Los cultivos celulares y sus aplicaciones I (cultivos de clulas animales)

Lic. Mara Eugenia Segretn

INGEBI-CONICET - Dpto. FBMyC, FCEyN-UBA

Los cientficos han desarrollado metodologas para aislar clulas y obtener poblaciones celulares
homogneas, que luego pueden ser incluso mantenidas y multiplicadas in vitro (en vidrio = en
recipientes especiales, en el laboratorio). Los cultivos celulares son esenciales en la investigacin
cientfica, ya que permiten estudiar los procesos que ocurren en las clulas, y en diversas aplicaciones
de la biotecnologa, como la produccin de molculas de inters industrial, ingeniera de tejidos, etc.

Cmo se obtienen las clulas?
El primer paso para aislar clulas de un mismo tipo a partir de un tejido (generalmente formado por
clulas de diversos tipos) consiste en separar la matriz extracelular que las mantiene unidas
1
. Para
lograrlo, la muestra de tejido es tratada con diversas enzimas proteolticas (como tripsina y
colagenasas) que degradan las protenas de la matriz; y tambin se utilizan agentes (como el EDTA -
cido etilendiaminotetraactico) que secuestran al in calcio, del cual depende la adherencia celular.
De esta forma, y mediante una suave agitacin, se obtiene una suspensin celular que contiene a
todas las clulas presentes en ese tejido.
Para separar los diferentes tipos celulares se pueden
utilizar varios mtodos:
1. La centrifugacin, que permite separar a las clulas
por tamao.
2. La capacidad de adherencia al vidrio o al plstico
que tienen algunos tipos celulares.
3. La unin a ciertos anticuerpos especficos para
determinados componentes celulares. Estos
anticuerpos se usan unidos a diferentes matrices
(colgeno, bolitas de polisacridos, de ltex o de
plstico). Las clulas unidas a la matriz (a travs de
los anticuerpos) se recuperan por agitacin,
tratamiento con tripsina (digiere a las protenas que
median la adhesin) o, en el caso de una matriz
digerible (como el colgeno), degradando la propia
matriz con enzimas (como la colagenasa).
4. La unin a ciertos anticuerpos acoplados a
colorantes fluorescentes. Las clulas que contienen
un determinado componente son reconocidas y
marcadas por los anticuerpos. Las clulas
marcadas son separadas de las no marcadas en un
separador de clulas activado por fluorescencia o
cell sorter (Figura 1).
5. La diseccin de un grupo de clulas a partir de una
seccin de tejido preparada para microscopa. La
regin que contiene las clulas de inters es
irradiada con un lser, que funde un pequeo
crculo con las clulas que estn por debajo. Estas
clulas capturadas son luego removidas para un
posterior anlisis. La tcnica, denominada
microdiseccin de captura por lser, puede
utilizarse para aislar y estudiar diferentes partes de
un tumor, por ejemplo. Otra tcnica relacionada
emplea un lser para disectar un grupo de clulas y
catapultarlas a un contenedor apropiado para un
posterior anlisis (Figura 2).

1
La matriz extracelular est compuesta por diferentes tipos de molculas, entre las que se encuentran los proteoglicanos,
polisacridos como el cido hialurnico, y protenas como el colgeno, laminina, fibronectina, fibrina y elastina.

Figura 1. Equipo para la separacin de
clulas marcadas por fluorescencia. Las
clulas individuales viajan a travs de un
conducto muy delgado y son iluminadas por un
lser. El equipo puede detectar qu clulas
emiten fluorescencia (por el anticuerpo
adherido). Cada clula es incorporada en una
gota que es cargada elctricamente como
negativa o positiva en funcin de la presencia o
ausencia del colorante fluorescente. Luego, las
gotas son separadas por un campo elctrico
hacia los recipientes colectores segn su carga
(adaptado de Alberts y col., MBC 2002).










Figura 2. Tcnica de microdiseccin para aislar clulas a partir de secciones de tejidos. Este mtodo
emplea un lser para escindir una regin de inters y eyectarla a un contenedor, permitiendo el aislamiento de
determinadas clulas (hasta clulas individuales) a partir de un tejido (adaptado de Alberts y col., MBC 2002).

Cmo se cultivan las clulas?
La mayora de las clulas animales y vegetales aisladas pueden vivir, multiplicarse, e incluso presentar
ciertas propiedades diferenciales, si se las cultiva en placas de plstico y con medios de cultivo
adecuados. As, las clulas pueden ser observadas continuamente bajo el microscopio o analizadas
bioqumicamente, para estudiar los efectos del agregado o remocin de molculas especficas, como
hormonas o factores de crecimiento. Adems, se pueden estudiar las interacciones entre clulas,
cultivando en la misma placa ms de un tipo celular. Cuando los experimentos se realizan con cultivos
celulares, se los denomina ensayos in vitro (en vidrio), para diferenciarlos de aquellos que se llevan
a cabo en organismos completos, o experimentos in vivo (en organismo viviente)
2
.


















Como se mencion anteriormente, los cultivos se establecen principalmente a partir de suspensiones
celulares generadas por disgregacin de tejidos. A diferencia de las bacterias, la mayora de las clulas
que forman parte de tejidos no pueden vivir en suspensin, y requieren una superficie slida sobre la
cual crecer y multiplicarse. Este soporte generalmente es la base de una placa o frasco de plstico,
aunque a veces los requerimientos son ms complejos y el plstico debe antes recubrirse con
componentes de la matriz extracelular (sustancia que rodea y contiene a las clulas en los tejidos, y
con la cual interactan), como por ejemplo el colgeno y la laminina.

2
En los laboratorios de bioqumica, por in vitro se entienden aquellas reacciones qumicas que se llevan a cabo en un tubo de
ensayo en ausencia de clulas, mientras que in vivo se refiere a las reacciones qumicas que ocurren dentro de la clula, an en
cultivo.


El cultivo de tejidos y clulas comenz en 1907 con un experimento diseado para esclarecer una
controversia en el rea de la neurobiologa. El investigador Dr. Ross Harrison, quien trabajaba en la
Universidad J ohns Hopkins, public un breve pero crtico artculo (Observaciones de la fibra nerviosa
viva en desarrollo) que introdujo exitosamente una nueva tcnica, el cultivo de tejidos, para demostrar
experimentalmente cmo se originan las fibras nerviosas. Los experimentos originales con fibras
nerviosas se basaron en el cultivo de pequeos fragmentos de tejidos, llamados explantos. Utilizando
tcnicas aspticas, Harrison tom fragmentos del tubo neural (tejido embrionario precursor del sistema
nervioso) de un embrin de rana, y lo deposit en una gota de lquido linftico fresco (medio de
cultivo) de rana colocada sobre un cubreobjetos estril. Una vez que la linfa coagul, invirti el
cubreobjetos sobre un portaobjetos de vidrio que posea una depresin, creando as un cultivo en gota
suspendida, tcnica utilizada por los microbilogos para estudiar las bacterias. Luego de peridicas
observaciones al microscopio, pudo describir el desarrollo de fibras nerviosas in vitro a partir de las
neuronas presentes en el tejido extirpado. As, adems de argumentar slidamente la doctrina neural,
resolvi los problemas bsicos del cultivo celular, como el medio, la observacin y la contaminacin.

Experimento de Ross Harrison (1907),
donde el explanto es la porcin de
tejido neural, incluido en una gota de
linfa. Adaptado de www.corning.com.

Cultivos primarios
Se denominan as a aquellos cultivos preparados directamente a partir de un tejido u rgano. Pueden
iniciarse con o sin fraccionamiento previo para separar los distintos tipos celulares. En estos cultivos
las clulas estn vivas, conservan sus caractersticas originales y su proliferacin es limitada. Pueden
ser removidas del recipiente de cultivo para formar cultivos secundarios (figura 3).

Cultivos secundarios
En estas condiciones las clulas suelen multiplicarse hasta cubrir la superficie del recipiente de cultivo,
formando una monocapa (capa de una clula de espesor). Como consecuencia del contacto entre las
clulas se detiene temporalmente su proliferacin, hasta que se las subcultiva a un recipiente con
medio fresco. As, podrn subcultivarse durante semanas o meses. En este estado, las clulas
frecuentemente mostrarn distintas propiedades segn su origen. Por ejemplo, los fibroblastos (clulas
que sintetizan fibras y mantienen la matriz extracelular del tejido de muchos animales) secretarn
colgeno, las clulas derivadas de tejido muscular esqueltico se fusionarn para generar fibras
musculares con capacidad contrctil espontnea, las clulas nerviosas extendern prolongaciones
(axones) elctricamente excitables que podrn conectarse (establecer sinapsis) con otras clulas
nerviosas, las clulas epiteliales formarn largas capas con varias propiedades de un epitelio intacto
(figura 4). Gracias a que estos fenmenos ocurren en cultivo, es posible estudiarlos con diferentes
metodologas, a veces no aplicables a tejidos intactos.










Cultivos continuos o lneas celulares
La mayora de las clulas de los vertebrados
dejan de dividirse luego de un determinado
nmero de divisiones en cultivo, por un
proceso llamado senescencia celular. Por
ejemplo, los fibroblastos humanos normales
se dividen solamente entre 25 y 40 veces en
cultivo, antes de detenerse. En estas clulas,
as como en muchas otras, la capacidad
limitada de proliferacin es el resultado de un
acortamiento progresivo de los telmeros
(porcin de ADN que se encuentra en los
extremos de los cromosomas). En las clulas
somticas (todas las clulas que no son
clulas sexuales) se encuentra apagado el
gen que codifica para la enzima telomerasa,
que se encarga de mantener la integridad de
los telmeros; como consecuencia, los
telmeros se acortan en cada divisin celular.
A los fibroblastos humanos se los puede forzar a proliferar indefinidamente si se les provee el gen que
codifica para la telomerasa; as, pueden propagarse como una lnea celular inmortalizada.
Pero como se mencion, no todas las clulas humanas se inmortalizan de la misma manera. Algunas
clulas, a pesar de que sus telmeros permanezcan largos, pueden frenar sus divisiones celulares
como consecuencia de la activacin de mecanismos denominados puntos de control (check points)
del ciclo celular. Para inmortalizar estas clulas, hay que lograr la inactivacin de los check-points. Una
forma de hacerlo es introducir ciertos oncogenes (genes promotores del cncer) que pueden
obtenerse de virus que causan cncer, como algunas cepas del virus del papiloma humano,
adenovirus, etc.

Figura 4. Clulas en cultivo. A)
Micrografas de contraste de fase de
fibroblastos en cultivo. B) Micrografas de
mioblastos en cultivo mostrando las
clulas fusionadas para formar clulas
musculares multinucleadas. C) Clulas
precursoras de oligodendrocitos en
cultivo. D) Clulas de tabaco en cultivo

Figura 3

A diferencia de las clulas humanas, las de los roedores no tienen apagado el gen de la telomerasa,
por lo que sus telmeros mantienen el largo a travs de las divisiones celulares. Pero cuando son
cultivadas, esas clulas experimentan cambios genticos que inactivan los mecanismos de check-
point, produciendo lneas celulares inmortalizadas espontneamente. Ambos tipos de lneas celulares
son muy tiles en la investigacin celular, como fuente de un gran nmero de clulas uniformes, que
pueden ser conservadas y almacenadas en nitrgeno lquido (a -196 C) por un perodo muy largo de
tiempo, reteniendo su viabilidad y siendo un buen modelo experimental para las primeras etapas de
una investigacin.
A pesar de la gran similitud que las clulas de una lnea tienen entre s, no son idnticas. La
uniformidad gentica en una lnea celular puede mejorarse por clonado celular, a travs del cual se
asla una sola clula, la que prolifera para formar una colonia de clulas clonales (idnticas). Una de
las aplicaciones ms importantes de esta estrategia es el aislamiento de lneas celulares mutantes que
poseen defectos en ciertos genes. Su estudio puede servir para inferir el papel que tiene la protena
ausente o alterada en las clulas normales.
Entre los cultivos celulares ms promisorios, desde el punto de vista mdico, se encuentran las lneas
de clulas madre embrionarias humanas. Estas clulas, obtenidas del macizo celular interno de un
embrin en los primeros estadios del desarrollo, pueden proliferar indefinidamente reteniendo la
habilidad de originar cualquier tipo celular del cuerpo. Estos cultivos celulares podran revolucionar la
medicina al proveer de clulas capaces de reemplazar o reparar tejidos daados. Hay otras fuentes de
clulas madre que se estn investigando en tejidos adultos, como la mdula sea y el cordn umbilical.

Los hibridomas
Se sabe que es posible fusionar dos clulas formando un heterocarionte (o heterocarion), es decir, una
clula con dos ncleos separados pero con los contenidos citoplasmticos compartidos. Para lograrlo,
se trata una suspensin de clulas con compuestos que inducen la fusin de membranas (fusgenos),
tales como el polietilenglicol (PEG) o ciertos virus. Eventualmente, un heterocarionte puede entrar en
mitosis, produciendo una clula hbrida en la cual las envolturas de ambos ncleos se han disgregado,
permitiendo juntar los cromosomas de ambos en un nico gran ncleo. Tales clulas hbridas pueden
clonarse estableciendo una lnea celular, pero se sabe que en muchos casos la lnea resultante es
inestable genticamente, y tiende a perder parte del material gentico.
En 1975, un equipo integrado por el cientfico
argentino Csar Milstein, desarroll, mediante la
tcnica de fusin, una lnea celular hbrida clave
para la produccin de anticuerpos monoclonales
(todos iguales) para fines teraputicos y de
diagnstico: los hibridomas (este desarrollo llev
al Dr. Milstein a ser galardonado con el Premio
Nbel). Los hibridomas son lneas resultantes de
la fusin de dos tipos celulares: linfocitos B
secretores de inmunoglobulinas (anticuerpos) y
clulas derivadas de una lnea tumoral de
linfocitos B (figura 5). De la fusin se obtiene una
mezcla heterognea de clulas, y con un medio
de cultivo especial se seleccionan las clulas
fusionadas que producen anticuerpos y proliferan
indefinidamente. Estos hibridomas son
propagados como clones individuales, y cada uno
de ellos sirve como una fuente estable y
permanente de un anticuerpo monoclonal. Dicho
anticuerpo reconoce un nico eptope antignico
(es decir, una pequea porcin de una protena).
Una de las ventajas de los hibridomas, en
comparacin con los cultivos clonales de linfocitos
B, es que estos ltimos tienen una vida limitada en
cultivo.




Figura 5. Preparacin de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales contra un antgeno en
particular. El medio de cultivo selectivo utilizado luego de la fusin celular contiene un inhibidor que bloquea las
rutas de sntesis de los nucletidos. Como consecuencia, las clulas deben utilizar una va alternativa para fabricar
sus cidos nucleicos. Esta va es defectiva en la lnea celular mutante derivada del tumor de linfocitos B, pero est
intacta en las clulas de bazo (linfocitos B) obtenidas del ratn inmunizado. Debido a que ninguna de las clulas
utilizadas para la fusin inicial puede crecer por s sola, slo las clulas hbridas o hibridomas sobreviven.

Qu contienen los medios para el cultivo de clulas?
Hasta los aos 70, el cultivo de tejidos pareca ser producto de una mezcla de ciencia y alquimia. De a
poco, los fluidos coagulados (como en el experimento de Harrison) fueron reemplazados por placas
con medios lquidos que contenan pequeas cantidades de una serie de molculas necesarias para la
supervivencia y multiplicacin celular: sales, glucosa, aminocidos y vitaminas. Adems, la mayora de
los medios incluan una mezcla poco definida de macromolculas adicionadas bajo la forma de suero
fetal bovino o equino, o extracto crudo de embriones de pollo. Dichos medios se siguen utilizando en la
actualidad para los cultivos de rutina, y por lo tanto es difcil saber qu macromolculas requiere un
determinado tipo celular para funcionar y multiplicarse. Como consecuencia, se desarrollaron
numerosos medios qumicamente definidos, denominados libres de suero, que poseen, adems de
las pequeas molculas mencionadas, varias protenas especficas necesarias para la supervivencia y
proliferacin, como los factores de crecimiento. As, gracias a estudios que buscaban establecer las
condiciones mnimas de cultivo para un comportamiento celular adecuado, se descubrieron muchas
molculas de sealizacin extracelulares esenciales para la supervivencia, desarrollo y proliferacin de
determinados tipos celulares.
Los medios de cultivo son generalmente tamponados para mantener un pH alrededor de 7,4 y tienen,
adems, indicadores de pH, como el rojo fenol, que cambian de color a medida que aparecen
catabolitos cidos como resultado del metabolismo celular. Suelen agregarse tambin antibiticos y
antimicticos para impedir la contaminacin con microorganismos.

Composicin de medios de cultivo para clulas de mamfero

Aminocidos Vitaminas Sales Otros compuestos* Protenas requeridas
en los medios
definidos libres de
suero
Arginina
Cistena
Glutamina
Histidina
Isoleucina
Leucina
Lisina
Metionina
Fenilalanina
Treonina
Triptofano
Tirosina
Valina
Biotina
Colina
Folato
Nicotinamida
Pantotenato
Piridoxal
Tiamina
Riboflavina
NaCl
KCl
NaH
2
PO
4
NaHCO
3
CaCl
2
MgCl
2
Glucosa
Penicilina
Estreptomicina
Anfotericina
Rojo fenol
Suero fetal bovino
Insulina
Transferrina
Factores de
crecimiento
especficos

* La penicilina y la estreptomicina son antibiticos y la anfotericina es un antimictico, que se adicionan para
impedir el crecimiento de bacterias y hongos contaminantes, respectivamente. El rojo fenol es un indicador de pH.
Los cultivos crecen usualmente en contenedores de plstico o vidrio con una superficie apropiada para la
adhesin celular, y se mantienen en una estufa a 37C en una atmsfera de 5% de CO
2
, 95% aire.

En qu recipientes se cultivan las clulas?

Existen numerosos contenedores y recipientes para cultivar clulas y tejidos, dependiendo de las
caractersticas de las clulas a cultivar y de la escala deseada.
Cuando se cultivan clulas para hacer experimentos, se hacen cultivos a pequea escala. En esta
escala, las clulas de multiplican en frascos que tienen una base de 25 a 175 cm
2
(figura 5, frascos T).
En un recipiente tpico de 175cm
2
pueden obtenerse aproximadamente 1x10
7
clulas adheridas, y unas
1x10
8
clulas cuando se trata de lneas que crecen en suspensin. En los frascos T estndares no es
posible producir cantidades mayores de clulas, dada la cantidad de tiempo insumida para los

repetidos pasajes necesarios a medio fresco, la demanda de espacio en un incubador (que controla la
composicin de gases, la temperatura y la humedad del entorno) y el costo de los insumos.
Cuando se necesita aumentar la escala del cultivo (escalado o scaling-up), se deben tener en cuenta
numerosos parmetros, incluyendo problemas asociados con la falta de nutrientes, el intercambio
gaseoso (especialmente la escasez de oxgeno), y la aparicin de metabolitos txicos como el amonio
y el cido lctico.
Existen muchos sistemas para escalar los cultivos
celulares, que se muestran en la figura 6. Entre
ellos, es posible encontrar desde arreglos de frascos
triples y botellas cilndricas, hasta biorreactores ms
complejos en su estructura. En todos los casos, es
necesario asegurar el correcto intercambio gaseoso
y la disponibilidad de nutrientes. Por ejemplo, el
arreglo de botellas de cultivo sobre rodillos que se
muestra en la figura 6c, est diseado de forma tal
que las clulas cubran toda la superficie interna de la
botella, con rodillos que al girar aseguran que el
medio de cultivo bae a todas las clulas,
aportndole nutrientes y retirando desechos. Otro
ejemplo es el biorreactor (6d) que permite obtener
un rendimiento importante de anticuerpos a partir de
un cultivo celular.
La adicin de bolitas de distintos materiales inertes
puede ayudar tambin a aumentar la densidad
celular en cultivos al aumentar la superficie de
cultivo entre 10 y 100 veces.








Tipo de contenedores para cultivo de clulas y sus capacidades
Contenedor
Mx Vol
(ml)
Mx clulas
(suspensin)
Mx clulas
(adhesin)
Frasco T 150 1.5x10
8
~10
7
Frasco triple 150 1.5x10
8
3x10
7
Biorreactor 8000 ------ 1.5x10
10
Botellas rodantes 1000 1x10
9
1x10
8
Frascos para agitacin (Erlenmeyer) 1000 1 x 10
9
-------
Frascos con paletas 1000 1 x 10
9
-------

Fuentes consultadas
Introduccin al cultivo celular. Universidad de Barcelona, Espaa,
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cap1.htm
Bruce Alberts, Alexander J ohnson, J ulian Lewis, Martin Raff, Keith Roberts, y Peter Walter.
Molecular Biology of the Cell, Editorial Garland, 4ta. Edicin (2002).
Celebrando un siglo del cultivo de tejidos, en http://www.corning.com/Lifesciences/cells100/
Tcnicas fundamentales en el cultivo celular. Un manual de laboratorio. Sigma,
http://www.sigmaaldrich.com

Figura 6. Contenedores para cultivo de clulas. a)
Frasco T; b) Frasco triple; c) botellas rodantes; d)
biorreactor; e) frasco con paletas; f) frascos con
agitacin (Erlenmeyer). Fotos: www.sigma-aldrich.com