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8.

Espectrofometra: Espectros de absorcin y


cuantificacin colorimtrica de biomolculas

Nieves Abril Daz
1
, J. Antonio Brcena Ruiz
1
,
Emilio Fernndez Reyes
1
, Aurora Galvn Cejudo
1
,
Jess Jorrn Novo
1
, Jos Peinado Peinado
1
,
Fermn Toribio Melndez-Valds
1
, Isaac Tnez Fiana
2


Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular,
1
Campus Universitario de Rabanales, Edificio Severo Ochoa, 14071-Crdoba,

2
Facultad de Medicina, Avda. Menndez Pidal s/n, 14004-Crdoba.


RESUMEN

La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite
determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en
que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez
que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la
concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un
espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de
la luz que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por
la misma.
En esta prctica se darn a conocer las caractersticas generales y
conceptos relacionados con la espectrofotometra. A continuacin y tras
la explicacin del funcionamiento del espectrofotmetro se harn
espectros de absorcin con el fin de determinar la longitud de onda
donde la muestra presenta la mxima absorcin, y tras realizar las
correspondientes rectas de calibrado se cuantificarn las
concentraciones de distintas biomolculas.

Palabras clave: Absorbancia; transmitancia; colorimetra; cromforo;
espectro; rectas de calibrado.

Abreviaturas empleadas. A: Absorbancia; 4-AP: 4-Aminoantipirina; FMN:
flavin mononucletido; FMNH
2
: forma reducida del flavin mononucletido; I:
intensidad de luz; N-NEDA: N-Naftol-1-etilendiamino; p-NP: p-nitrofenol; POD:
Peroxidasa; T: transmitancia; UV: luz ultravioleta.


1. INTRODUCCIN Y OBJETIVOS

El estudio a nivel bioqumico de cualquier biomolcula requiere la utilizacin
de tcnicas analticas que permitan su determinacin cualitativa y cuantitativa,
as como su caracterizacin fsico-qumica y biolgica. Uno de los mtodos
ms sencillos, accesibles, tiles y utilizados es la espectroscopa, en general, y
la espectroscopa ultravioleta-visible, en particular. Se pueden identificar y
cuantificar biomolculas en solucin y en muestras biolgicas, con el empleo
1
de reactivos especficos que reaccionan con el compuesto a analizar y forman
un producto coloreado que permite detectarlo en muestras complejas.

El fundamento de la espectroscopa se debe a la capacidad de las molculas
para absorber radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-
visible. Las longitudes de onda de las radiaciones que una molcula puede
absorber y la eficiencia con la que se absorben dependen de la estructura
atmica y de las condiciones del medio (pH, temperatura, fuerza inica,
constante dielctrica), por lo que dicha tcnica constituye un valioso
instrumento para la determinacin y caracterizacin de biomolculas.

Las molculas pueden absorber energa luminosa y almacenarla en forma
de energa interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la
fotosntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz (considerada como energa)
es absorbida por una molcula se origina un salto desde un estado energtico
basal o fundamental, E
1
, a un estado de mayor energa (estado excitado), E
2
. Y
slo se absorber la energa que permita el salto al estado excitado. Cada
molcula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del
resto de molculas. Como consecuencia, la absorcin que a distintas
longitudes de onda presenta una molcula -esto es, su espectro de absorcin-
constituye una sea de identidad de la misma. Por ltimo, la molcula en forma
excitada libera la energa absorbida hasta el estado energtico fundamental.


Figura 1. Diagrama de niveles de energa en
una molcula. La absorcin de energa
luminosa hace que la molcula pase desde un
estado fundamental (E
1
) a otro excitado (E
2
).
Posteriormente la molcula relaja su energa
mediante distintos mecanismos (vibracin,
rotacin, etc.)


E
2
- E
1
= h






En espectroscopa el trmino luz no slo se aplica a la forma visible de
radiacin electromagntica, sino tambin a las formas UV e IR, que son
invisibles. En espectofotometra de absorbancia se utilizan las regiones del
ultravioleta (UV cercano, de 195-400 nm) y el visible (400-780 nm).
Luz visible
Longitud de onda (metros)
Rayos gama Rayos X ultravioleta infrarrojo microondas
Frecuencia (hertz)
energa (electrn-voltios)
400nm 700nm
Figura 2. Espectro electromagntico

2
La regin UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400
nm. Es una regin de energa muy alta. Provoca dao al ojo humano as como
quemadura comn. Los compuestos con dobles enlaces aislados, triples
enlaces, enlaces peptdicos, sistemas aromticos, grupos carbonilos y otros
heterotomos tienen su mxima absorbancia en la regin UV, por lo que sta
es muy importante para la determinacin cualitativa y cuantitativa de
compuestos orgnicos. Diversos factores -como pH, concentracin de sal y el
disolvente- que alteran la carga de las molculas, provocan desplazamientos
de los espectros UV.
La fuente de radiacin ultravioleta es una lmpara de deuterio.

En la regin visible apreciamos el color visible de una solucin y que
corresponde a las longitudes de onda de luz que transmite, no que absorbe. El
color que absorbe es el complementario del color que transmite.
Por tanto, para realizar mediciones de absorcin es necesario utilizar la
longitud de onda en la que absorbe luz la solucin coloreada.
La fuente de radiacin visible suele ser una lmpara de tungsteno y no
proporciona suficiente energa por debajo de 320 nm.

longitud de onda color de luz que se color de luz que se
aproximada absorbe refleja o ve
390 - 435 Violeta Amarillo verdoso
435 - 490 Azul Amarillo
490 - 580 Verde Rojo
580 - 595 Amarillo Azul
595 - 650 Naranja Azul verdoso
650 - 780 Rojo Verde azulado

1.1. Transmitancia y Absorbancia

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda
de intensidad I
o
incide perpendicularmente sobre una disolucin
de un compuesto qumico que absorbe luz o cromforo, el
compuesto absorber una parte de la radiacin incidente (I
a
) y
dejar pasar el resto (I
t
), de forma que se cumple: I
o
=I
a
+I
t

La transmitancia (T) de una sustancia en solucin es la relacin entre la
cantidad de luz transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la
muestra, I
t,
y la cantidad de luz que incidi sobre ella, I
o
, y se representa
normalmente en tanto por ciento: % T = I
t/
I
o
x 100
La transmitancia nos da una medida fsica de la relacin de intensidad
incidente y transmitida al pasar por la muestra. La relacin entre %T y la
concentracin no es lineal, pero asume una relacin logartmica inversa.

La absorbancia (A) es un concepto ms relacionado con la muestra puesto
que nos indica la cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el
logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log I
t
/ I
o.
Cuando la intensidad incidente y transmitida son iguales (Io = It), la
transmitancia es del 100% e indica que la muestra no absorbe a una
determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 =0.
I
a
I
t
I
o
l
3
La cantidad de luz absorbida depender de la distancia que atraviesa la luz a
travs de la solucin del cromforo y de la concentracin de ste.

1.2. Ley de Lambert-Beer

Esta ley expresa la relacin entre absorbancia de luz monocromtica (de
longitud de onda fija) y concentracin de un cromforo en solucin:

A = log I/Io = cl

La absorbancia de una solucin es directamente proporcional a su
concentracin a mayor nmero de molculas mayor interaccin de la luz con
ellas-; tambin depende de la distancia que recorre la luz por la solucin a
igual concentracin, cuanto mayor distancia recorre la luz por la muestra ms
molculas se encontrar-; y por ltimo, depende de , una constante de
proporcionalidad -denominada coeficiente de extincin- que es especfica de
cada cromforo. Como A es adimensional, las dimensiones de dependen de
las de c y l. La segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la
primera (c) se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones
de resultan ser M
-1
cm
-1
. Este coeficiente as expresado, en trminos de
unidades de concentracin molar (o un submltiplo apropiado), se denomina
coeficiente de extincin molar (
M
). Cuando, por desconocerse el peso
molecular del soluto, la concentracin de la disolucin se expresa en otras
unidades distintas de M, por ejemplo gL
-1
, las dimensiones de resultan ser
distintas, por ejemplo g
-1
Lcm
-1
, y al coeficiente as expresado se denomina
coeficiente de extincin especfico (
s
).

La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de
c altos, vara con la concentracin, debido a fenmenos de dispersin de la
luz, agregacin de molculas, cambios del medio, etc.

1.3. Instrumentacin para la medicin de absorbancias de la luz visible y
ultravioleta: espectrofotmetro UV-visible

La medicin de absorbancia de la luz por las molculas se realiza en unos
aparatos llamados espectrofotmetros. Aunque pueden variar en diseo, en
especial con la incorporacin de ordenadores para el anlisis de datos, todos
los espectrofotmetros constan, segn se indica en la figura, de:

1. Una fuente de energa radiante: lmpara de deuterio y tungsteno.
2. Un monocromador para la seleccin de radiaciones de una determinada
longitud de onda: filtros, prismas, redes de difraccin.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o
tubos) que contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico
transparente. Para medir en UV se deben usar las de cuarzo o slice fundido,
porque el vidrio no transmite la radiacin UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las seales luminosas
en seales elctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

4
Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de
luz y longitud de onda a la que se va a realizar la medida. Hay
espectrofotmetros de un solo haz (con una sola celdilla para alojar la cubeta
con la muestra) y de doble haz (con dos celdillas para dos cubetas); en nuestro
caso se trabajar con los de un solo haz.
Se mide primero la absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al
que se le asigna el valor de cero mediante el ajuste del mando, de forma que la
intensidad incidente y transmitida sean iguales (I
o
=I
t
), y por tanto la absorbancia
es cero. A continuacin se pone en la celdilla la cubeta con la muestra y se lee la
absorbancia de sta.























1.4 Obtencin de un espectro de absorcin

El espectro de absorcin es una representacin grfica que indica cantidad de
luz absorbida () a diferentes valores de .

A partir de una solucin diluida de un compuesto, cuya absorbancia mxima
entra dentro del rango de medida del espectrofotmetro, se ver el valor de
absorbancia a diferentes longitudes de onda frente a un blanco que contenga el
disolvente de la solucin de la muestra a caracterizar. A partir del espectro de
absorcin se obtendr el valor de al que el compuesto presenta la mayor
absorbancia (
max
). Dicho se utilizar a la hora de hacer determinaciones
cualitativas y cuantitativas del compuesto.

El espectro de absorcin de un cromforo depende, fundamentalmente, de la
estructura qumica de la molcula.


ESPECTROFOTMETRO ESPECTROFOTMETRO
OH
NO2
p-Nitrofenol
Compartimento
muestra

ON/OFF
Ajuste 0% T
Ajuste de longitud de onda

Ajuste de 100% T
Fuente luminosa
Rendija entrada
Prisma dispersin
Rendija salida
Muestra
Detector

5





















No obstante, hay una gran cantidad de factores que originan variaciones en
los valores de
max
y
M
, entre los que se incluye el pH, la polaridad del solvente
o molculas vecinas y la orientacin de los cromforos vecinos; y cada uno
afecta de forma particular. Por ejemplo, variaciones originadas por cambios de
pH son debidas al efecto de ste sobre la ionizacin del compuesto. A
continuacin se muestran como ejemplo los espectros de absorcin de HNTS
(un reactivo empleado para la determinacin de especies oxidantes) y
comprobndose que por espectrotometra se puede seguir el efecto que ejercen
el pH y los oxidantes.







1.5 Curvas de calibrado

A
b
s
o
r
c
i

n

d
e

l
o
s

p
i
g
m
e
n
t
o
s

d
e
l
c
l
o
r
o
p
l
a
s
t
o
Carotenoides
Clorofila b
Clorofila a
Espectros de absorcin de
tres pigmentos fotosintticos
cloroplastdicos.
Observar que un compuesto
puede tener ms de un pico
de absorcin (
max
).
Longitud de onda (nm)
Efecto del pH en la absorcin de HNTS.
Espectros 1 y 2 en medio cido (mximo de
absorcin a 370 nm); espectros 3 y 4 en
medio bsico (mximo a 410 nm).
Desplazamiento del mximo de absorcin y
descenso de absorbancia cuando el HNTS se
incuba con H
2
O
2
a distintos tiempos (0, 5, 10 y
15 minutos).
6
Para obtener una curva de calibrado de un compuesto se preparan soluciones
de diferentes concentraciones del mismo, determinndose para cada una de
ellas el valor de absorbancia a
max
. Estos valores de absorbancia se
representan en el eje de abscisas (eje de x) y los de concentracin en el eje de
ordenadas (eje de y). Se observar que, a bajas concentraciones, el aumento de
concentracin se corresponde con un incremento lineal en la absorbancia (zona
de cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A concentraciones altas la
linealidad se pierde y se observa que la lnea se aplana, por lo que las medidas
son poco fiables.

La representacin de Lambert-Beer, A =cl, nos permitir calcular el valor
del coeficiente de extincin molar, que corresponde a la pendiente de la recta.

1.6. Objetivos

Espectos de absorcin

Se van a realizar espectros de absorcin de distintas sustancias para
determinar su
max
y comprobar que un cambio en la estructura de la molcula,
por ejemplo su reduccin, supone una modificacin en su espectro.

Ley de Lambert-Beer

Se aplicar la ley de Lambert-Beer y tras hacer una recta de calibrado para
dos sustancias, se calcular grficamente el valor de los correspondientes
coeficientes de extincin molar.

Determinaciones colorimtricas especficas de compuestos

Se aplicarn reacciones especficas para la determinacin colorimtrica de
sustancias.


2. LISTADO DEL MATERIAL NECESARIO

2.1. Material de uso general

Espectrofotmetro.
Agitador de tubos de ensayo.
Balanza.
pHmetro.
Tijeras

2.2. Material para cada grupo

Gradillas con tubos de ensayo.
J uego de pipetas (0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0 y 25.0 ml).
Prepipetas (dos juegos).
Probetas (100 y 250 ml).
Vasos de precipitado (100 y 500 ml).
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Frasco lavador con agua destilada.
Recipientes para muestras biolgicas de 50 ml.
Papel de filtro.
Papel de parafilm.
Rotulador para vidrio.
Pipetas Pasteur de plstico (cuatro).
Guantes de latex.
Cubetas de plstico para medir en el espectrofotmetro.

2.3. Reactivos

Espectos de absorcin

Solucin de p-nitrofenol 0,20 mM en agua destilada.
Solucin de NaOH 0,50 N.
Solucin de p-nitrofenol de concentracin desconocida.
Solucin de flavn mononucletido (FMN) 0,25 M en agua destilada.
Ditionito sdico.

Determinacin colorimtrica de glucosa y nitrito mediante reacciones
especficas

Glucosa
Glucosa oxidasa
Peroxidasa
Fenol
4 amino-antipirina
Tampn fosfato
Nitrito potsico
Sulfanilamida
Dicloruro de N-naftol-1-etilendiamino
cido clorhdrico


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