Introduction la Biologie Molculaire

Timothe Lionnet et Vincent Croquette

http://www.phys.ens.fr/~biolps/
25 mars 2005
Rsum
Selon Michel Morange, la biologie molculaire est "lensemble des techniques et dcouvertes qui ont permis lanalyse mo-
lculaire des processus les plus intimes du vivant, de ceux qui en assurent la perennit et la reproduction"[1]. Cette introduction
rsume de manire historique les vnements qui ont contribu sa naissance et son dveloppement. On trouve une descrip-
tion bien plus complte des concepts et des techniques classiques de la biologie dans les ouvrages de rfrence[2, 3] ou de
vulgarisation[4, 5].
Table des matires
1 Les origines de la Biologie Molculaire 2
1.1 La thorie cellulaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 La biochimie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.3 La gntique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
2 Expriences fondatrices 3
2.1 Quelques dates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.2 Lexprience de Beadle et Tatum . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
2.3 La nature chimique des gnes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
3 De la structure de lADN la rgulation de lexpression des gnes 6
3.1 Quelques dates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.2 La double hlice dADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
3.3 La rplication semi-conservative . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
3.4 La rgulation de lexpression des gnes : lopron lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
4 Du gnie gntique la transgnse 11
4.1 Quelques dates . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
4.2 Electrophorse de lADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
4.3 Les enzymes de restriction et autres enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
4.4 Vecteurs et transformation des cellules . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
4.5 Clonage et expression de gnes chez la bactrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
4.6 LADN polymrase . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.7 Squenage de lADN (Mthode de Sanger) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17
4.8 Amplication de lADN (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18
4.9 Puces ADN et rseaux gntiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
1
1. Les origines de la Biologie Molculaire
Les processus biologiques sont utilises par les tres humains depuis les temps prhistoriques en cuisine (pain, brassage de
la bire, production de fromage...). En medecine aussi, des techniques biologiques ont t utilises bien avant la comprhension
des mcanismes sous-jacents (utilisation par les chinois dantibiotiques extraits de champignons). Lhistoire de la biologie mo-
lculaire commence vraiment au milieu du XIX
eme
sicle, avec la rationalisation de ces savoirs et observations. Cette priode
est marque par labandon de la thorie vitaliste et du principe de gnration spontane. La premire tente de sparer les tres
vivants du reste de la matire inerte, en leur prtant une "force vitale", qui expliquerait leurs proprits physiques (mouvement)
et chimiques (fermentation par les micro-organismes). La gnration spontane, elle, postule lapparition spontane de la vie, par
exemple lapparition spontane de micro-organismes sur un milieu fermentescible.
1.1. La thorie cellulaire
Naissance de la microscopie (Van Leeuwenhoek XVII
eme
sicle); Observation de "compartiments" dans une tranche de
lige (Hooke XVII
eme
sicle) nomms cellules, mais sans laborer de thorie quant leur nature.
laboration de la thorie cellulaire (Schleiden & Schwann 1839)
La thorie de la gnration spontane est gratigne pour la premire fois par Francesco Redi, qui prouve en 1668 que
lapparition dasticots sur un morceau de viande en putrfaction na pas lieu si lon prend soin de recouvrir les bocaux
dune ne mousseline. Mais la croyance lemporte et il faut attendre Pasteur en 1862 pour mettre bas cette thorie.
Les liens entre micro-organismes et contagion sont observs mais non accepts. Par exemple, Semmelweis en 1846 est
assistant la maternit de Vienne. Il fait passer la mortalit de 12% 1% en imposant le lavage des mains avant opration.
Lorsquil demande son suprieur de se plier la rgle, il est renvoy et devient fou. Il faudra attendre jusqu Koch pour
que cette ide soit accepte (observation de germes danthrax en 1870).
Paralllement, la comprhension du lien entre micro-organismes et fermentation safne: Pasteur, la demande des indus-
triels lillois, dbute des recherches sur les fermentations ("alcoolique", "lactique" et "actique") et dcouvre qu chaque
fois, un micro-organisme est loeuvre. Il met au point la pasteurisation (1863) pour liminer les ferments parasites.
1.2. La biochimie
Le principe de la catalyse est dcouvert (1812).
La synthse de lure en 1828 par Whler partir de cyanate dargent contredit la thorie vitaliste puisquil est possible
de synthtiser un compos organique ("du vivant") partir dun compos minral. Toutefois, les partisans du vitalisme
rpliquent que lure nest quun produit de dgradation et ne sont pas convaincus.
la premire enzyme est extraite du malt: il sagit de la diastase qui catalyse la transformation de lamidon en glucose (Payen
& Persoz 1830).
fermentation des sucres a partir dun extrait acellulaire de levure obtenu par broyage (Bchner 1897). La thorie vitaliste
est contredite: les composants chimiques dun tre vivant sufsent seuls remplir les fonctions de celui-ci.
La notion de spcit est dcouverte; reconnaissance enzyme substrat; tude des anticorps (Ehrlich 1897);
Echelle de pH
Solutions "tampon"
1902-1909 Principe de fonctionnement des enzymes (Henri, Michaelis & Menten)
Premier moiti du XX
eme
sicle : dcryptage des grandes voies mtaboliques : glycolyse, cycle de lure, cycle de krebs
Dcouverte des macromolcules (1922: Hermann Staudinger labore le concept de polymre)
Technique de sparation et danalyse: Chromatographie, prcipitation par des sels ultracentrifugation (1924) lectrophorse
(1930-1945)
1.3. La gntique
Mendel dcouvre en 1866 les "lois de lhrdit" en tudiant la transmision de caractres dans des gnrations successives
de pois. Cette thorie passe totalement inaperue.
observation de la chromatine (1879), des chromosomes et de la mitose (1882) par Fleming.
de Vries redcouvre en 1900 la thorie de Mendel. Il observe lapparition de mutations spontanes et propose un mcanisme
dvolution par mutations.
Johannsen introduit les concepts de gnotype (sans le lier lADN) et phnotype (1909).
Expriences de Morgan (1913) sur la transmission de caractres et de mutations chez la drosophile: preuve de lexistence
des gnes et de leur localisation chromosomique (hrdit lie au sexe et premire carte gntique).
2
2. Expriences fondatrices
2.1. Quelques dates
la relation un gne - une enzyme: 1902 Garrod; 1941 Beadle et Tatum;
1943 : la naissance de la gntique bactrienne: le "test de uctuation" (Luria et Delbrck). Il consiste analyser compa-
rativement des populations de bactries infectes par un phage.
1944 : la nature chimique des gnes est dmontre par transformation de pneumocoques (Avery).
1949 : Lexplication molculaire de lanmie falciforme (L. Pauling)
1952 : Conrmation de la nature chimique des gnes (Hershey et Chase) par marquage radioactif de lADN et des protines
dun phage.
2.2. Lexprience de Beadle et Tatum
En 1902, Garrod dcouvre que la transmission dune maladie humaine, lalcaptonurie (une anomalie dexcrtion, affectant
le mtabolisme de la tyrosine et de la phnylalanine) se fait en accord avec les lois mendeliennes, et que cette maladie est
lie labsence dune enzyme dans le srum des patients. Il est le premier entrevoir le lien fondamental entre biochimie et
gntique: le phnotype est de nature chimique, et ce sont les protines qui en sont le support. Cette intuition fondamentale
reste malheureusement non dmontre, car il sagir dune maladie rare et la collecte des statistiques ncessaires serait beaucoup
trop longue. Il faut donc attendre que ltude soit mene sur un systme plus simple, et surtout au cycle de reproduction plus
court, pour pouvoir apporter une preuve de la relation gne-enzyme. Lexprience de Beadle et Tatum (1941) dmontre donc la
relation univoque (vision simpliste cependant, qui a t afne depuis) entre un gne et une protine responsable dune activit
catalytique. Ils se penchent sur une moisissure, Neurospora crassa, facilement cultivable sur un milieu articiel. On sait depuis
Muller (1927) induire des mutations par exposition aux rayons X. Par irradiation, Beadle et Tatum obtiennent donc des mutants
incapables de se dvelopper sur ce milieu minimal, mais qui poussent sur un milieu complment avec tel ou tel mtabolite. En
particulier, les tudes de la synthse du tryptophane, ou du cycle de lornithine, montrent que chacun de ces mutants est en ralit
dcient en une des enzymes ncessaires lune des tapes des ces chanes mtaboliques. Lanalyse gntique de ces mutants
permet de montrer que chacune de ces dciences segrge de faon mendlienne, et correspond donc une mutation dans un
unique gne. Lensemble de ces observations aboutit donc la conclusion que les gnes contrlent la synthse des enzymes, et
que chaque protine est code par un gne diffrent.
3
FIG. 1 Les expriences de Beadle et Tatum (1941). En haut: Aprs exposition aux UV de Neurospora, Beadle et Tatum caract-
risent des mutants dcients dans la synthse de lun des acides amins, larginine. En bas: Parci ces mutants, il russissent les
diffrencier suivant ltape qui est dciente dans la chane de synthse de larginine. Chaque tape de la synthse tant ralise
par une protine spcique, cette exprience dmontre le lien univoque entre une mutation dans un gne et ses consquences sur
lactivit dune enzyme donne.
2.3. La nature chimique des gnes
En 1928, Fred Grifth dcouvre le phnomne de "transformation": une coinjection chez une souris de pneumocoques non
pathognes (R) et de pneumomoques virulents (S) mais tus pralablement entrane la mort de lanimal. Les pneumocoques
non pathognes sont ainsi transforms par un facteur issu des pneumocoques virulents. En 1944, la purication du facteur
transformant par Avery aboutit au rsultat suivant: ce nest pas une protine, mais un acide desoxyribonuclique (ADN), mettant
ainsi en vidence le rle de lADN comme support de linformation gntique. Cependant, lADN est alors considr comme un
homopolymre dont llment de base serait ATGC (Takahashi 1932), et semble donc beaucoup trop rudimentaire pour tre le
support de linformation gntique.
4
FIG. 2 Lexprience de Grifth (1928): linjection de pneumocoques (S) entrine la mort de la souris, alors que les pneumo-
coques (R) sont non pathognes. La co-infection par des (R) vivants et des (S) tus par la chaleur entrane la mort de la souris
mettant en vidence la "transformation" des (R) par les (S).
En 1952, lexprience de Herschey et Chase conrme ce rsultat. Cest une des premires expriences de biologie molcu-
laire o des isotopes radioactifs permettent de tracer des molcules. Ils utilisent un marquage isotopique diffrentiel de chacun
des constituants du phage: du phosphore radioactif, incorpor lADN, et du soufre radioactif, incorpor aux protines de la
capside. Ces phages sont utiliss pour infecter des bactries. Immdiatement aprs linfection, il est possible de sparer par
agitation mcanique les bactries des phages qui les ont infects, et de sparer par centrifugation les particules phagiques des
bactries infectes. Lorsquelles sont remises en culture, ces bactries produisent des phages. Or lanalyse de la rpartition de la
radioactivit montre que ces bactries ne contiennent que du phosphore radioactif : seul lADN a donc pntr dans la cellule, et
cette fraction est responsable elle seule de la reproduction du phage. Cest donc lADN qui dtient linformation gntique.
FIG. 3 A gauche: Schma et image en microscopie lectronique dun bactriophage (cest une enveloppe constitue de protines
-la capside- qui contient de lADN; il infecte les bactries en injectant son ADN, laissant sa capside lextrieur de la bactrie).
A droite: lexprience de Herschey et Chase (1952): le marquage radioactif slectif des protines ou de lADN et le mcanisme
particulier dinfection du bactriophage permet de dterminer la nature chimique du matriel gntique
5
3. De la structure de lADN la rgulation de lexpression des gnes
3.1. Quelques dates
1953 : Dcouverte de la double hlice (Watson et Crick)
Analyse de clichs de diffraction de rayon X par des cristaux dADN
1953: un modle du code gntique (Gamow)
1956: lARN est dcouvert.
1958 : La dmonstration du modle semi-conservatif de la rplication de lADN (Meselson et Stahl).
1960 : Dcouverte de lARN messager (Monod).
1961->1966 : le dcryptage du code gntique (Nirenberg et Matthaei) grce la synthse de protines in vitro partir
dun ARN poly-U.
Afnage du "dogme central" de la biologie molculaire
1965 : Lopron lactose (Jacob et Monod)
Etude de lactivit de la Beta-galactosidase
Modle de la rgulation de lexpression des gnes
3.2. La double hlice dADN
La dcouverte de la structure de lADN bouleverse ltude des phnomnes biologiques en introduisant la dimension mol-
culaire. Propose par Watson et Crick en 1953, elle est obtenue non seulement partir de linterprtation de clichs de diffraction
des rayons X ralises par Franklin, mais aussi des travaux dErwin Chargaff (qui avaient montr que pour toute molcule
dADN, le nombre de molcules dadnine est gal au nombre de molcules de thymine, et que celui de cytosine est gal celui
de guanine) et enn danalyses en microscopie lectronique, qui avaient montr que le diamtre de la molcule dADN est de 20
, ce qui suggrait que cette molcule comportait deux chanes de dsoxyribose-phosphate. Les deux points fondamentaux de la
structure sont les suivants:
les bases ou nuclotides (A,T,C,G) sorganisent en pairs A-T et G-C
Cet appariement permet un enroulement quasi-parfait en hlice droite des deux chanes sucre-phosphate qui portent ces
nuclotides; Lhlice possde un pas denviron 10 paires de bases, qui sont espaces de 3.4 , donc le pas vaut environ 3.4
nm.
La structure est stabilie par linteraction (liaisons hydrogne) entre les bases et lempilement successif des paires de nuclo-
tides le long de la double-hlice ("stacking" du des interactions hydrophobes).
6
FIG. 4 A droite: Image par diffraction des rayons X dun cristal dADN.
7
FIG. 5 Article original de Watson et Crick (30 Avril 1953);
8
FIG. 6 A gauche: structure primaire de lADN: les pairs bases A-T et G-C sont stabilises par respectivement 2 et 3 liaisons
hydrogne. Chaque hlice est forme par un squelette sucre-phosphate orient. Les deux squelettes sont orients en sens inverse;
A droite: la structure secondaire de lADN en double-hlice droite.
FIG. 7 A gauche: il existe dautres structures dADN que la forme (B) la plus rpandue. La forme (A), de diamtre plus grand
et de pas plus petit, est stable en milieu anhydre; La forme (Z), hlice gauche stable haute concentration en sel; Lintrt
biologique de ces structures demeure incertain
9
3.3. La rplication semi-conservative
La dcouverte de la structure de lADN pose le problme de la rplication du code gntique lors de la division cellulaire. La
comprhension du mcanisme de rplication fait un pas dcisif avec lexprience de Meselson et Stahl (1958).
FIG. 8 Exprience de Meselson et Stahl (1958) : sparation dADN marqu au
32
P suivant sa densit par centrifugation en
CsCl et suivi au cours du temps de la proportion dADN lourd. Cette exprience dmontre le caractre semi-conservatif de la
rplication.
FIG. 9 Le dogme central de la biologie molculaire, nonc par Crick en 1960. Il dcrit lexpression de linformation gntique
depuis son support, lADN, jusquaux protines. Cette vision est cependant rductrice, voir texte.
10
3.4. La rgulation de lexpression des gnes : lopron lactose
Dans les annes soixante, Jacob et Monod dcouvrent le premier systme de rgulation de lexpression des gnes, quils
nomment l"opron" lactose. Il sagit du systme qui gre la rgulation de la production dune enzyme (qui intervient au dbut
de la chane de mtabolisme du lactose) en fonction de la concentration de lactose dans le milieu.
FIG. 10 Lopron lactose : le modle historique de rgulation; La -galactosidase est une enzyme initie la chane du mtabo-
lisme du lactose en coupant le lactose en galactose et glucose. En labscence de lactose dans le milieu, une protine (rpresseur)
se xe sur lADN en un site (oprateur) qui bloque la transcription du gne de la -galactosidase. En prsence de lactose
dans le milieu, un isomre du lactose, lallolactose, saccroche sur le rpresseur et diminue ainsi son afnit pour lADN. La
transcription du gne est alors rendue possible.
La dcouverte de la rgulation permet dafner le dogme central de la biologie molculaire. Dautre part, on sait aujourdhui
qu un gne ne correspond pas forcment une protine unique. En effet, lexpression peut subir des modications:
post-transcriptionnelles: lARN messager transcrit partir dun gne, peut tre recombin (certaines parties sont coupes
et limines, les introns, les autres sont "recolles" entre elles, les exons). Cest ce quon appelle lpissage alternatif, qui
peut tre modul en fonction du cycle cellulaire ou de stimuli extrieurs.
post-traductionnelles: le repliement 3D dune protine peut tre modi, par exemple sous laction de protines dites
chaperonnes. Dautre part, de nombreuses protines subissent des modications chimiques (formation de ponts disulfures,
ajouts de groupements sucres pour former des glycoprotines) aprs leur synthse.
Ces variations dexpression sont lorigine de la complexit de lexpression de linformation gntique. Certes, toute lin-
formation gntique est contenue dans lADN, mais deux cellules au mme contenu ADN peuvent tre extrmement diffrentes,
en fonction du contenu de leur cytoplasme (cf diffrentiation des cellules dans un organisme).
4. Du gnie gntique la transgnse
4.1. Quelques dates
1972 : Dbut du gnie gntique : recombinaison dADN in vitro (Jackson, Symons, Berg) Construction dune molcule
hybride dADN partir dune enzyme de restriction (EcoR1) et de ligase
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1973 : Electrophorse de lADN sur gel dagarose
1974 : Clonage de lADN utilisant des banques dADN gnomiques
1978 : 50 enzymes de restriction sont connues : cartographie de lADN
1977 : Construction du vecteur pBR322 (Bolivar)
1977 : Squencage de lADN (Sanger , Maxam et Gilbert)
1978 : Expression de protines humaines dans les bactries
1980 : Expression de protines humaines dans les cellules animales
1980 : Premire plante transgnique
1981 : Premire souris transgnique (Brinster)
1983 : Amplication spcique dADN (PCR) (Mullis)
4.2. Electrophorse de lADN
Le principe de lelectrophorse, qui consiste faire migrer dans un certain milieu des molcules charges en prsence dun
champ lectrique, date des annes trente. Cependant, elle est devenue une technique trs rpandue danalyse et de sparation
dADN (on lutilisait initialement pour la migration de protines) avec lutilisation de gel dagarose (1973). LADN est dpos
dans un gel dagarose en prsence dun marqueur qui devient uorescent lorsquil sintercale dans lADN. LADN est attir
vers llectrode + (phosphates chargs ngativement), mais les mailles du gel dagarose permettent de sparer les molcules en
fonction de laur taille. Cette mthode permet de vrier la taille de fragments dADN, et de les sparer ensuite. On peut aussi
lutiliser pour dtecter la prsence dune squence spcique dans des fragments donns. Cest la technique du Southern blot:
Aprs llectrophorse dADN double brin, le gel est transfr sur une membrane et lADN double brin dnatur en simple brin.
Cette tape permet de xer lADN sur un support solide. La rplique du gel sur la membrane est ensuite mlange une sonde,
cest--dire un simple brin dADN portant un marqueur (radioactif ou uorescent). Aprs rinage, seules les bandes du gel ayant
intgr la squence voulue retiennent la sonde, et on peut les rvler (par autoradiogramme ou simple photo dans le cas dun
marqueur uorescent). Cette technique est utilisable pour lADN (Southern), lARN (Northern), ou les protines (Western).
FIG. 11 gauche : Photo du rsultat dlectrophorse dADN marqu par uorescence sur gel dagarose. Les trois premires
colonnes montrent le mme fragment coup par les enzymes XhoI et/ou XbaI. La dernire colonne est une solution contenant des
fragments de tailles connues. Ainsi, on peut mesurer la taille et sparer diffrentes molcules dADN; droite haut: La distance de
migration varie comme le logarithme de la taille de lADN; droite bas: on peut extraire la bande voulue du gel et en rcuprer
lADN dbarass des fragments parasites;
12
FIG. 12 gauche : Principe de la technique dhybridation sur gel ("blot"). LADN issu dun gel est immobilis sur une membrane
et mis en prsence dune sonde pour tester la prsence dun sequence voulue dans les diffrents fragments;
4.3. Les enzymes de restriction et autres enzymes
La dcouverte des enzymes de restriction signe le dbut de lre du "gnie gntique". Ces enzymes, qui constituent in vivo
un mcanisme de dfense contre des molcules dADN trangres, sont capables de couper la molcule dADN en des sites
bien spciques. La ligase, elle, catalyse la raction inverse, cest--dire la formation de liaisons phosphodiester pour recoller
deux brins dADN. Les extrmits sont importantes, on distingue les fragments dADN bouts francs (i.e. sans quun des deux
brins ne dpasse) et les fragments extrmits collantes (synonyme: cohsives) dont un des brins dpasse. La ligase ne peut
que recoller des fragments dont les extrmits cohsives sont complmentaires (ou deux fragments bouts francs, mais avec
un moins bon rendement). En 1972, Lquipe de Berg utilise lenzyme de restriciton EcoRI pour obtenir in vitro une molcule
dADN hybride qui contient la fois lADN dun virus (SV40) et une forme altre dun bactriophage (). Cest la premire
recombinaison gntique ralise in vitro.
13
FIG. 13 haut: Les bactries ont dvelopp le systme de restriction/modication pour se protger des phages. La bactrie
modie son ADN en des sites spciques (en gnral lADN est mthyl). Des enzymes de restriction sondent en permanence tout
ADN prsent dans la bactrie et coupent lADN non modi aux sites de reconnaissance. Bas: exemple dEcoRI, qui reconnait
la squence 5-GAATTC-3. La coupure forme des extrtmits 5-P et 3-OH.
14
FIG. 14 Exprience de recombinaison in vitro par Paul Berg en 1972 (simpli): deux molcules dADN dorigine diffrentes
contenant le site de restriction EcoRI sont coupes par lenzyme puis religues ensemble laide de la ligase
4.4. Vecteurs et transformation des cellules
La dcouverte de nombreuses enzymes de restriction et la possibilit de recombiner lADN in vitro conduisent lutilisa-
tion de petites molcules circulaires dADN, les plasmides. Les plasmides sont prsents naturellement dans le cytoplasme des
bactries et sont rpliqus en parallle du chromosome bactrien. La bactrie les tolre car ils portent en gnral un gne qui
procure un avantage slectif. On a depuis labor un grand nombre de plasmides articiels, qui contiennent beaucoup de sites de
restriction, et en gnral un ou deux gnes permettant de les slectionner.
Aprs insertion dune squence dADNparticulire dans un plasmide (quon appelle aussi vecteur), celui-ci peut tre introduit
dans une bactrie ("transformation"), soit pour obtenir un grand nombre dexemplaire de cette squence, soit pour modier le
patrimoine gntique de la bactrie. Lexpression du plasmide peut tre stable ou transitoire, et avec ou sans site de rplication.
Une des limitations de la transformation est que la bactrie peut tolrer ou non la squence introduite, et donc peut ventuellement
liminer le plasmide, ou le modier.
FIG. 15 Carte de restriction du vecteur pBr322 (construit par Bolivar en 1977): gnralement, un plasmide contient une orgine
de rplication, un ou plusieurs gnes de rsistance des antibiotiques (gnes de slection, ici ampiciline et ttracycline), et un
grand nombre de site de restriction.
15
4.5. Clonage et expression de gnes chez la bactrie
Le clonage dun gne consiste insrer un gne dintrt dans un vecteur et transformer des bactries avec ce vecteur. Une
fois insr dans la bactrie, ce gne pourra, selon les besoins, tre ampli en vue dun squenage (voir plus loin), ou exprim
en vue de la production de la protine associe ce gne.
Historiquement, les premires expriences de production de protines humaines dans les bactries furent des protines din-
trt thrapeutique comme linsuline (1979). La production de protines ou llaboration dorganismes transgniques ne sont pas
des techniques limites aux bactries. Dautres mthodes de transformation peuvent aussi tre employes, par exemple lutilisa-
tion de vecteurs diffrents des plasmides (virus modis, phages, cosmides, phagemides, etc).
FIG. 16 Principe du clonage dun gne humain dans une bactrie.
16
4.6. LADN polymrase
Dcouverte par Arthur Kornberg en 1956, les polymrases assurent la copie du brin complmentaire dune molcule dADN
simple brin lors de la rplication. Elles travaillent uniquement dans le sens 53. Certaines prsentent un taux derreur remar-
quablement faible (10
4
et jusqu 10
7
) du un mcanisme de correction derreur, base sur une activit exonuclase 53
ou 35.
Lutilisation in vitro de ces enzymes est la base du principe damplication de lADN par PCR (voir plus loin).
4.7. Squenage de lADN (Mthode de Sanger)
Le squenage dune molcule dADN consiste dterminer lenchanement des bases qui le compose. En 1977 sont mises
au point deux techniques concurrentes: celle de Gilbert, dun part, qui est une mthode chimique de coupure des bases, et
celle de Sanger, dautre part, qui utilise un procd enzymatique requrant lADN polymrase. Les deux techniques requirent
lutilisation dlectrophorse ultra-rsolutive, permettant la sparation de molcules dADN ne differant que dun seul nuclotide.
FIG. 17 A gauche: principe du squenage de lADN par la mthode de Sanger modernise. 4 ractions de polymrisation
sont menes en parallle. Chacune contient les 4 nuclotides, un marqueur color spcique, ainsi quune faible quantit dun
des nuclotides modi de manire stopper la polymrisation (didoxynuclotide). On fait ensuite un gel ultrarsolutif pour
diffrencier les fragments diffrant dune paire de bases; A droite : Analyse de squence
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4.8. Amplication de lADN (PCR)
La technique damplication de lADN par Raction de Polymrisation en Chane (PCR) vient complter larsenal du gnie
gntique en 1983. La PCR permet damplier de manire trs spcique et trs dle une squence dADN dintrt.
FIG. 18 gauche haut: Dnaturation (melting) de lADN en fonction de la temprature et la composition de lADN; A droite:
Cycles damplication de lADN lors dune PCR. La PCR est un processus exponentiel: chaque cycle, la quantit dADN est
thoriquement multiplie par deux; gauche bas: mutagnse dirige par PCR. Une base modie dans les primers permet de
synthtiser un fragment dans lequel la mutation est localise lextrmit. On peut recombiner deux de ces PCR pour reformer
par PCR le fragment complet avec la mutation voulue lintrieur.
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4.9. Puces ADN et rseaux gntiques
Les puces ADN permettent de tester simultanment la transcription dune grande quantit de gnes dun organisme. La
technique consiste dposer sur une plaque de verre ou de nylon des ADN spciques dun gne particulier. Ensuite, on vient
hybrider sur cette plaque de lARN uorescent pralablement exprim par une cellule dans une condition particulire. Une plaque
peut contenir plusieurs milliers de chantillons, ce qui donne accs de nombreux gnes et permet de mettre en vidence des
corrlations et donc les rseaux gntiques qui sous-tendent le fonctionnement de la cellule.
FIG. 19 Principe et exemple de puce ADN
Rfrences
[1] M. Morange. Histoire de la Biologie Molculaire. Paris, 1994.
[2] B. Alberts, D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, and J.D. Watson. Molecular Biology of the Cell, 3rd. Garland Publishing
Inc., New-York, 1994.
[3] D. Voet and J.D. Voet. Biochemistry, 3rd. New York, 1995.
[4] F. Jacob. La Logique du Vivant. Paris, 1976.
[5] E. Schrdinger. Quest-ce que la vie? Paris, 1993.
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