35.

TÉCNICAS DE MANEJO, DETECCIÓN Y VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE

VIRUS ANIMALES O VEGETALES.

. Introducción
Los virus son entidades orgánicas compuestas tan sólo de material genético, rodeado por una
envuelta protectora. Carecen de vida independiente pero se pueden replicar en el interior de las
células vivas, perjudicando en muchos casos a su huésped en este proceso. Los cientos de virus
conocidos son causa de muchas enfermedades distintas en los seres humanos, animales, bacterias
y plantas. La existencia de los virus se estableció en 1892, cuando el científico ruso Dmitry I.
Ivanovsky, descubrió unas partículas microscópicas, conocidas más tarde como el virus del mosaico
del tabaco. En 1898 el botánico holandés Martinus W. Beijerinck denominó virus a estas partículas
infecciosas. Pocos años más tarde, se descubrieron virus que crecían en bacterias, a los que se
denominó bacteriófagos. En 1935, el bioquímico estadounidense Wendell Meredith Stanley cristalizó
el virus del mosaico del tabaco, demostrando que estaba compuesto sólo del material genético
llamado ácido ribonucleico (ARN) y de una envoltura proteica. En la década de 1940 el desarrollo del
microscopio electrónico posibilitó la visualización de los virus por primera vez. Años después, el
desarrollo de centrífugas de alta velocidad permitió concentrarlos y purificarlos. El estudio de los
virus animales alcanzó su culminación en la década de 1950, con el desarrollo de los métodos del
cultivo de células, soporte de la replicación viral en el laboratorio. Después, se descubrieron
numerosos virus, la mayoría de los cuales fueron analizados en las décadas de 1960 y 1970, con el
fin de determinar sus características físicas y químicas.

. Características
Los virus son parásitos intracelulares submicroscópicos, compuestos por ARN o por ácido
desoxirribonucleico (ADN) —nunca ambos— y una capa protectora de proteína o de proteína
combinada con componentes lipídicos o glúcidos. En general, el ácido nucleico es una molécula
única de hélice simple o doble; sin embargo, ciertos virus tienen el material genético segmentado en
dos o más partes. La cubierta externa de proteína se llama cápsida y las subunidades que la
componen, capsómeros. Se denomina nucleocápsida, al conjunto de todos los elementos anteriores.
Algunos virus poseen una envuelta adicional que suelen adquirir cuando la nucleocápsida sale de la
célula huésped. La partícula viral completa se llama virión. Los virus son parásitos intracelulares
obligados, es decir: sólo se replican en células con metabolismo activo, y fuera de ellas se reducen a
macromoléculas inertes.
El tamaño y forma de los virus son muy variables. Hay dos grupos estructurales básicos:
isométricos, con forma de varilla o alargados, y virus complejos, con cabeza y cola (como algunos
bacteriófagos). Los virus más pequeños son icosaédricos (polígonos de 20 lados) que miden entre
18 y 20 nanómetros de ancho (1 nanómetro = 1 millonésima parte de 1 milímetro). Los de mayor
tamaño son los alargados; algunos miden varios micrómetros de longitud, pero no suelen medir más
de 100 nanómetros de ancho. Así, los virus más largos tienen una anchura que está por debajo de
los límites de resolución del microscopio óptico, utilizado para estudiar bacterias y otros
microorganismos.
Muchos virus con estructura helicoidal interna presentan envueltas externas (también llamadas
cubiertas) compuestas de lipoproteínas, glicoproteínas, o ambas. Estos virus se asemejan a esferas,
aunque pueden presentar formas variadas, y su tamaño oscila entre 60 y más de 300 nanómetros de
diámetro. Los virus complejos, como algunos bacteriófagos, tienen cabeza y una cola tubular que se
une a la bacteria huésped. Los poxvirus tienen forma de ladrillo y una composición compleja de
proteínas. Sin embargo, estos últimos tipos de virus son excepciones y la mayoría tienen una forma
simple.

. Replicación
Los virus, al carecer de las enzimas y precursores metabólicos necesarios para su propia
replicación, tienen que obtenerlos de la célula huésped que infectan. La replicación viral es un
proceso que incluye varias síntesis separadas y el ensamblaje posterior de todos los componentes,
para dar origen a nuevas partículas infecciosas. La replicación se inicia cuando el virus entra en la
célula: las enzimas celulares eliminan la cubierta y el ADN o ARN viral se pone en contacto con los
ribosomas, dirigiendo la síntesis de proteínas. El ácido nucleico del virus se autoduplica y, una vez
que se sintetizan las subunidades proteicas que constituyen la cápsida, los componentes se
ensamblan dando lugar a nuevos virus. Una única partícula viral puede originar una progenie de
miles. Determinados virus se liberan destruyendo la célula infectada, y otros sin embargo salen de la
célula sin destruirla por un proceso de exocitosis que aprovecha las propias membranas celulares.
En algunos casos las infecciones son ‘silenciosas’, es decir, los virus se replican en el interior de la
célula sin causar daño evidente.
Los virus que contienen ARN son sistemas replicativos únicos, ya que el ARN se autoduplica sin la
intervención del ADN. En algunos casos, el ARN viral funciona como ARN mensajero, y se replica de
forma indirecta utilizando el sistema ribosomal y los precursores metabólicos de la célula huésped.
En otros, los virus llevan en la cubierta una enzima dependiente de ARN que dirige el proceso de
síntesis. Otros virus de ARN, los retrovirus, pueden producir una enzima que sintetiza ADN a partir
de ARN. El ADN formado actúa entonces como material genético viral.
Durante la infección, los bacteriófagos y los virus animales difieren en su interacción con la superficie
de la célula huésped. Por ejemplo, en el ciclo del bacteriófago T7, que infecta a la bacteria
Escherichia coli, no se producen las fases de adsorción ni de descapsidación. El virus se fija primero
a la célula y, después, inyecta su ADN dentro de ella. Sin embargo, una vez que el ácido nucleico
entra en la célula, los eventos básicos de la replicación viral son los mismos.

-DETECCIÓN Y ENUMERACIÓN DE VIRUS

A diferencia de otros organismos vivos, los virus o viriones no crecen o se multiplican por si mismos.
Ellos necesitan infectar células para multiplicarse en el interior de las mismas utilizando su
maquinaria biosintética. Los viriones vegetales se enumeran típicamente por la determinación de
lesiones locales en la hoja, para lo cual se aplica una suspensión de viriones a una hoja junto con un
mate¬rial abrasivo que produce pequeños orificios en las pare¬des de las células vegetales. Cada
virión que penetra en la célula hospedadora inicia una lesión local que se ex¬tiende a las células
circundantes, creando una región de infección que se decolora y por ello es fácil de reconocer.
Antes de que se desarrollasen técnicas para cultivar células animales in vitro, los virus animales se
enumera¬ban habitualmente mediante la prueba de la pústula, que se realiza en embriones de pollo
en desarrollo. Una mues¬tra que contiene viriones se inyecta a un compartimiento fluido del huevo.
Estos viriones se adsorben a las célu¬las de una de las membranas internas del embrión en
de¬sarrollo, produciendo regiones de infección denominadas pústulas que se reconocen por estar
engrosadas y decoloridas

Valoración en placa
En el caso de los bacteriófagos necesitan bacterias y en el caso de virus animales necesitan células
animales. Para detectar el crecimiento de los virus se requiere previamente cultivar las células a las
que ellos infectan y dentro de las cuales se multiplican.
Unidades Formadoras de Placas (P.F.U.)
Número de bacteriófagos (o virus) viables que pueden formar placas de lisis mediante la infección y
posterior lisis de las bacterias infectadas. Al lisarse la bacteria, los bacteriófagos infectan y lisan las
bacterias inmediatas formandose un área sin crecimiento de bacterias por lisis (placas de lisis o
calvas)
Los virus animales y bacterianos se enumeran infectando células hospedadoras que están.
creciendo en una capa fina sobre un medio parcialmente solidificado con agar. En un cultivo de este
tipo, una célula infectada establece una infección, local que se va extendiendo, en donde,
dependiendo del virus que infecta, las células mueren o bien crecen anormalmente despacio. Estas
calvas , difieren en su aspecto de la capa de células circundante. Las calvas formadas por los fagos
son generalmente regiones circulares claras en una capa turbia de células denominada césped. Las
calvas que forman los virus animales pueden ponerse de manifiesto a veces después de aplicar un
colorante que tiñe a las células vivas pero no a las que han muerto a causa de la infección vírica.

CINETICA
En 1940, M. Delbrück realizó un tipo de experimento, llamado de crecimiento de escalón con el
bacteriófago T2 que ha resultado ser extremadamente útil para analizar la genética de la
multiplicación de una gran variedad de virus bacterianos y animales. El fundamento del experimento
consiste en infectar simul¬táneamente un gran número de células; las sucesivas medidas del cultivo
celular reflejan la sucesión de aconteci¬miento que ocurren cuando una sola célula sensible es
in¬fectada por un virión. En el experimento original se mez¬cló una suspensión de viriones de fago
con un cultivo denso de bacterias sensibles en una proporción tal que fuesen pocas las células que
pudiesen quedar infectadas por más de un virión. Después de un breve período duran¬te el cual la
mayoría de los virus se adsorbieron a las célu¬las hospedadoras, la mezcla se diluyó unas mil
veces, ha¬ciendo muy poco probables las posteriores colisiones vi¬rión-célula y, por consiguiente,
posteriores infecciones. A distintos intervalos de tiempo se tomaron muestras de cultivo y mediante
recuento de calvas se determinó el número de partículas de virus y de bacterias infectadas
(denominados colectivamente centros infectivos). Duran¬te un tiempo (el período de latencia) el
número de cen¬tros infectivos permaneció constante. Este número aumen¬tó repentinamente
(período de explosión) cuando las células infectadas se lisaron, liberando cada una de ellas
numerosas partículas víricas. Cuando todas las células infectadas ya se habían lisado, el número de
centros in¬fectivos volvió a permanecer relativamente constante porque los posteriores ciclos de
crecimiento estaban en gran parte impedidos por la dilución inicial del cultivo. Si se admite que la
adsorción es eficiente, es posible deter¬minar el tamaño de la explosión, o número de partículas
víricas liberadas de una sola célula infectada, dividiendo el número de centros infectivos presentes
después de la explosión por el número presente antes de ésta. Se puede obtener información
adi¬cional exponiendo brevemente cada una de las muestras a la acción del cloroformo antes de
sembrarlas para determinar el número de calvas.
El recuento de calvas tratadas con cloroformo refleja solamente el numero de partículas de fagos
presentes en la muestra. Si el experimento de crecimiento en escalón se hace exponiendo las
muestras al cloroformo antes de realizar la enumeración de calvas se pone de manifiesto una
notable característica del crecimiento los viriones, como entidades infectivas estables, desaparecen
inmediatamente después de la infección y reaparecen en gran número sólo al final del período de
latencia
El período durante el cual no es posible recuperar partículas infectivas a partir de las células se ha
denominado de eclipse. Ahora se sabe que durante la fase de eclipse es el período durante el cual
están sintetizados componentes del virus antes de su ensamble para dar viriones.
Los experimentos de crecimiento en escalón utilizarse para seguir la cinética de la síntesis de de
componentes víricos así como la de viriones intactos., podrían así analizarse muestras tomadas del
cultivo infectado para ver su contenido de ácido nucleico, proteínas víricas o de otros componentes
Si los virus lisogenicos se puede determinar realizando inmunofluorescencia mediante la utilización
de un anticuerpo especifico que reconozca alguna proteína viral como veremos más adelante.
La mediada de la infectividad de un virus es conocida como titulo que viene definido por el numero
de partículas infecciosas por unidad de volumen.
Se puede utilizar como medida de infectividad la concentración necesaria para provocar la muerte de
un animal, expresándose como la dosis a la cual se produce el 50% de la infección o muerte de los
animales inoculados (ID 50)

Cultivo puro
Para general un cultivo puro se debe partir de un clon o de una solo partícula vírica obtenida por
plaqueo o por diluciones seriadas haciendo una dilución tal que asegure que una solo célula es
infectada por 1 virus. Tras infectarse las células de alrededor y generarse una calva se pincha en
esta zona y se crece un stock puro.

VALORACIÓN DE LA ACTIVIDAD BIOLÓGICA DE VIRUS

El diagnóstico virológico tanto de virus animales como vegetales se realiza generalmente a través
diversas técnicas, pero su éxito depende fundamentalmente de que la muestra clínica sea
adecuada, obtenida en el momento preciso y procesada en las condiciones requeridas para la
técnica elegida. los virus se pueden descubrir ya sea de una forma directa o indirecta. Las pruebas
directas son las que evidencian al virus o algunos de los antígenos virales que se pueden encontrar
presentes en los tejidos o fluidos humanos. Las pruebas indirectas son las que se utilizan con más
frecuencia y básicamente demuestran un contacto del huésped con el agente viral mediante la
determinación de anticuerpos específicos contra el virus. En muchos casos el diagnóstico de
infección viral se hace por el cuadro clínico del paciente y la presencia de anticuerpos contra el
agente viral sospechoso; sin embargo, hay algunas técnicas rápidas para demostrar los antígenos
virales y también se sabe de técnicas para amplificar su material genético.
El diagnóstico virológico de laboratorio se realiza generalmente a través de tres grandes grupos de
técnicas
Estas técnicas son:
1. Aislamiento viral en un sistema huésped
2. Detección de antígenos virales
3. Serología viral
Aislamiento Viral. Una de las técnicas más utilizadas en el aislamiento del virus es la inoculación a
animales. El objetivo es producir síntomas y lesiones de la enfermedad reconocibles en un animal
susceptible, en el que se realiza la prueba. El diagnóstico de las enfermedades infecciosas está
fundamentalmente basado en el aislamiento y detección del agente infeccioso que origina la
enfermedad, o en la determinación de los anticuerpos específicos que se originan, en suero o fluidos
orgánicos. Consiste en detectar la presencia de virus infectivo vivo en muestras clínicas de
pacientes, que pueda replicar en células huésped.
Sistemas huéspedes: Las células huésped, en las que van a replicar los virus pueden provenir de
cultivos celulares, huevos embriones y animales. Actualmente los cultivos celulares son el sistema
más utilizado por su facilidad de manejo, pero por la diferente sensibilidad y cantidad de virus que
pueden estar involucrados, es posible utilizar una combinación de dos o tres tipos de células para
ampliar su espectro. La sensibilidad de los cultivos varía mucho en los distintos laboratorios. Por
ejemplo, en nuestro caso, las células de pulmón fetal humano, diploides, preparadas en nuestro
Instituto presentan mejor sensibilidad al V.R.S. que la línea continua Sep-2, que originalmente se
obtuvo comercialmente, y también estas células diploides son extremadamente sensibles al Virus
Citomegálico. Por otra parte hemos detectado Virus Parainfluenza 3 en Sep-2, que no son
recomendadas para su aislamiento. Por ello cada laboratorio de aislamiento de virus respiratorios
debe establecer su propia realidad y factibilidad. Los embriones de gallina son un excelente sistema
para aislar virus influenza, especialmente tipo A. Por este motivo, aunque en los laboratorios de
rutina no se utilicen actualmente por su costo y complicado manejo, deben mantenerse en los
centros de referencia, ya que permiten aislar cepas que posteriormente pueden ser utilizadas en la
producción de vacunas.
Los animales en general no se utilizan a no ser que se sospeche de un brote producido por un
probable virus Coxsackie A. Cualquiera que sea el sistema utilizado para el aislamiento viral, debe
finalmente complementarse con el uso de reacciones de identificación para el virus aislado. Por lo
general estas reacciones utilizan antisueros específicos y son las mismas que se mencionan en las
técnicas de diagnóstico serológico. Lo anteriormente expuesto corrobora el hecho de que el
aislamiento es un método caro, generalmente largo y que está condicionado a la existencia de
laboratorios con gran infraestructura virológica
Otro método muy utilizado para el aislamiento del virus es la inoculación de material sospechoso ó
fluidos orgánicos a cultivos celulares. Éstos pueden ser cultivos primarios ó líneas celulares
establecidas que se subcultivan periódicamente en el laboratorio. Los efectos que se podrán
producir incluyen: destrucción celular (efecto citopático en la célula infectada), proliferación o fusión
celular, alteraciones en la membrana de la célula infectada (efecto de hemoadsorción etc. ) . Para la
identificación específica de un determinado virus se aplicarán posteriormente técnicas de detección
antigénica ó de detección de material genético, sobre los cultivos infectados. En determinados tipos
de virus, como los mixovirus, virus variálicos y virus que infectan a aves, las técnicas de inoculación
a embriones son las más utilizadas.
Otras metodologías para la detección e identificación de un virus: el aislamiento del virus, son la
detección del material antigénico y la detección del material genético.

b-.Detección de material antigénico

El objetivo de estas técnicas es poner de manifiesto la presencia de proteínas específicas de un
determinado virus directamente en una muestra (órgano ó tejido) procedente de un animal infectado
ó en cultivos infectados con el material sospechoso.
Dos técnicas que se vienen utilizando son la técnica de precipitación difusión en gel de agar (PDGA)
y la Inmunoelectroosmoforesis (IEOP).Ambas técnicas se basan en la capacidad que tiene el
antígeno (presente en la muestra sospechosa) y el anticuerpo (suero control positivo frente a un
determinado virus) en inducir líneas de precipitación en medio sólido cuando están combinados en
proporciones de equivalencia. En la técnica de IEOP, la reacción se acelera aplicando corriente
eléctrica al gel en el que se encuentran al mismo tiempo el antígeno y el anticuerpo. La lectura en la
IEOP se puede realizar en media hora, mientras que en la PDGA es necesario dejar transcurrir entre
12-24 horas para la lectura de los resultados. Son técnicas fáciles de realizar pero su sensibilidad es
limitada, aunque todavía se utiliza para el diagnóstico de referencia de muchas enfermedades.
Una de las técnicas más utilizadas para la detección de antígenos virales es la Inmunofluorescencia
Directa (IFD). En esta técnica, cortes ó improntas de tejidos de una muestra sospechosa se hacen
reaccionar con un conjugado de anticuerpos específicos frente a un determinado virus marcado con
Isotiocianato de Fluoresceina. En el caso de IFD positiva, la preparación se teñirá fluorescente, con
una distribución de la fluorescencia que dependerá de cada virus en particular. Aunque esta técnica
es rápida y sencilla, la interpretación de los resultados es en ocasiones algo más complicado por la
aparición de posibles fluorescencias de tipo inespecífico que solo se llega a distinguir tras un
entrenamiento adecuado
Técnica de anticuerpos fluorescentes (TAF)
Este método revela la presencia de antígenos víricos en el interior de las células adhiriéndoles un
anticuerpo marcado fluorecesnte. Esto puede hacerse por el método directo, en el cual el propio
anticuerpo antivírico lleva el marcador fluorescente, o por el método indirecto, en el que se requieren
dos tiempos. Pri¬mero, se deja que el anticuerpo vírico específico se fije en el antí¬geno de la
muestra; luego se deja que un segundo anticuerpo contra la globulina de especie y con el marcador
fluorescente se fije en el anticuerpo primario, formando un complejo con el antígeno.
Los factores que influyen sobre la elección del método directo o el indirecto son: a) el número de
antígenos que busca el laboratorio, verbigracia, sólo un antígeno, como en los centros antirrábicos,
para lo cual conviene más un método directo; b) la necesidad de marcar múlti¬ples antisueros en el
método directo, con una disminución subsi¬guiente del título; c) pueden emplearse antisueros no
marcados para más de un fin, v.g., ELISA; d) la coloración final de preparaciones con la técnica
indirecta es 5 a 10 veces más brillainte que con la técnica directa; e) la técnica directa tiene sólo un
tiempo, y j) la preferencia personal.
Ventajas técnicas

1. La ventaja principal de la TAF es que permite detectar antígenos víricos mientras están
todavía en la célula; por tanto, se necesitan relativamente pocas células.
2. Tras la fijación, las muestras son estables y pueden enviarse sin limitaciones de tiempo.

Desventajas técnicas

1. Son indispensables los antisueros altamente específicos y buenos conjugados, que no siempre
son asequibles.
2. Se necesita un microscopio de fluorescencia, que es costoso.
3. Es necesario tener amplia experiencia.
4. Algunas muestras -v.g., mucosidad en los esputos, costras en lesiones cutáneas- dan altos
grados de reacciones no específicas
. La TAF es también adecuada para detectar IgM específica. El antígeno específico se fija en un
portaobjetos, luego se aplica el suero de prueba y se detecta la IgM aplicando una globulina-IgM
antihumana marcada con fluoresceína. Es necesario suprimir de las muestras que se analizan el
exceso de IgG específica y el factor reumatoide
Otro tipo de metodología utilizada son las técnicas de Inmunohistoquímica sobre cortes de tejido,
donde los conjugados van marcados enzimáticamente con Peroxidasa ó Fosfatasa alcalina. Este
tipo de metodologias son también aplicables sobre cultivos celulares infectados con macerados de la
muestra sospechosa.
Una técnica muy sensible y muy utilizada entre los años 60 y 80 fué el Radioinmunoensayo (RIA).
En esta técnica, el material antigénico se fija a una fase sólida y se le hace reaccionar con
anticuerpos específicos marcados radiactivamente con I 125. La emisión de cuentas radiactivas
pondrá de manifiesto si la reacción antígeno-anticuerpo ha tenido o no lugar.
variantes a esta técnica serían el RIA Sandwich y RIA de competición. Los inconvenientes de estas
técnicas están en la necesidad de un equipamiento e infraestructura compleja debido a la utilización
de isótopos radiactivos. Por ello, cada vez más. esta técnica se ha ido sustituyendo por técnicas
similares que utilizan conjugados marcados enzimáticamente.
Es precisamente el Enzimoinmunoensayo ELISA la técnica que por su sencillo manejo y alta
sensibilidad, reproducibilidad y rapidez ha ido sustituyendo al Radioinmunoensayo. En el ELISA, la
reacción positiva se pone de manifiesto por la aparición de color, que puede ser medido por
espectrofotometría ó visualmente.
Existen dos modalidades del ELISA muy utilizadas para la detección antigénica. El ELISA directo,
donde el material antigénico se fija al soporte sólido (placa de poliestireno), para hacerlo reaccionar
con el conjugado de anticuerpos específicos marcados enzimáticamente (peroxidasa o fosfatasa
alcalína) y el ELISA sandwich, donde anticuerpos específicos (monoclonales ó policlonales) se fijan
primeramente a la placa, para hacerles reaccionar con la muestra sospechosa y posterior revelado
con el conjugado enzimático. Los conjugados que se utilizan pueden ser anticuerpos policlonales
marcados enzimátícamente ó anticuerpos monoclonales, de gran especificidad, que van dirigidos
frente a una determinada proteína viral y evitan posibles reacciones de tipo inespecífico, más
frecuentes con el uso de los anticuerpos policlonales.
Una técnica desarrollada recientemente de gran sensibilidad es la Inmunoadsorción. Esta técnica es
similar al ELISA y utiliza como fase sólida no una placa sinó filtros de diferente naturaleza; los más
utilizados son los de nitrocelulosa.
En esta técnica el antígeno, macerado ó sobrenadantes de cultivos celulares inoculados con el
material sospechoso, se filtra a vacio, a través del filtro, quedando adherido al mísmo el material
antigénico para sobre él realizar la reacción inmunológica.

En el método ELISA más comúnmente empleado para la detección de antígenos se utiliza una capa
de anticuerpo de «captura» sobre una fase sólida para fijar el antígeno. Se detecta luego el antígeno
mediante un anticuerpo específico marcado con enzima o se utiliza aquél para absorber el
anticuerpo específico, que a su vez es detectado mediante una globulina antiespecie marcada con
enzima. Después que el anticuerpo marcado con enzima y no combinado ha sido eliminado por
medio de lavado, se agrega el sustrato apropiado para la reacción enzimática. Se obtienen
productos del desdoblamiento enzimático y aparece el color que puede evaluarse a simple vista o
cuantificarse con un espectrofotómetro.
Cuando se emplea la ELISA para la detección de la IgM, el método consiste en utilizar la anti-IgM
como «capa de captura» a la cual se agrega el suero de prueba y el antígeno específico, y,
finalmente, el sistema de detección (antiglobulina marcada con enzima y sustrato). Esta técnica
resuelve el problema del exceso de IgG específica pero no elimina completamente la reacción
positiva falsa causada por el factor reumatoide. Este último problema puede superarse utilizando un
antígeno específico marcado con la enzima. Los anticuerpos específicos IgG son detectados
empleando el antígeno como «capa de captura
Ventajas técnicas
1. Los reactivos son relativamente estables.
2. El color producido en la reacción puede leerse a simple vista cuando no se dispone de equipo
complicado.
3. Pueden examinarse grandes cantidades de muestras al mismo tiempo.
Desventajas técnicas
1. El procedimiento es relativamente complicado y consume mucho tiempo.
2. Las placas de plástico pueden ser inadecuadas por producir efectos estáticos.
3. Los sustratos cromógenos pueden ser carcinógenos o mutágenos
4 Se necesita un espectrofotómetro para aumentar la sensibilidad de la prueba

Prueba radioinmunológica de fase sólida (SPRIA)

Como en otras pruebas de fase sólida, el método comprende un sustrato, sea la superficie de una
celdilla de placa de microtitulación, sea una perla de plástico a la que se adhiere el anticuerpo de
«captura». La muestra para prueba se agrega y el antígeno absorbido a esta capa se detecta,
habitualmente por medio de un anticuerpo marcado con 1251
Ventajas técnicas
1. SPRIA es la más, sensible de las pruebas examinadas en esta sección.
2. El método parece ser más complicado que otros, pero no es difícil si se presta atención a los
detalles.
Desventajas técnicas
1. Se necesitan equipo y reactivos costosos. -
2. Los reactivos duran poco en el laboratorio y: ofrecen un riesgo biológico por la radiactividad
Visualización de la partícula viral

Microscopía de luz. Se efectúa mediante tinciones especiales, generalmente son coloraciones con
Wright o Giemsa en extendidos provenientes de lesiones vesiculares donde se visualizan las
inclusiones o los cambios celulares ocasionados por la invasión viral. Un ejemplo de esto lo
constituye el estudio de inclusiones producidas por el citomegalovirus (CMV) en sedimento urinario y
la prueba de Tzank para observar las células infectadas por herpes (o varicela zóster), para ésta se
hace un raspado de la base de las vesículas y después de fijarla con metanol, se hace la tinción y se
observan las células, que se tornan agrandadas, con múltiples núcleos y un citoplasma que se tiñe
de oscuro además de inclusiones intranucleares eosinofílicas. La sensibilidad de esta técnica
depende de su preparación, tinción y la experiencia del observador, generalmente es menor que la
de la inmunofluorescencia y el cultivo viral1,6

Microscopia electrónica
Permite visualizar la partícula viral debido a la gran resolución del microscopio electrónico. Para este
fin se utilizan dos tinciones especiales con sales de metales pesados como el uranio o el tungsteno.
La primera es la tinción negativa donde el acetato de uranilo forma una especie de molde viral que
permite detallar la estructura del virus. La segunda tinción es la del sombreado, donde las partículas
virales se ponen en un ángulo donde el metal que se utiliza en ella se deposita sobre el virus pero no
sobre su sombra y sólo se visualiza lo que no se ha cubierto con el metal. Esta técnica no revela las
estructuras internas del virus sino su forma y dimensiones. El uso de equipo especializado y costoso,
el elevado nivel técnico que requiere, la baja sensibilidad cuando hay un bajo número de partículas
virales y el hecho de que en algunos casos la morfología per se no es suficiente para un diagnóstico
viral definitivo, hacen que este sistema sea poco usado y sólo se emplee a nivel investigativo o
académico. La microscopía electrónica se ha utilizado para el diagnóstico del agente Norwalk,
adenovirus entéricos, calicivirus, astrovirus y coronavirus en materia fecal así como de otros virus
para los cuales no se tiene disponibilidad de otras pruebas diagnósticas comerciales o aquellos que
no son cultivables5
El procedimiento consiste en mezclar la suspensión que contiene el virus con un colorante denso en
electrones, y dejar que una gota de esta mezcla se seque en una rejilla. La técnica puede
practicarse en unas cuantas horas o incluso en minutos según que el virus requiera o no
concentración. El uso de la microscopia inmunoelectrónica (MIE) aumenta la sensibilidad del método
y permite la identificación serológica de un virus. Este método se funda en la agregación de
partículas víricas con anticuerpos específicos, lo que da por resultado una detección más fácil y más
clara mediante la microscopia electrónica
Ventajas técnicas
1. La muestra se examina directamente sin tiempos preparatorios complicados.
2. La sensibilidad y la rapidez son buenas.
Desventajas técnicas
1. Se requiere equipo costoso y un operador experimentado.
2. Sólo puede examinarse un número limitado de, muestras en cada vez.

C-.DETECCIÓN DE MATERIAL GENÉTICO

Otras metodologías muy utilizadas en los últimos años para la identificación de un virus son las
técnicas basadas en la detección del ácido nucleico viral. Las técnicas de hibridación molecular son
muy sensibles y permiten la detección del DNA ó RNA viral en pocas horas. Son además muy útiles
como alternativa en aquellos casos donde no es posible el aislamiento o detección del virus, bien por
tratarse de infecciones latentes, como en las infecciones por herpesvirus, ó en enfermedades donde
la alta producción de anticuerpos frente al virus da lugar a la formación de inmunocomplejos,
impidiendo la detección de los antígenos virales.
Para su realización, las muestras deben procesarse primero para la extracción del DNA ó RNA viral
mediante un método sencillo, que consiste en un tratamiento con detergentes y extracciones con
fenol. La fase acuosa donde se encuentra el material genético se filtra entonces a través de un filtro
de nitrocelulosa donde queda retenido y listo para reaccionar con las sondas radiactivas. Estas
sondas radiactivas consisten en un plásmido que lleva inserto un fragmento del genoma de un
determinado virus. Estos plásmidos se marcan radiactivamente quedando listos para ser utilizados
en las técnicas de hibridación. Tras la incubación de la sonda con el DNA ó RNA presente en el filtro,
la hibridación será positiva si se produce la hibridación entre secuencias complementarias de
nucleótidos, apareciendo en el filtro una señal radiactiva. Las sondas también pueden utilizarse
marcadas con biotína, aunque su sensibilidad es algo más baja. Otro método utilizado para la
detección del genoma viral es la hibridación "in situ" sobre cortes de órganos ó tejidos de animales
infectados, en la cual la detección del ácido nucleico viral se realiza directamente sobre la célula
infectada, utilizando plásmidos marcados radiactivamente o más frecuentemente marcados con
biotina.

En los últimos años y gracias a la aplicación de una técnica revolucionaria: la técnica de PCR
(Polimerasa Chain Reaction) la detección de DNA ó RNA viral mediante PCR ó RT-PCR se está
convirtiendo en un método rutinario para el diagnóstico virológico y de confirmación. Esta técnica
permite la amplificación del genoma viral en horas, en muestras donde antes no podrá ser detectado
al existir pocas copias. Tras la amplificación, la identificación se realiza por el tamaño de la muestra
amplificada, mediante electroforesis en geles de agarosa. En la actualidad la técnica de PCR se está
adaptando ya en algunas enfermedades para su realización en placas microtiter. La técnica de
ELISA-PCR permite el procesamiento de un mayor número de muestras simultáneamente, a la hora
de la extracción del ácido nucleico, evitando la purificación directa del mismo. Se esta adaptando
también y en un futuro muy próximo se dispondrá de técnicas estandarizadas de ELISA-
PCRfluorescente, que permitirá visualizar las muestras PCR positivas por la emisión de
fluorescencia, sin tener que recurrir como hasta ahora a la realización de geles de agarosa para
visualizar los resultados de la amplificación.

DIAGNÓSTICO SEROLÓGICO
Para la mayoría de las enfermedades infecciosas, las técnicas serológícas constituyen la base del
diagnóstico laboratorial en las campañas de control y erradicación. La presencia de anticuerpos
específicos frente a un virus, en un animal significa que éste ha estado en contacto con el virus (o
antígenos virales) bien por una infección o por vacunación.
El nivel de anticuerpos específicos frente a un determinado virus en diferentes periodos de tiempo es
muy significativo del momento inmunológico en que éste se encuentra. Así, un nivel creciente de
anticuerpos demuestra que se está venciendo una infección en curso o un programa de vacunación,
mientras que niveles bajos y de tendencia decreciente puede indicar anticuerpos residuales de
infección o vacunación.

Existen un gran número de métodos de diagnóstico para la detección de anticuerpos específicos

frente a un virus. Estos podrían agruparse en reacciones de neutralización, reacciones de
precipitación, reacciones de aglutinación y fijación de complemento, y reacciones que utilizan
reactivos marcados.
Las reacciones de neutralización son muy importantes en el diagnóstico serológico de las
enfermedades víricas. Estas consisten en valorar la capacidad que poseen los anticuerpos
presentes en un suero, de neutralizar la infección de un virus "in vitro". Son técnicas muy sensibles y
en la mayoria de los casos se obtiene buena correlación entre estos valores y los niveles de
protección "in vivo". Las pruebas de neutralización se pueden realizar sobre animales vivos, o más
generalmente sobre cultivos celulares. Para ello se precisa de un virus perfectamente valorado del
que se conozcan sus diferentes grados de neutralización, de un suero control valorado previamente,
y de un animal o cultivo celular sensible al virus. En cultivos celulares, el grado de neutralización de
la infección se mide generalmente por la no aparición del efecto cítopático en las células. En el caso
de aislados virales no citopatogenicos se tienen que aplicar técnicas de detección de antigenos
virales para comprobar que la neutralización del virus ha tenido lugar.
Las reacciones de precipitación están basadas en la capacidad que tienen el antígeno y el
anticuerpo cuando se combinan en proporciones de equivalencia, de unirse e inducir líneas de
precipitación en medio sólido. Estas técnicas están ampliamente extendidas en todos los
laboratorios, destacando la técnica de precipitación difusión en gel de agar (PDGA) y la técnica de
Inmunoelectroosmoforesis (IEOP) o electroforesis en contracorriente, entre 10 a 20 veces más
sensible que la anterior, donde la reacción de precipitación se acelera por aplicación de una
corriente eléctrica. En los últimos años, el desarrollo de técnicas más rápidas, sensibles y
específicas, como las técnicas inmunoenzimáticas ha provocado en gran medida que estas técnicas
no sean ya aplicadas para el diagnóstico de rutina muchas enfermedades víricas, recomendándose
únicamente para "screening" de grandes grupos, pero no para el análisis de animales individuales.

Reacciones de aglutinación y fijación de Complemento: La detección de anticuerpos se puede

también realizar con otras técnicas como la hemaglutinación, con niveles de sensibilidad más altos a
los conseguidos en las técnicas de precipitación. La hemaglutinación se basa en la capacidad de los
anticuerpos (anticuerpos aglutinantes) de aglutinar eritrocitos.
Esta técnica no es posible utilizarla frente a todas las enfermedades víricas, debido a que en todas
las enfermedades no se inducen anticuerpos aglutinantes. Sin embargo, en muchos casos se puede
realizar la unión de un antigeno viral a los eritrocitos simplemente por adsorción Hemoadsorcion o de
forma covalente, lo que permite utilizar entonces esta técnica para el diagnóstico de muchas
enfermedades. La unión del antígeno a la superficie del eritrocito se puede realizar con agentes
como cloruro crómico, ácido tánico, glutaraldehido etc. Las ventajas en el uso de los eritrocitos es
clara por su disponibilidad, sensibilidad como indicador, y capacidad de almacenaje, tras sencillos
tratamientos con formalina o glutaraldehido. La hemoadsorción. Consiste en que cuando el virus
infectante incorpora proteínas virales con propiedad de hemaglutininas en la membrana celular, las
células infectadas se pueden descubrir por la adsorción de eritrocitos de ciertas especies animales,
que se puede observar al microscopio de luz.. Es el caso de los ortomixovirus y paramixovirus que
se pueden reconocer por la hemadsorción de eritrocitos de cobayo a las células; la identificación se
confirma con la inmunofluorescencia directa mediante anticuerpos específicos
otra técnica basada en reacciones de aglutinación, es la técnica de Latex, similar a la anterior donde
en lugar de eritrocitos se utilizan particulas de latex recubiertas de antígenos.
El Complemento es uno de los mecanismos efectores humorales de destrucción de tejidos, inducido
por inmunocomplejos. La técnica de fijación de Complemento se basa en que las reacciones
antigeno-anticuerpo conducen a la formación de inmunocomplejos que provocan la fijación del
Complemento, y por tanto su consumo, que puede ser cuantificado, si se utiliza en la misma
reacción un sistema hemolítico (eritrocitos y anticuerpos antieritrocitos). Cuanto mayor sea la unión
antígeno- anticuerpo problema, se consumirá más complemento, y por tanto menos quedará para
unirse al sistema hemolítico y menor hemolisis se producirá.

Hemaglutinación inversa pasiva (RPHA)

Puede lograrse que los virus que no hemaglutinan de manera na¬tural produzcan modalidades
hemaglutinantes si los hematíes utiliza¬dos se recubren con anticuerpo específico para el virus. Este
método requiere que el anticuerpo unido a eritrocitos fres¬cos o el anticuerpo unido a eritrocitos
fijados puedan ser liofilizados. La prueba suele practicarse mezclando muestras y eritrocitos
recu¬biertos con anticuerpo y dejándolos reposar durante algún tiempo. Los resultados se
interpretan exactamente de la misma manera que en una prueba clásica de hemaglutinación.
También se ha utilizado una variante de la RPHA, la agregación en fase sólida (10) de eritro¬citos
acoplados (SPACE). Este método permite aplicar la hemaglutinación pasiva en muestras sucias que
no serían adecuadas para la prueba ordinari
ventajas
1. La prueba es rápida y de fácil ejecución. 2. Los reactivos son de bajo costo.
3. No hay riesgos biológicos que acompañen a ninguno de los reactivos.
4. No se necesita equipo costoso.
desventajas
1. Los hematíes frescos duran poco en el laboratorio.
2. Los antisueros deben ser de título alto
3. Las desventajas son semejantes a las de la ELISA, pues el plástico de la fase sólida puede
introducir problemas de absorción estática.

Hemólisis radial simple (SRH)

La prueba se utiliza principalmente para la de¬tección rápida de anticuerpos. El antígeno vírico se
absorbe a los eritrocitos de manera natural (mezclando e incubando) o mediante enlace químico
(con adición de CrCl2). Se suspenden luego esos eri¬trocitos en gel de agar y se vierten en placas
de Petri o en portaobje¬tos y se dejan asentar. Las placas están listas para usarse cuando se ha
cortado una serie de celdillas de unos 2 mm de diámetro. Se in¬corpora en el gel o se agrega
ulteriormente el complemento de suero completo
Ventajas técnicas
1. No se necesita equipo complicado.
2. Pueden obtenerse resultados cuantitativos precisos en una sola dilución de suero midiendo el
diámetro o la superficie de la zona de hemólisis.
3. No es necesario eliminar del suero los inhibidores no específicos.
4. Para la prueba se necesita una pequeña cantidad (unos 5 ul) de suero.
Desventajas técnicas
1. Se necesita una cantidad considerable de antígeno de alto título para unir los eritrocitos.
2. Los reactivos son de difícil normalización

Prueba inmunológica en capa delgada (TIA)

Esta prueba es una técnica elaborada recientemente para detectar la reacción antígeno-anticuerpo.
Se funda en que las globulinas pueden absorberse en capa delgada sobre una superficie de
poliestireno. Esa superficie revestida de antígeno tiene las características de un inmunoabsorbente
que es capaz de fijar antígenos. La interacción antígeno-anticuerpo se hace visible cuando se
expone la superficie al vapor de agua. Una superficie sobre la que ha tenido lugar una reacción
antígeno-anticuerpo es hidrofílica (grandes gotas de agua) en contraste con el fondo, que es
hidrofóbico (gotas de agua diminutas). A simple vista se reconoce fácilmente la diferencia de tipos de
condensación y para ello no se necesita un equipo refinado de laboratorio. Sin embargo, la
sensibilidad del método parece ser baja y está por demostrarse su utilidad.

Reacciones con reactivos marcados:

1. La Inmunofluorescencia indirecta es una técnica muy utilizada en el diagnóstico serológico ,
relativamente rápida y sencilla, que combina la sensibilidad de las técnicas histológicas con la
sensibilidad de las muestras inmunológicas. Para su realización se emplean cultivos celulares
infectados con un determinado virus, fijados en portas o cámaras lab-tek, sobre los cuales se añade
el suero o liquido orgánico procedente del animal sospechoso. Tras un periodo de incubación, las
preparaciones se lavan y se revelan con un conjugado de anticuerpos anti-especie marcados con
isotiocianato de fluoresceína (FITC), o en el caso de sueros porcinos o de conejo, también se puede
utilizar proteína A /FITC, con la que se obtienen menos fondos inespecíficos. En el caso de las
muestras positivas sobre el tapiz celular se localizan fluorescencias cuya distribución dependerá de
cada virus en particular.

2. El Radio inmunoensayo es una técnica muy sensible que permite la detección tanto de antígenos
como de anticuerpos especificos. Existen varias modalidades de ensayo, siendo de entre ellas el
método indirecto, el más utilizado para la detección de anticuerpos. Para su realización, se realiza
primeramente la unión de un antígeno a una fase sólida (tubo o placa microtiter) sobre la que se
añade el suero problema. Tras una incubación y posterior lavado se añaden anti-inmunoglobulinas
marcadas con un isótopo radiactivo, generalmente Iodo-1125. El principal inconveniente de esta
técnica es la utilización de material radiactivo. Este hecho, junto con el desarrollo de técnicas que
utilizan conjugados marcados enzimáticamente de. igual sensibilidad, ha llevado a limitar su
utilización en el diagnóstico de rutina.

3. La técnica inmunoenzimática ELISA es una técnica muy sensible y específica, que permite
realizar en muy poco tiempo estudios sobre grandes poblaciones, de manera sencilla y económica.
Presenta además una buena reproducibilidad y facilidad en la interpretación de los resultados.
Existen un gran número de modalidades de ensayo, siendo el Elisa indirecto, El Elisa indirecto de
competición y el Elisa sandwich de competición los más utilizados para la detección de anticuerpos
específicos frente a un determinado virus.
En el Elisa indirecto sobre la superficie sólida se fija el antígeno, sobre el cual se añadirá
posteriormente el suero problema. Tras un periodo de incubación y lavado, se añade un conjugado
anti-especie marcado con una enzima (generalmente peroxidasa, o fosfatasa alcalina) o proteína A
marcada. La reacción se revela añadiendo un sustrato específico del enzima que reaccionará con
ésta produciendo color. Este color será mayor cuanto mayor sea la cantidad de anticuerpos unida al
antígeno. En el Elisa indirecto de Competición el conjugado, que consiste en anticuerpos específicos
anti-virus (generalmente anticuerpos monoclonales) marcados enzimáticamente, se añade
generalmente al mismo tiempo o tras la incubación del suero problema, para "competir" en la unión
al antígeno fijado a la placa. Al adicionar el sustrato del enzima, si se produce una reacción
coloreada será indicativo de que el conjugado , y no los anticuerpos del suero, se han unido al
antígeno, y por tanto el diagnóstico para el suero será negativo. En el Elisa sandwich sobre la fase
sólida se fijan anticuerpos policlonales o monoclonales anti-virus. Posteriormente, se añade el
antígeno específico que se incuba un tiempo para permitir su unión. Seguidamente se añade el
suero problema. Tras la incubación y lavado, se adiciona el conjugado de anticuerpos anti-especie
marcado con la enzima, y se revela la reacción añadiendo el sustrato. En el Elisa sandwich de
competición en fase líquida, primeramente se realiza una incubación previa del suero problema con
el antígeno. Posteriormente esta mezcla se añade a la placa y se incubará un tiempo determinado
para permitir la unión del antígeno a los anticuerpos específicos fijados en la placa.
Simultáneamente o con posterioridad se adiciona el conjugado de anticuerpos específicos,
generalmente anticuerpos monoclonales, marcados enzimáticamente. Si la reacción entre los
anticuerpos del suero problema y el antígeno ha tenido lugar (caso de los sueros positivos), el
antígeno no se fijará al anticuerpo de captura. Al adicionar el conjugado éste no se podrá unir y al
añadir el sustrato no se producirá color (diagnóstico positivo). Si por el contrario no se produce la
unión entre los anticuerpos del
suero problema (caso de los sueros negativos), el antígeno se fijará a la placa y poseerá epítopos
libres que reaccionarán con el conjugado, éste quedará unido y tras el revelado se obtendrá color
(diagnóstico negativo).. En general, cuando se realiza un diagnóstico donde es necesario no solo la
detección de anticuerpos específicos, sinó también diferenciar entre anticuerpos producidos por
cepas vacunales y cepas de campo (ej. el virus de la enfermedad de Aujeszky...), o entre dos virus
serológicamente muy relaccionados ( ej. virus de Peste porcina clásica y diarrea vírica bovina; o
entre virus de enfermedades vesiculares...) son los Elisas de competición los utilizados, empleando
para ello en el primer caso anticuerpos monoclonales diferenciales de la cepa vacunal, y en el
segundo anticuerpos monoclonales diferenciales de cada virus en particular.

4. Una técnica desarrollada en los últimos años, y utilizada principalmente para el diagnóstico
serológico de confirmación de lo casos dudosos o positivos es la técnica de "Immunoblotting" (IB) .
El IB es una técnica inmunoenzimática que utiliza como soporte antigénico filtros de nitrocelulosa,
donde las proteínas virales han sido previamente transferidas. Es una técnica muy sensible, de fácil
manejo y ejecución, que no necesita de aparataje especial para su realización. Otra gran ventaja de
esta técnica es la conservación de los reactivos a temperatura ambiente, sin pérdida de actividad,
durante al menos seis meses, lo que permite el envió de los mismos con total seguridad.
Para la obtención de los filtros antigenados, A partir de una extracto viral las proteínas son
separadas primeramente mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y
transferidas a continuación mediante corriente eléctrica al filtro de nitrocelulosa. Este filtro es
recortado en pequeñas tiras, que constituirán el soporte de tiras antigenadas. después se pone a
reaccionar el suero del paciente donde se encuentran los anticuerpos específicos para las proteínas
virales que se hallan en la membrana y después de un lavado, se aplica el conjugado que es un
antianticuerpo marcado con peroxidasa de rábano, se incuba, se lava y posteriormente se adiciona
el sustrato enzimático. Una reacción de unión antígeno y anticuerpo se observará como una banda
de color café que hace evidente la unión de los anticuerpos que reaccionaron con la proteína que
migró en ese sitio. Al comparar con un control se ubica y se determina el tipo de proteína para la
cual hay antígenos específicos; de esta forma se puede definir exactamente contra cuáles proteínas
están dirigidos los anticuerpos del paciente y asimismo determinar la fase de la infección en que se
encuentra. Esta prueba es muy específica y se utiliza como suplementaria y confirmatoria en
infección por el VIH o HTLV-I cuando ELISA da resultados contradictorios o difíciles de interpretar.
También se utiliza para diferenciar entre infección por VIH1 y VIH2. En estos momentos se emplea
en muchos laboratorios clínicos y de referencia
Más recientemente, se ha desarrollado la técnica DIA ("Dot immunoassay") para la detección de
anticuerpos basada en la técnica de enzimoimmunoadsorción. En el DIA, el antígeno va adsorbido a
un soporte de papel, generalmente nitrocelulosa, sobre el que se añade el suero problema.
Posteriormente se realiza el revelado añadiendo el conjugado de anti-inmunoglobu linas marcadas y
el sustrato. La técnica de DIA posee una alta sensibilidad y especificidad y es aplicable en
condiciones de campo. Su utilización no requiere de equipamiento, los resultados obtenidos son
fáciles de interpretar y ofrece un diagnóstico rápido ya que puede realizarse en muy poco tiempo a
temperatura ambiente.
5. Por último, en los casos de mayor conflictividad, los laboratorios que disponen de equipamiento e
instalaciones específicas, pueden utilizar la técnica de radioinmunoprecipitación. En esta técnica, los
sueros sospechosos se hacen reaccionar con antígenos virales marcados radiactivamente. Tras la
reacción y posterior precipitación de los inmunocomplejos con Staphiloccus aureus, las muestras se
solubilizan y se someten a electroforesis en SDS-PAGE. Las bandas de proteínas específicas
reaccionantes se visualizan por autoradiografía.

Ejemplo de diagnosis en plantas

Durante los últimos años, varios métodos de diagnóstico serológico han sido desarrollados o
adaptados con la finalidad de detectar rápidamente al virus de la tristeza de los cítricos (citrus
tristeza virus, CTV) y sustituir el diagnóstico biológico clásico con la planta indicadora Citrus
aurantifolia (Christm.) Swing. (limonero criollo) (5). Esta planta, a pesar de ser muy sensible, en
ocasiones detecta con dificultad o incluso no detecta patotipos débiles del virus (4). Además,
presenta otros inconvenientes como es la lentitud del diagnóstico, ya que tarda en manifestar los
síntomas de aclaramiento en las nervaduras y acanaladuras en los tallos (7.21). Esto dificulta su uso
a gran escala e involucra un elevado costo económico, además de la dificultad que presenta a la
hora de su aplicación a tejidos vegetales cultivados in vitro (5).
La técnica de inmunodifusión doble en agar fue puesta a punto y aplicada para la detección del CTV
a finales de la década de los 70 (6, 13, 15, 24). Paralelamente, se perfeccionó la técnica de
inmunofluorescencia indirecta sobre cortes histológicos de pecíolos de hojas y brotes jóvenes de
Citrus, lo cual constituyó un aporte de interés (30). Un avance significativo lo constituyó la
adaptación de la técnica inmunoenzimática ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) (2). La
primera aplicación se realizó mediante el método ELISA-DASI. Este método fue perfeccionado
posteriormente, utilizando inmunoglobulinas de conejo y de huevo de gallina inmunizada con CTV
(3). ELISA ha sido particularmente útil en los muestreos a gran escala y ha introducido nuevas
posibilidades para el estudio y control de la enfermedad (12, 22, 25).
La inmunoelectro-microscopía (9) fue adaptada para la detección del CTV. De esta manera se ha
logrado combinar el poder de resolución que ofrece la microscopía electrónica con la especificidad
de la serología. El método del radio inmuno ensayo (RIA) también fue aplicado al diagnóstico del
CTV y comparado con la técnica ELISA (19). Esta técnica posee la desventaja de utilizar productos
radiactivos potencialmente peligrosos y equipos costosos (5). Todos estos estudios han utilizado
antisueros policlonales. No obstante, recientemente, a través de la obtención y cultivo de hibridomas,
se han obtenido anticuerpos monoclonales para virus pertenecientes a diferentes grupos (10, 11, 16,
17, 18, 27, 31).
Avances en el desarrollo de metodologías sencillas. En 1987 se logró la purificación parcial del virus
del mosaico enanizante del maíz raza venezolana (MDMV-V), homogeneizando tejido foliar con una
solución amortiguadora más un antioxidante y 5 % de cloroformo. Posteriormente, fué precipitado
con polietilenglicol (PEG) y NaCl, y sometido a centrifugaciones en gradientes de sacarosa (14).
Paralelamente, ese mismo año, se obtuvo un antisuero contra el virus del mosaico severo del frijol
(VMSF) modificándose un esquema de purificación ya conocido (1) y adaptándolo a ciertas
limitaciones de laboratorio. El suero obtenido fue saturado con proteínas de plantas sanas extraídas
siguiendo el mismo esquema de purificación mencionado. Presentó un título en pruebas de difusión
doble en agar de 1:512 y no se diferenció de otro proveniente de Perú (serotipo III) al reaccionar con
aislamientos autóctonos de VMSF, pero si fue diferente al de Brasil (serotipo II) (1). En 1989 es
propuesto un método fácil para obtener antisueros útiles en pruebas de inmunodifusión doble en
agar, adaptable a diferentes virus vegetales . Se indica que un esquema de preparación de
antisueros se desarrolló para un virus altamente inmunogénico con partículas poliédricas, el VMSF, y
un potyvirus que afecta caraotas (Phaseolus vulgaris L.), pobremente inmunogénico. Más
recientemente, otra metodología sencilla para la obtención de antisuero contra el virus del mosaico
sureño de la caraota ha dado buenos resultados.
En la busqueda de métodos sencillos y rápidos, en 1989 se desarrolló un método para la producción
de antisuero altamente específico al CTV, utilizando un equipo de bajo costo . De esta manera, a
partir de corteza de cidra 'Etrog' infectada con aislamientos originarios de California, EE.UU., aplican
un procedimiento de purificación fundamentado básicamente en la concentración de las partículas
virales a través de precipitación doble con PEG y colecta del precipitado con la ayuda de
centrifugación a baja velocidad y la separación de la cubierta protéica en subunidades a través de
electroforesis en geles de poliacrilamida con sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE). El componente CP1
de la cubierta proteica viral fue cortado directamente en el gel, suspendido e inyectado
intramuscularmente en conejos y gallinas; la inmunoglobulina fue recuperada a partir de la sangre de
conejos y del amarillo del huevo. El antisuero obtenido fue probado utilizando la técnica ELISA. A
juicio de estos investigadores, este método ofrece las siguientes ventajas:
a) una virtual eliminación de reacciones no específicas en las placas de ELISA, haciendo al
antisuero comparable en este sentido con anticuerpos monoclonales;
b) requiere facilidades mínimas ya que no necesita del apoyo del microscopio electrónico,
ultracentrífugas, etc.;
c) el antisuero presenta títulos altos, particularmente cuando se trabaja con gallina;
d) grandes volúmenes de antisuero son recuperables del amarillo de los huevos de gallina
empleando la metodología de Polson et al. ;
e) la metodología es simple, ya que el antigeno puede ser preparado en un día y una vez preparado
puede ser almacenado bajo congelación por largos períodos de tiempo

CONCLUSIONES
Las pruebas de diagnóstico viral se han desarrollado de manera importante en los últimos años,
nuevas técnicas más rápidas, simples, poco costosas, sensibles y específicas se ofrecen hoy en día,
sin embargo, la evaluación de éstas siempre se debe hacer con base en los «estándares de oro»
(como los cultivos y la fijación de complemento, etc.) y de acuerdo con una adecuada correlación
clínica. La disponibilidad de estas pruebas se debe acompañar de una óptima realización a nivel
técnico, y una adecuada recolección y almacenamiento de la muestra, además de una interpretación
acertada. La demostración directa de antígenos tiene valor en el diagnóstico, pronóstico y
seguimiento de la infección así como en el tratamiento médico y es indicador importante de infección
activa. Sin embargo, en algunos casos la concentración del antígeno puede no ser suficiente para su
descubrimiento. Por otro lado, la determinación de anticuerpos es útil particularmente cuando no se
tiene la posibilidad de realizar una demostración directa de antígeno o en caso de ser negativa a
pesar de la sospecha clínica o porque haya pasado la fase aguda de la infección. Estos casos
constituyen un complemento para determinar el diagnóstico de una enfermedad. Las pruebas
indirectas o de anticuerpos también son importantes para establecer los antecedentes de infección
viral en la historia clínica de un paciente y en una comunidad y son claves en definir el modelo de
diseminación de un serotipo determinado. Sin embargo, deben tenerse criterios muy definidos para
la interpretación de un título de anticuerpos y esto depende del tipo de la infección, la naturaleza del
virus, la clase de anticuerpos y la condición del huésped. Para la interpretación de los títulos de
anticuerpos se deben tener en cuenta algunas guías:
a. Los cambios en el título de anticuerpos sólo se pueden interpretar cuando se hayan hecho con la
misma técnica;
b. Debe evitarse en lo posible interpretar un solo título alto de anticuerpos como indicativo de
infección activa o aguda;
c. La caída de los títulos suministra poca información, sólo que la infección ha ocurrido pero no en
qué momento;
d. Un aumento significativo en el título de anticuerpos en sueros pareados (agudo y convaleciente)
se puede utilizar para el diagnóstico. Un suero agudo se obtiene durante la fase aguda de la
enfermedad y se debe comparar con un suero convaleciente que se debe tomar a las dos semanas
cuando la fase aguda ya se ha resuelto. Una diferencia de 4 títulos es significante y puede indicar
presencia de infección activa; esto es lo más indicado para el diagnóstico, pues una sola muestra de
suero es muy difícil de interpretar
Las pruebas moleculares son una alternativa útil en el diagnóstico viral y su desarrollo es cada vez
más amplio, sin embargo son costosas y requieren altos niveles de entrenamiento y estandarización
que hacen que su puesta en marcha en el medio nacional se realice en forma progresiva y lenta, no
obstante la necesidad de tenerlas disponibles.
Sin embargo, es importante recordar que, a pesar de la escasa disponibilidad de las pruebas más
avanzadas de diagnóstico viral, la utilización, realización e interpretación adecuada de los métodos
de laboratorio accesibles dentro del contexto clínico del paciente, pueden ofrecer un óptimo
diagnóstico e instaurar las medidas profilácticas o terapéuticas necesarias
Bibliografia y links de interes Microbiología
R.Stanier, J. Ingraham, M. Wheelis, P. Painter. segunda edición editorial reverte

MÉTODOS DE DIAGNOSTICO VIRAL

Dra. Marisa Arias INIA, Centro de Investigación en Sanidad Animal, Valdeolmos Madrid.
http://www.bago.com/Bolivia/html/doc_pdf/dengue.pdf
http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/MBAyC/protocol/bacteriofago/bacteriofago3.html