaan DNA dalam entomologi forensik
PCR dalam diagnosis penyakit [ sunting ]
PCR memungkinkan diagnosis dini ganas penyakit seperti leukemia dan limfoma , yang saat ini tertinggi
dikembangkan dalam penelitian kanker dan sudah digunakan secara rutin. Tes PCR dapat dilakukan
langsung pada sampel DNA genom untuk mendeteksi sel-sel ganas-translokasi tertentu pada sensitivitas
yang setidaknya 10.000 kali lipat lebih tinggi dibandingkan dengan metode lainnya.
[ rujukan? ]

PCR juga memungkinkan identifikasi mikroorganisme non-cultivatable atau tumbuh lambat
seperti mycobacteria , bakteri anaerob , atau virus dari kultur jaringan tes dan model hewan . Dasar untuk
aplikasi diagnostik PCR dalam mikrobiologi adalah deteksi agen infeksi dan diskriminasi non-patogen dari
strain patogen berdasarkan gen-gen tertentu.
[21]

DNA virus dapat juga dideteksi dengan PCR. Primer yang digunakan harus spesifik ke urutan ditargetkan
dalam DNA virus, dan PCR dapat digunakan untuk analisis diagnostik atau sequencing DNA dari genom
virus. Sensitivitas tinggi PCR memungkinkan pendeteksian virus segera setelah infeksi dan bahkan
sebelum timbulnya penyakit. Deteksi dini tersebut dapat memberikan dokter waktu memimpin signifikan
dalam pengobatan. Jumlah virus (" viral load ") pada pasien juga dapat diukur dengan PCR berbasis teknik
kuantisasi DNA (lihat di bawah).
Variasi pada dasar PCR teknik [ sunting ]
Artikel utama: Varian dari PCR
Spesifik alel PCR : teknik diagnostik atau kloning berdasarkan variasi nukleotida tunggal (SNVs tidak
harus bingung dengan SNPs ) (perbedaan basa tunggal pada pasien). Hal ini membutuhkan
pengetahuan sebelumnya dari urutan DNA, termasuk perbedaan antara alel , dan menggunakan
primer yang 3 'berakhir mencakup SNV (pasangan basa penyangga di sekitar SNV biasanya
dimasukkan). PCR amplifikasi dalam kondisi ketat jauh lebih efisien dengan adanya ketidaksesuaian
antara Template dan primer, begitu sukses amplifikasi dengan primer sinyal kehadiran SNP-spesifik
dari SNP tertentu secara berurutan.
[22]
Lihat SNP genotip untuk informasi lebih lanjut.
Majelis PCR atau Polymerase Cycling Assembly (PCA): sintesis buatan urutan DNA yang panjang
dengan melakukan PCR pada pool oligonukleotida panjang dengan segmen tumpang tindih
pendek. Oligonukleotida bergantian antara akal dan antisense arah, dan segmen tumpang tindih
menentukan urutan fragmen PCR, sehingga selektif memproduksi produk akhir DNA yang panjang.
[23]

Asymmetric PCR : istimewa menguatkan satu untai DNA dalam template DNA beruntai ganda. Hal ini
digunakan dalam sequencing dan hibridisasi menyelidik di mana amplifikasi hanya salah satu dari dua
untai komplementer diperlukan. PCR dilakukan seperti biasa, tapi dengan kelebihan besar dari primer
untuk untai ditargetkan untuk amplifikasi. Karena lambat ( aritmatika ) amplifikasi kemudian dalam
reaksi setelah primer membatasi telah habis, siklus ekstra PCR yang diperlukan.
[24]
Sebuah modifikasi
baru pada proses ini, yang dikenal sebagai L inear-A etelah-T dia-E xponential-PCR (LATE-PCR),
menggunakan primer membatasi dengan suhu leleh tinggi ( Tm ) dari kelebihan primer untuk
mempertahankan efisiensi reaksi karena konsentrasi primer membatasi berkurang pertengahan
reaksi.
[25]

Dial-out PCR : metode yang sangat paralel untuk mengambil molekul DNA yang akurat untuk sintesis
gen. Sebuah perpustakaan kompleks molekul DNA yang dimodifikasi dengan tag mengapit unik
sebelum sekuensing massively parallel. Tag-diarahkan primer kemudian mengaktifkan pengambilan
molekul dengan urutan yang diinginkan oleh PCR.
[26]

Tergantung helikase amplifikasi :. mirip dengan PCR tradisional, tetapi menggunakan suhu konstan
daripada bersepeda melalui denaturasi dan siklus anil / penyuluh helikase DNA ., sebuah enzim yang
unwinds DNA, digunakan di tempat denaturasi termal
[27]

Hot start PCR : teknik yang mengurangi amplifikasi non-spesifik selama awal menyiapkan tahap
PCR. Ini dapat dilakukan secara manual dengan memanaskan komponen reaksi terhadap suhu
denaturasi (misalnya, 95 C) sebelum menambahkan polimerase.
[28]
sistem enzim khusus telah
dikembangkan yang menghambat aktivitas polimerase yang pada suhu kamar, baik oleh pengikatan
suatu antibodi
[11]

[29]
atau oleh adanya inhibitor kovalen terikat yang terdisosiasi hanya setelah suhu
tinggi langkah aktivasi. Hot-start/cold-finish PCR dicapai dengan polimerase hibrida baru yang tidak
aktif pada suhu kamar dan akan segera diaktifkan pada suhu perpanjangan.
-Intersequence spesifik PCR (ISSR):. metode PCR untuk DNA fingerprinting yang memperkuat daerah
antara urutan sederhana mengulangi untuk menghasilkan sidik jari yang unik diperkuat panjang
fragmen
[30]

Inverse PCR : umumnya digunakan untuk mengidentifikasi urutan mengapit sekitar genom sisipan. Ini
melibatkan serangkaian digestions DNA dan ligasi diri , sehingga urutan dikenal di kedua ujung urutan
diketahui.
[31]

Ligasi-dimediasi PCR : menggunakan linker DNA kecil diikat dengan DNA dari bunga dan beberapa
primer anil ke linker DNA, telah digunakan untuk sequencing DNA , genom berjalan , danfootprinting
DNA .
[32]

-Metilasi spesifik PCR (MSP): dikembangkan oleh Stephen Baylin dan Jim Herman di Johns Hopkins
School of Medicine,
[33]
dan digunakan untuk mendeteksi metilasi pulau CpG DNA genom. DNA
pertama kali diobati dengan natrium bisulfit, yang mengubah basis sitosin unmethylated ke urasil, yang
diakui oleh PCR primer sebagai timin. Dua PCR kemudian dilakukan pada DNA yang dimodifikasi,
dengan menggunakan primer set identik kecuali pada setiap pulau CpG dalam urutan primer. Pada
titik ini, satu set primer mengakui DNA dengan sitosin untuk memperkuat DNA alkohol, dan satu set
mengakui DNA dengan urasil atau timin untuk memperkuat DNA unmethylated. MSP menggunakan
qPCR juga dapat dilakukan untuk mendapatkan informasi kuantitatif daripada kualitatif tentang
metilasi.
Miniprimer PCR : menggunakan polimerase termostabil (S-TBR) yang dapat memperpanjang dari
primer pendek ("smalligos") sesingkat 9 atau 10 nukleotida. Metode ini memungkinkan PCR
menargetkan primer lebih kecil daerah yang mengikat, dan digunakan untuk memperkuat urutan DNA
dilestarikan, seperti 16S (atau eukariotik 18S) gen rRNA.
[34]

Multiplex Ligasi-dependent Probe Amplifikasi (MLPA): memungkinkan beberapa sasaran yang akan
diperkuat dengan hanya sepasang primer tunggal, sehingga menghindari keterbatasan resolusi
multiplex PCR (lihat di bawah).
Multiplex-PCR : terdiri dari beberapa set primer dalam PCR campuran tunggal untuk
menghasilkan amplikon dari berbagai ukuran yang spesifik untuk sekuens DNA yang
berbeda. Dengan menargetkan beberapa gen sekaligus, informasi tambahan dapat diperoleh dari tes-
lari tunggal yang tidak akan membutuhkan beberapa kali reagen dan lebih banyak waktu untuk
melakukan.Suhu Annealing untuk masing-masing set primer harus dioptimalkan untuk bekerja dengan
benar dalam reaksi tunggal, dan ukuran amplikon. Artinya, panjang pasangan basa mereka harus
cukup berbeda untuk membentuk band yang berbeda ketika divisualisasikan dengan elektroforesis
gel .
Nested PCR : meningkatkan spesifisitas amplifikasi DNA, dengan mengurangi latar belakang karena
amplifikasi non-spesifik DNA. Dua set primer yang digunakan dalam dua PCR berturut-turut. Dalam
reaksi pertama, satu pasang primer digunakan untuk menghasilkan produk DNA, yang selain sasaran
yang dituju, mungkin masih terdiri dari fragmen DNA non-spesifik diperkuat.Produk (s) kemudian
digunakan dalam PCR kedua dengan satu set primer yang mengikat situs yang sepenuhnya atau
sebagian berbeda dan terletak 3 'dari masing-masing primer yang digunakan dalam reaksi
pertama. Nested PCR seringkali lebih berhasil dalam khusus memperkuat fragmen DNA panjang
daripada PCR konvensional, tetapi membutuhkan pengetahuan yang lebih rinci dari urutan target.
Tumpang tindih-ekstensi PCR atau Penyambungan dengan ekstensi tumpang tindih
(SOEing): a rekayasa genetika teknik yang digunakan untuk sambatan bersama-sama dua atau lebih
fragmen DNA yang mengandung urutan komplementer. Hal ini digunakan untuk bergabung dengan
potongan DNA yang mengandung gen, urutan peraturan, atau mutasi, teknik memungkinkan
penciptaan konstruksi DNA spesifik dan panjang. Hal ini juga dapat memperkenalkan penghapusan,
insersi atau mutasi titik dalam urutan DNA.
[35]

[36]

PCR kuantitatif (qPCR): digunakan untuk mengukur kuantitas dari urutan target (umumnya secara
real-time). Ini kuantitatif mengukur jumlah mulai dari DNA, cDNA, atau RNA. PCR kuantitatifumumnya
digunakan untuk menentukan apakah urutan DNA hadir dalam sampel dan jumlah salinan dalam
sampel. kuantitatif PCR memiliki tingkat yang sangat presisi yang tinggi. Metode PCR kuantitatif
menggunakan pewarna fluorescent, seperti SYBR Hijau, EvaGreen atau fluorophore probe DNA yang
mengandung, seperti TaqMan , untuk mengukur jumlah produk diperkuat secara real time. Hal ini juga
kadang-kadang disingkat RT-PCR (real-time PCR) tapi singkatan ini harus digunakan hanya
untuk reverse transcription PCR . qPCR adalah kontraksi yang tepat untuk PCR kuantitatif (real-time
PCR).
Digital PCR (dPCR): digunakan untuk mengukur jumlah urutan DNA target dalam sampel
DNA. Sampel DNA sangat diencerkan sehingga setelah menjalankan banyak PCR secara paralel,
beberapa dari mereka tidak akan menerima satu molekul DNA target. Konsentrasi DNA target dihitung
dengan menggunakan proporsi hasil negatif. Oleh karena itu nama 'digital PCR'.
Membalikkan Transkripsi PCR ( RT-PCR ):. untuk memperkuat DNA dari RNA reverse
transcriptase balik mentranskripsi RNA menjadi cDNA , yang kemudian diperkuat dengan PCR. RT-
PCR banyak digunakan dalam ekspresi profiling , untuk menentukan ekspresi gen atau untuk
mengidentifikasi urutan transkrip RNA, termasuk awal transkripsi dan situs terminasi. Jika urutan DNA
genom gen diketahui, RT-PCR dapat digunakan untuk memetakan lokasi ekson dan intron dalam
gen. Ujung 5 'dari gen (sesuai dengan awal transkripsi) biasanya diidentifikasi olehRACE-PCR (Cepat
Amplifikasi cDNA Ends).
Padat Tahap PCR : meliputi beberapa arti, termasuk sosis polony Amplifikasi (di mana koloni PCR
berasal dalam matriks gel, misalnya), Bridge PCR
[37]
(primer yang kovalen terkait dengan permukaan
solid-support), Fase Padat konvensional PCR (di mana Asymmetric PCR diterapkan di hadapan padat
bantalan dukungan primer dengan urutan yang cocok salah satu primer berair) dan Enhanced Fase
Padat PCR
[38]
(di mana Fase Padat konvensional PCR dapat ditingkatkan dengan menggunakan Tm
tinggi dan bersarang padat dukungan primer dengan aplikasi opsional dari 'langkah' termal untuk
mendukung dukungan yang solid priming).
Thermal asimetris interlaced PCR ( TAIL-PCR ): untuk isolasi urutan diketahui mengapit urutan
dikenal. Dalam urutan yang dikenal, TAIL-PCR menggunakan sepasang bersarang primer dengan
suhu anil berbeda;. Primer merosot digunakan untuk memperkuat ke arah lain dari urutan yang tidak
diketahui
[39]

Touchdown PCR (Step-down PCR): varian dari PCR yang bertujuan untuk mengurangi background
nonspesifik secara bertahap menurunkan suhu annealing PCR bersepeda berlangsung. Suhu
annealing pada siklus awal biasanya beberapa derajat (3-5 C) di atas T
m
dari primer yang
digunakan, sementara pada siklus kemudian, itu adalah beberapa derajat (3-5 C) di bawah primer
T
m.
Suhu yang lebih tinggi memberikan spesifisitas yang lebih besar untuk primer mengikat, dan suhu
yang lebih rendah memungkinkan amplifikasi lebih efisien dari produk tertentu yang terbentuk selama
siklus awal.
[40]

PAN-AC :. menggunakan kondisi isotermal untuk amplifikasi, dan dapat digunakan dalam sel-sel
hidup
[41]

[42]

Universal Cepat Berjalan : untuk genom berjalan dan sidik jari genetik menggunakan lebih spesifik
'dua sisi' PCR dari pendekatan 'satu sisi' konvensional (hanya menggunakan satu primer-gen spesifik
dan satu primer umum - yang dapat menyebabkan artefak 'noise')
[43]
berdasarkan mekanisme yang
melibatkan pembentukan struktur menjerat. Derivatif streamline UFW adalah jalur RAGE (nested PCR
untuk amplifikasi DNA genom cepat tergantung menjerat berakhir),
[44]
5'RACE Lane
[45]
dan 3'RACE
Lane.
[46]

Dalam silico PCR (PCR digital, virtual PCR, PCR elektronik, e-PCR) mengacu pada alat komputasi
yang digunakan untuk menghitung hasil reaksi berantai polimerase teoritis menggunakan
himpunan primer ( probe ) untuk memperkuat DNA urutan dari sequencing genom atau transcriptome .
Sejarah [ sunting ]


Representasi diagram dari sepasang primer contoh. Penggunaan primer dalam uji in vitro untuk memungkinkan sintesis
DNA adalah sebuah inovasi besar yang memungkinkan pengembangan PCR.
Artikel utama: Sejarah polymerase chain reaction
Sebuah makalah di tahun 1971 Journal of Molecular Biology oleh Kleppe dan rekan kerja pertama kali
dijelaskan metode menggunakan tes enzimatik untuk meniru template DNA pendek dengan primer in
vitro.
[47]
Namun, manifestasi awal dari prinsip dasar PCR tidak menerima banyak perhatian, dan
penemuan polymerase chain reaction pada tahun 1983 umumnya dikreditkan ke Kary Mullis .
[48]



"Baby Blue", mesin prototipe 1986 untuk melakukan PCR
Ketika Mullis mengembangkan PCR pada tahun 1983, ia bekerja di Emeryville , California untuk Cetus
Perusahaan , salah satu yang pertamabioteknologi perusahaan. Di sana, dia bertanggung jawab untuk
sintesis rantai pendek dari DNA. Mullis telah menulis bahwa ia dikandung dari PCR saat berlayar di
sepanjang Pacific Coast Highway satu malam di mobilnya.
[49]
Ia bermain di pikirannya dengan cara baru
menganalisis perubahan (mutasi) dalam DNA ketika ia menyadari bahwa ia bukan diciptakan metode
memperkuat setiap wilayah DNA melalui siklus berulang duplikasi didorong oleh DNA
polimerase. Dalam Scientific American , Mullis diringkas prosedur:.. "Dimulai dengan satu molekul DNA
materi genetik, PCR dapat menghasilkan 100 miliar molekul yang sama di sore reaksi ini mudah untuk
mengeksekusi Hal ini membutuhkan tidak lebih dari tabung reaksi, sebuah beberapa reagen sederhana,
dan sumber panas. "
[50]
Dia dianugerahi Penghargaan Nobel dalam Kimia pada tahun 1993 untuk
penemuan,
[5]
tujuh tahun setelah ia dan rekan-rekannya di Cetus pertama mengajukan usulan untuk
berlatih. Namun, beberapa kontroversi tetap mengenai kontribusi intelektual dan praktis dari para ilmuwan
lain untuk bekerja Mullis ', dan apakah ia telah satu-satunya penemu prinsip PCR (lihat di bawah).
Pada inti dari metode PCR adalah penggunaan yang cocok DNA polimerase mampu menahan suhu
tinggi> 90 C (194 F) diperlukan untuk pemisahan dua untai DNA dalam DNA helix ganda setelah
setiap replikasi siklus. Polimerase DNA awalnya digunakan untuk in vitro percobaan presaging PCR tidak
dapat menahan suhu tinggi.
[3]
Jadi prosedur awal untuk replikasi DNA yang sangat efisien dan memakan
waktu, dan diperlukan sejumlah besar DNA polimerase dan penanganan terus menerus selama proses
berlangsung.
Penemuan pada tahun 1976 dari Taq polymerase - polimerase DNA dimurnikan dari bakteri
termofilik , Thermus aquaticus , yang secara alami hidup di tempat yang panas (50 sampai 80 C (122-176
F)) lingkungan
[12]
seperti mata air panas - diaspal jalan bagi perbaikan dramatis dari metode
PCR.Polimerase DNA diisolasi dari T. aquaticus stabil pada suhu tinggi tetap aktif bahkan setelah
denaturasi DNA,
[13]
sehingga menghindarkan kebutuhan untuk menambahkan polimerase DNA baru
setelah setiap siklus.
[4]
Hal ini memungkinkan proses berbasis thermocycler otomatis untuk amplifikasi
DNA.
Perang paten [ sunting ]
Teknik PCR telah dipatenkan oleh Kary Mullis dan ditugaskan untuk Cetus Perusahaan , dimana Mullis
bekerja ketika ia menemukan teknik pada tahun 1983. The Taq polimerase enzim juga dilindungi oleh hak
paten. Ada beberapa tuntutan hukum high-profile yang berhubungan dengan teknik, termasuk gugatan
berhasil dibawa oleh DuPont . Perusahaan farmasi Hoffmann-La Rochemembeli hak paten pada tahun
1992 dan saat ini memegang mereka yang masih dilindungi.
Sebuah pertempuran paten terkait atas enzim polimerase Taq masih berlangsung di beberapa yurisdiksi di
seluruh dunia antara Roche dan Promega . Argumen hukum telah melampaui kehidupan PCR dan Taq
polymerase paten asli, yang berakhir pada tanggal 28 Maret 2005.
[51]




















Mengenal PCR (Polymerase Chain Reaction)
by Yepy Hardi Rustam
Tentu Anda sudah mengenal yang namanya DNA. DNA
ini sering disebut-sebut terutama berkaitan dengan kriminalitas, diagnosa penyakit, penentuan
keabsahan keturunan, dll. Mungkin Anda bingung bagaimana caranya polisi bisa mengungkap
pelaku kejahatan dengan berbekal sehelai rambut pelaku yang tercecer di TKP, atau dari tetesan
sperma pemerkosa yang mengering di tubuh korban. Padahal kan sampel yang dianalisa jumlahnya
sangat sedikit, ajaib!
Ternyata hal ini gak lepas dari yang namanya PCR alias Polymerase Chain Reaction. Proses yang
berlangsung secara in vitro dalam tabung reaksi sebesar 200 l ini mampu menggandakan atau
mengkopi DNA hingga miliaran kali jumlah semula. Maka pantes aja dengan berbekal DNA yang
terkandung dalam sampel yang cuma secuil itu bisa diperoleh banyak sekali informasi sesuai
kebutuhan kita.
Reaksi PCR meniru reaksi penggandaan atau replikasi DNA yang terjadi dalam makhluk hidup.
Secara sederhana PCR merupakan reaksi penggandaan daerah tertentu dari DNA cetakan
(template) dengan batuan enzim DNA polymerase.
PCR terdiri atas beberapa siklus yang berulang-ulang, biasanya 20 sampai 40 siklus. Nah, sekarang
bayangkan bahwa pada setiap siklus DNA polymerase akan menggandakan DNA sebanyak 2 kali,
dan coba hitung berapa salinan utas ganda DNA yang akan dihasilkan setelah 30 siklus? Yup, 2
pangkat 30 alias 1.073.741.824 kali! Tentu saja nilainya tidak tepat seperti itu, kita masih harus
memperhitungkan efisiensi reaksi, tapi tetap saja hasilnya akan sangat banyak.
[simage=201,512,y,left]
Komponen PCR
Selain DNA template yang akan digandakan dan enzim DNA polymerase, komponen lain yang
dibutuhkan adalah:
Primer
Primer adalah sepasang DNA utas tunggal atau oligonukleotida pendek yang menginisiasi sekaligus
membatasi reaksi pemanjangan rantai atau polimerisasi DNA. Jadi jangan membayangkan kalau
PCR mampu menggandakan seluruh DNA bakteri E. coli yang panjangnya kira-kira 3 juta bp itu. PCR
hanya mampu menggandakan DNA pada daerah tertentu sepanjang maksimum 10000 bp saja, dan
dengan teknik tertentu bisa sampai 40000 bp. Primer dirancang untuk memiliki sekuen yang
komplemen dengan DNA template, jadi dirancang agar menempel mengapit daerah tertentu yang kita
inginkan.
dNTP (deoxynucleoside triphosphate)
dNTP alias building blocks sebagai batu bata penyusun DNA yang baru. dNTP terdiri atas 4 macam
sesuai dengan basa penyusun DNA, yaitu dATP, dCTP, dGTP dan dTTP.
Buffer
Buffer yang biasanya terdiri atas bahan-bahan kimia untuk mengkondisikan reaksi agar berjalan
optimum dan menstabilkan enzim DNA polymerase.
Ion Logam
Ion logam bivalen, umumnya Mg++, fungsinya sebagai kofaktor bagi enzim DNA polymerase. Tanpa
ion ini enzim DNA polymerase tidak dapat bekerja.
Ion logam monovalen, kalsium (K+).
Tahapan Reaksi
[simage=200,512,y,left]
Setiap siklus reaksi PCR terdiri atas tiga tahap, yaitu:
Denaturasi
Denaturasi dilakukan dengan pemanasan hingga 96oC selama 30-60 detik. Pada suhu ini DNA utas
ganda akan memisah menjadi utas tunggal.
Annealing
Setelah DNA menjadi utas tunggal, suhu diturukan ke kisaran 40-60oC selama 20-40 detik untuk
memberikan kesempatan bagi primer untuk menempel pada DNA template di tempat yang
komplemen dengan sekuen primer.
Ekstensi/elongasi
Dilakukan dengan menaikkan suhu ke kisaran suhu kerja optimum enzim DNA polymerase, biasanya
70-72oC. Pada tahap ini DNA polymerase akan memasangkan dNTP yang sesuai pada
pasangannya, jika basa pada template adalah A, maka akan dipasang dNTP, begitu seterusnya
(ingat pasangan A adalah T, dan C dengan G, begitu pula sebaliknya). Enzim akan memperpanjang
rantai baru ini hingga ke ujung. Lamanya waktu ekstensi bergantung pada panjang daerah yang akan
diamplifikasi, secara kasarnya adalah 1 menit untuk setiap 1000 bp.
Selain ketiga proses tersebut biasanya PCR didahului dan diakhiri oleh tahapan berikut:
Pra-denaturasi
Dilakukan selama 1-9 menit di awal reaksi untuk memastikan kesempurnaan denaturasi dan
mengaktifasi DNA Polymerase (jenis hot-start alias baru aktif kalau dipanaskan terlebih dahulu).
Final Elongasi
Biasanya dilakukan pada suhu optimum enzim (70-72oC) selama 5-15 menit untuk memastikan
bahwa setiap utas tunggal yang tersisa sudah diperpanjang secara sempurna. Proses ini dilakukan
setelah siklus PCR terakhir
PCR dilakukan dengan menggunakan mesin Thermal Cycler yang dapat menaikkan dan menurunkan
suhu dalam waktu cepat sesuai kebutuhan siklus PCR. Pada awalnya orang menggunakan tiga
penangas air (water bath) untuk melakukan denaturasi, annealing dan ekstensi secara manual,
berpindah dari satu suhu ke suhu lainnya menggunakan tangan. Tapi syukurlah sekarang mesin
Thermal Cycler sudah terotomatisasi dan dapat diprogram sesuai kebutuhan.
Aplikasi teknik PCR
Kita harus berterima kasih kepada Kary B Mullis yang telah menemukan dan mengaplikasikan PCR
pada tahun 1984. Saat ini PCR sudah digunakan secara luas untuk berbagai macam kebutuhan,
diantaranya:
Isolasi Gen
Kita tahu bahwa DNA makhluk hidup memiliki ukuran yang sangat besar, DNA manusia saja
panjangnya sekitar 3 miliar basa, dan di dalamnya mengandung ribuan gen. Oh ya, gen itu apaan ya?
Sebagaimana kita tahu bahwa fungsi utama DNA adalah sebagai sandi genetik, yaitu sebagai
panduan sel dalam memproduksi protein, DNA ditranskrip menghasilkan RNA, RNA kemudian
diterjemahkan untuk menghasilkan rantai asam amino alias protein. Dari sekian panjang DNA
genome, bagian yang menyandikan protein inilah yang disebut gen, sisanya tidak menyandikan
protein atau disebut junk DNA, DNA sampah yang fungsinya belum diketahui dengan baik.
Kembali ke pembahasan isolasi gen, para ahli seringkali membutuhkan gen tertentu untuk diisolasi.
Sebagai contoh, dulu kita harus mengekstrak insulin langsung dari pancreas sapi atau babi,
kemudian menjadikannya obat diabetes, proses yang rumit dan tentu saja mahal serta memiliki efek
samping karena insulin dari sapi atau babi tidak benar-benar sama dengan insulin manusia.
Berkat teknologi rekayasa genetik, kini mereka dapat mengisolasi gen penghasil insulin dari DNA
genome manusia, lalu menyisipkannya ke sel bakteri (dalam hal ini E. coli) agar bakteri dapat
memproduksi insulin juga [http://www.littletree.com.au/dna.htm]. Dan ajaib! Hasilnya insulin yang
sama persis dengan yang dihasilkan dalam tubuh manusia, dan sekarang insulin tinggal diekstrak
dari bakteri, lebih cepat, mudah, dan tentunya lebih murah ketimbang cara konvensional yang harus
mengorbankan sapi atau babi.
Nah, untuk mengisolasi gen, diperlukan DNA pencari atau dikenal dengan nama probe yang
memiliki urutan basa nukleotida sama dengan gen yang kita inginkan. Probe ini bisa dibuat dengan
teknik PCR menggunakan primer yang sesuai dengan gen tersebut.
DNA Sequencing
Urutan basa suatu DNA dapat ditentukan dengan teknik DNA Sequencing, metode yang umum
digunakan saat ini adalah metode Sanger (chain termination method) yang sudah dimodifikasi
menggunakan dye-dideoxy terminator, dimana proses awalnya adalah reaksi PCR dengan pereaksi
yang agak berbeda, yaitu hanya menggunakan satu primer (PCR biasa menggunakan 2 primer) dan
adanya tambahan dideoxynucleotide yang dilabel fluorescent. Karena warna fluorescent untuk setiap
basa berbeda, maka urutan basa suatu DNA yang tidak diketahui bisa ditentukan.
Forensik
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan (baik pelaku maupun korban), atau korban
kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin lagi
dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian tubuh
manapun, kemudian dilakukan analisa PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian tertentu DNA yang
disebut fingerprints alias DNA sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang. Hasilnya
dibandingkan dengan DNA sidik jari keluarganya yang memiliki pertalian darah, misalnya ibu atau
bapak kandung. Jika memiliki kecocokan yang sangat tinggi maka bisa dipastikan identitas orang
yang dimaksud.
Konon banyak kalangan tertentu yang memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri orang tua
sesungguhnya dari seorang anak jika sang orang tua merasa ragu.
Diagnosa Penyakit
Penyakit Influenza A (H1N1) yang sebelumnya disebut flu babi sedang mewabah saat ini, bahkan
satu fase lagi dari fase pandemi. Penyakit berbahaya seperti ini memerlukan diagnosa yang cepat
dan akurat.
PCR merupakan teknik yang sering digunakan. Teknologi saat ini memungkinkan diagnosa dalam
hitungan jam dengan hasil akurat. Disebut akurat karena PCR mengamplifikasi daerah tertentu DNA
yang merupakan ciri khas virus Influenza A (H1N1) yang tidak dimiliki oleh virus atau makhluk
lainnya.
Masih banyak aplikasi PCR lainnya yang sangat bermanfaat. Maka tak salah panitia Nobel
menganugrahkan hadiah Nobel bidang kimia yang bergengsi ini kepada Kary B Mullis hanya 9 tahun
setelah penemuannya (1993).