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Labo 8

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Informe 7 BQ
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PRÁCTICO 8-9Electroforesis en gel depoliacrilamida al 12%, continción Nitrato de plata
Integrantes: Docentes:Felipe Cayumil Dr. Reginaldodel Pozo, PhD Jaime Hernández Bq. JavierGrandónKarol González Bq. MirnaMuñoz Javiera León QA. GermánRotterPatricia LobosMitchel Manterola
 
Muestra problema n°2Fecha de realización: 19/08/2009 Fecha de entrega:24/09/200926/08/2009
Introducción
Dentro de las técnicas de laboratorio utilizadas con mayor frecuencia, seencuentra la electroforesis, técnica basada en la utilización de una corrienteeléctrica, controlada a diferentes voltajes con el fin de lograr la separaciónde biomoléculas. La separación puede realizarse sobre la superficiehidratada de un soporte sólido (p. ej., electroforesis en papel o enacetato de celulosa), o bien a través de una matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis libre). Dependiendo de la técnica que seuse, la separación obedece en distinta medida a la carga eléctrica de lasmoléculas y a su masa.Esta técnica fue inventada por el bioquímico sueco Arne Wilhelm Kaurin Tiselius, quien sometió a corriente eléctrica en un tubo de cuarzo unasolución proteica y observó que en el tubo se diferenciaban distintasbandas, de distintos grosores. En ese momento no utilizo ningún tipo desoporte, pero más adelante se descubriría que al utilizar soporte se notanzonas mucho mas delimitadas.Actualmente los instrumentos utilizados para la realización de esta técnicabioquímica son primero una fuente de tensión la que realizara los cambiosde voltaje para que corra la muestra, electrodos, cubetas, un soporteelectroforético y un tampón. La existencia de distintos tipos de soportes nosposibilita a clasificar las electroforesis dentro de 2 grandes grupos,dependiendo de la ausencia o presencia de impedimento al paso demoléculas. Si no oponen resistencia, es un soporte no restrictivo y si lo hacehablaríamos de un soporte restrictivo.
 
Dentro del grupo de soportes restrictivos, el más representante de estos porexcelencia es la electroforesis en gel de poliacrilamida, una de las másutilizadas para la caracterización de mezclas proteicas de gran complejidad,lo cual se debe a sus ltiples ventajas. Es pido, se necesita pocamuestra para poder analizar, el gel es químicamente inerte, estransparente, por lo que facilita la visibilidad de las bandas, el gel tambiénes resistente a agentes desnaturalizantes como la urea y detergentes,mecánicamente son estables, lo que posibilita su deshidratación parareducirlos a una capa fina que facilita su almacenamiento, también sonestable a variados pH y a temperaturas variadas.En el práctico utilizamos el método electroforético en gel de poliacrilamida.El proceso de separación de este gel se basa en la porosidad del mismo, elcual obtuvimos mezclando distintas concentraciones de poliacrilamida y bis-acrilamida (dependiendo de el porcentaje que buscábamos, en nuestro casode 12%) siendo menor el poro cuanta s bis-acrilamida usemos encomparación a ala archilamida. También se puede controlar los tamaños delos poros variando los tiempos de polimerización. Esta polimerización selleva a cabo iniciando un sistema generalizador de radicales libres, secomienza con la adición de TEMED (tetrametiletilendiamina) y persulfato deamonio. TEMED acelera la velocidad de formación de radicales libres a partirdel persulfato, estos radicales libres convierte a los momeros deacrilamida en radicales libres que activan a otros monómeros iniciando lapolimerización, los enlaces entrecruzados están dados por la polimerizaciónde la bis-acrilamida es por eso que cuanto s concentracn de bis-acrilamida adicionemos menor será el tamaño del poro. Esta técnica secombina con la adición a la muestra de sodio dodecil sulfato (SDS) el cual esun detergente que se une a las proteínas proporcional a la masa molecularde estas, las somete a desnaturalización, cargándolas negativamente así ladistancia que avancen las proteínas estará dado exclusivamente por eltamaño y no por la forma. Además al cargarlas negativamente asegura quela migración será de cátodo a ánodo.Habitualmente, se utilizan 2 geles de distinta porosidad. El segundo gel esel llamado “stacking gel” con poros mas grandes generalmente 4% quepermite concentrar la muestra aplicada, antes de ingresar al gel deseparación. En el práctico también se utilizo este gel.En el siguiente informe se entregara el análisis de la electroforesis teñidacon nitrato de plata, incluida el análisis de nuestra muestra problema, secomparara con la tinción de Coomassie Blue G250. Comprobando lasuperioridad de la tinción de nitrato de plata desde el punto de vista deresolución en la electroforesis.Una aplicación cnica de esta cnica es el alisis de proteínasplasmáticas, hay que recordar que en plasma hay más de 120 proteínassolubles que pueden ser identificadas bioquímicamente, y separadas ycuantificadas electroforéticamente según sus respectivas característicasfísico-químicas.

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