Uji Endotoksin Sediaan Injeksi (Insan Sunan K)

28

UJI ENDOTOKSIN SEDIAAN INJEKSI INTRAVENA NATRIUM KLORIDA
DENGAN METODE GEL-CLOT

Insan Sunan Kurniawan Syah, Sohadi Warya, Yessy Christina
Fakultas Farmasi Universitas Padjadjaran

ABSTRAK

Endotoksin merupakan bagian kompleks lipopolisakarida membran bakteri Gram
negatif yang dapat menyebabkan reaksi pirogenik. Uji Limulus Amebocyte Lysate
(LAL) metode gel-clot telah banyak digunakan untuk mendeteksi keberadaan
endotoksin dalam sediaan parenteral. Penelitian ini dilakukan untuk membandingkan
kadar endotoksin pada sediaan injeksi natrium klorida 0,9% yang dibuat dengan
menggunakan karbon aktif sebagai penjerap endotoksin dan tanpa karbon aktif. LAL
yang digunakan adalah Pyrotell Single Test Vial (STV) yang memiliki sensitivitas
0,25 EU/mL. Sebagai pembanding dilakukan pengujian terhadap standar kontrol
endotoksin 0,5 EU/mL sebagai kontrol positif dan LAL Reagent Water (LRW)
sebagai kontrol negatif. Dari pengujian sampel didapatkan hasil negatif tetapi dengan
konsistensi gel yang berbeda. Hal ini membuktikan bahwa karbon aktif berpengaruh
terhadap pembebasan endotoksin.

Kata kunci : endotoksin, injeksi natrium klorida, metode gel-clot

ABSTRACT

Endotoxin is part of lipopolysaccharide complex from Gram negative bacteria
membran that can cause pyrogenic reaction. The Limulus Amebocyte Lysate (LAL)
gel-clot method assay have been used for detection of endotoxin in parenteral
preparation. This research was done to compare endotoxin content of preparations of
sodium chloride injection 0,9% made by using activated carbon as endotoxin
adsorbent and without activated carbon. LAL which used is Pyrotell Single Test Vial
(STV) with sensitivity 0,25 EU/mL. As comparator, the examination to endotoxin
control standar 0,5 EU/mL as positive control and LAL Reagent Water (LRW) as
negative control was done. From examination samples, was got negative result but
with different gel consistency. This showed that activated carbon have influence to
Iiberation of endotoxin.

Key words : endotoxin, sodium chloride injection, gel-clot method

Farmaka, Volume 7 Nomor 1, April 2009

29

PENDAHULUAN
Suplai larutan steril bertakaran besar
pada manusia secara intravena kadang
kadang muncul reaksi demam tinggi, yang
disertai rasa menggigil, cemas, kesulitan
bernafas, lemahnya peredaran darah, nyeri
kepala, dan nyeri bagian tubuh. Pada
hipertermi ini mulamula akan terjadi
leukopeni (pengurangan jumlah leukosit)
dan belakangan menjadi leukositosis
(Voigt, 1995).
Salah satu syarat dari sediaan injeksi
intravena ialah harus bebas pirogen (Ansel,
1989). Pirogen adalah senyawa molekular
tinggi, yang dinyatakan sebagai senyawa
lipopolisakarida, yang diproduksi kirakira
5 10% dari masa total bakteri (Voigt,
1995). Pirogen dari satu sediaan dapat
dihilangkan dengan cara adsorpsi,
diantaranya dengan menggunakan karbon
aktif 0,1 0,3 % b/v. Namun demikian
karbon aktif tersebut selain mengadsorpsi
pirogen, juga mengadsorpsi zatzat
terkandung dalam larutan itu sendiri
(ChemicaCom, 2006).
Untuk menjamin tidak adanya pirogen
dalam sediaan injeksi intravena volume
besar maka dilakukan uji pirogen. Uji
pirogen menggunakan kelinci dilakukan
dengan cara menginjeksikan larutan
sediaan steril secara intravena, kemudian
diukur peningkatan suhu tubuh kelinci
melalui rektal (Departemen Kesehatan RI,
1995).
Metode yang lebih baik adalah uji in
vitro yang telah memiliki tingkat
sensitivitas lebih tinggi dari pada uji
pirogen kelinci yaitu uji LAL (Limulus
Amoebocyte Lysate). Uji ini menggunakan
ekstrak cair dari Limulus polyphemus
(kepiting ekor tapal kuda) untuk
mendeteksi tingkat endotoksin bakterial
dalam sampel. Tiga jenis metode uji
endotoksin (metode bekuan gel, metode
turbidimetri, metode kromogenik) telah
dijelaskan dalam British Pharmacopoeia
untuk evaluasi akhir konsentrasi
endotoksin dalam suatu produk steril
(Department of Health, 1980).
Metode yang digunakan dalam
penelitian ini adalah metode bekuan gel
(Gel-Clot Method). Metode bekuan gel
melibatkan penggunaan pembekuan
protein yang dipotong pada suatu enzim
pembekuan aktif, dimana bagian tidak larut
produk membentuk gel. Walaupun reaksi
keseluruhan belum ditemukan, dapat
dimengerti bahwa reaksi pembentukan
bekuan diaktivasi oleh enzim tertentu
(Joiner, et al., 2002).
Penelitian ini bertujuan untuk
mengetahui keberadaan endotoksin yang
masih tersisa dalam sediaan injeksi
intravena natrium klorida setelah
dibebaskan dengan karbon aktif,
menggunakan metode gel-clot.


Uji Endotoksin Sediaan Injeksi (Insan Sunan K)
30

METODE PENELITIAN
Alat-alat yang digunakan dalam uji
endotoksin ini antara lain botol infus, alat
gelas yang lazim, inkubator (Memmert),
Laminar Air Flow (LAF) cabinet
(Minihelic

II Zero 0), mikropipet

(Finnpipette Campus S69054), otoklaf
(MC 03000011), oven (Heraeus RT360),
pencampur vortex (VM 300), syringe steril
(York), dan timbangan analitik digital
(Mettler Toledo).
Bahan-bahan yang digunakan dalam uji
endotoksin ini antara lain alkohol 70%
(Nurfarindo), aqua pro injectionum
bidestilata bebas pirogen (PT.
Ikapharmindo Putramas), indikator pH
universal (Merck), karbon aktif
(Shirasagi), natrium klorida (Merck), LAL
Reagent Water (Associates of Cape Cod
Incorporated), Pyrotell

Limulus
Amebocyte Lysate (Associates of Cape
Cod Incorporated), Pyrosol

Reconstitution Buffer (Associates of Cape
Cod Incorporated), dan Standar Kontrol
Endotoksin (Associates of Cape Cod
Incorporated).
Tahapan kerjanya adalah sebagai berikut :
1. Penyiapan Alat dan Bahan
Seluruh alat yang digunakan dibungkus
menggunakan kertas perkamen kemudian
disterilisasi menggunakan otoklaf pada
suhu 121C selama 15 menit. Setelah itu,
alat kualitatif yang telah disterilisasi
dimasukan ke dalam oven dengan suhu
250C selama 30 menit atau 200C selama
1 jam.
2. Formulasi
Sediaan yang akan diuji pada
penelitian ini adalah injeksi natrium
klorida 0,9%. Injeksi natrium klorida
dibuat sendiri di laboratorium dengan
menggunakan formula berdasarkan
Formularium Nasional edisi II tahun 1978
dimana tiap 100 mL injeksi mengandung
natrium klorida sebanyak 0,9 gram.
3. Pembuatan Injeksi Natrium Klorida
Injeksi natrium klorida yang dibuat 2
sediaan, yaitu dengan menggunakan
karbon aktif dan tanpa karbon aktif.
Volume yang dibuat untuk masing-masing
sediaan adalah 120 mL.
a. Pembuatan sediaan injeksi intravena
NaCl 0,9% tanpa karbon aktif.
Natrium klorida ditimbang sebanyak
1,08 gram kemudian dilarutkan dalam
sebagian aqua pro injectionum.
Larutan ditambahkan aqua pro
injectionum hingga mendekati volume
akhir lalu cek pH larutan. Larutan
ditambahkan aqua pro injectionum
hingga 120 mL dan disaring
menggunakan kertas saring, filtrat
pertama dibuang. Larutan injeksi yang
telah dibuat dimasukkan dalam botol
infus sebanyak 102 mL, kemudian
tutup dan disterilisasi dalam otoklaf
121
0
C selama 15 menit.
b. Pembuatan sediaan injeksi intravena
NaCl 0,9% dengan karbon aktif 0,1%.
Farmaka, Volume 7 Nomor 1, April 2009

31

Ditimbang natrium klorida sebanyak
1,134 gram dan karbon aktif sebanyak
0,12 gram. Natrium klorida dilarutkan
dalam sebagian aqua pro injectionum
kemudian ditambah aqua pro
injectionum hingga mendekati volume
akhir dan pH larutan dicek. Larutan
ditambahkan aqua pro injectionum
hingga 120 mL dan ditambahkan
karbon aktif kemudian dipanaskan
sampai suhu 60
0
70
0
C sambil diaduk
selama 15 menit. Larutan disaring
panas-panas menggunakan kertas
saring, filtrat pertama dibuang. Filtrat
yang telah disaring ditampung dalam
botol infus sebanyak 102 mL,
kemudian tutup dan disterilisasi dalam
otoklaf 121
0
C selama 15 menit.
4. Penyiapan Endotoksin dan LAL
a. Penyiapan Endotoksin
Standar kontrol endotoksin yang
tersedia adalah 2500 EU/vial.
Sebanyak 10 mL LAL Reagent Water
dimasukkan ke dalam vial endotoksin
sehingga diperoleh endotoksin 250
EU/mL. Kemudian dilakukan
pengenceran endotoksin sebagai
berikut :
1. Endotoksin 25 EU/mL
Sebanyak 1 mL endotoksin 250
EU/mL ditambah dengan 9 mL
LAL Reagent Water (LRW).
2. Endotoksin 2,5 EU/mL
Sebanyak 1 mL endotoksin 25
EU/mL ditambah dengan 9 mL LRW.
3. Endotoksin 0,5 EU/mL
Sebanyak 1 mL endotoksin 2,5
EU/mL ditambah dengan 4 mL LRW.
b. Penyiapan LAL
Pereaksi LAL yang digunakan dalam
penelitian ini adalah Pyrotell

LAL
Single Test Vial yang hanya dapat
digunakan untuk sekali pakai.
Sensitivitas dari LAL ini adalah
sebesar 0,25 EU/mL. Vial yang berisi
LAL dapat langsung digunakan untuk
menguji endotoksin dalam sediaan
injeksi natrium klorida yang telah
dibuat.
5. Prosedur Metode Gel-Clot
a. Kontrol positif
Penelitian dilakukan di dalam Laminar
Air Flow (LAF). Pyrosol

Reconstitution Buffer dimasukkan ke
dalam larutan endotoksin 0,5 EU/mL
sebanyak 2-3 tetes sampai diperoleh
pH dengan rentang 6-8 . Kemudian
larutan endotoksin yang telah ditambah
buffer diambil sebanyak 0,2 mL
menggunakan mikropipet dan
dimasukkan ke dalam Pyrotell

LAL
Single Test Vial (STV). Campuran
dalam vial dikocok menggunakan
pencampur vortex selama 1-2 detik,
kemudian vial dimasukkan ke dalam
inkubator dan diinkubasi pada suhu
371
o
C selama 602 menit.
Uji Endotoksin Sediaan Injeksi (Insan Sunan K)
32

b. Kontrol Negatif
Pyrosol

Reconstitution Buffer
dimasukkan ke dalam LAL Reagent
Water (LRW) sebanyak 2-3 tetes
sampai diperoleh pH dengan rentang 6-
8 . Kemudian LRW yang telah diberi
buffer diambil sebanyak 0,2 mL
menggunakan mikropipet dan
dimasukkan ke dalam Pyrotell

LAL
Single Test Vial. Campuran dalam vial
dikocok menggunakan pencampur
vortex selama 1-2 detik, kemudian vial
dimasukkan ke dalam inkubator dan
diinkubasi pada suhu 371
o
C selama
602 menit.
c. Pengujian Sediaan Injeksi Intravena
Natrium Klorida 0,9%
Pyrosol

Reconstitution Buffer
dimasukkan ke dalam sediaan injeksi
natrium klorida sebanyak 2-3 tetes
sampai diperoleh pH dengan rentang 6-
8 . Kemudian larutan uji yang telah
ditambah buffer diambil sebanyak 0,2
mL menggunakan mikropipet dan
dimasukkan ke dalam Pyrotell

LAL
Single Test Vial. Campuran dalam vial
dikocok menggunakan pencampur
vortex selama 1-2 detik kemudian vial
dimasukkan ke dalam inkubator dan
diinkubasi pada suhu 371
o
C selama
602 menit. Prosedur ini dilakukan
untuk kedua sediaan, yaitu injeksi
natrium klorida dengan karbon aktif
dan tanpa karbon aktif.

6. Penafsiran Hasil
Setelah proses inkubasi selesai, STV
dikeluarkan dari dalam inkubator.
Kemudian diamati apakah di dasar STV
tersebut terbentuk gel atau tidak. STV
dibalik 180
o
secara perlahan dan dilihat
apakah gel yang terbentuk di dasar STV
jatuh atau tidak.

HASIL PEMBAHASAN
1. Pengujian Endotoksin Kontrol
Positif
Dari pengujian standar kontrol
endotoksin 0,5 EU/mL dengan
menggunakan LAL Pyrotell Single Test
Vial (STV) didapatkan hasil gel yang
kompak. Gel yang terbentuk tidak tumpah
ketika STV diputar sampai terbalik 180
o
.
Hasil diperlihatkan pada gambar di bawah
ini :

Gambar 1. Hasil Pengujian Endotoksin
Kontrol Positif
Seperti yang tertera pada USP, standar
kontrol endotoksin yang digunakan untuk
kontrol positif adalah dua kali sensitivitas
LAL yang digunakan (2). Sensitivitas ini
merupakan batas konsentrasi endotoksin
Farmaka, Volume 7 Nomor 1, April 2009

33

yang dapat terdeteksi oleh LAL Pyrotell
STV . Menurut Guidance for Industry
yang dikeluarkan oleh US Department of
Health and Human Services, Food and
Drug Administration (FDA), salah satu
persyaratan sediaan injeksi volume besar
memiliki batas toleransi endotoksin
sebesar 0,25 EU/mL. Reaksi positif terjadi
karena bakteri Gram negatif (endotoksin
dari Escherichia coli) mengkatalisis
aktivitas proenzim dalam pereaksi LAL
Pyrotell STV. Enzim yang diaktivasi
(koagulase) menghidrolisis ikatan spesifik
pada protein penggumpal (koagulogen)
yang terdapat dalam pereaksi LAL menjadi
bagian yang larut dan tidak larut
(koagulin). Bagian tidak larut ini yang
membentuk gel. Pada saat vial dibalikkan
tidak boleh ada guncangan karena gel yang
terbentuk sangat sensitif dan mudah rusak
sehingga hasil yang seharusnya positif
menjadi negatif. Hasil yang positif
menunjukkan bahwa kadar endotoksin
yang digunakan lebih besar dari
sensitivitas LAL.
2. Pengujian Endotoksin Kontrol
Negatif
Dari pengujian LAL Reagent Water
(LRW) bebas endotoksin dengan
menggunakan STV didapatkan hasil yaitu
tidak terbentuknya gel. Larutan langsung
tumpah ketika STV diputar sampai terbalik
180
o
. Hasil diperlihatkan pada gambar di
bawah ini :

Gambar 2. Hasil Pengujian Endotoksin
Kontrol Negatif
Hasil yang negatif disebabkan karena
tidak adanya endotoksin dalam LRW. Hal
tersebut menunjukkan bahwa LRW yang
digunakan memenuhi persyaratan untuk
digunakan dalam pengujian LAL.
Hasil kontrol positif dan kontrol
negatif digunakan sebagai pembanding
hasil pengujian endotoksin terhadap injeksi
natrium klorida yang dibuat tanpa karbon
aktif dan dengan karbon aktif.
3. Pengujian Endotoksin Injeksi
Natrium Klorida 0,9% Tanpa Karbon
Aktif
Dari hasil pengujian sampel dengan
menggunakan STV didapatkan gel yang
tidak sempurna. Gel yang terbentuk
tumpah secara perlahan ketika STV diputar
sampai terbalik 180
o
.

Uji Endotoksin Sediaan Injeksi (Insan Sunan K)
34


Gambar 3. Hasil Pengujian Endotoksin
Injeksi Natrium
Klorida 0,9% Tanpa Karbon Aktif
Dari gambar 3. dapat dilihat hasil yang
negatif tetapi terbentuk gel yang tidak
sempurna. Gel yang terbentuk jatuh secara
perlahan ketika vial dibalikkan. Hasil
tersebut menunjukkan bahwa di dalam
larutan uji terdapat endotoksin yang
mengaktivasi enzim membentuk gel, tetapi
kadar endotoksin dalam larutan uji berada
di bawah sensitivitas pirotel. Hasil yang
negatif menunjukkan bahwa kadar
endotoksin dalam larutan uji kurang dari
sensitivitas STV (0,25 EU/mL).
4. Pengujian Endotoksin Injeksi
Natrium Klorida 0,9% dengan
Karbon Aktif
Dari pengujian sampel dengan
menggunakan STV didapatkan hasil yaitu
tidak terbentuknya gel. Larutan langsung
tumpah ketika STV diputar sampai terbalik
180
o
. Hasil ditunjukkan pada gambar di
bawah ini :

Gambar 4. Hasil Pengujian Endotoksin
Injeksi Natrium Klorida 0,9% dengan
Karbon Aktif
Dari gambar 4. dapat dilihat hasil yang
negatif, ditandai dengan tidak terbentuknya
gel. Hasil pengujian jatuh secara langsung
ketika vial dibalikkan. Hasil tersebut
menunjukkan bahwa kadar endotoksin
dalam larutan uji kurang dari sensitivitas
STV.

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan
Dari hasil penelitian dapat disimpulkan
bahwa :
1. Pengujian endotoksin kontrol positif
dengan penambahan standar kontrol
endotoksin 0,5 EU/mL pada STV
membentuk gel yang kompak. Hasil
menunjukkan bahwa standar kontrol
endotoksin memenuhi persyaratan.
2. Pengujian endotoksin kontrol negatif
dengan penambahan LAL Reagent
Water (LRW) pada STV tidak
membentuk gel. Hasil menunjukkan
bahwa dalam LRW tidak mengandung
endotoksin.
Farmaka, Volume 7 Nomor 1, April 2009

35

3. Pengujian endotoksin pada injeksi
natrium klorida tanpa karbon aktif,
menghasilkan pembentukan gel yang
tidak kompak. Hal ini menunjukkan
masih terdapat endotoksin dengan
konsentrasi yang lebih kecil daripada
sensitivitas STV.
4. Pengujian endotoksin pada injeksi
natrium klorida dengan karbon aktif,
tidak menghasilkan pembentukan gel.
Hal ini menunjukkan bahwa dalam
larutan uji tidak terdapat endotoksin
dan membuktikan efek karbon aktif
terhadap pembebasan endotoksin
dalam sediaan yang dibuat.

Saran
Pada penelitian selanjutnya disarankan :
1. Penggunaan metode lain yang lebih
baik dalam pembebasan endotoksin.
2. Penggunaan cara pengujian lain dalam
mendeteksi endotoksin, seperti uji
Neutrophil Chemiluminescence.

DAFTAR PUSTAKA
Akers, M. J. 1994. Parenteral Quality Control. 2
nd
Edition. New York : Marcel Dekker, Inc.
p. 101-147
Ansel, H. C. 1989. Pengantar Bentuk Sediaan Farmasi. Penerjemah : Farida Ibrahim. Edisi
ke-4. Jakarta : UI Press. hal. 399-400
ChemicaCom. 2006. Carbon Based Adsorbent. http:// www.chemica.com/
consultationsery.html. diakses tanggal 30 November 2006
Departemen Kesehatan RI. 1995. Farmakope Indonesia. Edisi ke-4. Jakarta : Departemen
Kesehatan RI. hal. 300-301, 908-909

Department of Health. 1980. British Pharmacopeia. Volume II. London : Pharmaceutical
Press. p. A222 A227
Joiner, T. J., Paul F. K., Thomas C. K., Ph.D. 2002. Comparison of Endotoxin Testing
Methods for Pharmaceutical Products. International Journal of Pharmaceutical
Compounding. Volume 6. p. 408-409
Lukas, S. 2006. Formulasi Steril. C.V. Yogyakarta : Andi Offset. hal. 11-14, 81-98
Societys Department of Pharmaceutical Sciences. 1994. The Pharmaceutical Codex :
Principles and Practice of Pharmaceutics. 12
th
Edition. London : Pharmaceutical Press. p.
92-94

Suwandi, U., Drs. 1988. Uji Pirogenitas dengan Kelinci dan Limulus Amebocyte
Lysate.http://www.kalbefarma.com/files/cdk/files/52_08_UjiPirogenitasdenganKelincidan
Limulus.pdf/52_08_UjiPirogenitasdenganKelincidanLimulus.html. diakses tanggal 12
April 2007

United States Pharmacopeial Convention. 2005. The United States Pharmacopeia 28 : The
National Formulary 23. Volume III. Twinbrook Parkway : United States Pharmacopeial
Convention, Inc. p. 2201
Uji Endotoksin Sediaan Injeksi (Insan Sunan K)
36

Voigt, R. 1995. Buku Pelajaran Teknologi Farmasi. Edisi ke-5. Penerjemah : Soendani NS
dan Mathilda BW. Yogyakarta : Gadjah Mada University Press. hal. 462 463