UNIVERSITE DE NOUAKCHOTT

FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES

DEPARTEMENT DE BIOLOGIE
MANUEL DE TRAVAUX PRATIQUES
DE MICROBIOLOGIE
BG2
Par
Aminetou Bent Mohamed Aicha mint Sidi Baba
2007 - 2008
1
SOMMAIRE
TP. N 1 - RGLES SUIVRE DURANT LES TRAVAUX PRATIQUES DE
MICROBIOLOGIE
TP. N 2 - LA STRILISATION
TP. N3 - UTILISATION DES MILIEUX DE CULTURE
TP. N 4 - EXAMEN MACROSCOPIQUE DES CULTURES
TP. N 5 - ISOLEMENT DE COLONIES PURES
TP. N - L!EXAMEN MICROSCOPIQUE DES BACTRIES
TP. N" - EXAMEN APRS COLORATION
T P. N # - COLORATION DI$$ERENTIELLE DE GRAM
TP. N % - IN$LUENCE DE LA VARIATION DE CERTAINS $ACTEURS
P&'SIQUES SUR LA CROISSANCE DES MICROORGANISMES
TP N 1( - ETUDE DE LA SENSIBILIT AUX ANTIBIOTIQUES
2
couvillon
Autoclave
Botes de Ptri
Flacon pour milieu
de culture
Bec Bunsen
grattoir
Etuve
3
TP. N 1. RGLES SUIVRE DURANT LES TRAVAUX PRATIQUES DE
MICROBIOLOGIE
OBJECTIFS :
Se familiariser avec un laboratoire de microbiologie, son quipement et son fonctionnement
l. V!"# $#! l%&a'( :
) Structure
) Prsentation des gros matriels tuves, autoclave, ! "
*. Pr+!#,"a"%, $-', .%!"# $# "ra/al :
) Matriels bec bunsen, pipettes, verres, bchers anse, pinces lame,###",
) Produits eau, alcool, colorants divers,!#"
0. L#! &%,!1,#! $# !+&'r"+ :
$ Procder % un lavage minutieu& des mains, avec brossage des ongles avant et apr's
les manipulations, et avant toute sortie m(me momentane de la salle de )P#
$ *viter les ouvertures des fen(tres pendant les manipulations
$ +uvrir avec prcaution les rcipients contenant des cultures microbiennes, afin
d,viter toute pro-ection#
$ .lamber, avant et apr's manipulations, les anses mtalliques utilises pour les
prl'vements, en commen/ant par chauffer la partie mo0enne de l,instrument afin de
desscher les restes de culture avant de porter l,e&trmit dans la flamme, ceci pour viter
toute pro-ection#
$ Prvenir immdiatement le responsable de )P en cas de bris d,un rcipient contenant
une culture en cas de contamination accidentelle d,un manipulateur ou tout incident dispersant
le matriel microbien#
$1nterdiction formelle de boire, manger et fumer pendant les )P
$Striliser tout le matriel septique % la fin de la manipulation $
$Prendre toutes dispositions indispensables pour la mise % l,abri des souches
microbiennes ainsi que leur destruction afin d,viter toute contamination#
2
4. M!# #, +/$#,&# $# la .r+!#,&# $# 2&r%)%r1a,!2#! a' la3%ra"%r#
1. Ma"+r#l : milieu& gloss en boite de Ptri, couvillon, eau de robinet, cheveu, bec
Bunsen, pi'ce de monnaie#
*. M%$# %.+ra"%r# :
Prendre 3 milieu& gloss en boite de Ptri 3
$ diviser la boite n41 en 2 secteurs 3 dposer un cheveu sur le premier et quelques
gouttes d5eau du robinet sur le second#
$ diviser la boite n42 en 2 secteurs 3 appliquer une trace de doigt sur le premier, refaire
l5opration sur le second apr's s5(tre lav les mains, dposer une pi'ce de monnaie sur le
troisi'me, frotter un couvillon sur la paillasse et appliquer celui$ci sur le dernier secteur#
$laisser la troisi'me boite ouverte au dessus de la paillasse environ 16 min"#
R#2ar4'# : une srie de 7 boites de Ptri de 8cm de diam'tre est laisse ouverte sur une
paillasse pr's d5un bec Bunsen allum#
A la fin de la manipulation, regrouper les diffrentes boites de Ptri et les placer % l5tuve %
394: ; 22 heures#
R#2ar4'# : pour viter que l5eau de condensation dans les bo<tes de Ptri perturbe la surface
du milieu glos, on place les bo<tes en position retourne dans l5tuve#
P%!"# $# "ra/al
Portoirs
tubes
Eau de
Javel
Verre pied
+ instruments
Bec Bunsen
Zone dair
strile
7
TP. N : * ) LA ST5RILISATION
=a strilisation est l,opration qui consiste % liminer les micro$organismes d,un ob-et,
et ce de mani're durable# >n microbiologie, le but de la strilisation est d,une part de ma<triser
les micro$organismes introduits dans le milieu d,tude, et d,autre part d,viter la contamination
du milieu e&trieur et des personnes# 1l e&iste deu& grands mo0ens de Strilisation 3
1# =a chaleur
2# =a filtration
I. La !"+rl!a"%, .ar la &6al#'r
=a chaleur dtruit les bactries et les spores# +n distingue les procds % chaleur
? s'che @ ou ? humide @#
1. C6al#'r !7&6# :
a. Fla23a1# : =e passage dans la flamme bec BABS>B" de la surface de
matriel non inflammable assure une parfaite strilisation# +n strilise de cette
fa/on les fils de platine et les pipettes Pasteur#


a. B. F%'r .a!"#'r : :,est un four$tuve % air chaud et sec# 1l est utilis %
1864: pendant C6 minutes# :et appareil n,est utilis que pour la strilisation
de la verrerie pralablement netto0e et sche ou de matriels mtalliques
instruments de dissection" pouvant tolrer de tr's hautes tempratures#
8%,# $# !"+rl"+ $9', 3#& 3',!#,
D
=e matriel ainsi strilis sera laiss dans l5tuve -usqu5% son
refroidissement complet, puis stocE % l5abri des poussi'res#
3.
2# C6al#'r 6'2$#
=a strilisation par la chaleur humide, reconna<t trois modalits
) la strilisation % l5autoclave
) =a Pasteurisation,
) =a )0ndallisation
a. A'"%&la/# : c5est un appareil indispensable dans un laboratoire de
microbiologie# =e chauffage a lieu sous pression de vapeur d5eau, % une
temprature de 1264: pendant une dure qui varie en fonction du milieu, de la
temprature utilise et du volume des rcipients# :e procd tue toutes les
cellules vgtatives et les endospores#
3. Pa!"#'r!a"%, : la pasteurisation est un traitement % chaud de
liquides, tuant des pathog'nes mais pas forcment toutes les bactries# =es
tempratures de la pasteurisation se situent entre 97 % 864:#
&. T:,$all!a"%, : =a t0ndallisation est une srie de 3 chauffages bref
% des tempratures de 964: % intervalles rguliers, ceci afin de laisser au&
formes rsistantes la possibilit de germer pour les tuer au chauffage suivant#
Par e&emple la destruction des pathog'nes du lait se fait par un c0cle de D34:
pendant 36 minutes suivie de 934: pendant 17 minutes
II. La ;l"ra"%,
=a filtration est une technique qui consiste % faire passer un liquide % travers un
filtre dont les pores ont un diam'tre de 6,2 Fm# =es micro$organismes sont trop gros et
sont donc retenus par le filtre#
:ette technique est intressante lors d,utilisation de produits
thermolabiles comme certains acides amins aromatiques, vitamines, hormones de
croissance, acides nucliques et une bonne partie des antibiotiques#
III. A'"r#! .r%&+$+! $# !"+rl!a"%,
:ertaines mati'res Plastiques, :aoutchous !" ne tol'rent pas l5autoclave ou se
dtriorent rapidement apr's des e&positions rptes % la chaleur#
9
1. Ra$a"%,! :
=a strilisation par les A#G# est utilise au laboratoire pour la dcontamination de l5air
et des paillasses situes sous la hotte de protection# =e ra0onnement n5agit que de fa/on
directe et sa pntration est faible# H5autres radiations ra0ons I", peuvent servir pour la
strilisation industrielle des boites de Ptri en mati're plastique et de produit
pharmaceutiques#
*. A1#,"! &624'#! :
1ls sont utiliss en gnral pour la dsinfection des salles de travail et pour la
destruction des germes ports par des instruments souills# :e mode de strilisation doit (tre
s0stmatiquement pratiqu dans le laboratoire pour les lames et pour la verrerie qui ne passe
pas en autoclave#
8
TP. N0 ) UTILISATION DES MILIEUX DE CULTURE
=es micro$organismes e&igent pour leur croissance des aliments# :es aliments leur
sont fournis au laboratoire par des milieu& nutritifs ou milieu& de culture# Pour permettre le
dveloppement des microbes le milieu doit 3
Jcontenir tous les aliments ncessaires en quantit suffisante et en proportion relative
convenable 3 le milieu doit (tre nutritif et quilibr#
Javoir un pK, une pression osmotique, une viscosit des caractristiques ph0sico$
chimiques compatibles avec la vie microbienne# :omme les besoins nutritionnels des micro$
organismes et les conditions de leurs dveloppements sont tr's varis il n,e&iste videmment
aucun milieu universel sur lequel tous les microbes soient capables de se multiplier#
)outefois, certains milieu& conviennent au dveloppement d,une grande varit de germes
microbiens L le choi& de tels milieu& repose sur la connaissance de l,habitat naturel et de la
ph0siologie alimentaire du groupe de germes que l,on dsire cultiver# H,une mani're tr's
gnrale, on peut distinguer 3
1. Ml#'( !:,"6+"4'#! 3
Prpars e&clusivement avec des produits chimiques purs# =e milieu s0nthtique de
composition bien dfinie, constitue le milieu de culture idal# :e t0pe de milieu permet
d,obtenir des rsultats comparables et de dceler avec prcision les modifications qu,il subit au
cours du dveloppement microbien# 1l n,en est gnralement pas de m(me avec les milieu&
non s0nthtiques qui sont constitus par des lments comple&es de composition variable# =es
milieu& s0nthtiques conviennent surtout au& moisissures champignons microscopiques"
mais fort peu au& bactries#
*. Ml#'( &%2.l#(#! :
milieu dont on ne conna<t que partiellement la composition# :es milieu& de culture
peuvent contenir des e&traits de levure cellule de levure dsh0drate et l0ses" qui
fournissent une source d,acide amin de vitamine et d,aMote, des e&traits de malt apportant une
source de carbone, des peptones protine animale, de poisson, de casine de lait" source
d,aMote organique qui intresse les individus htrotrophes# >&# bouillon nutritif, bouillon au
so-a#"#
Parmi ces 2 t0pes de milieu, il e&iste $#! 2l#'( !+l#&";! 3 qui vont permettre de
slectionner le t0pe de bactries qui pourront cultiver dessus, alors que tous les autres micro$
C
organismes prsents sont inhibs#
An milieu de culture est rendu slectif pour une esp'ce microbienne lorsque sont
seules satisfaites les e&igences nutritives et les conditions de dveloppement particuli'res %
cette esp'ce =es principau& facteurs de slection microbienne utiliss seuls ou en association
sont 3
Jla temprature d5incubation
J=e pK du milieu
J=a facult d5utiliser une source nutritive dtermine carbone, aMote"#
J=a rsistance % l5action bactricide d5un antiseptique ou d5un antibiotique#
=es milieu& sont soit l4'$#!, soit !%l$#!# +n utilise frquemment la glose ou agar$agar un
pol0m're de sucre tir d,une algue rouge# >lle ne constitue qu,un support du milieu de culture#
:apable d,absorber 266 % 276 fois son poids d,eau, la glose forme une gele qui se liqufie %
D7$964 en refroidissant, cette gele demeure en surfusion -usqu,% 26$274 et prend une masse
au& tempratures infrieures# =a glose est gnralement incorpore au& milieu& liquides % la
dose de 17 % 26N#
=es milieu& solides prsentent un grand intr(t en Microbiologie# 1ls
permettent, lorsque la technique d,ensemencement est convenable, le dveloppement des
germes en colonies apparentes, isoles les unes des autres, provenant en principe, de la
multiplication d,un seul germe clone" et % partir desquelles peuvent (tre obtenues des cultures
pures#
M%$# %.+ra"%r#
Ma"+r#l! :
$ 2 bchers de 766 ml, thermom'tre, agitateur, bec bunsen, trpied et sa grille, boites
de ptri, des tubes % vis ou cotonns striles, pince en bois ou gants
Pr%$'"! :
) Bouillions nutritif BB" et Olose Butritive OB", en poudre,
) >au distille,
16
Pr%"%&%l# :
Peser la masse ncessaire de poudre OB pour 276 ml d,eau distille#
Hissoudre la poudre dans le diluant % l,aide de l,agitateur#
:hauffer au bec bunsen -usqu,% l,bullition
=aisser refroidir la prparation dans le cPne strile du bec bunsen
=orsque la prparation a atteint une temprature infrieure % D64: couler dans
des boites de ptri et des tubes % vis striles
11
TP. N < ) EXAMEN MACROSCOPIQUE DES CULTURES
=,e&amen macroscopique des cultures est le premier e&amen effectu % partir de
l,isolement apr's incubation# =,aspect des colonies dpend du milieu utilis de la dure et de la
temprature de l,incubation#
1l ne pourra (tre dcrit convenablement qu,% partir de colonies bien isoles 3 les
colonies sont d,autant plus petites qu,elles sont rapproches#
=a colonie peut appara<tre % la surface du milieu de culture pour les germes arobies, ou
(tre en profondeur pour les germes anarobies

1# A!.#&" $# &%l%,#! #, !'r;a&# !'r 2l#' !%l$#
1.1. La "all#
>lle peut (tre mesure % l,aide d,une r'gle gradue pour les grandes colonies# 1l est
possible aussi d,utiliser le microscope au grossissement le plus faible pour mesurer la taille
des petites colonies en utilisant de microm'tres oculaires##
1.*. La ;%r2#
Allure de contours 3 lisse, dentels, dchiquets, irrguliers
Qelief 3 surface bombe, demi$bombe, plate#
:entre 3 parfois surl've, parfois ombilique en creu&"
1.0. L-a!.#&" $# la !'r;a&#
=a surface d5une colonie bactrienne peut (tre lisse, rugueu&, renvo0er la lumi're de
fa/on % leur donner un reflet mtallique ou un aspect iris#
1.<. L-%.a&"+
=es colonies sont dcrites comme 3
+paques ne laissent pas passer la lumi're"
)ranslucides laissent passer la lumi're mais on ne voit pas les formes au
travers, comme le verre dpoli"
)ransparentes laissent passer la lumi're et voir les formes au travers, comme
le verre, on parle de gouttes de roseR
12
1.=. La &%,!!"a,&#
Au moment du prl'vement il est possible d,apprcier si les colonies sont grasses,
crmeuses on obtient facilement des suspensions homog'nes", s'ches ou encore muqueuses
on obtient difficilement des suspensions homog'nes"#
1.>. La &%'l#'r #"?%' .12#,"
Plusieurs colonies n5ont pas une couleur bien dfinie blanc, gris"# Par contre,
certaines bactries produisent un pigment insoluble qui donnent un aspect bien
caractristique % la colonie rose, -aune, rouge !", tendis que d5autres produisent un
pigment soluble qui diffuse et colore le milieu
*. A!.#&" $#! &%l%,#! #, .r%;%,$#'r :
1# :olonies rguli'res en formes de lentilles,
2# :olonies irrguli'res de formes diffuses et floues#
0. A!.#&" $#! &%l%,#! #, !'r;a&# !'r 1+l%!# l,+ar#
1# filiformes
2# lg'rement envahissantes avec bords onduls
3# lg'rement envahissantes avec bord rod
2# envahissante
II. A!.#&" $# la .%'!!# #, 2l#' l4'$#
=es bouillons nutritifs sont aussi utiliss pour cultiver les bactries# Hans un bouillon
la croissance microbienne se traduit par l5apparition d5un trouble ou opalescence mais l5aspect
varie selon les esp'ces#
III. M%$# %.+ra"%r# :
a. Ml#' !%l$# :
Qepiquer diffrentes aspects et formes de colonies sur des tubes de glose
linaire
1ncuber % 394: pendant 22 h
+bserver" les diffrents aspects#
13
ronde A bords dentels En toile
bombe
plate
A bords surlevs
ombilique
Vue par dessus
3. Ml#' l4'$# :
Qepiquer % l5aide d5une anse de platine des colonies diffrentes dans des tubes
de bouillon nutritifs
.lamber l5anse apr's chaque repiquage
1ncuber % 39 4: pendant 22 % 28h
+bserver les diffrents aspects de pousse en milieu liquide
+mbilique
Bomb
1rrguli're >n toile Qonde
F%r2# :
El+/a"%, :
Plate
12
TP. N= ) ISOLEMENT DE COLONIES PURES
=es germes se trouvent souvent dans la nature sous forme de mlange de plusieurs
esp'ces#
1soler c,est sparer les divers micro$organismes contenus dans le prl'vement initial#
An isolement peut (tre envisag pour 3
Sparer des micro$organismes diffrents au sein d,un mlange prl'vement
par e&emple"
Purifier une souche contamine ou contrPler sa puret#
=,isolement peut (tre ralis par puisement de la semence en talant le produit initial
% la surface d,un milieu solide appropri# Pendant l,incubation, chaque micro$organisme
dpos se multiplie pour donner un clone de cellules identiques# =orsque les micro$
organismes dposs sont suffisamment loigns# le clone se dveloppe abondamment pour
produire une colonie amas de cellules identiques"# =,ob-ectif de l,isolement est donc d,obtenir
pour chaque micro$organisme diffrent des colonies distinctes#
=es colonies obtenues, en talant une souche pure, doivent toutes prsenter les m(mes
caract'res# A l,oppos, l,isolement d,un mlange donnera autant de colonies diffrentes que de
micro$organismes diffrents contenus dans ce mlange#
N%"#@ : deu& colonies de m(me aspect et de m(mes caract'res ne contiennent pas
forcment des micro$organismes identiques
Ra..#l : les boites doivent (tre places couvercle en bas
1. Ma"+r#l .ar 1r%'.#
>au ph0siologique tube de Cml"
Anse de platine
Olose nutritive
Boite de ptri
*. Pr,&.#
Hiluer dans de l5eau ph0siologique une fraction du mlange de germe -usqu,%
obtention d5une suspension opalescente,
Prlever ensuite une fraction de cette chantillon dilu puis taler sur la plus grande
surface possible de milieu nutritif a l5aide d5un instrument d5isolement anse de platine,
pipette pasteur boutonnes etc#!"#
17
=e nombre de germe restant sur l5instrument sera de plus en plus faible, ce qui va
permettre d5obtenir des colonies distantes les une des autres#
0. M%$# %.+ra"%r# )echnique utilisant la boite de ptri" 3
a. M+"6%$# $# ,#/%"
Prlever % l5aide de l5anse de platine une fraction de l5inoculum
>nsemencer par stries fines et tr's serres le premier demi$ cercle
.lamber l5anse de platine, laisser refroidir
>nsemencer le deu&i'me demi$ cercle
.lamber l5anse de platine
>nsemencer le troisi'me demi$cercle
3. T#&6,4'# $#! < !+r#! $# !"r#!
)racer sur le fond e&trieur de la boite de ptri deu& diam'tres perpendiculaires
sparant la boite en quatre secteurs#
Prlever % l,anse strile" la suspension ou le bouillon dans le cPne strile#
Avec la main gauche maintenir entrouverte la boite dans le cPne strile et taler
le prl'vement par stries tr's serres dans une moiti de quadrant quadrants 1
et 2 $ .lamber l,anse et laisser refroidir
>taler % nouveau le prl'vement par stries serres dans la moiti
correspondante au& quadrants 2 et 3#
.lamber l,anse et laisser refroidir#
Qpter une derni're fois l,talement en stries serres dans la moiti
correspondante au& quadrants 3 et 2
&. "#&6,4'# $# 3'""a'( :
+n se sert d5une pipette pasteur boutonneL la petite boule est plonge dans l5inoculum,
ensuite on bala0e toute la surface de la glose#
1D
HpPt initial
19
TP. N> ) L9EXAMEN MICROSCOPIQUE DES BACT5RIES
=5observation microscopique permet de faire une tude morphologique des cellules
d5une esp'ce bactrienne# >lle comprend 3
I. E(a2#, A l9+"a" ;ra!
:5est l5e&amen microscopique de bactries vivantes, en milieu liquide# 1l permet d5apprcier
leur mobilit ou immobilit" et leur morphologie#
Pr+.ara"%, :
1. A .ar"r $9',# &'l"'r# #, 2l#' l4'$# :
Hposer sur une lame propre soit le contenu d5une ? anse de platine @ soit ? une petite
goutte @ % l5aide d5une pipette Pasteur# Qecouvrir la goutte d5une lamelle#
*. A .ar"r $9',# &'l"'r# !'r 2l#' !%l$# :
Hposer une gouttelette de liquide milieu liquide ou eau" sur la lame# Prlever une trace de
culture % l5anse de platine et l5mulsionner dans le liquide#
Qecouvrir d5une lamelle#
3# Qecouvrir d,une lamelle
2# Hposer une goutte de
la suspension bactrienne
1# .lamber l5anse de
platine
18
TP. NB ) EXAMEN APRS COLORATION
=5e&amen apr's coloration permet d5observer des bactries tues fi&es sur une lame
et a0ant subi l5action d5un ou plusieurs colorants# =es colorations, ralises sur des frottis
s'ches et fi&es, sont classes en 3
:oloration simple un seul colorant"
:oloration diffrentielle t0pe Oram
:olorations spciales des structures bactriennes capsules, spors!#"#
Remarque :
=a ralisation de frottis de bonne qualit est une condition pralable % toute coloration#
1. R+al!a"%, $#! ;r%""! :
=es frottis doivent (tre tals en couche mince et rguli're, puis schs et fi&s#
1. E"al#2#," !'r la2# $# /#rr# :
1# BoteM la rfrence de l5chantillon sur une lame parfaitement propres et
dgraisses, 2# PrleveM strilement % l5aide d5une anse de platine une goutte de culture
bactrienne et taleM un film mince,
*. S+&6a1# :
=e schage est effectu % l5aire libre -usqu5% ce que le frottis prsente un aspect mat#
0. F(a"%, $' ;r%""! !#& :
:ette tape consiste % tuer les bactries et les coller sur la lame, sans en altrer la
structure# =a fi&ation s5effectue par la chaleur 3
=a lame, tenue par une pince frottis situ sur le dessus" est passe 3ou 2 fois dans
la flamme du bec Bunsen# =aisser refroidir avant d5entreprendre une coloration#
1C
1# 1dentifier la lame 2# Hposer une goutte d5eau
3# .lamber l5anse 2# Prlever une partie
d5une colonie isole
7# Mlanger les bactries avec la goutte d5eau D# =aisser scher
l5talement %
l5air
9# .i& le frottis en passant dlicatement et rapidement la lame 2$3 fois au dessus de la
flamme
26
1# COLORATIONS SIMPLES : CC%l%ra"%, a' 3l#' $# M+"6:l7,#D
=a coloration au bleu de mth0l'ne peut apporter des informations concernant la
morphologie des germes#
M%$# %.+ra"%r# :
Sur le frottis fi& et refroidi 3
$ .aire couler la solution de bleu de mth0l'ne phniqu -usqu,% ce que toute la lame
soit recouverte#
$ =aisser agir 1 minute#
$ Qincer abondamment la lame avec le -et d,une pissette d,eau distille, ou % l,eau du
robinet -usqu,% limination des colorants en e&c's#
$ Scher % l,air ou sur une platine chauffante, ou encore scher dlicatement entre deu&
feuilles de papier filtre fin ou buvard", sans frotter#
$ >&aminer au microscope, ob-ectif % immersion#
R+!'l"a"!
=es bactries sont colores en bleu sombre# :ette coloration est intressante pour
l,observation rapide des frottis mais elle permet seulement l,tude de la morphologie des
bactries#
1# Qaliser un talement sur lame 2# :oloration au bleu de mth0l'ne
3# >limination du bleu de mth0l'ne
Bleu de
mth0l'n
e
21
TP. N E ) COLORATION DIFFERENTIELLE DE GRAM
:5est la coloration de base en bactriologie qui permet de distinguer les bactries en
Oram positif et en Oram ngatif, cette distinction est fondamentale pour leur identification#
>n effet, le violet de gentiane se fi&e sur des composants c0toplasmiques et apr's ce
temps de coloration, toutes les bactries sont violettes# :heM les bactries % Oram ngatif, la
paroi, riche en lipides, laisse passer l,alcool ou le mlange alcool S actone" qui dcolore le
c0toplasme alors que, cheM les bactries % Oram positif, la paroi constitue une barri're
impermable % l,alcool et le c0toplasme demeure color en violet#
R+a&";! :
$ Giolet de gentiane phnique
$ =ugol iodo$iodure de potassium"
$ Alcool % C7N ou mlange alcool absoluS 1;7
'me
d5actone"
$ Safranine ou .uchsine phnique de Miehl"
M%$# %.+ra"%r# :
1# Qaliser un frottis et le fi&er % la flamme
2# Gerser le Giolet de Oentiane sur la lame L laisser en contact 1 minute
3# Teter le colorant et finir de la chasser par la solution de =ugol L laisser agir le =ugol
environ 1 min
2# Teter le =ugol et faire couler de l5alcool sur la prparation L rincer immdiatement %
l5eau
7# Qecouvrir la prparation de Safranine, laisser agir environ 1 min# laver abondamment#
D# Scher au dessus de la flamme d5un bec Bunsen#
R+!'l"a"! :
A l5issue de cette coloration, on peut distinguer 3
$ Hes bactries colores en violet fonc L elles ont gard le violet, Ule gram5 elle sont
dites UOram positif5 L
$ Hes bactries colores en rose ou rouge pVle L elles ont perdu le violet, Ule Oram5
elles sont dites Ugram ngatif5#
22
1# Prlever une partie d5une colonie isole 2# Qaliser un talement sur lame
3# .i&er % la chaleur
2# Qaliser les tapes de coloration
Anse boucle
.rottis vers le haut
:olorant
23
TP. N F ) INFLUENCE DE LA VARIATION DE CERTAINS FACTEURS
PGHSIQUES SUR LA CROISSANCE DES MICROORGANISMES
An certains nombre de facteurs ph0sique e&ternes peuvent intervenir dans le
dveloppement des microorganisme#
=a variation de certains entre eu& pK du milieu, la temprature, la pression osmotique
etc#!" peut acclrer, retarder, ou arr(ter la croissance microbienne# Bous tudions dans cette
sance l5influence de la variation de temprature#
Vara"%, $# la "#2.+ra"'r#
Pour chaque microorganisme, on dfinit une temprature optimale de croissance pour
laquelle le dveloppement est ma&imal, une temprature minimale en de/% de laquelle il n50
a plus de croissance et une temprature ma&imale au dla de laquelle le dveloppement est
stopp
1. B'" $# #(.+r#,&#
1l s5agit d5apprcier les valeurs limites de la temprature et la valeur optimale de
croissance d5un germe donn germe msophile"
*. Ma"+r#l .ar 1r%'.#
7 tubes de bouillons nutritifs contenant 7 ml de milieu"
Anse de platine
Boites ensemences par le germe % tudier
0. M%$# %.+ra"%r#
Marquer chaque tube de la temprature correspondante 3 S 24:, 264:,394:,224:et
774:#
>nsemencer les cinq tubes avec la souche microbienne a tudier
1ncuber immdiatement chaque tube a la temprature indique# =a dure
d5incubation est de 22 h, mais elle peut (tre prolonger -usqu,% 28 h pour 264:" Lvoir
une semaine pour S 24:"
<. L#&"'r# $#! r+!'l"a"!
22
+n note par le s0st'me des croi& le dveloppement des germes dans les tubes
$" 3 absence de pousse
S" 3 lger trouble douteu&
S" 3 lg're turbidit, visible
SS"3 dveloppement asseM important
SSS" 3 trouble ma&imale
R#2ar4'# : Pour plus de prcision, il est prfrable de dterminer la densit optique des
tubes avec un turbidim'tre#
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TP N 1I ) ETUDE DE LA SENSIBILIT5 AU ANTIBIOTIQUES
L#! a,"3%"4'#! sont des composs chimiques, labors par un micro$organisme ou
produit par s0nth'se et dont l5activit spcifique se manifeste % dose faible sur les micro$
organismes#
=a dtermination de la sensibilit d5une bactrie % divers antibiotiques est d5une
grande importance en microbiologie# >lle permet l5laboration des milieu& d5isolement
slectifs, le contrPle d5une infection par chimiothrapeutique et enfin elle peut (tre utilise
comme approche dans la caractrisation et l5identification bactrienne# =5antibiogramme
d5une souche peut (tre dtermin en milieu liquide par la mthode de la :M1 concentration
minimale inhibitrice" ou par la technique des disques#
1. Ma"+r#l .ar 1r%'.#
Hisques de celluloses imprgnes d5antibiotique
Boite de ptri S de glose
:ulture microbienne en suspension
QVteau
*. M%$# %.+ra"%r#
:ouler la glose dans une boite de ptri
=aisser prendre en masse
Prlever 2 ou 3 gouttes de la suspension bactrienne, les dposer a la surface de la
glose les taler avec un rVteau
S5assurer que la surface de la glose est bien sche, et 0 dposer les disques de
celluloses imprgnes d5antibiotique
Placer la boite de ptri % basse temprature S24: pendent 17 % 36mn afin de permettre
au& antibiotiques de diffuser dans la glose avant que les bactries ne commencent %
se multiplier
Qetirer la boites du rfrigrateur et la placer dans l5incubateur,% la temprature
optimale de croissance du germe a tudier 39 4:" pendent 22 h
Ra..#l : les boites doivent (tre places couvercle en bas
0. L#&"'r#! $#! r+!'l"a"!
2D
=5activit de chaque antibiotique sera apprcie, par le diam'tre de l5aurole
d5inhibition provoqu autour du disque
R#2ar4'# : :ette mthode est une application de la diffusion en glose #=e diam'tre de
l5aurole dpend de la vitesse de diffusion de l5antibiotique dans la glose#
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