Artigo Nano

i
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

INSTITUTO DE QUMICA
DEPARTAMENTO DE FSICO-QUMICA

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAO DE
FORMULAES LIPOSSOMAIS CONTENDO O
FRMACO NISTATINA

Edeilza Gomes Brescansin

Orientador:
Prof. Dr. Francisco Benedito Teixeira
Pessine (IQ-UNICAMP)

Campinas SP
2006

ii

iii

EDEIZA GOMES BRESCANSIN

DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAO DE FORMULAES
LIPOSSOMAIS CONTENDO O FRMACO NISTATINA

Tese apresentada Universidade Estadual
de Campinas, como requisito para
obteno do ttulo de Doutor em Cincias

Aprovado em:

BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Francisco Benedito Teixeira Pessine (orientador)

Prof
a
. Dr
a
. Eneida de Paula (IB-UNICAMP)

Prof. Dr. Cludio Francisco Tormena (IQ-UNICAMP)

Prof. Dr. Marcelo Ganzarolli de Oliveira (IQ-UNICAMP)

Prof. Dr. Noboru Hioka (DQ-UEM)

iv

v

Dedico este trabalho

A meu Deus pela proteo e paz,
A minha querida me Maria Eunice que esteve sempre a meu lado em todas as horas,
A meu querido marido, Jos Valdir pelo apoio e companheirismo,
A meus filhos Mariana e Pedro.

vi

vii

" O valor das coisas no est no tempo em que elas duram,
mas na intensidade com que acontecem.
Por isso existem momentos inesquecveis,
coisas inexplicveis e
pessoas incomparveis" .

(Fernando Pessoa)

viii

ix
AGRADECIMENTOS

Ao Professor Francisco Benedito Teixeira Pessine, meus sinceros agradecimentos, no
apenas pela orientao, mas tambm pelo incentivo, confiana e amizade nestes anos
de convivncia.
Aos amigos que encontrei na UNICAMP pela simpatia, incentivo e auxlio nos
momentos difceis do projeto e na vida pessoal: Ana Paula, Milene, Neife, Dbora Biloti,
Adriana, Daniel, Anglica, Josivnia,
A minha amiga, professora Mrcia Portilho da UEM pela leitura e correes do trabalho.
Aos professores da UEM , Osvaldo A. Cavalcanti, Graciette Matioli, Elza Kimura, Maria
da Conceio T. Truiti, Adriana Lenita M. Albiero, Nelson Y. Uesu, Edna Regina N.
Oliveira pelas palavras de incentivo nesta reta final da tese.
Ao professor Luiz Carlos Dias (IQ/UNICAMP) e seus alunos, pela amizade,
companheirismo e pela colaborao na realizao de nosso projeto com o emprstimo
e doao de equipamentos e /ou reagentes.
A Professora Eneida de Paula (IB/UNICAMP) e funcionrios do IB pelo auxlio no uso
da ultracentrfuga
Aos professores Maria Helena Santana (FEQ/UNICAMP), Pedro L. O Volpe
(IQ/UNICAMP), Fernando Galenbeck (IQ/UNICAMP), Carlos F. S. Bonaf
(IB/UNICAMP), Anita J. Marsaioli, Lauro Kubota (IQ/UNICAMP), Maria Isabel M. S.
Bueno (FEQ/UNICAMP) e Renato Atlio Jorge (IQ/UNICAMP) pelo emprstimo de
equipamentos em seus laboratrios.
Ao Dr. Carlos Ramos (BFM/LNLS) e Silvia Lucas F. da Silva (IQ/UNICAMP) e ao
Laboratrio Nacional de Luz Sncroton (LNLS) pelo emprstimo e auxlio na utilizao
do MicroDSC.
A professora Anglica Zaninelli Schreiber (FCM/UNICAMP) e Luzia Lyra
(FCM/UNICAMP) pelo grande auxlio nas anlises de atividade antifngica do frmaco
estudado.
Aos Tcnicos do IQ que tanto nos auxiliaram nesta tese: Claudia Matelli, Robson, Maria
do Carmo, Ana, Ricardo Pereira, Divino, Sonia (RMN), Sr. Fontana, Pimpim, Cssia,

x
Fabiana, Iveraldo
Aos funcionrios das oficinas, vidraria, almoxarifado, marcenaria, manuteno e
informtica
A CAPES, pelo suporte financeiro com a concesso de bolsa de estudo pelo programa
Institucional de Capacitao Docente e Tcnico-Administrativo (PICDT).

xi
CURRICULUM VITAE

DADOS PESSOAIS
Nome:Edeilza Gomes Brescansin
Tel: (44)3026-8010 - e-mail: egbrescansin@uem.br
Endereo residencial: Rua Joaquim Nabuco, 163, apto. 1401.
Zona 01, Maring PR. - CEP: 87013-340
FORMAO ACADMICA
Doutorado em Cincias Fsico-Qumica.
Desenvolvimento e Caracterizao de Formulaes Lipossomais contendo o Frmaco
Nistatina.
Universidade Estadual de Campinas Instituto de Qumica - Perodo: 2001 2006.
rgo financiador: CAPES Programa PICDT
Mestrado em Qumica Fsico-Qumica.
Determinao da Estabilidade Qumica e mecnica do Medicamento Reliflex e seu Princpio
Ativo Nabumetona.
Universidade Estadual de Maring Departamento de Qumica - Perodo: 1995 1998.
Especilizao em Gesto da Qualidade.
Aplicao de Mtodos Estatsticos para a Melhoria da Qualidade na Produo de
Comprimidos.
Universidade Estadual de Maring - Departamento de Administrao
Perodo: setembro 1993 dezembro 1995.
Graduao em Farmcia Farmcia Industrial
Universidade Federal do Rio de Janeiro Departamento de Farmcia. Perodo: 1981 1986
ATUAO PROFISSIONAL
Universidade Estadual de Maring, UEM, Brasil.
Vnculo: Servidor Pblico, Enquadramento Funcional: Professor Assistente Nivel D, Carga
horria: 40 h - Regime: Dedicao exclusiva. Perodo: 1991 Atual
LIVROS PUBLICADOS/ORGANIZADOS OU EDIES
BRESCANSIN, E.G. VALENTINI, S. R. MEMENTO TERAPUTICO, SRIE
APONTAMENTOS. Maring: EDUEM - Editora da Universidade Estadual de Maring, 1999.
ARTIGOS COMPLETOS PUBLICADOS EM PERIDICOS
MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; HIOKA, N. ; MAIONCHI, F. ; MATIOLI, G. .
ESTUDO DA DEGRADAO DO FRMACO NABUMETONA FRENTE LUZ . Acta
Scientiarum, Maring, v. 23, n. 3, p. 651-659, 2001.
RESUMOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSO (ARTIGOS)
BRESCANSIN, E. G.; MARTINS, M. H.; PESSINE, F. B. T. ENCAPSULATION OF NYSTATIN
IN MULTILAMELLAR LIPOSOMES. Revista Brasileira de Cincias Farmacuticas, v. 39, supl.
2, 2003.
MARTINS, M. H.; BRESCANSIN, E. G.; PESSINE, F. B. T. PHOTOSTABILITY OF
ISOTRETINOIN IN METHANOL AND IN LIPOSOMES. Revista Brasileira de Cincias
Farmacuticas, v. 39, supl. 2, 2003.
MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . IDENTIFICATION OF THE
OBTAINED PHOTOPRODUCTS OF THE DEGRADATION THE NABUMETONE. European

xii
Journal of Pharmaceutical Sciences, v. 13, n. 1, p. 57, 2001.
TRABALHOS COMPLETOS PUBLICADOS EM ANAIS DE CONGRESSO
FERRACINI, Cristiane Nunes ; MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MORAES, Flvio
Farias de ; MATIOLI, G. . STUDY OF THE FORMATION OF THE COMPLEX
ALBENDAZOLE-BETA-CYCLODEXTRIN. In: Congress of Pharmaceutical Science - CIFARP,
2001, guas de Lindia. European Journal of Pharmaceutical Sciences. New York : Elsevier,
2001. v. 13. p. 139-140.
MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . IDENTIFICATION OF THE
OBTAINED PHOTOPRODUCTS OF THE DEGRADATION OF THE NABUMETONE. In:
Congress of Pharmaceutical Science, 2001, guas de Lindia. European Journal of Science
Pharmaceutical Sciences. New York : Elsevier, 2001. v. 13. p. 57-57.
MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . ESTABILIDADE DA
NABUMETONA FRENTE LUZ: UM ESTUDO FSICO-QUMICO. In: XIV Semana de
Integrao de farmcia, 2000, MARING. Livro de Resumos da XIV Semana de Integrao de
Farmcia, 2000.
MORIWAKI, Cristiane ; MORAES, Flvio Farias de ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. .
ESTUDO DA FORMAO DO COMPLEXO ALBENDAZOL-BETA-CU\ICLODEXTRINA. In: IX
Encontro Estadual de farmacuticos e Bioqumicos e VII Congresso Catarinense de,
2000, Florianpolis. Caderno de Resumos do IX Encontro Estadual de farmac6euticos e
Bioqumicos, 2000. v. 1. p. 19.
LUCENA, F. A. M.; REIS, A. V. BRESCANSIN, E. G. CARACTERIZAO E AVALIAO
CINTICA PRELIMINAR DA NABUMETONA. Anais do IX Encontro Anual de Iniciao
Cientfica, v. 2, p. 392 393, 2000.
MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . FOTLISE DO FRMACO
NABUMETONE E IDENTIFICAO DE SEUS FOTOPRODUTOS. In: IV Jornada de
Farmcia e Anlises Clnicas de Londrina, 2000. LONDRINA. Anais da IV Jornada de
Farmaia e Anlises Clnicas de Londrina, v. 1. p. 8-8 2000.
MORIWAKI, Cristiane ; BRESCANSIN, E. G. ; MATIOLI, G. . ISOLAMENTO E
IDENTIFICAO DE FOTOPRODUTOS OBTIDOS DA DEGRADAO DA NABUMETONA.
In: IX ENCONTRO ANUAL DE INICIAO CIENTFICA, 2000, LONDRINA. Anais do IX
Encontro Anual de Iniciao Cientfica, v. 1, p. 384-385, 2000.
BRESCANSIN, E. G.; HIOKA, N.; SANTIN FILHO, Ourides. EVALUATION OF THE STABILITY
OF NABUMETONE TO LIGHT. In: 2nd Congress of Pharmaceutical Sciences, 1999, Ribeiro
Preto. Bolletino Chimico Farmaceutico. Milano : Societ Editoriale Farmaceutica, v. 138. p.
CLXII 1999.
MARTINS, S. S. M. ; BRESCANSIN, E. G. ; HIOKA, N.; SANTIN FILHO, Ourides . AVALIAO
DAS PROPRIEDADES MECNICAS E ESPECTROSCPICAS DO COMPRIMIDO
RELIFLEX E SEU PRINCPIO ATIVO (NABUMETONA). In: V Encontro de Qumica da Regio
Sul, Porto Alegre - RS. Livro de Resumos, 1997. p. AQ18 1997.
PALESTRAS PROFERIDAS
Lipossomas como Carreador de Frmacos, na disciplina: Pr-formulao e Tecnologia
Farmacutica do Programa de Ps-Graduao em Cincias farmacuticas, 2006
Prmios E Ttulos
Professsora Homenageada pelos Formandos de Farmcia de 1999, Universidade Estadual de
Maring.
Patronesse da Turma dos Formandos de Farmcia de 2001, Universidade Estadual de
Maring.

xiii
RESUMO

No presente trabalho, buscamos desenvolver formulao lipossomal sistmica de
nistatina (NYS) com o propsito de aplicaes futuras na teraputica de micoses
sistmicas, que tanto afligem indivduos imunodeprimidos. Na primeira parte do projeto
caracterizamos o frmaco atravs de anlises trmicas (TGA e DSC), anlises
espectroscpicas (IV, UV e fluorescncia), teste de solubilidade, avaliao da umidade
segundo o mtodo de Karl-Fischer e coeficiente de partio octanol/meio aquoso. Na
segunda parte do trabalho procuramos desenvolver e otimizar formulaes lipossomais,
onde o frmaco apresentasse maior estabilidade qumica. Foram preparadas
formulaes lipossomais pelo mtodo do filme lipdico que foram analisadas por HPLC.
As preparaes passaram por processo de diminuio de tamanho e separao entre
frmaco livre e encapsulado A terceira e ltima fase do projeto consistiu da
caracterizao de duas preparaes, atravs de anlises do raio hidrodinmico,
determinao da carga de superfcie das partculas (potencial zeta), teor de fosfolipdios
totais (teor de fosfato), eficincia e avaliao da encapsulao por anlises de HPLC,
anisotropia e supresso de fluorescncia. Ainda na fase de caracterizao investigamos
a atividade biolgica in vitro, destas formulaes, pelo teste de susceptibilidade. As
preparaes foram desafiadas contra leveduras e dermatfitos. Pela seleo e
otimizao das formulaes desenvolvidas conclumos que a melhor formulao foi a
que apresenta uma composio de 70 % de Epikuron 200 SH; 20 % de Colesterol; 10
% de Diestearoilfosfatidilglicerol, 1,3 % de 2,6 - bis (1,1-dimetil) 4 - metil fenol (BHT) e
7 % de NYS. Duas preparaes foram caracterizadas L1 (hidratada a 55 C) e L2
(hidratada a 60 C). Os resultados para anisotropia e supresso de fluorescncia
evidenciam a encapsulao do frmaco nas preparaes estudadas, tanto na bicamada
lipdica quanto na superfcie dos lipossomas. Verificamos tambm que L2 apresentou
menor polidisperdidade de seu raio hidrodinmico, maior carga de superfcie e maior
eficincia de encapsulao, evidenciando ser L2 a preparao, fsico-quimicamente,
mais estvel. Todavia, a preparao L1 mostrou, aps sonicao, atividade biolgica in
vitro maior que L2. Estes resultados podem refletir a possvel degradao do frmaco,
quando aquecido a 60 C.

xiv
Palavras-chaves: nistatina, antifngicos, lipossomas,

xv
ABSTRACT

This study was designed to develop liposomal formulations containing Nystatin (NYS),
looking forward its future applications in systemic mycosis therapy, which often affect
immunodepressed individuals. In the first part of the project, the drug was characterized
by means of thermal analyses (TGA and DSC), IR, UV/V and fluorescence
spectroscopies, solubility tests, humidity contents evaluation (Karl-Fischer method) and
octanol-water partition coefficient. In the second part of the study, liposomal formulations
were developed and optimized, in which the drug presented improved chemical stability.
Liposomal formulations were prepared by the dry lipid film hydration method and were
analyzed by HPLC. The vesicles were submitted to the processes of size reduction and
separation of non encapsulated drug. The last part of the project consisted in the
characterization of the two formulations by means of analysis of the is hydrodynamic
radius; determination of the particles superficial charge (zeta-potential); total
phospholipids content (phosphate); degree of NYS with encapsulation by HPLC; degree
of anisotropy and fluorescence quenching of NYS. Still during the characterization
phase, the in vitro biological activity of the formulations was investigated by means of
susceptibility tests. The formulations were challenged against some yeasts and
filamentous fungi. Conclusions pointed that the best formulation was the one which
presented in its compositions 70% Epikuron 200 SH, 20% Cholesterol, 10 % Distearoyl-
phosphatidylglycerol, 1.3 % 2,6 bis (1,1-dimethylethyl) 4 - methylphenol (BHT) and 7
% NYS. Two formulations were characterized: L1 (hydrates at 55 C) and L2 (hydrated
at 60 C). Results regarding the degree of anisotropy and fluorescence quenching
evidenced by NYS encapsulation at the liposomal lipid bilayers. Moreover, it was
observed that L2 presented lower polydispersity in size distribution, higher superficial
load and higher encapsulation effectiveness, i.e. L2 presented higher physico-chemical
stability. Nevertheless the L1 preparation showed, after sonication, higher biological
activity in vitro than L2, which might reflect possible thermal degradation of NYS when
heated to 60 C.

Key words: antifungal, nystatin, liposomes.

xvi

xvii
NDICE

ABREVIAES ........................................................................................... XXI
NDICE DE TABELAS ................................................................................. XXIII
NDICE DE FIGURAS .................................................................................. XXVII
1 INTRODUO ............................................................................................. 01
2 OBJETIVOS ................................................................................................. 11
3 REVISO BIBLIOGRFICA ........................................................................ 15
3.1 Fungos ......................................................................................................... 17
3.2 Dimorfismo Fngico ................................................................................... 24
3.3 Infeces Fngicas .................................................................................... 25
3.4 Antibiticos Antifngicos Polinicos ....................................................... 29
3.5 Lipossomas ................................................................................................. 31
3.5.1 Aplicaes de lipossomas em medicina .................................................. 37
3.5.2 Lipossomas em doenas parasitrias e infecesfngicas .................. 40
3.5.3 Mtodos de Preparao de lipossomas ................................................... 41
3.5.3.1 Mtodo pelo filme lipdico ......................................................................... 41
3.5.3.2 Mtodo de injeo de Etanol ..................................................................... 43
3.6 Caracterizao de preparaes lipossomais ........................................... 44
3.6.1 Determinao do raio hidrodinmico de lipossomas ............................. 44

xviii
3.6.2 Determinao da carga de superfcie das partculas .............................. 45
3.6 3 Anlise por supresso de Fluorescncia ................................................. 45
3.6.4 Espectroscopia de polarizao de fluorescncia ................................... 46
4 MATERIAIS E MTODOS ........................................................................... 49
4.1 Materiais ...................................................................................................... 51
4.2 Mtodos ....................................................................................................... 52
4.2.1 Caracterizao fsico-qumica da NYS...................................................... 52
4.2.1.1 Avaliao da solubilidade .......................................................................... 53
4.2.1.2 Determinao do teor de umidade ............................................................ 53
4.2.1.3 Anlises espectroscpicas ....................................................................... 53
4.2.1.3.1 Anlise por espectroscopia de absoro na regio do UV/V ................. 53
4.2.1.3.2 Anlise por espectroscopia de fluorescncia ......................................... 54
4.2.1.3.3 Anlise por espectroscopia no Infravermelho (IV) .................................. 54
4.2.1.4 Anlises por Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC) e
Termogravimetria (TGA).............................................................................

54

4.2.1.5 Determinao do coeficiente de partio octanol/tampo ..................... 55
4.2.2 Anlise da atividade antifngica in vitro da NYS..................................... 56
4.2.3 Desenvolvimento de formulaes lipossomais com NYS ...................... 57
4.2.4 Tratamentos efetuados em vesculas multilamelares para obteno

xix
de lipossomas unilamelares ...................................................................... 59
4.2.5 Caracterizao qumica e fsica de suspenses lipossomais ............... 60
4.2.5.1 Anlise por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)................ 60
4.2.5.2 Determinao do teor (%) de fosfato ........................................................ 61
4.2.5.3 Determinao do raio hidrodinmico ....................................................... 62
4.2.5.4 Determinao do potencial Zeta ............................................................... 62
4.2.5.5 Anlise do grau de anisotropia de fluorescncia da NYS livre e
encapsulada em lipossomas ....................................................................

62
4.2.5.6 Estudo da supresso de emisso de fluorescncia da NYS livre e em
lipossomas...................................................................................................

63
4.2.5.7 Avaliao da atividade antifngica in vitro de suspenses
lipossomais .................................................................................................

64
5 RESULTADOS E DISCUSSES ................................................................. 67
5.1 Caracterizao fsico-qumica da NYS ..................................................... 69
5.1.1 Solubilidade ................................................................................................ 69
5.1.2 Anlise do teor de Umidade ...................................................................... 70
5.1.3 Caracterizao espectroscpica da NYS na regio do UV/V em
Metanol ........................................................................................................

70
5.1.4 Anlise fluorimtrica da NYS .................................................................... 74
5.1.5 Anlise por espectroscopia na regio do Infravermelho (IV) ................. 75

xx
5.1.6 Anlise da NYS por DSC ............................................................................ 78
5.1.7 Anlise da NYS por TGA ............................................................................ 79
5.1.8 Determinao do coeficiente de partio octanol/tampo ..................... 80
5.2 Preparao das formulaes lipossomais ............................................... 81
5.3 Caracterizao fsico-qumica das suspenses lipossomais ................ 93
5.3.1 Raio hidrodinmico .................................................................................... 93
5.3.2 Potencial Zeta ............................................................................................. 95
5.3.3 Teor de fosfato ............................................................................................ 95
5.3.4 Eficincia de encapsulao ....................................................................... 96
5.3.5 Determinao do grau de anisotropia de fluorescncia ......................... 98
5.3.6 Estudo da interao da NYS em lipossomas ........................................... 101
5.3.7 Avaliao da atividade antifngica in vitro da NYS e NYS lipossomal . 110
5.3.8 Concluses sobre as preparaes lipossomais selecionadas ............. 116
6 CONCLUSES GERAIS ............................................................................. 119
7 SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS .......................................... 123
8 REFERNCIAS BIBIOGRFICAS .............................................................. 127

xxi
ABREVIAES

AnfB: Anfotericina B
ASD: meio de cultura Agar Saboraud Dextrose
BHT: 2,6 bis (1,1-dimetil)-4-metil fenol
CLAE: Cromatografia Lquida de Alta eficincia
DMPC: 1,2-Di-meristoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DMPG: 1,2-Di-meristoil-sn-glicero-3-fosfatidilglicerol
DPPC: 1,2-Di-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DSC: Calorimetria Exploratria Diferencial
DSPC: 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina
DSPG: 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilglicerol
DTG: Termogravimetria Diferencial
ELISA: Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
FDA: Food and Drug Administration"
GUV: vesculas gigantes unilamelares
HEPES: N-[2-hidroxietil] piperazina-N-[2-cido tanosulfnico]
IgG: Imunoglobulina G
IgM: Imunoglobulina M
IV: Infravermelho
LUV: vesculas unilamelares grandes
MIC: Concentrao Inibitria Mnima
microDSC: MicroCalorimetria Exploratria Diferencial
MLV: vesculas multilamelares
MVV: vesculas multivesiculares
NYS: Nistatina
OLV: vesculas oligolamelares
PCH: fosfatidilcolina de soja hidrogenada
QELS: Espalhamento Quase-Elstico de Luz

xxii
RMN: Ressonncia Magntica Nuclear
RPMI: meio de cultura Roswell Park Memorial Institute
SUV: vesculas unilamelares pequenas
Tc: temperatura de transio de fases
TGA: Anlise Termo-Gravimtrica
UV/Vis.: Ultravioleta/Visvel
v:v : razo volume:volume

max
: comprimento de onda mximo

xxiii
NDICE DE TABELAS

Tabela 1 Classificao de lipossomas, baseada em parmetros estruturais . .. 34
Tabela 2 Solubilidade da NYS em diferentes solventes. As concentraes as
solues de NYS com os solventes testados foram de 1,94 mol.L
-1

...................................................................................................................

69
Tabela 3 Dados de regresso linear da curva de calibrao (
Mx
292 nm) .... 72
Mx
304 nm) ..... 73
Mx
320 nm) .... 73
Tabela 6 Freqncias de absoro caractersticas das vibraes de ligao
da NYS Medley e Cristlia ......................................................................

76
Tabela 7 Coeficientes de partio da NYS em n-octanol/tampo succinato
(0,02 mol L
-1
; pH 5,6) isotnico a 25 e 37 C .........................................

81
Tabela 8 Teores % de NYS recuperada nas formulaes lipossomais,
contendo 10 % de NYS em relao concentrao molar de PCH,
hidratadas com Hepes (0,01 mol.L
-1
; pH 7,4) ou tampo succinato
(0,02 mol.L
-1
, pH 5,6) , isotnicos, a 55 e 65 C
...................................................................................................................

82
Tabela 9 Teores obtidos de NYS recuperada na formulao 80 % PCH e 20%
de Colesterol, hidratada com os tampes Hepes (0,01 mol L
-1
; pH
7,4) ou tampo succinato (0,02 mol.L
-1
, pH 5,6), isotnicos, 55 e 65
C ..........................................................................................................

84
Tabela 10 Teores de NYS recuperada nas formulaes lipossomais (Etapa 2),
compostas de lipdios PCH, colesterol e DSPG, contendo NYS
(NYS/lipdio 7 %), hidratadas com tampo succinato (0,02 mol.L
-1
) ,
isotnico, a 55 C ....................................................................................

87
Tabela 11 Teores obtidos de NYS recuperada nas formulaes: 80 % PCH e 20
% de Colesterol e 70 % PCH e 30 % de DSPG, quando as
formulaes so hidratadas com tampo succinato (0,02 mol L
-1)
;
pH 5,6 isotnico. As preparaes foram hidratadas a 55 C e foram
variadas as concentraes de lipdios de 10 a 15 mM. A relao
frmaco/lipdio de 7 para 10 %
.....................................................................................................................

88

xxiv
Tabela 12 Teores de NYS nas formulaes lipossomais compostas PCH,
colesterol e DSPG, BHT e NYS em uma relao frmaco/lipdio de 7
%, hidratadas com tampo succinato (0,02 mol.L
-1
) isotnico, a 60
C ................................................................................................................

89
Tabela 13 Teores de NYS recuperada na formulao lipossomal composta de
PCH, colesterol, DSPG, BHT e NYS numa relao frmaco/lipdio de
6,5 %; hidratada com tampo succinato (0,02 mol L
-1
), isotnico, a
55 e 60 C, modo de hidratao AU e AE
....................................................................................................................

92
Tabela 14 Teores de encapsulao de NYS em preparaes lipossomais L1 e
L2 .............................................................................................................

97
Tabela 15 Grau de anisotropia de fluorescncia (r) da NYS livre e encapsulada
em lipossomas em tampo succinato (0,02 mol L
-1
), isotnico, pH
5,6 a 25 C ................................................................................................

98
Tabela 16 Variao da fluorescncia da NYS em concentraes e
temperaturas diferentes, na ausncia e presena de lipossomas, em
tampo succinato (0,02 mol L
-1
), isotnico, pH 5,6
.....................................................................................................................

100
Tabela 17 Valores de 1/fa obtidos para a NYS encapsulada em lipossomas (L1
e L2), usando como os supressores iodeto de potssio e Acrilamida
.....................................................................................................................

110
Tabela 18 Resultados do teste de susceptibilidade in vitro (MIC(M/ml)) para
as NYSs 1 e 2 em leveduras do gnero Candida, das espcies
krusei, albicans, parapsilosis e do gnero Cryptococcus, espcie
neoforman .................................................................................................

111
Tabela 19 MIC(M/ml) para as amostras de NYS 1 e 2 em fungos dos gneros
Trichophyton (espcies rubrum, mentagrophytes e espcie
indefinida (spp.); Fusarium spp. e Aspergillus fumigatus
.................................................................................................................

112
Tabela 20 MIC(M/ml) e CFM (M/ml) para a NYS livre, NYS 1 e NYSs L1A
(hidratadas a 55 C) e L2A (hidratadas a 60 C), em leveduras dos
gneros Candida e Cryptococcus .......................................................

113
Tabela 21 MIC(M/ml) e CFM (M/ml) para dois lotes de NYS livre (NT/C
645743/Medley e 04102/2004/Cristlia) e preparaes lipossomais L1
e L2, empregando as espcies albicans e krusei
..................................................................................................................

115

xxv
Tabela 22 MIC e CFM para dois lotes de NYS livre (NT/C 645743/Medley e
04102/2004/Cristlia) e preparaes lipossomais L1 e L2,
empregando os gneros Candida (parapsilosis) e Cryptococcus
(neoformans) .........................................................................................

116

xxvi

xxvii
NDICE DE FIGURAS

Figura 1 Estruturas moleculares de NYS
S
A1, A2 e A3 ................................. 04
Figura 2 Direcionamento da encapsulao de frmacos em lipossoma
multilamelar (MLV): molculas hidrossolveis, lipossolveis e
anfipticas .........................................................................................

07
Figura 3 Ilustraes de hifas septadas mononucleadas, multinucleadas e
no septadas, presentes em de fungos filamentosos ...................

18
Figura 4 Ilustrao de hifa com esporo assexuado do tipo clamidsporo
de fungos filamentosos ....................................................................

20
Figura 5 Ilustrao de esporo assexuado do tipo artrsporo de fungo do
gnero Geotrichum ...........................................................................

20
Figura 6 Ilustrao de esporo assexuado do tipo blastsporo ................... 21
Figura 7 Ilustrao de esporo assexuado do tipo esporangisporo .......... 21
Figura 8 A Cultura, em Agar, de Aspergillus fumigatus (imagem
esquerda) e Condios de Aspergillus fumigatus (imagem central
e direita).
B Ilustrao de Condios de Aspergillus agrupados em forma
de cabea, ao redor de uma vescula ..............................................

22
Figura 9 Ilustrao de Condios de Peniccilium agrupados em forma de
pincel ..................................................................................................

23
Figura 10 Fotos de Candida albicans crescendo na forma filamentosa (
esquerda) e na forma de levedura (no centro e direita) .............

24
Figura 11 Caractersticas dos diferentes gneros de fungos filamentosos
e septados, principais causadores de dermatomicoses ...............

27
Figura 12 Onicomicose por Trichophyton rubrum .......................................... 27
Figura 13 Representao esquemtica de poro formado pela NYS em uma
membrana celular ..............................................................................

30
Figura 14 Frmulas estruturais moleculares dos fosfolipdios 1,2-Di-
estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DSPC), 1,2-Di-palmitoil-
sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC), 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-

xxviii
3-fosfatidilglicerol (DSPG) e do lipdio Colesterol ........................ 32
Figura 15 Grupos cabea de fosfolipdios encontrados em membranas
biolgicas ...........................................................................................

33
Figura 16 Seco transversal (A) de um lipossoma e (B) de uma bicamada
lipdica ................................................................................................

34
Figura 17 Transio das fases gel e lquida cristalina da bicamada lipdica
de fosfolipdio (A). Diferentes configuraes (trans e gauche)
causadas pela rotao de ligao simples C-C das cadeias acila
dos fosfolipdios (B) ..........................................................................

36
Figura 18 Possveis mecanismos de interao dos lipossomas com
clulas ................................................................................................

38
Figura 19 Esquema do mtodo de preparo de lipossomas por filme
lipdico ................................................................................................

42
Figura 20 Representao Esquemtica da hidratao e o preparo de
diferentes tipos de lipossomas ........................................................

43
Figura 21 Espectros de absoro, da NYS Medley, na regio do UV/V em
MeOH, 25C (2,6; 3,9; 5,3; 6,6; 7,9; 9,2x10
-6
; 1,0x10
-5
mol.L
-1
) ......

71
Figura 22 Curva de calibrao para solues de NYS Medley (
mx
292 nm)
.............................................................................................................

71
mx
304nm)
.............................................................................................................

72
mx
320nm)
.............................................................................................................

73
Figura 25 Espectros de fluorescncia de NYS Medley em MeOH (1,05x10
-5
;
9,2; 7,9; 6,6; 5,3; 3,9; 2,6x10
-6
mol.L
-1
) e de metanol puro ..............

74
Figura 26 Espectros no IV das amostras de NYS Medley (azul) e Cristlia
(preto) .................................................................................................

75
Figura 27 Espectros no IV da NYS dos diferentes tipos de cristalizao da
NYS A, B e C ......................................................................................

77
Figura 28 Curvas de aquecimento obtidas por DSC para as amostras de
NYS Medley (A); Cristlia (B) ...........................................................

78

xxix
Figura 29 Curvas de aquecimento obtidas por TGA da NYS Lotes: NT/C
645743/Medley e 04102/2004/Cristlia. Massas: 3,7mg (Medley) e
3,5mg (Cristlia) .................................................................................

79
Figura 30 Curvas de DTG da NYS Lotes: NT/C 645743/Medley e
04102/2004/Cristlia. Massas: 3,7 mg (Medley) e 3,5 mg
(Cristlia) ............................................................................................

80
Figura 31 Estruturas moleculares das formas isomricas interconvertveis
do antibitico NYS. A - maior atividade biologica. B - menor
atividade biolgica ............................................................................

83
Figura 32 Cromatogramas das duas formulaes (Etapa 1). (A) 80% de PC
e 20% de colesterol e teor de 98,1 0,4% de NYS e (B) 100% de
PCH e teor de 90,8 0,1 % de NYS ..................................................

85
Figura 33 Cromatogramas das formulaes com 80 % de PCH e 20 % de
Colesterol (Etapa 1). (A): tampo succinato (0,02 mol.L
-1
), pH 5,6
e 55 C; (B): tampo succinato (0,02 mol.L
-1
), pH 5,6 e 65 C; (C):
tampo Hepes (0,01 mol.L
-1
), pH 7,4 e 55 C; (D): tampo Hepes
(0,01 mol.L
-1
), pH 7,4 e 65 C .............................................................

86
Figura 34 Cromatogramas das formulaes P1 (PCH 54 %, colesterol 26 %
e DSPG 20 %) (A), P2 (PCH 80 %, colesterol 20 %) (B), P3 (PCH
70 %, colesterol 20 % e DSPG 10 %) (C) e P4 (PCH 70 % e DSPG
30 %) (D), respectivamente em tampo succinato (0,02 mol.L
-1
),
pH 5,6 e 60 C .....................................................................................

91
Figura 35 Distribuio multimodal de tamanho. (A) Preparao lipossomal
L1; (B) Preparao lipossomal L2 ....................................................

94
Figura 36 Cromatogramas da NYS presente em formulao lipossomal
MLV (L2) sem ultracentrifugar (A) e ultracentrifugada (B).
Suspenso em tampo succinato (0,02 mol.L
-1
); pH 5,6;
isotnico. O Pico com tempo de reteno prximo a 3 min o
pico do solvente e em cerca de 10 min o da NYS
............................................................................................................

96
Figura 37 Sobreposio de espectros de emisso de fluorescncia da

xxx
NYS (C = 9,9 M) nos lipossomas L1 (hidratado a 55 C) e L2
(hidratado a 60 C) aps a adio sucessiva dos agentes
supressores iodeto de potssio (A e B) e acrilamida (C e D), a
25 C. As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29
mol.L
-1
................................................................................................

103
Figura 38 Sobreposio de espectros de emisso de fluorescncia da
NYS livre (C = 9,9 M) livre em tampo succinato aps a adio
sucessiva dos agentes supressores iodeto de potssio (A) e
acrilamida (B) a 25 C. As concentraes dos supressores
variaram de 0 a 0,29 mol.L
-1
.............................................................

104
Figura 39 Grficos de Stern-Volmer relativos ao estudo da supresso de
fluorescncia no estado fixo da NYS livre (C = 9,9 M) e em
lipossomas com os supressores iodeto de potssio (A) e
acrilamida (B). As concentraes dos supressores variaram de
0 a 0,29 mol.L
-1
..................................................................................

105
Figura 40 Grficos da equao de Stern-Volmer modicada (equao 5)
empregada para supresso de fluorescncia combinada
dinmica e esttica, no estado fixo, da NYS livre (C = 9,9 M) e
em lipossomas com os supressores iodeto de potssio (A) e
acrilamida (B). As concentraes dos supressores variaram de
0 a 0,29 mol.L
-1
..................................................................................

107
Figura 41 Grficos para a equao Stern-Volmer modificada (equao 6)
para as fraes de acessibilidade ao supressor no estudo da
supresso de fluorescncia da NYS livre (C = 9,9 M) e em
lipossomas com os supressores iodeto de potssio (A) e
acrilamida (B). ). As concentraes dos supressores variaram
de 0 a 0,29 mol.L
-1
.............................................................................

108

xxxi
Figura 42 Grficos para a equao Stern-Volmer modificada (equao 6)
para os estudos da supresso de fluorescncia da NYS livre (C
= 9,9 M) e em lipossomas, com os supressores iodeto de
potssio (A) e acrilamida (B). As concentraes dos
supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L
-1
.......................................

109

_____________________________________________________________________Introduo
1

1.INTRODUO
_____________________________________________________________________Introduo
2

_____________________________________________________________________Introduo
3
Durante muitos anos a teraputica de micoses especialmente de micoses
profundas, encontrava dificuldades devido ao fato dos fungos serem clulas
eucariticas que parasitam hospedeiros com clulas da mesma natureza. Assim, as
diferenas citolgicas entre o parasito e o hospedeiro so pequenas e os frmacos que
interferem no metabolismo daqueles habitualmente agem no metabolismo dos ltimos
(TAVARES, 1984).

A Nistatina (NYS) (C
47
H
75
NO
17
) ou fungicidina (massa molar 926,13 g/mol) um
antibitico extrado principalmente de culturas de Streptomyces Nursei. Este composto
foi isolado em 1950 por Hazen e Brown da diviso de laboratrios e pesquisa do
departamento de sade do Estado de Nova York, Estados Unidos da Amrica
(MICHEL, 1972). Apresenta em sua estrutura uma lactona macrocclica (Figura 1),
consistindo de dieno tetraeno hidroxilado ligado a um ou dois grupamentos amino
acar. Devido presena de grupos carboxil e amino, a NYS anfotrica e tambm
anfiflica, pois possui uma estremidade polar e outra apolar em sua molcula (Figura 1).
A NYS pouco solvel na gua e solventes orgnicos, mas solvel em
dimetilformamida e dimetilsulfxido.

A NYS comercial representa uma mistura de compostos intimamente
relacionados. Segundo POROWSKA e col. (1972) que caracterizaram amostras de NYS
comercial, o frmaco na verdade um complexo contendo trs constituintes
biologicamente ativos, designados como NYS A1, A2 e A3 (MICHEL, 1972 &
POROWSKA e col., 1972). O principal componente do complexo o componente A1,
que apresenta em sua estrutura um amino acar, a D - micosamina ligada ao oxignio
do carbono 19 (RICKARDS & CHONG, 1970; MANWARING & RICKARDS, 1969;
BOROWSKI e col., 1971). A NYS A2 (figura 1) mostra uma estrutura muito semelhante
a A1. As diferenas esto na aglicona do antibitico, nas variaes na estereoqumica
dos grupamentos hidroxilas que carecem de uma hidroxila no carbono 10 do macrociclo
e na posio da carboxila o carbono 15. J o componente A3 possui mudanas na
estereoqumica dos grupos hidroxilas e tem um outro radical acar, a L-digitoxose,
ligada ao carbono 35 (ZIELINSKY e col., 1979; ZIELINSKY e col., 1987) (Figura1).
_____________________________________________________________________Introduo
4
Todavia A3 tem o mesmo amino acar presente nos outros dois componentes. Os
compostos A1 e A2 foram identificados por SHENIN e col., (1993) que analisaram
amostras de NYS grau farmacutico. Todavia, a designao da estrutura do
componente A2 do complexo NYS foi realizada por PAWLAK e col., (2005). A
complexidade da composio do composto NYS devida a sua obteno atravs de
processo fermentativo, onde os trs componentes so produzidos.

Nistatina A1

Nistatina A2

Nistatina A3
Figura 1. Estruturas moleculares de NYS
S
A1, A2 e A3 (Borowski e col., 1971; Zielinsky e col.,
1987; Pawlak e col., 2005).
_____________________________________________________________________Introduo
5
A NYS membro de um grupo relativamente grande de compostos
estruturalmente relacionados, altamente insaturados, chamados antibiticos
antifngicos polinicos. Entre os quimioterpicos antifngicos, os antibiticos so muito
eficazes na teraputica de micoses profundas. Essa classe de compostos altera a
permeabilidade da membrana de clulas sensveis, como as clulas fngicas. A NYS
ativa frente a diversas espcies de fungos dos gneros Candida, Cryptococcus,
Aspergillus, Histoplasma, Blastomyces y Coccidioides. Contudo, os polinicos no tm
ao em clulas de protozorios, bactrias, exceto para Acholeplasma crescido na
presena de esterol, assim como contra algas azul-verdes (GALE e col., 1972).

Na prtica clnica, a NYS utilizada no tratamento da candidases superficiais de
pele e mucosas (esofgica, intestinal e vaginal). O antibitico praticamente no
absorvido por via oral, entretanto devido a sua ao superficial local, administrado
oralmente em casos de candidase bucal e intestinal (WASAN e col., 1996). Contra a
candidase vaginal empregada sob a forma de vulos e na cutnea e periungueal sob
a forma de cremes, pomadas e loes (TAVARES, 1984). Quando administrada por via
intramuscular e intravenosa muito txica, sendo capaz de causar hemlise, necrose e
abscessos frios nos locais de injeo. Isto se deve imediata ligao do frmaco aos
esteris das membranas das hemcias e clulas tissulares, causando sua destruio
(HIEMENZ & WALSH, 1996).

A NYS tem estrutura molecular similar da Anfotericina B (AnfB) mas, em alguns
casos, mostra um espectro de ao antifngica in vitro mais amplo do que esta ltima,
pois atua em fungos AnfB resistentes (GROLL e col., 1999). Entretanto, a NYS e a AnfB
apresentam problemas de pouca solubilidade em gua e de grande toxicidade para os
pacientes, quando administradas intravenosamente, como nefrotoxicidade,
tromboflebite, febre, calafrios e nuseas. Em funo disso, tem-se evitado a aplicao
parenteral da NYS (MORIBE & MARUYAMA, 2002; MORIBE & MARUYAMA, 2000).
Desde que a NYS mostra propriedades farmacolgicas diferentes daquelas da AnfB, ou
seja, maior ao sobre leveduras e alguns casos tem um espectro de ao maior do
que a AnfB, desejvel o desenvolvimento de formulao para a administrao
_____________________________________________________________________Introduo
6
intravenosa da NYS, j que se dispe no mercado farmacutico uma preparao
lipossomal de AnfB, comercializada sob o nome AMBISOME (marca registrada da
NeXstar Pharmaceuticals, Inc.) e distribuda no Brasil pela empresa United Medical.

A cincia e tecnologia envolvida na obteno de novos frmacos, sejam os
mesmos, sintticos ou de fontes naturais, tiveram grande desenvolvimento nas dcadas
de 40 e 50 e continuam, de forma desacelerada, a evoluir. A partir da dcada de 80,
molculas com efeitos teraputicos, tm sido enriquecidas por produtos obtidos pela
aplicao de processos biotecnolgicos, que utilizam princpios da engenharia gentica,
tais como fermentaes com microrganismos geneticamente modificados e cultura de
clulas de mamferos (GOMES & REIS, 2001). Mais recentemente no cenrio mundial,
tm-se observado que companhias farmacuticas pioneiras tm deixado de
comercializar novos frmacos sintticos para produzir produtos genricos, conforme
tem expirado suas patentes (http://www.sbqrio.sbq.org.br/download/set1801.pdf). Este
cenrio cria a necessidade de apresentar frmacos clssicos sob novas formas, que
podem ser novos sistemas de entrega (TYLE, 1988). Outra questo, que o
desenvolvimento de novos frmacos est relacionado aos altos custos, principalmente
em rotas sintticas e ainda se observa que pouca inovao ocorreu em relao ao
surgimento de novas formas farmacuticas mais eficientes na entrega do frmaco aos
stios de ao, registrando-se efeitos colaterais indesejveis e danos ao organismo do
paciente. Vrios frmacos empregados na teraputica, devido ao alto grau de
toxicidade, exigem que a quantidade a ser administrada seja a menor possvel, para
no causar danos aos tecidos sadios e, ao mesmo tempo, seja suficiente para atingir as
clulas alvo, aps ser absorvido e distribudo no organismo.

Teoricamente, um dos objetivos bsicos da qumica teraputica entregar a
substncia medicinal especfica e eficientemente ao local da doena ou distrbio. Em
geral isto pode ser conseguido pela administrao do frmaco por via oral (em forma de
cpsulas, comprimidos, suspenses, solues, entre outras.), nasal, transdrmica
(tpica), intramuscular, endovenosa, subcutnea, entre outras. Em muitos casos,
entretanto, a eficcia do frmaco pode ser melhorada, e os efeitos colaterais reduzidos,
_____________________________________________________________________Introduo
7
encapsulando-o em algum tipo de transportador. Idealmente, este dever vetorizar o
frmaco em concentrao adequada e apenas no local onde o mesmo necessrio,
evitando a sua perda, degradao e a ocorrncia de efeitos colaterais indesejveis
(PRISTA e col., 1996).

Os lipossomas so vesculas lipdicas, onde uma fase aquosa totalmente
cercada por uma ou mais lamelas (bicamadas de fosfolipdios), constituindo, ao lado de
aerossis, hidrogis, micro/nanopartculas polimricas, "patches" um dos sistemas mais
importantes para encapsulao e liberao sustentada de frmacos in vivo. Eles podem
encapsular ingredientes hidroflicos, hidrofbicos ou anfiflicos. Drogas hidroflicas tm
tendncia a permanecer no compartimento central aquoso e drogas
hidrofbicas/anfiflicas encontram-se inseridas na bicamada lipdica (Figura 2). As
drogas lipoflicas permanecem mais tempo encapsuladas devido ao alto
particionamento na fase membranar (SHARATA, 1996).

Figura 2. Direcionamento da encapsulao de frmacos em lipossoma multilamelar (MLV):
molculas hidrossolveis, lipossolveis e anfipticas.(Arajo e col,2003).

Os sistemas lipossomais tm sido testados com sucesso como transportadores
_____________________________________________________________________Introduo
8
de diversos frmacos, material gentico e enzimas para o interior de clulas. So
atxicos, pouco imunognicos, biodegradveis e capazes de proteger os compostos
encapsulados da diluio e degradao no sangue, de forma que quando alcanam os
tecidos que necessitam de tratamento podem liberar doses concentradas de frmaco
aumentando sua ao teraputica. Entretanto, ao circularem na corrente sangunea, os
lipossomas funcionam como corpos estranhos, sendo rapidamente atacados pelos
macrfagos que, assim, passam a transportar os frmacos veiculados nos lipossomas.
Compostos antimicrobianos lipossomados podem penetrar em clulas do sistema
mononuclear fagocitrio onde microrganismos patognicos residem, causando a morte
do agente microbiano (PRISTA e Col., 1996 & LASIC, 1993). O tamanho dos
lipossomas determina o grau de reconhecimento pelo Sistema Mononuclear Fagocitrio
(SMF) e determina a velocidade de retirada dos mesmos da circulao sangunea.

Para uso humano, os sistemas lipossomais tm sido empregados para reduzir a
toxicidade clnica sistmica de frmacos aumentando, assim, a eficcia teraputica de
agentes antimicrobianos, antineoplsicos e outros (TORCHILIN, 2005). OFFNER e col.,
(2004) avaliaram a atividade e segurana da nistatina lipossomal, numa dose de 4
mg/kg, em pacientes com aspergilose invasiva refratria ou intolerante a AnfB, estes
pesquisadores verificaram que a NYS lipossomal foi efetiva contra a aspergilose
invasiva, todavia alguns efeitos adversos observados para a AnfB, tambm foram para
a NYS lipossomal, como: tremores calafrios, febre, hipo ou hipertenso e taquicardia .
Outros autores, tambm comprovaram que a NYS incorporada em lipossomas, nas
doses de 2 a 6 mg/kg, demonstrou significante reduo da toxicidade enquanto que a
atividade antifngica foi preservada (CARRILLO-MUNOZ e col., 1999; GROLL e col.,
1999; JOHNSON e col., 1998; MEHTA e col., 1987; OAKLEY e col., 1999). A utilidade
de formulaes lipossomais em clnica mdica comprovada pela aprovao da
agncia controladora norte-americana, "Food and Drug Administration" (FDA), de
formulaes lipossomais para entrega de algumas substncias com atividade
antineoplsica (DOXIL
com doxorrubicina e DAUNOSOME
com daunorrubicina) e
antifngica (AMBISOME
com Anfotericina B), j comercializadas em vrias partes do

mundo.
_____________________________________________________________________Introduo
9
Uma formulao lipossomal de NYS (NYOTRAN
) foi preparada pela Aronex

Pharmaceuticals, com boa atividade em ratos. A referida formulao j se encontra em
aplicao clnica e para obteno da nistatina lipossomal os autores utilizaram os
lipdios Dimiristoilfosfatidilcolina (DMPC) e Dimiristoilfosfatidilglicerol (DMPG) em
uma razo mssica de 7:3. A formulao apresenta tamanho de partculas que variam
de 0,1 a 3 M porm as propriedades fsicas da formulao ainda no esto bem
compreendidas (MEHTA e col., 1987, TORCHILIN, 2005). Sendo assim, plenamente
justificado um trabalho no sentido de preparar e caracterizar formulaes lipossomais
contendo NYS.

Os sistemas lipossomais podem ser estudados em relao a fatores como
eficincia de encapsulao, tamanho, teor de fosfolipdios na formulao, entre outros.
Na caracterizao desses sistemas podem ser utilizadas vrias tcnicas analticas
como espectroscopia (de absoro UV/Vis, de emisso, IV e RMN), espalhamento de
luz, calorimetria diferencial de varredura (DSC), Cromatografia Lquida de Alta
Eficincia (CLAE). preciso, tambm, avaliar a atividade dos lipossomas em sistemas
biolgicos in vitro e in vivo.
_____________________________________________________________________Introduo
10

______________________________________________________________________Objetivos
11

2.OBJETIVOS
______________________________________________________________________Objetivos
12

______________________________________________________________________Objetivos
13
Os objetivos deste trabalho foram:

1) desenvolver e otimizar formulaes lipossomais contendo o frmaco NYS;

2) selecionar formulaes em que o frmaco apresentasse maior estabilidade
qumica;

3) caracterizar as formulaes lipossomais de NYS fsico-quimicamente;

4) testar a atividade in vitro das formulaes lipossomais contendo NYS.
______________________________________________________________________Objetivos
14
____________________________________________________________Reviso Bibliogrfica
15

3.REVISO BIBLIOGRFICA
16

17
3.1.Fungos

Fungos (do latim fungus = cogumelo) so seres eucariticos, com um s ncleo,
como as leveduras, ou multinucleados, como os fungos filamentosos ou bolores. As
clulas de fungos podem apresentar uma membrana citoplasmtica, que mais
externamente, apresentam uma parede celular que reveste o citoplasma e organelas
dispersas. So tambm revestidas por membranas semelhantes o retculo
endoplasmtico, aparelho de Golgi, ribossomos, mitocndrias, vacolos, ncleo e
nuclolo. As membranas celulares fngicas contm esteris, assemelhando-se s
membranas de organismos superiores, como as dos mamferos. As clulas fngicas
possuem vida independente e no se organizam em tecidos e os componentes
principais da parede celular so hexoses e hexosaminas. Alguns fungos apresentam
parede rica em quitina (N-acetil glicosamina). Outros possuem complexos de
polissacardeos e protenas, com predominncia de cistena. Fungos do gnero
Cryptococcus, como o Cryptococcus neoformans, apresentam cpsula de natureza
polissacardica que envolve a parede celular (TORTORA e col., 1993).

Os fungos constituem um grupo de organismos que no possuem clorofila e so
ditos hetertrofos por absoro, pois suas hifas, no caso de fungos filamentosos
(filamentos tubulares), crescem penetrando os substratos orgnicos e neles lanando
suas enzimas digestivas. Os produtos finais solveis, resultantes da digesto, so lenta
e continuamente absorvidos. A gua utilizada na solubilizao das enzimas e
indispensvel na ao das mesmas. Desta forma, justifica-se o bom desenvolvimento
dos fungos em ambientes midos (PELCZAR e col., 1996). Para seu desenvolvimento,
esses organismos exigem sempre uma fonte de carbono, que ser utilizada como
material energtico. Necessitam ainda de fontes de nitrognio, que podem ser
inorgnica (NO
3
-
e NH
4
+
) ou orgnica (aminocidos, polipeptdeos e protenas). s
vezes, certas substncias como aminocidos, podem funcionar como fontes de carbono
e nitrognio. Os fungos podem ser saprobiticos (ou saprfitas) e parasitas (facultativos
ou obrigatrios), conforme vivam de fontes de alimentos existentes livres ou em
hospedeiros (PELCZAR e col., 1980).
18
Dependendo da forma como os fungos se desenvolvem em meios de cultura,
pode-se classific-los em leveduriforme e filamentosos. As colnias leveduriformes so
pastosas ou cremosas, formadas por microrganismos unicelulares ovais ou esfricos,
geralmente com largura de 1 a 5 m e comprimento de 5 a 30 m, chamados
leveduras. Esses microrganismos cumprem funes vegetativas (de crescimento) e
reprodutivas. As colnias filamentosas podem ser algodonosas, aveludadas ou
pulverulentas; so constitudas fundamentalmente por elementos multicelulares em
forma de tubo, as hifas (do grego hyphe= teia). Essas estruturas so filamentos
tubulares ramificados com cerca de 2 a 10 m de largura, podendo ser contnuas ou
septadas. As no-septadas, tambm denominadas cenocticas, so multinucleadas. J
as septadas podem ser: mono e multinucleadas (Fig. 3). As hifas septadas tm um
septo que divide os filamentos em clulas distintas. Entre essas clulas ocorre migrao
do citoplasma e ncleos por poros existentes em cada septo (TORTORA e col., 1993,
PELCZAR e col, 1980).

Figura 3. Ilustraes de hifas septadas mononucleadas, multinucleadas e no septadas
multicleadas, presentes em de fungos filamentosos (Pelczar e col., 1980).

As hifas crescem pelo alongamento de suas pontas (crescimento apical) e pela
19
produo de ramificaes laterais. Em geral, as hifas formam um conjunto de estruturas
tubulares microscpicas, junto ao substrato (fonte de alimento), chamada de miclio
vegetativo (ALEXOPOULOS e col., 1996). J outras hifas, relacionadas reproduo,
correspondem ao miclio reprodutivo ou areo. O miclio areo se projeta na superfcie
e cresce acima do meio de cultura. Quando o miclio areo se diferencia por apresentar
clulas reprodutivas ou esporos (propgulos), constitui o miclio reprodutivo. Este
cresce em contato com o ar e dissemina os esporos produzidos. Outras hifas podem
organizar-se em estruturas grandes para formar fungos corpulentos, como cogumelos,
por exemplo: bufa-de-lobo e orelha-de-pau (TORTORA e col., 1993; PELCZAR e col.,
1996).

A reproduo ocorre por formao de esporos. Os esporos so classificados,
segundo sua origem, em sexuados e assexuados. Embora o miclio vegetativo no
tenha especificamente funes de reproduo, alguns fragmentos de hifa podem se
desprender do miclio vegetativo e cumprir funes de propagao, uma vez que as
clulas fngicas so autnomas. Os esporos assexuais so produzidos por um fungo
individual atravs de mitose e consecutiva diviso celular. Entre os esporos assexuados
podem ser citados os clamidsporos, artrsporos, blastsporos, esporangisporos e
conidisporos (PELCZAR e col., 1980).

Os clamidsporos (Fig. 4) tm funo de resistncia, semelhante dos esporos
bacterianos. So clulas, geralmente arredondadas, de volume aumentado, com
paredes duplas e espessas que limitam o citoplasma. Sua localizao no miclio pode
ser apical (terminal) ou intercalar. Esses esporos se formam em condies ambientais
adversas, como escassez de nutrientes, de gua e temperaturas no favorveis ao
desenvolvimento fngico. Um fungo que produz clamidsporo a Candida albicans
(TORTORA e col., 1993).
20

Figura 4. Ilustrao de hifa com esporo assexuado do tipo clamidsporo de fungos
filamentosos ( Pelczar e col., 1980).

Os artrsporos (Fig. 5) so formados por fragmentao das hifas septadas em
segmentos retangulares. So encontrados nos fungos do gnero Geotrichum,
Coccidioides immitis e em dermatfitos (TORTORA e col., 1993).

Figura 5. Ilustrao de esporo assexuado do tipo artrsporo de fungo do gnero Geotrichum
(SwateK, 1967).

Os blastsporos, tambm denominados gmulas, so comuns nas leveduras e
se derivam por brotamento da clula-me. Em alguns casos, os blastsporos
permanecem ligados clula-me, formando cadeias, as pseudo-hifas, cujo conjunto
o pseudomiclio, como se pode visualizar na Fig. 6 (TORTORA e col., 1993).
21

Figura 6. Ilustrao de esporo assexuado do tipo blastsporo (Alexopoulos e col., 1996).

Os esporangisporos (Fig. 7) so formados no interior de uma espcie de saco
(esporngio), situado ao final de hifas areas denominadas esporangiforo. A liberao
dos esporos se realiza pela clivagem do citoplasma dos esporngios. Esse tipo de
esporo produzido pelo gnero Rhizopus (TORTORA e col., 1993).

Figura 7. Ilustrao de esporo assexuado do tipo esporangisporo (Pelczar e col.,
1980).

Um quinto tipo de esporo assexual o conidisporo ou condios. Os
conidisporos se formam em cadeias ao final dos conidiforos, que nada mais so do
22
que ramificaes das hifas. Dependendo de suas caractersticas morfolgicas, podem
ser classificados em micro e macrocondios (PELCZAR e col., 1980). Na Fig. 8A
visualizamos-se os condios agrupados do gnero Aspergillus e na 8B os condios de
Aspergillus fumigatus

A

B
Figura 8: Cultura, em gar, de Aspergillus fumigatus (imagem esquerda) e Condios de
Aspergillus fumigatus (imagem central e direita) (A). Ilustrao de Condios de
Aspergillus agrupados em forma de cabea, ao redor de uma vescula (B)
(http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/const_micro
org/fungos.htm e Alexopoulos e col., 1996).

No aparelho de conidiao ou produtor de condios (esporos) do gnero
Aspergillus, os condios formam cadeias sobre filides, estruturas no formato de
garrafa, em torno de uma vescula que uma dilatao na extremidade do conidiforo
23
(Fig. 8).
Outros gneros, como o Penicillium, apresentam um aparelho de conidiao
onde os conidiforos se ramificam e no se verifica a presena de vescula. Como no
caso do gnero Aspergillus, os condios formam cadeias que se distribuem sobre as
filides (Fig. 9).

Figura 9. Ilustrao de Condios de Penicillum agrupados em forma de pincel(Alexopoulos e
col., 1996)

Os esporos sexuados fngicos so os resultados do processo de reproduo
sexual meitico, que compreende as fases: 1) um ncleo haplide (metade dos
cromossomos da espcie) de uma clula doadora (macho) penetra no citoplasma de
uma clula receptora (fmea); 2) os ncleos macho e fmea se fundem para formar um
ncleo diplide; 3) atravs de meiose, o ncleo diplide d surgimento a quatro ncleos
haplides (PELCZAR e col., 1980). ALEXOPOULOS e col., (1996) postularam que a
reproduo sexual em muitos fungos envolve a formao de esporos especializados.
Os quatro tipos que tm sido observados so osporos, zigsporo, ascsporo e
basidisporo.

Os fungos produzem esporos sexuais com menos freqncia que os assexuais e
s se reproduzem por processo sexual em determinadas condies, como em casos de
variaes de umidade, temperatura e disponibilidade de nutrientes (PELCZAR e col.,
24
1980).

3.2.Dimorfismo fngico

Alguns fungos e especialmente alguns patognicos apresentam dimorfismo, ou
seja, duas formas de crescimento: filamentosa e leveduriforme, como ilustrado na Fig.
10 (PELCZAR e col., 1996).

Figura 10. Fotos de Candida albicans crescendo na forma filamentosa ( esquerda) e na
forma de levedura (no centro e direita) (Pelczar e col., 1996).

Os fungos dimrficos podem ter morfologia diferente, conforme as condies
nutricionais e a temperatura de seu meio de desenvolvimento. Esse fenmeno de
variao morfolgica, muito importante em micologia mdica se expressa por um
crescimento micelial entre 22 C e 28 C e leveduriforme entre 35 C e 37 C. Em geral,
as formas so reversveis. A fase micelial ou saproftica a forma infectante e est
presente no solo e nas plantas. A fase leveduriforme ou parasitaria encontrada nos
tecidos. O fenmeno de dimorfismo fngico se observa entre os fungos de importncia
mdica, como Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides
brasiliensis, Sporothrix schenckii. Na Candida albicans, a forma saproftica infectante
a leveduriforme e a forma parasitria, isolada dos tecidos, a micelial. Em laboratrio,
possvel reproduzir o dimorfismo mediante variaes de temperatura de incubao, de
tenso de O
2
e de meios de cultura especficos (PELCZAR e col., 1980)

Ainda que o pH mais favorvel ao desenvolvimento dos fungos esteja entre 4 e
7, a maioria dos fungos tolera amplas variaes de pH (ALEXOPOULOS e col., 1996).
25
Os fungos filamentosos podem crescer em meio cujo pH est entre 1,5 e 11, mas as
leveduras toleram pouco o meio alcalino e se desenvolvem bem em meios com pH
ajustados 3,5 e 3,8. Em geral os limites de tolerncia de pH para leveduras de 2,2 e
8,0, de acordo com as diversas espcies (PELCZAR e col., 1980).

O crescimento de fungos mais lento que o das bactrias e suas culturas
precisam, em mdia, de 7 a 15 dias, ou mais, de incubao. Com a finalidade de evitar
o desenvolvimento bacteriano que pode inibir ou se sobrepor ao do fungo, necessrio
incorporar, aos meios de cultura, agentes antibacterianos de largo espectro, como o
cloranfenicol. Tambm se pode acrescentar cicloheximida, para diminuir o crescimento
de fungos saprfitas contaminantes de culturas de fungos patognicos (ZAITZ C. e col.,
1998).

Muitas espcies fngicas exigem luz para seu desenvolvimento, outras so por
ela inibidos e outras ainda mostram-se indiferentes a esse agente. Em geral, a luz solar
direta, devido radiao ultravioleta, elemento fungicida (ALEXOPOULOS e col.,
1996).

Por diferentes processos, os fungos podem elaborar vrios metablitos, como
antibiticos, como a penicilina (Penicillium chrysogenum) e as cefalosporinas
(Cephalosporium acremonium); agentes imunossupressores como a ciclosporina
(Cylindrocarpon lucidum e Tolypocladium inflatum); lcoois (etanol saccharomyces
cerevisae); cidos orgnicos (cido ctrico (Aspergillus niger)), enzimas (amilase,
celulase, lpase e pectinase (Aspergillus niger)) e micotoxinas, como aflatoxinas
(Aspergillus flavus e A. parasiticus) que confere aos fungos, um importante papel nas
reas: farmacutica, agrcola e alimentcia (ALEXOPOULOS e col., 1996, PELCZAR e
col., 1980).

3.3.Infeces fngicas

As infeces fngicas so denominadas micoses e so classificadas,
26
geralmente, como micoses superficiais e sistmicas. As micoses superficiais localizam-
se nas camadas superficiais da pele e seus anexos, bem como nas mucosas e zonas
cutneo-mucosas. As micoses superficiais podem ser subdivididas em cutneas e
subcutneas. J as infeces sistmicas ou profundas afetam os tecidos e rgos de
indivduos imunodeprimidos (RANG e col., 2004; LACAZ e col., 2002).

Existem condies ambientais, hbitos e condies de sade humanas que
favorecem o desenvolvimento de micoses superficiais e sistmicas. Com relao s
micoses superficiais, os fatores que favorecem seu desenvolvimento so calor e
umidade ambiente, uso de roupas e sapatos impermeveis (botas de borracha, tnis,
roupas de nylon), deficincias nutricionais (avitaminoses, anemia, desnutrio),
transpirao abundante e presena de feridas e machucados na pele. No caso das
micoses sistmicas, como o principal mecanismo de proteo do hospedeiro ao fungo
a resposta imunolgica celular, as doenas imunossupressivas que diminuem a ao
dos linfcitos T predispem o hospedeiro a infeces fngicas oportunistas; portanto,
so considerados suscetveis a infeces oportunistas indivduos infectados pelo vrus
HIV, ps-transplantados, neutropnicos, com neoplasias, alm daqueles
imunodeprimidos por drogas ou outras patologias (LAZZARINI e col., 1999).

As micoses so produzidas por diversos tipos de fungos, de diferentes gneros e
espcies. Alguns afetam tecidos queratinizados como cabelos, unhas, plos e o extrato
crneo da epiderme, produzindo as dermatomicoses (micoses superficiais), tambm
chamadas Tinhas. Os agentes etiolgicos responsveis pelas dermatomicoses so
principalmente os gneros de fungos filamentosos Tricoppytum, Microsporum e
Epidermophyton, que apresentam diferenas morfolgicas relativas ao nmero de
macro e microcondios, as estruturas responsveis pela reproduo assexuada dos
fungos (Fig. 11) (MAZN e col., 1997; RUBIO e col., 1999).

27

Figura 11.Caractersticas dos diferentes gneros de fungos filamentosos e septados, principais
causadores de dermatomicoses ([http://ib.ufpel.edu.br/dermatomicose.pdf).

As dermatomicoses promovem descamaes e ulceraes da pele, placas de
calvcie, infeces da bainha de plos e unhas. Na Fig. 12, visualiza-se a onicomicose
provocada pelo dermatfito Trichophyton rubrum.

Figura 12. Onicomicose por Trichophyton rubrum([http://ib.ufpel.edu.br/dermatomicose.pdf).

As micoses sistmicas so produzidas por fungos patognicos capazes de
invadir rgos e tecidos sadios, se multiplicar e provocar dano tecidual. Os fungos ditos
patognicos pertencem s espcies Histoplasma capsulatum, Coccidiodes imitis,
Paracoccidiodes brasiliensis, Blastomices dermatitides e Esporotrix schenkii. Todavia,
fungos oportunistas, que normalmente so incuos para indivduos imunocompetentes,
28
podem promover micoses severas. Entre eles citam-se: Candida albicans e espcies
no albicans to ou mais freqentes, especialmente a Candida tropicalis, Candida
parapsilosis, Cndida glabrata e Candida krusei; e outras espcies; Aspergillus
fumigatus, Cryptococus neoformans, Fusarium sp.(ZAITZ e col., 1998).

H tempos, infeces superficiais graves por fungos eram relativamente raras e
as sistmicas ainda mais. Nos ltimos 35 anos, houve um aumento uniforme na
incidncia de infeces fngicas sistmicas secundrias graves. Os fatores envolvidos
nesse aumento tem sido o uso disseminado de antibiticos de amplo espectro, a
presena de indivduos com reduo da resposta imune devido AIDS (Sndrome da
Imuno Deficincia Adquirida) ou ao de agentes imunossupressores ou frmacos
utilizados na quimioterapia do cncer. Estes fatores levaram a um aumento na
prevalncia de infeces oportunistas (http://www.cumc.columbia.edu/research/Faculty
_Profiles/profiles/mitchell_ap.htm). No Brasil, as doenas sistmicas mais comuns so:
candidase sistmica, criptococose e histoplasmose, sendo o Cryptococcus neoformans
o agente que infecta 10% dos pacientes com AIDS, causando meningite. A infeco
pela referida espcie fngica ainda no tem tratamento eficaz; logo, apresenta altos
ndices de mortalidade
(http://caibco.ucv.ve/caibco/CAIBCO/Vitae/VitaeOcho/Articulos/Micologia/ArchivosPDF/
Micologia.PDF; http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/guia bolso 5ed2.pdf.

No panorama internacional, verifica-se que a sepse fngica vem se tornando
freqente nas unidades de terapia intensiva peditrica e neonatal. Entre os agentes
etiolgicos identificados encontram-se a Candida spp., Aspergillus spp. e Fusarium spp.
A taxa de mortalidade elevada e varia de 15% a 50% (LEIBOVITZ, 2002). Novos
antifngicos esto sendo empregados, como novos compostos triazlicos, o voriconazol
e o acetato de caspofungina (equinocandina). A caspofungina um antifngico
lipopeptdico que inibe a enzima -1-3-D-glucano sintetase, envolvida na sntese de
polissacardeo vital para a formao da parede celular de fungos filamentosos e
leveduras e no presente em clulas de mamferos (ARKADER e CARVALHO, 2006).
No entanto, o emprego de antifngicos mais antigos em carreadores de frmacos como
29
os lipossomas devem ser mais uma opo no combate s micoses sistmicas.

3.4.Antibiticos antifngicos polinicos

Os antibiticos polinicos constituem um grupo de substncias ativas contra os
fungos. Apresentam ao fungisttica e fungicida sobre organismos sensveis. Contudo,
so substncias txicas para o homem e outros mamferos, por provocarem leses
celulares. O mecanismo de ao destes polinicos envolve a interao do frmaco com
esteris existentes na membrana do microrganismo (TAVARES, 1984). Os antibiticos
antifngicos so compostos amplamente usados no tratamento de infeces fngicas
tpicas e invasivas em humanos (ZOTCHEV, 2003). A principal vantagem dos
polinicos sobre outros frmacos antifngicos, como azis e flucitozinas, a ao
fungicida e a baixa incidncia de patgenos resistentes. As aes fungicidas dos
antibiticos macroldeos dependem estritamente da presena de esteris na membrana
das clulas sensveis (BOLARD, 1986).

Mecanismo de ao

O mecanismo de ao da NYS e de outros antibiticos polinicos caracteriza-se
pela sua ligao ao ergosterol presente na membrana citoplasmtica de fungos
sensveis, resultando em alteraes na permeabilidade da membrana pela formao de
poros intramembranares, ocasionando perda dos componentes vitais intracelulares, tais
como ons e pequenas molculas, resultando na morte celular (Fig. 13) (LEIBOVITZ,
2002). Em geral, os antibiticos polinicos tm maior afinidade pelo esterol fngico, o
ergosterol, do que o das clulas de mamferos, o colesterol, pois o ergosterol possui
uma estrutura mais rgida que o colesterol (FRANZINI, 2006). Sendo assim, os
antibiticos polinicos so menos txicos para as clulas de mamferos (MICHEL, 1972;
NG e WASAN, 2003).

A estrutura dos poros formados pela nistatina em membranas ricas em ergosterol
no est clara. (HELRICH e col., 2006). Contudo, COUTINHO A. e col., (2004)
30
declaram que a partir de estudos espectroscopia de fluorescncia, realizadas em
lipossomas, LUV (Vesculas Unilamelar grande), contendo ergosterol e POPC (1-
palmitoil-2-oleil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina) e a nistatina, o frmaco pode apresentar
duas fases distintas em seu modo de ao. Na primeira fase, molculas do antibitico
se ligam superfcie da bicamada lipdica (Nistatina monomrica) e numa fase posterior
quando o nmero mdio de molculas atinge um valor crtico de 100
molculas/lipossoma acorre formao de agregados moleculares (oligmeros) que
passam ao modelo clssico de nistatina transmembrana, ocorrendo a formao dos
poros.

Figura 13. Representao esquemtica de poro formado pela NYS em uma membrana
celular(Adaptado de Lasic, 1993).

A ausncia de ergosterol nas membranas de bactrias pode explicar porque esse
antibitico no capaz de afetar o crescimento daqueles microrganismos.

31
3.5.Lipossomas

Os lipossomas so estruturas lamelares constitudas por sistemas lipdio:gua e
foram descritas em meados dos anos 60 do sculo XX, por BANGHAM e col que
estudaram a hidratao de filmes lipdicos depositados nas paredes de frascos de vidro.
Os referidos pesquisadores observaram que as molculas do lipdio se organizavam em
bicamadas formando estruturas vesiculares microscpicas, que posteriormente, foram
denominadas genericamente lipossomas por SESSA e WEISSMANN, que mostraram
que estas vesculas, em seu interior encerravam um compartimento aquoso (SANTOS e
CASTANHO, 2002). Na realidade, essas estruturas se formam espontaneamente
quando os lipdios (especialmente fosfolipdios) so dispersos em meio aquoso,
originando uma populao de vesculas esfricas com dimenses coloidais (cujo
dimetro pode variar de 0,02m a 100m) limitadas por duas ou mais camadas
lipdicas, cuja espessura , aproximadamente, de 4nm. Os lipossomas ganharam
bastante popularidade como modelos para estudos sobre propriedades de membranas
celulares (SANTOS & CASTANHO, 2002; PAPAHADJOPOULOS & WATKINS, 1967) e,
mais recentemente como carreadores de frmaco (TORCHILIN, 2005).

Os lipdios empregados no preparo dos lipossomas so substncias anfiflicas,
caracterizadas por apresentarem grupamentos hidroflico e hidrofbico na mesma
molcula. Os referidos lipdios so compostos por duas cadeias hidrocarbnicas,
tambm denominadas caudas hidrofficas, ligadas a um grupo hidroflico, comumente,
denominado como cabea polar. Os lipdios que contenham grupo fosfato na cabea
polar so chamados fosfolpidios e constituem a principal classe de lipdios das
membranas biolgicas. Na Fig. 14, so apresentadas as frmulas estruturais
moleculares de trs fosfolipdios utilizados no presente trabalho, alm do colesterol.

32

DPPC

DSPC

DSPG

Colesterol
Figura 14. Frmulas estruturais moleculares dos fosfolipdios 1,2-Di-estearoil-sn-glicero-3-
fosfatidilcolina (DSPC), 1,2-Di-palmitoil-sn-glicero-3-fosfatidilcolina (DPPC), 1,2-Di-
estearoil-sn-glicero-3-fosfatidilglicerol (DSPG) e do colesterol (www.avantilipids.com).

Alm do grupo fosfato, a frao polar do fosfolipdio, pode conter os grupos
cabea: etanolamina, colina, glicerol e inositol, encontrados em fosfolipdios de
membranas biolgicas, como mostra a Figura 15. As cabeas polares podem ser
carregadas (positiva ou negativamente) e zwitterinicas (carga lquida nula), dependo
das cargas dos grupos cabea e fosfato.
33

Figura 15 Grupos cabea de fosfolipdios encontrados em membranas biolgicas (Adaptado
de New, 1990)

Em geral, as molculas de fosfolipdios so insolveis em gua e nesse meio
formam estruturas agregadas decorrentes da organizao das molculas. A parte
hidroflica do fosfolipdio ser seletivamente hidratada e as cadeias hidrocarbnicas
hidrofbicas preferem ficarem escondidas no interior da estrutura formada, ou seja,
minimiza-se contato com meio aquoso. As molculas de fosfolipdios se mantm juntas,
lado a lado formando folhetos separados por compartimentos aquosos. Dependendo
da concentrao, da estrutura molecular dos lipdios, da temperatura, do teor de gua
no meio, pH e fora inica, pode se ter diferentes estruturas agregadas, como as
bicamadas lipdicas (lamelas) que se unem para formar um folheto bidimensional ou
folheto que se dobra entre si formando uma esfera, denominada lipossoma (LASIC,
1993). Esquemas da seco transversal de um lipossoma e de uma bicamada lipdica
podem ser observados na Fig. 16.

34

A B
Figura 16. Seco transversal (A) de um lipossoma e (B) de uma bicamada lipdica.

Dependendo do nmero de lamelas contidas nos lipossomas, estes podem ser
classificados em multilamelares, MLV (vrias lamelas separadas por compartimentos
aquosos) ou unilamelares com uma nica lamela. Os lipossomas unilamelares podem
ser classificados pelo tamanho; grandes e pequenos (LUV) e (SUV), respectivamente.
Na Tabela 1, tem-se a classificao de lipossomas de acordo com seus parmetros
estruturais (tamanho e nmero de lamelas) (BERENHOLZ e CROMMELIN, 1994).

Tabela 1 Classificao de lipossomas, baseada em parmetros estruturais.
Classificao do Lipossoma Tamannho
MLV Vesculas Multilamelares > 0,5m
OLV Vesculas Oligolamelares 0,1-1m
UV- Vesculas Unilamelares todos os tamanhos
SUV Vesculas Unilamelares pequenas 20-100nm
LUV Vesculas Unilamelar grande > 100nm
GUV Vesculas Unilamelares gigantes > 1m
MVV Vesculas Multivesicular > 1m

Quando so selecionados os lipdios que vo compor uma formulao
lipossomal, tem-se que considerar questes como temperatura de transio de fases
(Tc), estabilidade qumica, carga, fonte de lipdios, presena de colesterol na
composio. Em sistemas compostos de um tipo de lipdio, agregado em bicamadas, a
35
temperatura de transio de fase principal corresponde temperatura requerida para
induzir uma mudana no estado fsico do lipdio agregado de uma fase gel, mais
ordenada, quando as cadeias hidrocarbnicas encontram-se totalmente estendidas e
apresentando uma estrutura inclinada, em configurao toda-trans e empacotadas, para
uma fase lquida cristalina desordenada, na qual as cadeias hidrocarbnicas dos lipdios
esto menos orientadas e fluidas, em configurao trans-gauche (Fig. 17) (SMALL,
1986 e NEW, 1990). Na escolha de lipdios para uma formulao lipossomal deve-se
selecionar aqueles que apresentem altas temperaturas de transio de fase
(fosfolipdios com cadeias hidrocarbnicas longas), grande estabilidade qumica, ou
resitncia a oxidao (cadeias acilas saturadas) e presena de colesterol na
composio lipdica (LASIC, 1993). A presena de ncleos rgidos planares de
colesterol na bicamada lipdica tem o efeito de mudar a fluidez da bicamada lipdica na
fase gel, tornando-a mais fluida na referida fase. A mudana na fluidez seguida por
mudanas na permeabilidade da membrana, diminuda em temperatura maior do que
Tc, mas aumentada em temperaturas menores que Tc, assim, impedindo o escape dos
compostos encapsulados (NEW, 1990). A utilizao da combinao fosfolipdios
neutros e com carga negativa pode favorecer a repulso entre as partculas
lipossomais, devido carga e formao de partculas com menores tamanhos.

36

A

B
Figura 17. Transio das fases gel e lquida cristalina da bicamada lipdica de fosfolipdio (A).
Diferentes configuraes (trans e gauche) causadas pela rotao de ligao simples
C-C das cadeias acila dos fosfolipdios (B) (Adaptado de New, 1990).

As bicamadas dos lipossomas so qumica e biologicamente compatveis com as
membranas celulares, o que facilita a entrega de frmacos, aumentando a eficincia
teraputica. Os lipossomas podem, ainda, ser modificados quimicamente pela insero
de polmeros como o polietileno glicol 2000 na bicamada, para escapar do
patrulhamento exercido pelas clulas do sistema imunolgico e aumentar sua interao
37
com tecidos doentes, reduzindo seu acmulo nos tecidos sadios.

Neste trabalho, foram produzidos lipossomas convencionais, definidos como
aqueles tipicamente compostos de fosfolipdios (neutros e negativamente carregados) e
colesterol. Os lipossomas convencionais so caracterizados tambm por um tempo
relativamente curto de circulao no sangue, quando administrados in vivo por via
parenteral, geralmente intravenosa (STORM e CROMMELIN, 1998). A literatura contm
muitos exemplos de aplicaes com sucesso de lipossomas convencionais, tendo como
alvo macrfogos infectados, como na vetorizao de agentes antimicrobianos
(BAKKER-WOUDENBERG, 1995; RASTOGI e col., 2006) e de imunomoduladores que
vo aumentar a capacidade dos macrfagos em destruir clulas neoplsicas e
aumentar a resistncia contra microrganismos infecciosos (DAEMEN, 1992; VASIR e
col., 2005). Lipossomas convencionais tambm so usados para entrega de antgenos.
Os lipossomas empregados como vacinas tm sido efetivos em modelos experimentais
contra vrus, bactrias e parasitas (GREGORIADIS, 1994; ALVING, 1995; TORCHILIN,
2005).

3.5.1. Aplicaes de lipossomas em medicina

As aplicaes de lipossomas em medicina podem ser divididas em aplicaes
teraputicas e diagnsticas. Os lipossomas podem veicular frmacos e agentes de
contraste (marcadores) importantes no diagnstico de vrias patologias. Podem,
tambm, ser empregados como modelo, ferramenta ou reagente em estudos bsicos
sobre interaes celulares, processos de reconhecimento e modo de ao de certas
substncias (LASIC, 1993).

Devido a sua estrutura de bicamadas, semelhante das membranas celulares,
os lipossomas so capazes de interagir profundamente com as clulas do organismo.
Os benefcios e limitaes de lipossomas utilizados como carreadores de frmacos
dependem da interao dos mesmos com clulas e seu destino in vivo aps a
administrao. Estudos in vitro e in vivo mostraram que a interao predominante de
38
lipossomas com clulas por adsoro simples e subseqente endocitose. A fuso
com membranas celulares muito mais rara. Outra possvel interao a troca de
constituintes com os da bicamada, como lipdios, colesterol e molculas ligadas a
componentes da membrana (Fig. 18) (CHORILLI e col., 2004).

Figura 18. Possveis mecanismos de interao de lipossomas com clulas(Adaptado de Chorilli
e col., 2004).

O sistema imunolgico humano apresenta um complexo sistema de defesa,
visando proteo contra agentes potencialmente perigosos que podem trazer riscos
sade do organismo. Aps a administrao intravenosa de lipossomas convencionais,
as protenas do plasma conhecidas como opsoninas (imunoglobulinas IgM e IgG,
relacionadas resposta imune inata do organismo) so rapidamente adsorvidas na
superfcie das partculas. Esta adsoro leva ao rpido reconhecimento pelas clulas do
sistema mononuclear fagocitrio (macrfagos, principalmente do bao e clulas de
Kuppfer, do fgado) e conseqente fagocitose das partculas, especialmente no fgado
39
(60 %-90 %), bao (2 %-20 %), medula ssea (0,1 %-1 %) e quantidades variadas nos
pulmes (GULYAAEV e col., 1998). Em funo disso, foram feitos estudos para reduzir
a captura das partculas coloidais pelo sistema monuclear fagocitrio, aumentar a
concentrao desses veculos no sangue e, consequentemente, no tecido ou rgo alvo
desejado (GUO e THOMAS, 2001; ELLEY, 2001). A resposta do sistema imune tem
desencadeado esforos no desenvolvimento de superfcies biocompatveis e no
reconhecveis pelo sistema de defesa humano. Desta forma, tem-se estreitado o
espectro de aplicaes de micro e nanopartculas empregadas como carreadores de
frmacos e, em alguns casos, almejando ter como alvo as referidas clulas do sistema
imunolgico.

Os lipossomas como sistemas carreadores de frmacos, podem oferecer vrias
vantagens sobre as formas farmacuticas convencionais, especialmente em relao
parenteral (injeo local, sistmica ou infuso), tpica e pulmonar. Entre elas, pode-se
citar (LASIC, 1993):

- melhora na solubilidade de frmacos lipo e anfiflicos e aumento da solubilidade de
compostos hidroflicos;

- direcionamento passivo de compostos para clulas do sistema imune, especialmente
para as do sistema mononuclear fagocitrio;

- liberao sustentada de frmacos veiculados em lipossomas, administrados local ou
sistemicamente;

- mecanismo de fuga de stios: os lipossomas geralmente no se dirigem a rgos,
como corao, rins, crebro e sistema nervoso, reduzindo a toxicidade de certos
frmacos quando incorporados nessas vesculas dirigidas aos referidos stios;

- stios-alvo especficos: em certos casos, lipossomas com superfcie ligada a certos
compostos (como anticorpos) podem ligassem a clulas-alvo ou podem ser
40
direcionados aos tecidos-alvo devido s condies anatmicas locais, como vasos
sanguneos malformados e capilares;

- aumento da insero em tecidos, de frmacos lipossolveis, especialmente no caso
de formas farmacuticas de aplicao drmicas.

Os sistemas lipossomais exibem biodistribuio e farmacocintica diferentes
daquelas das molculas do frmaco livre. GROLL e col., (1999) verificaram que a
formulao lipossomal de NYS aumentou o tempo de vida do frmaco, promoveu a
remoo efetiva do microorganismo dos pulmes de coelhos neutropnicos com
aspergilose experimental e ainda houve diminuio dos efeitos colaterais do antifngico.

3.5.2.Lipossomas em doenas parasitrias e infeces fngicas

Lipossomas convencionais so digeridos por clulas fagocticas depois de
administrados por via intravenosa sendo, portanto, veculos apropriados para direcionar
molculas de frmaco ao interior dos macrfagos. Como exemplos podem ser citados
vrias doenas parasitrias e infeces causadas por patgenos residentes nas clulas
do sistema mononuclear fagocitrio, como as leishmanioses e as infeces fngicas.
Os lipossomas acumulam-se nas clulas que esto infectadas e, portanto, servem
como veculos para a entrega de frmacos em organismos acometidos por essas
doenas (ZAITZ e col., 1998).

Os melhores resultados do emprego de lipossomas como carreadores de
frmacos so na terapia de infeces fngicas. Os frmacos antifngicos, como a AnfB
e NYS, so empregados no tratamento de infeces fngicas disseminadas que
geralmente acometem pacientes imunocomprometidos, como aqueles que passam por
quimioterapia e os HIV positivos. OFFNER e col., (2004) avaliaram a atividade da NYS
encapsulada em lipossomas no tratamento de pacientes refratratrios ou intolerantes a
AnfB com aspergilose invasiva e concluram que o frmaco em sistemas lipossomais foi
41
efetivo. Infelizmente antifngicos polinicos so txicos e seu uso limitado, devido
principalmente a nefrotoxicidade. Esta comumente associada ao tamanho das
molculas dos frmacos dessa classe de compostos. A encapsulao dos frmacos em
lipossomas previne a acumulao nos rins e reduz drasticamente a nefroxicidade
(LASIC, 1993). Geralmente os fungos residem nas clulas do sistema mononuclear
fagocitrio e a encapsulao resulta em toxicidade reduzida e entrega passiva.
MINOFIER e col., (2003) comparam a ao de AnfB em lipossomas (
AMBISOME) e
em outra formulao lipdica (
AMPHOCIL) para o tratamento de leishmania visceral

em pacientes imunodeprimidos e observaram que a formulao lipossomal apontou
maior reduo na nefrotoxicidade, que o principal efeito adverso da AnfB e da NYS.

3. 5.3.Mtodos de preparao de lipossomas

3.5.3.1.Mtodo pelo filme lipdico

O mtodo de hidratao de filme lipdico (Fig. 19) envolve trs estgios bsicos:
a) dissoluo dos lipdios constituintes da formulao em solvente ou mistura de
solventes orgnicos; b) eliminao do (s) solvente (s), presso reduzida, obtendo uma
pelcula de lipdios na parede de balo; c) disperso do filme lipdico em meio aquoso
(em geral tamponado), em temperatura superior de transio de fase dos lipdios (NG
e WASAN, 2003). Em gua, em um primeiro momento, ocorre formao de bicamadas
lipdicas e depois se atinge o equilbrio entre as foras que procuram conseguir uma
estrutura estvel (camada fosfolipdica hidratada). As foras intrabicamada consistem
de foras hidrofbicas, de hidratao, eletrostticas e as de Van der Walls que tendem
a criar interaes nas cadeias hidrocarbnicas (Lasic, 1993). Por agitao, as
bicamadas lipdicas fecham-se e produzem vesculas ovaladas que, mais tarde e
progressivamente, adquirem a forma especfica (menor energia de curvatura). Os
lipossomas assim obtidos so do tipo MLV. A Fig. 18 apresenta esquematicamente os
passos da preparao destes lipossomas.
42

Fig. 19 Esquema do mtodo de preparo de lipossomas por filme lipdico
(www.avantilipids.com/PreparationOfLiposomes.html).

A incluso dos frmacos nos lipossomas efetuada em momentos diferentes, de
acordo com sua solubilidade. Assim, compostos lipoflicos so adicionados junto com os
fosfolipdios, colesterol (quando utilizado) e antioxidantes, enquanto que os hidroflicos
so dissolvidos na fase aquosa, ou seja, no momento da hidratao.

A partir dos lipossomas multilamelares ou multivesiculares pode-se obter
lipossomas de menores dimenses, menor nmero de lamelas e unilamelares. Para
isso utilizam-se processos que consistem no emprego de ultra-som (sonicao) ou de
homogenizadores de alta presso (extruso). Tais homogenizadores exercem presso
sobre as vesculas, custa de gases inertes, obrigando as vesculas a passarem por
filtros com poros de tamanho definido, o que permite a obteno de uma populao de
vesculas com tamanho mais homogneo (Fig. 19). Na Fig. 20 observa-se o esquema
da hidratao das bicamadas lipdicas e obteno dos diferentes tipos de lipossomas.

43

Fig. 20 Representao Esquemtica da hidratao e o preparo de diferentes tipos de
lipossomas. (Adaptado de www.avantilipids.com/PreparationOfLiposomes.html).

Com a obteno dos lipossomas, devem ser realizadas operaes
complementares que promovero, principalmente, a separao do frmaco livre do
encapsulado, para posterior caracterizao da formulao lipossomal. As operaes
so a ultracentrifugao, dilise e filtrao em gel.

3.5.3.2.Mtodo de injeo de etanol

Esse mtodo corresponde ao preparo de uma soluo etanlica com os lipdios
constituintes da formulao. A soluo ento injetada, rapidamente, com auxlio de
seringa e agulha hipodrmica, em uma soluo aquosa tamponada sob constante
agitao e em temperatura acima da Tc dos lipdios. Do mesmo modo que no mtodo
de hidratao do filme lipdico, os frmacos lipossolveis, sero dissolvidos junto com
os lipdios e os compostos hidrossolveis na fase aquosa.
44

A fora da injeo suficiente para permitir a dissoluo do etanol na fase
aquosa e as molculas dos lipdios so dispersas no meio. Este procedimento, em
geral, produz grandes propores de vesculas SUV, embora possam ocorrer
agregaes e formao de vesculas maiores. As limitaes deste mtodo so as
solubilizaes dos lipdios em etanol, que depende da concentrao; a introduo de no
mximo 7,5 % (v/v) de etanol em relao ao volume de soluo aquosa e a dificuldade
da remoo do etanol residual da formulao (NEW, 1990).

Este mtodo apropriado para a encapsulao de compostos lipossolveis,
sendo pequena a porcentagem de encapsulao dos hidrossolveis.

3.6.Caracterizao de preparaes lipossomais

3.6.1.Determinao do raio hidrodinmico de lipossomas

O tamanho mdio dos lipossomas pode ser determinado por espalhamento
quase elstico da luz (Quasi-Elastic Light Scattering - QELS) que utiliza o princpio da
Espectroscopia de Correlao de Ftons (ECF). A ECF a anlise da dependncia do
tempo com a intensidade de flutuao no espalhamento da luz laser, devido aos
movimentos Brownianos das partculas em suspenso. Os dimetros das partculas so
determinados atravs da medio da disperso de uma radiao laser incidente na
amostra, provocada por vesculas em suspenso. Uma vez que as vesculas no so
estticas, a variao temporal do espalhamento depende do coeficiente de difuso (D)
das mesmas. Assim, as variaes da intensidade da difrao da luz so tanto mais
rpidas quanto menores forem s vesculas em suspenso. O coeficiente de difuso (D)
pode ser determinado analisando dados em diferentes tempos de amostragem. A partir
desses dados e, juntamente com a temperatura absoluta (T) e a viscosidade do meio
(), possvel determinar o raio hidrodinmico (R) das vesculas atravs da equao de
Stokes-Einstein (1)(NEW, 1990):

45
(1) D = T /(6 R)

onde a constante de Boltzmann.

Como os lipossomas MLV obtidos por hidratao do filme lipdico tem tamanho
bastante heterogneo, que pode variar desde alguns nanmetros a vrios micrmetros,
constitudos em sua maioria por vrias camadas concntricas de fosfolpidos e
aglomerados de vesculas, havendo tambm fosfolpidos no includos nas membranas
(GROLL e col., 1999), o seu dimetro difcil de medir por espectroscopia de
correlao fotnica. Os LUV so o tipo de amostra que proporciona bons resultados
com esta tcnica, devido sua maior homogeneidade em relao ao tamanho e
esfericidade das vesculas (SANTOS & CASTANHO, 2002).

3.6.2.Determinao da carga de superfcie das partculas

Nas disperses coloidais, as foras de atrao e repulso na superfcie do
colide determinam sua estabilidade. Um dos maiores efeitos da superfcie so os
fenmenos eletrocinticos. Os colides apresentam cargas eltricas superficiais, que
podem aparecer devido dissociao de grupos ionizveis e adsoro diferencial de
ons da soluo (dispersante). A carga lquida na superfcie de cada partcula afeta a
distribuio de ons na sua vizinhana, aumentando a concentrao de contra ons junto
superfcie. Assim, forma-se uma dupla camada eltrica (uma interna com ons
fortemente ligados, a camada de Stern, e outra externa com uma distribuio de ons
determinada pelo equilbrio entre foras eletrostticas e o movimento trmico) (NEW,
1990). O potencial entre as duas camadas denominado potencial zeta. Essas cargas
produzem foras de repulso eletrostticas entre colides vizinhos e se a carga for
suficientemente grande, os colides permanecem estveis e dispersos em suspenso.

3.6 3.Anlise por supresso de fluorescncia

A fluorescncia a luminescncia que determinadas substncias apresentam e
46
ocorre a partir de estados eletrnicos excitados singlete, onde o eltron no estado
excitado, emparelhado a um segundo eltron, retorna ao estado fundamental
(LAKOWICZ, 1999).
A supresso de fluorescncia refere-se a um processo que diminui a intensidade
ou rendimento quntico da emisso fluorescnte. Vrias interaes podem provocar
essa supresso, entre as quais as reaes no estado excitado, rearranjos moleculares,
formao de complexos no estado fundamental e colises entre uma molcula
fluorescente e a de um supressor (LAKOWICZ, 1999). As supresses mais comuns so
a esttica e a dinmica. A primeira se refere s interaes com formao de complexos
no fluorescentes entre o fluorforo e o supressor. Quando o complexo absorve luz, ele
retorna ao estado fundamental sem emisso de um fton. J a supresso dinmica
ocorre por causa das colises entre as molculas do fluorforo e do supressor,
desativando o fluorforo no estado excitado.

A presena de duplas conjugadas e a rigidez da estrutura molecular de frmacos
possibilitam a utilizao de mtodos fsico-qumicos ticos para anlise e localizao
dos referidos compostos em lipossomas. A fluorescncia, por ser um mtodo que
apresenta alta sensibilidade pode fornecer informaes importantes sobre o
microambiente onde se localizam as molculas do frmaco.

3.6.4.Espectroscopia de polarizao de fluorescncia

A determinao do grau de anisotropia de fluorescncia envolve a incidncia de
luz polarizada na amostra, que excita as molculas que tm momento de transio
paralelo ao vetor campo eltrico do plano de polarizao do feixe de luz. Se o
fluorforo, no estado excitado, permanecer imvel, a luz emitida como fluorescncia
tambm ser polarizada na mesma direo da radiao incidente. Porm, se, durante o
tempo de vida do fluforo no estado excitado, ocorrer rotao, a radiao emitida ser
menos polarizada (LAKOWICZ, 1999; NEW, 1990).
O grau de anisotropia (r) dado pela equao (2)
47

(2)

em que I
VV
a intensidade de emisso de fluorescncia detectada paralelamente
direo da luz polarizada de excitao (luz polarizada de excitao usada verticalmente
e de emisso verticalmente) e I
VH
a intensidade de emisso detectada
perpendicularmente (luz polarizada de excitao usada verticalmente e de emisso
horizontalmente). O fator G um parmetro de correo instrumental, devido aos
diferentes componentes ticos presentes no espectrofluormetro apresentarem uma
transmitncia que depende da direo da polarizao da luz. Assim, h a necessidade
do referido parmetro para a comparao das intensidades de emisso polarizadas da
amostra. O fator G pode ser medido usando a luz polarizada de excitao
horizontalmente e a de emisso ora polarizada verticalmente ora horizontalmente,
respectivamente (I
HV
e I
HH
), calculandose o seu valor pela equao (3) (PIOVESAM,
2006).

(3

A determinao do grau de anisotropia fornece informaes sobre a rigidez de
ambientes moleculares, incluindo a bicamada lipdica existente em lipossomas e sobre
a fluidez de membranas. As bicamadas lipdicas podem conferir anisotropia x, y a
componentes nela inseridos.
I
HH
I
HV
G =
( r ) =
I
VV
- G.I
VH

I
VV
+ 2 .G.I
VH

48

_____________________________________________________________Materiais e Mtodos
49

4.MATERIAIS E MTODOS
50

51
4.1.Materiais

Neste trabalho, foram empregados:

NYS:
- lote NT/C 645655, ttulo 6509 UI/mg e lote NT/C 645743, ttulo 6636 UI/mg,
fornecidos por Medley S/A Indstria Farmacutica;
- lote 04102/2004, ttulo: 6372,0 UI/mg, fornecido pela Cristlia Produtos
Qumicos e Farmacuticos.

Lipdios:
- fosfatidilcolina de soja hidrogenada (PCH) (Epikuron 200SH # 169705 - Lucas
Meyer)
(99 % de pureza);
- colesterol (Genzyme, 99 % de pureza);
- 1,2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfatidilglicerol (DSPG), Genzyme, 99 % de pureza.

OBS:Todos os lipdios foram armazenados em dessecador a vcuo e em
geladeira.

Solventes e reagentes:
Etanol (planta piloto IQ); gua destilada e deionizada em equipamento MilliQ-
plus; clorofrmio PA (Nuclear); metanol p.a. (Chemco, Synth); metanol grau HPLC
(Tedia); n-octanol PA (Merck); HEPES (Sigma-Aldrich, com 99% de pureza); cido
Succnico PA (Ecibra); acetato de sdio PA (Vetec); cido actico glacial PA (ACS
LabSinth); hidrxido de sdio PA (Chemco); cloreto de sdio PA (Chemco); cloreto de
potssio PA (Quimis); cido sulfrico PA (Vetec); gua oxigenada 30 vol. (Merck);
molibdato de amnio PA (LabSinth); cido ascrbico PA (Vetec); iodeto de potssio PA
(Vetec); tiossulfato de sdio PA (Ecibra); acrilamida (Sigma); BHT (CFO) alimentcio
(Quiminest); DMSO (Vetec, Sigma-Aldrich) PA; soluo salina 0,9% (m/v); meio de
cultura RPMI 1640 com glutamina e sem bicarbonato (Sigma-Aldrich) tampo MOPS
52
0,165 mol L
-1
(3-N-morfilino)-cido propanosulfnico (Sigma-Aldrich); pH 7,0; meio ASD,
Agar Saboraud Dextrose (Difco e oxoid).

Equipamentos:
Banho-maria (Nova tica); espectrofotmetro com detector de arranjo de diodos
(Hewlett-Packard, mod. 8452A); espectrofluormetro (Perkin Elmer, mod. LS-55, tendo
como fonte de excitao uma lmpada de Xe de 250W); espectrofotmetro de
infravermelho (Bomem Hartmann, mod. MB 100); TGA (TA Instruments, mod. 2050);
rotaevaporador (Buchi, mod. 461); balana analtica (Mettler, mod. AB204 S); pHmetro
(Micronal, mod. B474); ultracentfuga (Beckman, mod. L8-80, rotor TI 80);
microcentrfuga (Revan Intrumentos Cientficos
modelo: 14000 D); centrfuga (FANEM, modelo Excelsa II, 206-BL); cromatgrafo
lquido (Waters, mod. 600E) acoplado ao detector (Waters, mod. 484) e coluna
Microsorb MV (Varian) C18 com 25cm x 4,6mm com tamanho de partcula de 5m;
extrusora (Avestin, mod. LiposoFast
TM
100); membranas de policarbonato (Osmonics,
linha Poretics
, dimetro 47 mm, com poros de dimetro 100 nm, 200 nm e 400 nm);
disco de drenagem de polister (Osmonics, linha Poretics
, 47mm de dimetro);
membranas com poros de 0,22 m (Millipore); sonicador de ponte (Sonifier B-12 cell
disruptor, Branson Sonic Power Co.); placas de microdiluio estreis e descartveis
(Placa de ELISA); cmaras de Neubauer; equipamento para medir espalhamento
dinmico da luz (QELS) (Brookhaven Instruments., mod. BI-MAS); micro-calormetro
diferencial de varredura (Microcal, Northampton, MA); espectropolarmetro (Jasco, mod.
J-720); banho de ultra-som (Thornton, mod. T7).

4.2.Mtodos

4.2.1.Caracterizao fsico-qumica da NYS

Foram realizadas anlises fsico-qumicas em amostras de NYS doadas pelas
empresas Medley, lote NT/C 645743 (denominada NYS Medley) e pela Cristlia, lote
04102/2004 (denominada NYS Cristlia), para identificar o principal constituinte e o tipo
53
de cristal que prevalece nas NYSs comerciais utilizadas neste trabalho.

4.2.1.1.Avaliao da solubilidade

Os testes de solubilidade foram realizados a 25
o
C, em diferentes solventes. Foi
utilizado 1,8 mg de frmaco em 10 mL dos solventes: gua; tampo HEPES (0,01 mol.
L
-1
; pH 7), tampo succinato (0,02 mol.L
-1
; pH 5,6), etanol, metanol, clorofrmio,
dimetilformamida, dimetilsulfxido e misturas de clorofrmio: metanol (1:1 e 2:1; v:v).
Para solubilizar algumas amostras de NYS em alguns solventes foi necessrio o
emprego de banho de ultra-som por, pelo menos, 2 min. Todas as anlises foram
conduzidas em ambiente somente com luz natural e todos os solventes utilizados foram
borbulhados com nitrognio por, pelo menos, 10 min.

4.2.1.2.Determinao do teor de umidade

O teor de umidade nas amostras de NYS foi obtido pelo mtodo de Karl-Fischer.
Foram utilizadas as massas mdias para NYS Medley de 36,2 mg e 30,9 mg para NYS
Cristlia. As anlises foram realizadas em triplicata.

4.2.1.3.Anlises espectroscpicas

4.2.1.3.1.Anlise por espectroscopia de absoro na regio do UV/V

Para obteno dos espectros de absoro e posterior determinao das
absortividades molares () nos
mx
da NYS em metanol foi preparada soluo estoque
de NYS em metanol (1,3x10
-4
mol.L
-1
), a partir da qual foram preparadas solues
(1,0x10
-5
a 2,6x10
-6
mol.L
-1
).
Todos os espectros de absoro na regio do UV/V foram obtidos entre 250 nm
e 380 nm, em cuvetas de quartzo (caminho tico:1,00 cm), com tampa de teflon.

54
4.2.1.3.2.Anlise por espectroscopia de fluorescncia

- Obteno dos espectros de fluorescncia

Foram obtidos os espectros de fluorescncia das amostras empregadas no
preparo da curva de calibrao na regio do UV/V (1,0x10
-5
a 2,6x10
-6
mol.L
-1
).
Foram utilizadas duas condies para a obteno dos espectros:
Condio 1: Tamanhos de fenda de excitao e emisso: 4 nm;
exc
: 304 nm; intervalo
de varredura: 320 nm550 nm.
Condio 2: Tamanhos de fenda de excitao e emisso: 6nm;
exc
: 320 nm; intervalo
de varredura: 340nm620 nm.
As anlises foram realizadas a 25
0
C e toda a vidraria e cuvetas foram
previamente lavadas com mistura sulfontrica.

4.2.1.3.3.Anlise por Espectroscopia no Infravermelho (IV)

Os espectros de absoro das NYSs foram obtidos entre 400 cm
-1
e 4000 cm
-1
,
com suspenso dos frmacos em leo mineral (Nujol).

4.2.1.4.Anlises por Calorimetria Exploratria Diferencial (DSC) e
Termogravimetria (TGA)

A Calorimetria exploratria diferencial (DSC) uma tcnica de anlise trmica
que mede a diferena de energia liberada ou fornecida amostra e um material de
referncia, termicamente inerte, em funo da temperatura, enquanto a amostra e a
referncia so submetidas a uma programao controlada de temperatura (DANTAS,
2006).

A anlise termogravimtrica (TGA) mede alteraes de massa da amostra em
funo do tempo (isotrmica) ou da temperatura, quanto a substncia submetida a
55
uma programao de temperatura a substncia submetida a uma programao
controlada de temperatura (LACKMAN e col., 2001). Nem todos os eventos trmicos
acontecem com perda de massa, como por exemplo, fuso, cristalizao e transio
vtrea, mas h outros eventos importantes como a desoro, absoro, sublimao,
vaporizao, oxidao, reduo e decomposio, que podem ser detectados por este
mtodo. A TGA tem sido empregada para caracterizar a decomposio e a estabilidade
trmica de materiais ( HATAKEYAMA e QUINN, 1999).

Nas anlises por DSC e TGA das amostras de NYS, foram utilizadas 3,5 mg para
o lote de NYS Medley e 3,7 mg para a NYS Cristlia. As amostras foram mantidas em
dessecador e na geladeira at o momento da anlise. Os experimentos foram
realizados nas condies: fluxo de argnio: 80 mL/min; taxa de aquecimento: 15
C/min; temperatura mxima de aquecimento: 250 C.

4.2.1.5.Determinao do coeficiente de partio em octanol/tampo

Foram adicionadas diferentes massas de NYS Medley a um tubo de centrnfuga,
tipo falcon graduado, com tampa rosquevel, 10 mL, contendo 2 mL de n-octanol
saturado com tampo succinato 0,02 mol L
-1
, pH 5,6 e 2 mL de tampo succinato 0,02
mol L-1
-1
, pH 5,6 saturado com n-octanol. Solues de NYS na mistura n-
octanol/tampo succinato 0,02 mol.L
-1
pH 5,6 foram obtidas. As concentraes das
solues foram: 0,25; 0,5; 1, 2, 3, 4; 5 mmol L
-1
. Os tubos foram agitados
vigorosamente 30 vezes, invertendo-os e deixando em repouso por 1h. As solues
foram centrifugadas a 613,6 x g/3 min. As fases aquosas e orgnicas foram recolhidas
e medidas as respectivas absorbncias a 306 nm (
max
da NYS nos meios). Foram
calculados a concentrao e o coeficiente de partio do frmaco em cada fase,
empregando o coeficiente de extinso molar da NYS em cada meio. Os ensaios foram
realizados a 25 C e 37 C.

56
4.2.2.Anlise da atividade antifngica in vitro da NYS

A anlise da atividade antifngica in vitro, tambm chamada teste de
susceptibilidade, foi realizada com base nos procedimentos do NCCLS M27 - A
(National Committee for Clinical Laboratory Standards Method for Broth Dilution
Antifungal Susceptibility Testing of Yeasts). Foram testadas duas amostras de NYS
Medley pura (Lote NT/C 645655, amostra antiga no usada em outros testes, ttulo
6509 UI/mg e Lote NT/C 645743, ttulo 6636 UI/mg). A NYS foi dissolvida em DMSO
(1,3 mg/mL) e posteriormente submetida a microdiluies empregando-se como
diluente soluo salina e obtendo-se as concentraes: 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5;
2,5 e 1,25 g/mL. Foram tomadas alquotas de 20 L de cada microdiluio e
transferidas para a placa de ELISA. Em cada poo da placa foram adicionados 160 L
de meio de cultura RPMI 1640 (com L-glutamina e sem bicarbonato) e tampo MOPS
0,165 mol L
-1
, tamponado a pH 7,0 0,1 e suplementado com 2% de glicose e 20 L
de inculo (densidade de clulas 1x10
4
), calibrado em cmaras de Neubauer. Os
microrganismos empregados foram leveduras e fungos filamentosos. As cepas de
leveduras testadas pertencem aos gneros: Candida e Cryptococcus. Do gnero
Candida foram C. albicans ATCC 90028, ATCC 76615; C. krusei ATCC 6258; C.
parapsilosis ATCC 22019. As do gnero Crytococcus foram: C. neoformans ATCC
90112 e C. neoformans LIF 217. Os fungos filamentosos empregados foram:
Trichophyton sp. (raspado de pele e unhas), Trichophyton rubrum (raspado de pele),
Trichophyton mentagrophytes (raspado de unhas) e Fusarium e Aspergillus isolados de
crnea e lavado brnquico respectivamente. Os fungos filamentosos foram isolados de
materiais retirados de pacientes do Hospital de Clnicas/UNICAMP. As leituras das
placas de ELISA para anlise da CIM (Concentrao Inibitria Mnima, ou MIC) para as
leveduras foram realizadas aps 24/48 h (gneros Candida) e 48/72 h para os
Cryptococcus por leitura visual do crescimento do microrganismo testado (presena de
turvao) aps incubao a 35 C. Para os fungos filamentosos, foram realizadas
somente anlises do CIM (Concentrao Inibitria Mnima - MIC), aps 1 semana de
incubao a 25
o
C, no escuro.

57
4.2.3.Desenvolvimento de formulaes lipossomais com NYS

No desenvolvimento de uma formulao lipossomal multilamelar, diversos
parmetros influenciam a otimizao da formulao e a estabilizao da substncia a
ser encapsulada. Entre eles os lipdios empregados, suas concentraes e propores,
o meio, tempo, temperatura de hidratao e concentrao da substncia a ser
encapsulada. Existem, tambm, fatores mecnicos relativos aos instrumentos usados
para o preparo das suspenses: a velocidade de agitao, o tamanho dos recipientes,
temperatura do banho-maria, eficincia das bombas de vcuo na retirada de resduos
de solventes orgnicos, entre outros.
Na escolha dos fosfolipdios a serem empregados, foi selecionado inicialmente o
lipdio, quimicamente estvel, o Epikuron 200SH contendo 85 % de DSPC e 15 % de
DPPC, citado neste trabalho como PCH, cuja temperatura de transio de fases (Tc) foi
igual a 53 C, determinada por microDSC. O referido lipdio apresenta Tc acima da
temperatura corprea normal, o que favorece a manuteno do frmaco encapsulado
no organismo. Outro fosfolipdio empregado foi o diestearoilfosfatidilglicerol (DSPG),
cuja Tc 55 C, sendo um lipdio dotado de carga negativa, que desfavorece a
agregao das vesculas devido repulso eletrosttica. O colesterol utilizado de
suma importncia, pois estabiliza a bicamada lipdica formada (NEW, 1990) e se
associa a NYS, podendo conduzir ao ancoramento do frmaco nessa bicamada. A
concentrao total dos lipdios variou de 11 a 15 mmol.L
-1
e a relao entre as
concentraes de frmaco e lipdios foi 6,5 a 10 % (em concentrao molar). Os filmes
lipdicos, secos, foram hidratados a 55, 60 e 65 C.

A metodologia usada para a preparao de lipossomas foi a hidratao do filme
seco (LASIC, 1993; NEW, 1990). A NYS e os lipdios empregados foram dissolvidos em
clorofrmio:metanol (1:1; v:v). Os solventes foram evaporados em rotaevaporador
presso reduzida, em temperatura igual ou superior Tc do fosfolipdio com maior Tc
que compe a formulao. O filme seco obtido foi mantido por pelo menos 1h sob
vcuo, para eliminao de resduos de solvente orgnico. O filme foi hidratado nas
temperaturas citadas, nas quais foram empregados os tampes HEPES (0,01 mol.L
-1
,
58
pH = 7,4) e Succinato (0,02 mol.L
-1
; pH 5,6). As formulaes foram agitadas por 1h
sendo utilizados dois modos de hidratao: adio nica com agitao mxima de 280
rpm (AU) e a adio em trs etapas (AE) com agitao em velocidades, designada:
lenta (20 rpm), mdia (160 rpm) e rpida (280 rpm), cada uma com durao de 20 min.

Foram preparadas 23 preparaes lipossomais multilamelares contendo NYS,
sendo que duas delas foram testadas por ensaio microbiolgico, o qual se avaliou a
atividade antifngica in vitro. A amostra de NYS utilizada em toda a fase de
desenvolvimento e seleo e caracterizao das preparaes MLV, LUV e SUV foi NYS
Medley lote NT/C 645743.

Na fase de seleo das melhores formulaes foi variada a composio lipdica,
temperatura de hidratao e teores de frmaco. Foram alteradas tambm as
concentraes de lipdios, meio e modo de hidratao. A determinao dos teores (%) e
a estabilidade qumica do frmaco foram os itens de seleo das melhores
preparaes, sendo utilizada CLAE e amostras em duplicata neste estudo.

Etapa 1 - Variaes da composio e concentrao de lipdios, meios e
temperaturas de hidratao.

Foram utilizados PCH 100 %; PCH:colesterol 80:20 % (razo molar),
temperaturas de 55 C e 65 C e os meios de hidratao (tampes succinato 0,02
mol.L
-1
; pH 5,6 e HEPES 0,01 mol.L
-1
; pH 7,4), fixando o modo de hidratao em AU
(adio nica) e a porcentagem molar de frmaco em relao aos lipdios de 10 %.

Etapa 2 - Variaes na composio, concentrao de lipdios e modo de
hidratao.

Foram utilizados PCH:colesterol (80:20 %, molar) e PCH:DSPG (66:34 %, molar),
modos de hidratao AU (adio nica) e AE (adio em Etapas) com tampo
succinato, temperatura de hidratao 55 C e porcentagem molar de frmaco em
59
relao aos lipdios de 7 %.

Etapa 3 - Variaes nas relaes frmaco/lipdio, concentrao e composio de
lipdios.

As relaes NYS:lipdio utilizadas foram 7 % e 10 %, as mesmas relaes
frmaco:lpidios utilizadas em formulaes lipossomais comerciais que contm a NYS e
Anfotericina (Nyotran
e Ambisome
). O meio, a concentrao e composio de lipdios

e ainda a temperatura de hidratao foram os mencionados na Etapa 2. AE foi o modo
de hidratao.

Etapa 4 - Variaes na composio lipdica e temperatura de hidratao.

Os lipdios PCH, colesterol e DSPG foram combinados nas propores:
PCH:colesterol:DSPG (54:26:20 %), PCH:colesterol (80:20 %), PCH:colesterol:DSPG
(70:20:10 %) e PCH:DSPG (70:30 %). Foram mantidas fixas: concentrao total de
lipdio 15 mmol L
-1
; relao frmaco:lipdio 7,0 %; modo de hidratao AE; adio de
BHT a 1,3 % (em relao massa de NYS); soluo de hidratao foi o tampo
succinato (0,02 mol L
-1
; pH 5,6); temperatura de hidratao 60
o
C.

Etapa 5 - Variaes da temperatura e modo de hidratao.

As Temperaturas e modos de hidratao que foram utilizados foram 55 C e 60
C e AU e AE, respectivamente. A composio da formulao utilizada foi:
PCH:colesterol:DSPG (70:20:10 %) e BHT a 1,3 %.

4.2.4.Tratamentos efetuados em vesculas multilamelares para
obteno de lipossomas unilamelares

Formulaes lipossomais multilamelares (PCH:colesterol:DSPG; 70:20:10 %) e
BHT (1,3 %) hidratadas com tampo succinato foram preparadas pela metodologia
60
descrita no item 4.2.3. As suspenses lipossomais foram extrudadas 10 vezes em
membranas de policarbonato (dimetro de poros: 400 nm, 200 nm e 100 nm), mas este
procedimento foi abandonado e passou-se a realizar a ultracentrifugao e sonicao
para diminuir o tamanho das vesculas. As amostras foram ultracentrifugadas a
112.021,06 x g (quando usados 2 mL) ou a 112.240,71 x g (quando usados 5 mL) a 20
C/2 h. A sonicao foi feita em sonicador de ponte (Sonifier B-12) durante 10 min (3, 3
e 4 min com pausas de 1 min), mantendo as amostras em banho de gelo. A potncia foi
de 40 W. As solues coloidais sonicadas foram centrifugadas em microcentrfuga
(Revan Intrumentos Cientficos
modelo: 14000 D) a 9438,65 x g/10min/10C para retirada das partculas de titnio e
frmaco livre. O sobrenadante, contendo suspenso de lipossomas de dimetro
pequeno e com frmaco encapsulado, foi recolhido e passou por recozimento 60 C/20
min. Em seguida a suspenso lipossomal foi analisada e o teor de NYS encapsulada foi
obtido por CLAE.

4.2.5.Caracterizao qumica e fsica de suspenses lipossomais

As suspenses lipossomais obtidas (PCH:colesterol:DSPG (70:20:10 %)) e BHT
1,3 % hidratadas a 55 C e 65 C foram caracterizadas quanto eficincia de
encapsulao (anlise por CLAE), determinao do teor (%) de fosfato, raio
hidrodinmico, potencial zeta das partculas, grau de anisotropia e anlise de supresso
da fluorescncia intrnseca da NYS. Na caracterizao biolgica foi utilizado o teste de
susceptibilidade a fungos e leveduras para NYS livre e lipossomal.

4.2.5.1.Anlise por Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (CLAE)

Durante a anlise preliminar, foi empregada CLAE para avaliar os sistemas
lipossomais quanto aos teores de frmaco presentes aps a preparao dos
lipossomas e existncia de possvel degradao qumica do composto encapsulado.
Estas anlises foram teis tambm para realizar a caracterizao dos lotes de NYS
utilizados e para determinar a eficincia de encapsulao do antibitico nos lipossomas.
61
Solues metanlicas de NYS (10 g/mL) foram analisadas em sistemas
cromatogrficos semelhantes aos descritos por Coutinho e Prieto, (1995), nos quais
foram utilizados como fase mvel metanol:tampo acetato 0,2 mol.L
-1
; pH 5,6 (70:30;
v:v; fluxo: 1 mL/min); coluna Microsorbmv1005C18 250x4,6 mmx1/4,
termostatizada a 35 C, equipada com forno Shimadzu, CTO-250x4,6; detector de UV/V
em 304 nm. Todas as anlises foram realizadas em duplicata. Foram obtidas curvas de
calibrao para avaliar a correlao linear das reas em relao ao intervalo de
concentrao empregado.

4.2.5.2.Determinao do teor (%) de fosfato

A determinao do teor (%) de fosfato presente em formulaes lipossomais
quantifica os fosfolipdios constituintes atravs da determinao do fsforo inorgnico.
O mtodo, segundo Bartlett (NEW, 1990), consiste na oxidao dos compostos de
carbono com cido Slfurico a carbono elementar, que novamente oxidado a dixido
de carbono com gua oxigenada. O fsforo convertido a ortofosfato, que reage com
molibdato de amnio e reduzido com cido ascrbico, produzindo um complexo de
cor azul. A intensidade da cor proporcional concentrao de fosfolipdio presente na
amostra. A quantificao realizada com o auxlio de curva de calibrao, obtida no
grfico de absorbncia versus concentrao.

A curva de calibrao foi preparada a partir de soluo estoque de fosfato cido
de sdio heptahidratado (3,06 mmol.L
-1
). Foram tomadas alquotas dessa soluo,
diludas, sendo obtidas novas solues com concentraes de 0,25 a 1,51 mmol.L
-1
.
Amostras de suspenses lipossomais foram diludas concentrao 1,00 mmol.L
-1
.
Tomou-se 100 L de soluo (solues da curva, amostras de suspenso lipossomal e
branco) para tubos de ensaio e adicionou-se 500 L de H
2
SO
4
10 N. Os tubos foram
aquecidos em placa de aquecimento (na capela) a 230 C/30 min. Aps resfriar as
solues a 25C, 165 L de H
2
O
2
foram adicionados a cada tubo e aqueceu-se por
mais 30 min/230 C. Em seguida, resfriou-se a 25 C e acrescentou-se 4 mL de gua
deionizada e 500 L de soluo de molibdato de amnio 2,5 % (m/v) e o mesmo
62
volume de soluo de cido ascrbico a 10 % (m/v). As solues foram
homogeneizadas em agitador tipo vortex e aquecidas em banho-maria a 100C/7min,
aparecendo uma cor azul. Aps resfriamento, a absorbncia foi medida em 820 nm.

Todas as solues foram preparadas em tampo succinato 0,02 mol.L
-1
; pH 5,6
em duplicata e todo os materiais e reagentes estavam livres de fosfato.

4.2.5.3.Determinao do raio hidrodinmico

Foi empregado o mtodo por espalhamento quase elstico da luz. As amostras
foram diludas em gua deionizada at obteno de uma taxa mdia de contagem de
200 a 400 Kcps. As leituras foram realizadas a 25 C; com 5 aquisies (1 min cada); :
675,0 nm e ngulo de anlise 90. As Anlises foram realizadas com o programa
ZetaPlus Particle Sizing, verso 2.2.1.

4.2.5.4.Determinao do potencial zeta

Na determinao do potencial zeta, as amostras de lipossomas foram diludas,
com soluo de KCl 1x10
-4
mol.L
-1
, concentrao de 1 mg/mL. As amostras foram
colocadas em cuvetas de acrlico de 1,0 cm de caminho tico, sendo obtidos os raios
hidrodinmicos e, depois, o potencial zeta. As Anlises foram realizadas com o
programa Zeta Potencial Analyzer, verso 2.1.8.

4.2.5.5.Anlise do grau de anisotropia de fluorescncia da NYS livre e
encapsulada em lipossomas

Soluo estoque de NYS em metanol (previamente borbulhado com nitrognio)
(0,51 m mol.L
-1
) e suspenses lipossomais foram diludas com tampo succinato para
obter solues de concentraes 1,0 e 9,9 mol.L
-1
. As solues foram acondicionadas
em cuvetas de quartzo com 1,00 cm de caminho tico. As medidas do grau de
63
anisotropia de fluorescncia em estado fixo foram determinadas em espectrofluormetro
Perkin Elmer, mod. LS-55. A fonte de excitao foi uma lmpada de Xe (250 W) e foram
utilizadas fendas de excitao e emisso iguais a 4,0 nm, de excitao de 304 nm e
de emisso iguais de 416 nm. O intervalo de comprimento de onda de varredura foi de
350 nm a 500 nm, em uma velocidade de 600 nm/min.

4.2.5.6.Estudo da supresso de fluorescncia da NYS livre e em
lipossomas

As medidas de fluorescncia da NYS a 25 C foram feitas em espectrofluormetro
Perkin Elmer, citado no item anterior. O comprimento de onda de excitao foi 304 nm e
a emisso monitorada em 416 nm. As fendas de excitao e emisso foram,
respectivamente, 4,0 nm e 10,0 nm e a velocidade de varredura foi 600 nm/min.

Foram preparadas solues de NYS livre e em lipossomas em concentrao 9,9
mol.L
-1
(tampo succinato 0,02 mol.L
-1
; pH 5,6). Foram utilizados como agentes
supressores em ambiente hidroflico a soluo de KI 0,5 mol.L
-1
com tiossulfato de
sdio 0,01 mol L
-1
e, em ambiente hidrofbico, a soluo de acrilamida a 0,5 mol.L
-1
. As
solues de agentes supressores foram diludas com o auxlio de tampo succinato
0,02 mol.L
-1
; pH 5,6. As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L
-1
.

As intensidades de fluorescncia foram tratadas, em princpio, pela equao de
Stern-Volmer (equao 4) (LAKOWICZ, 1990):

(4) F
0
/F = 1 + K [Q]

em que F
0
e F so as intensidades de fluorescncia da NYS na ausncia e presena do
supressor, K a constante de supresso e [Q] a concentrao do supressor. A
linearidade do grfico correspondente a essa equao indica a existncia de uma nica
classe de fluorforos, todos igualmente acessveis ao supressor.

64
Podem ser observados desvios dessa equao e, nesta Etapa, os dados podem
ser analisados pelas equaes de Stern-Volmer modificadas. Podem-se descrever as
supresses esttica e dinmica combinadas, atravs de uma equao de Stern-Volmer
modificada. Nesta Etapa, o a fluorescncia ser suprimida por colises e por formao
de complexos no fluorescentes com o supressor.

Os ajustes lineares da constante de supresso aparente (K
ap
) e a concentrao
do supressor ([Q]) demonstram a ocorrncia das supresses combinadas. A equao
(5) descreve a supresso dinmica e esttica de algumas populaes de supressores.

(5) K
ap
= (F0/F 1) 1/[Q] = (KD + KS) + KD KS [Q]

em que KD e KS so as constantes de supresso dinmica e esttica, respectivamente.

Outra equao de Stern-Volmer modificada (equao 6) descreve a supresso
de duas diferentes populaes de fluorforos que apresentam diferentes
acessibilidades ao supressor, sendo usada a equao 6 na qual F representa a
intensidade de fluorescncia que foi suprimida (F
0
F), f
a
a frao de fluorescncia
inicial que acessvel ao supressor (LAKOWICZ, 1990).

(6) F
0
/F = [1/(f
a
K [Q])] + (1/f
a
)

4.2.5.7.Avaliao da atividade antifngica in vitro de suspenses
lipossomais

Foram testadas NYS puras (lotes: NT/C 645743 (Medley) e 04102:2004
(Cristlia), ttulo: 6372,0 UI/mg), amostras de lipossomas hidratados a 55 C e a 60 C e
lipossomas vazios para cada temperatura de hidratao. As suspenses lipossomais
multilamelares, as amostras lipossomais que sofreram sonicao e as amostras de NYS
foram analisadas por CLAE para determinar o teor de NYS recuperado e realizao de
correes nas concentraes usadas nas anlises microbiolgicas. Posteriormente,
65
foram usados os procedimentos preconizados pelo NCCLS M 27-A. As amostras
lipossomais sonicadas foram previamente esterilizadas em membranas com poros de
0,22 m. A NYS pura, lote NT/C 645743 (Medley), foi dissolvida e diluda como descrito
no item 4.2.2, obtendo-se as concentraes de 65,0; 32,5; 16,250; 8,125; 4,06; 2,03;
1,01; 0,508; 0,25 e 0,125 g/mL. Alquotas das suspenses lipossomais
(multilamelares) L1A (hidratada a 55 C) e L2A (hidratada a 60 C) foram tomadas e
diludas, nas mesmas condies da NYS pura, nas concentraes: L1A (75,0; 37,5;
18,75; 9,37; 4,68; 2,34; 1,17; 0,58; 0,29 e 0,146g/mL) e L2A (61,0; 30,5; 15,25; 7,62;
3,81; 1,90; 0,95; 0,47; 0,23 e 0,119 g/mL). J as amostras de NYS, lotes NT/C 645743
(Medley) e 04102:2004 (Cristlia), que foram analisadas junto com as suspenses
lipossomais sonicadas, foram dissolvidas e diludas igual ao descrito no item 4.2.2 nas
concentraes: 64,0; 32,0; 16,0; 8,0; 4,0; 2,0; 1,0; 0,5; 0,25; 0,125 g/mL. As
suspenses lipossomais sonicadas foram diludas nas concentraes: L1 (amostra
hidratada a 55 C) 270,0; 135,0; 67,5; 33,75; 16,88; 8,44; 4,22; 2,11; 1,05 e 0,53 g/mL
e L2 (amostra hidratada a 60C) 360,0; 180,0; 90,0; 45,0; 22,5; 11,25; 5,62; 2,81; 1,41 e
0,70 g/mL. Na ltima diluio, as leveduras testadas, condies de incubao e
leituras para as anlises do MIC foram semelhantes as empregadas para os testes
realizados com NYS pura, conforme descrito no item 4.2.2. A determinao da CFM
(Concentrao Fungicida Mnima) para as leveduras foi feita da seguinte forma: aps a
determinao da MIC, foi retirada uma alquota de 100 l da diluio que apresentou o
resultado do MIC (a menor concentrao que no apresentou crescimento visvel) e a
mesma foi plaqueada em ASD (Agar Saboraud Dextrose), por 48 h a 35 C. A CFM foi
tida como a concentrao que no mostrou UFC (Unidade Formadora de Colnia)
crescida na placa.

66
__________________________________________________________Resultados e Discusses
67

5.RESULTADOS E DISCUSSES
68

69
5.1.Caracterizao fsico-qumica da NYS

O antibitico NYS, lote NT/C 645743, fornecido pela Medley e o lote 04102/2004,
fornecido pela Cristlia, so amostras micronizadas, ambas fabricadas pela empresa
DSM Cpua S.p.A., Itlia.

5.1.1.Solubilidade

A solubilidade da NYS Medley foi testada a 25
0
C nos solventes empregados no
preparo de lipossomas (Tabela 2).

Tabela 2. Solubilidade da NYS em diferentes solventes. A concentrao das solues de NYS
com os solventes testados foi de 1,94 x 10
-4
mol L
-1
.

Solvente Solubilidade
gua destilada e desionizada Insolvel
Tampo HEPES 0,01mol L
-1
; pH 7 Insolvel
Tampo succinato 0,02mol L
-1
pH 5,6 Insolvel
Etanol Pouco solvel
Metanol Pouco solvel
Clorofrmio Insolvel
Clorofrmio:Metanol (1:1) Pouco solvel
Clorofrmio:Metanol (2:1) Pouco solvel
Dimetilformamida (DMF) Solvel
Dimetilsulfxido (DMSO) Solvel
As amostras foram classificadas como:
Insolvel: utilizao de 1 h de banho em ultra-som sem ocorrer solubilizao.
Muito pouco solvel: utilizao de 30 min de banho em ultra-som, para ocorrer
70
solubilizao.
Pouco solvel: solubilizao aps 2 min de banho em ultra-som.
Solvel: solubilizao imediata.

5.1.2.Anlise do teor de Umidade

As anlises do teor de umidade, pelo mtodo de Karl Fischer, revelaram para a
NYS Medley teor de 9,2 % e para a NYS Cristlia, teor de 8,8 %. O objetivo foi
correo das massas de frmaco empregadas nos diferentes ensaios.

5.1.3.Caracterizao espectroscpica da NYS na regio do UV/V em
metanol

A NYS Medley pouco solvel em metanol, mas mesmo assim esse solvente foi
empregado na solubilizao do frmaco para obteno das formulaes lipossomais, de
modo que avaliamos o comportamento espectroscpico da NYS em metanol.

Os espectros de absoro na regio do UV/V das solues de NYS em metanol
(2,6x10
-6
a 1,0x10
-5
mol L
-1
) foram registrados e sobrepostos (Fig. 21), para observar
mudanas de posio, intensidade e perfil das bandas de absoro em funo da
interao da NYS com o solvente e possvel formao de agregados.

71

Figura 21. Espectros de absoro, da NYS Medley, na regio do UV/V de NYS Medley em
MeOH, 25
0
C (2,6; 3,9; 5,3; 6,6; 7,9; 9,2x10
-6
; 1,0x10
-5
mol L
-1
) a 25 C.

Observa-se um espectro com estrutura vibrnica com trs
mx.
: em 292 nm, 304
nm e 320 nm. Para verificar a correlao entre as concentraes e leituras em
absorbncia dos trs
mx
, foram preparadas curvas de calibrao para os
mx
e
calculados os valores das absortividades molares () com o programa Origin, v.5. (Fig.
22, 23 e 24)

Na Fig. 22, tem-se a curva de calibrao para as solues de NYS Medley em
mx
292 nm.

2 , 0 x 1 0
- 6
4 , 0 x 1 0
- 6
6 , 0 x 1 0
- 6
8 , 0 x 1 0
- 6
1 , 0 x 1 0
- 5
1 , 2 x 1 0
- 5
0 , 1
0 , 2
0 , 3
0 , 4
0 , 5
0 , 6
0 , 7
C u r v a c a l i b r a o N i s t a t i n a e m m e t a n o l
C o m p r i m e n t o d e o n d a : 2 9 2 n m
A
C o n c e n t r a o ( m o l . L
- 1
)

Fig. 22 Curva de calibrao para solues de NYS Medley (
mx
292nm).

72
Na Tabela 3, foram observados os dados de regresso linear para tipo Y = A + B
* X (Tabela 3), com coeficiente de correlao 0,9982 e o valor de absortividade molar
() de 53814 mol
-1
cm
-1
.

Tabela 3. Dados de regresso linear da curva de calibrao (
Mx
292 nm).

Parmetros Valores Coef. Cor.
A 0,0578 0,0109 0,9982
B 53814,2373 1455,4081

A Fig. 23 mostra a curva de calibrao da NYS para
mx
304 nm.

2 , 0 x 1 0
- 6
4 , 0 x 1 0
- 6
6 , 0 x 1 0
- 6
8 , 0 x 1 0
- 6
1 , 0 x 1 0
- 5
1 , 2 x 1 0
- 5
0 , 2
0 , 3
0 , 4
0 , 5
0 , 6
0 , 7
0 , 8
0 , 9
1 , 0
1 , 1
C u r v a d e c a l i b r a o d a n i s t a t i n a e m m e t a n o l
A
- 1
)

Figura 23. Curva de calibrao para solues de NYS Medley (
mx
304nm).

A seguir, tm-se os dados de regresso linear (Tabela 4) para a curva de
calibrao das solues de NYS Medley a 304 nm. O coeficiente de correlao
0,9982 e o valor de 81597 L mol
-
1 cm
-1
.

73
Mx
304nm).

Parmetros Valores Coef. Correl.
A 0,0548 0,01629 0,99822
B 81596,8984 2178,6079 ------

Para
mx
320 nm, preparou-se curva de calibrao apresentada na Fig. 24.

2 , 0 x 1 0
- 6
4 , 0 x 1 0
- 6
6 , 0 x 1 0
- 6
8 , 0 x 1 0
- 6
1 , 0 x 1 0
- 5
1 , 2 x 1 0
- 5
0 , 2
0 , 3
0 , 4
0 , 5
0 , 6
0 , 7
0 , 8
0 , 9
1 , 0
C u r v a d e c a l i b r a o d a n i s t a t i n a e m m e t a n o l
A
- 1
)

Figura 24. Curva de calibrao para solues de NYS Medley (
mx
320nm).

Os dados de regresso linear para essa curva esto na Tabela 5. O coeficiente
de correlao 0,9983 e de 73889 L mol
-1
cm
-1
.

Mx
320 nm).

Parmetros Valores Coef. Correl.
A 0,0483 0,0146 0,99825
B 73888,8001 1955,5780 ------

Todos os dados de regresso linear foram calculados empregando-se as
74
concentraes em mol L
-1
.

O espectro de absoro de NYS entre 230 nm e 800 nm (dados no mostrados)
s apresenta bandas na regio mostrada na Fig. 21. Segundo Thomas e col., (1981),
quando amostras do antibitico (compostos tetranicos) absorvem em 382 nm, estas se
encontram contaminadas por compostos heptanicos, o que no o caso presente.
Ainda na anlise dos espectros de absoro da NYS nas concentraes e solvente
estudado, tem-se o frmaco do estado monomrico, segundo Coutinho e col., (1995).
Assim, no se observa modificao nos espectros de absoro. Todavia, no trabalho de
Castanho e col., (1992), a NYS tambm no mostra alterao em seu espectro de
absoro em concentraes nas quais ela se apresenta no estado monomrico e no
agregado em meio aquoso. O mesmo no ocorre com a Filipina, outro antibitico
polinico.

5.1.4.Anlise fluorimtrica da NYS

Na Fig. 25, verifica-se que o espectro de emisso no estruturado como os de
absoro (Fig. 20) ou seja, no se observa a obedincia regra da imagem espelho.
Figura 25. Espectros de fluorescncia de NYS Medley em MeOH (1,05x10
-5
; 9,2; 7,9; 6,6; 5,3;
3,9; 2,6x10
-6
mol L
-1
) e de metanol puro.
3 0 0 3 5 0 4 0 0 4 5 0 5 0 0 5 5 0
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
M e t a n o l
2 . 6 3 x 1 0
- 6
M
C = 3 . 9 5 x 1 0
- 6
M
C = 5 . 2 7 x 1 0
- 6
M
C = 6 . 5 9 x 1 0
- 6
M
C = 7 . 9 0 x 1 0
- 6
M
C = 9 . 2 2 x 1 0
- 6
M
C = 1 . 0 5 x 1 0
- 5
M
C o n d i e s : C o m p . d e o n d a e x c i t a o : 3 0 4 n m
L o s c a n l i m i t : 3 2 0 n m
H i s c a n l i m i t : 5 5 0 n m
F e n d a s : 4 n m
E
m
i
s
s
o

d
e

F
l
u
o
r
e
s
c
n
c
i
a
C o m p r i m e n t o d e o n d a ( n m )
75
Uma anlise dos espectros de absoro e emisso dos compostos polinicos
revela que a fluorescncia se origina de um estado de simetria diferente daquele
associado ao espectro de absoro, pois a transio de menor energia S
0
S
1
no
permitida. Assim, o espectro de absoro reflete a excitao a um nvel mais alto,
embora a emisso ainda ocorra como uma transio S
1
S
0
. (LAKOWICZ, 1999).

5.1.5.Anlise por espectroscopia na regio do infravermelho

Foram obtidos espectros no IV (Fig. 26) das amostras de NYS Medley e Cristlia.
O Analytical Profiles of Drug Substances (MICHEL, 1972) apresenta trs espectros de
infravermelho para os diferentes tipos de cristal da NYS que so classificados como tipo
A, B e C (Fig. 27). As duas amostras apresentam espectros semelhantes entre si,
anlogos ao do tipo A, mas no se descarta a hiptese de contaminao com os outros
tipos.

4000 3000 2000 1000
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1
7
0
2
,
0
1
7
0
3
,
0
1
4
5
7
,
8
1
4
5
6
,
9
8
4
8
,
6
8
4
8
,
6
1
0
6
5
,
0
1
0
6
5
,
4
1
3
7
6
,
6
1
3
7
6
,
6
1
5
7
6
,
7
1
5
7
7
,
5
2
9
2
4
,
6
3
4
2
3
,
3
2
9
2
6
,
4
3
4
1
5
,
8
%

T
r
a
n
s
m
i
t
n
c
i
a
Nmero de Onda (cm
-1
)

Figura 26. Espectros no IV das amostras de NYS Medley (azul) e Cristlia (preto).
76
Na Tabela 6, esto indicadas as freqncias de vibrao mais caractersticas
dessa molcula.

Tabela 6.Freqncias de absoro caractersticas das vibraes de ligao da NYS Medley e
Cristlia

. Freqncia (cm
-1
) Modo vibracional
1065 Estiramento simtrico de CH
3

1376 Deformao simtrica de CH
3

1577 e 1576 on Carboxilato
1702 Lactona
3300 - 3500 Estiramento NH, OH
77

Fig. 27 Espectros da NYS no IV dos diferentes tipos de cristalizao da NYS A, B e C.

78
5.1.6.Anlise da NYS por DSC

As anlises foram realizadas entre 50 C e 250 C. Na Fig. 28, tm-se curvas de
aquecimento por DSC de amostras NYS Medley (a) e Cristlia (b), ambas apresentando
um pico endotrmico, largo, nico. O fato do pico ser largo pode indicar que as
amostras no so puras, ou seja, que elas so constitudas de uma mistura das NYS
A1, A2 e A3. Tambm contribui para o alargamento do pico a decomposio gradual
que ocorreu acima de 160 C sem fundir (MICHEL, 1972). Contudo, a presena de um
pico nico indica a prevalncia de composto provavelmente A1, que o mais
abundante na mistura, em ambas as amostras.

A

B
Fig. 28 Curvas de aquecimento obtidas por DSC para as amostras de NYS Medley (A); Cristlia
(B).

0 50 100 150 200 250 300
-5
0
5
10
15
20
181,08
o
C
Curva de DSC da amostra da Cristlia
F
l
u
x
o

d
e

C
a
l
o
r

(

m
W

)
Temperatura (
o
C )
181,08 C
0 50 100 150 200 250 300
-50
-45
-40
-35
-30
-25
-20
-15
179,75
o
C
Curva de DSC de amostra Medley
F
l
u
x
o

d
e

C
a
l
o
r

(

m
W

)
Temperatura (
o
C )
179,75 C
79
A determinao das reas dos picos fornece as entalpias de fuso para as
amostras. Para a NYS Medley a entalpia foi 295,8 J/g e para a Cristlia 245,8 J/g,
indicando que esta ltima mais pura. preciso mencionar tambm que o fato das
duas curvas de aquecimento por DSC apresentarem um nico pico endotrmico mostra
que no h polimorfismo, ou seja, existe apenas uma estrutura cristalina para ambas as
amostras.

5.1.7.Anlise da NYS por TGA

Os termogramas das amostras NYS Medley e Cristlia demonstram que ambas
so muito semelhantes, com um mesmo perfil de perda de massa (Fig. 29).

50 100 150 200 250 300
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
130
Amostra Medley
Amostra Cristlia
M
a
s
s
a

(

%

)
Temperatura (
o
C )

Figura 29. Curvas de aquecimento obtidas por TGA da NYS Lotes: NT/C 645743/Medley e
04102/2004/Cristlia. Massas: 3,7mg (Medley); 3,5mg (Cristlia).

Os DTGs das amostras indicam que as NYSs sofrem decomposio em trs
fases no intervalo de temperatura estudado (Fig. 30). As temperaturas correspondentes
80
para NYS Medley so 90,1 C; 171,0 C e 260,3 C e para a Cristlia 88,4 C; 173,6 C
e 258,8 C.

50 100 150 200 250 300
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
260,3
o
C
171,0
o
C
90,1
o
C
Derivada da Curva de TGA - Amostra Medley
M
a
s
s
a

(

%

)
Temperatura (
o
C )
50 100 150 200 250 300
-0,2
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
258,8
o
C
173,6
o
C
88,4
o
C
Derivada da curva de TGA da amostra Cristlia
M
a
s
s
a

(

%

)
Temperatura (
o
C )

Figura 30. Curvas de DTG da NYS Lotes: NT/C 645743/Medley e 04102/2004/Cristlia.
Massas: 3,7mg (Medley) e 3,5mg (Cristlia).

5.1.8.Determinao do coeficiente de partio octanol/tampo

Para estimar o grau de lipofilicidade da NYS Medley, determinou-se o coeficiente
de partio octanol/tampo succinato (0,02 mol L
-1
pH 5,6) isotnico do frmaco a 25 C
e 37 C pela razo entre as concentraes do composto nas fases orgnica e
aquosa(Tabela 7). Esse coeficiente uma medida da distribuio da substncia em um
sistema bifsico e comumente usado como parmetro relacionado a capacidade de
penetrar em membranas biolgicas, mimetizadas por lipossomas.

81
Tabela 7. Coeficientes de partio da NYS em n-octanol/tampo succinato (0,02 mol.L
-1
; pH
5,6) isotnico a 25 e 37 C.

Concentrao (mM) Coeficiente
25C
Coeficiente
37C
0,25 1,3 1,2
0,48 1,2 1,4
1,00 1,4 ND
2,00 1,6 1,3
3,00 1,1 1,0
4,00 1,0 0,7
5,00 0,9 0,5
ND = No Determinado

Verificou-se uma partio maior da NYS Medley na fase apolar at uma
concentrao de 2 mM de frmaco na temperatura ambiente. Quando a concentrao
aumentou, observou-se que a NYS migra para a fase aquosa, que mais evidente na
temperatura de 37C.

5.2.Preparao das formulaes lipossomais

Com o intuito de desenvolver sistemas lipossomais, nos quais o frmaco NYS
apresentasse estabilidade qumica e teor elevado de recuperao, foram obtidas vrias
preparaes combinando lipdios selecionados. Modificou-se a concentrao de
frmaco em relao dos lipdios, s temperaturas e ao modo de hidratao.
Inicialmente, foram preparadas vesculas multilamelares que foram sonicadas para
terem tamanho mais reduzido.
Na Tabela 8, so mostrados os teores e as condies experimentais de quatro
formulaes multilamelares, nas quais partiu-se de uma composio lipdica e relao
frmaco/lipdio pr-estabelecida. Foram variados inicialmente os meios e a temperatura
82
de hidratao (Etapa 1).

Tabela 8. Teores % de NYS recuperada nas formulaes lipossomais, contendo 10 % de NYS
em relao concentrao molar de PCH, hidratadas com Hepes (0,01 mol.L
-1
; pH
7,4) ou Tampo succinato (0,02 mol.L
-1
, pH 5,6), isotnicos, a 55 C e 65 C.

Teor (%) C
total

lipdios
(mM)
Meios
hidrat
Temp.
hidrat (C)
Modo
hidrat
Relao
NYS:lip
(%)
Teor (%)
frmaco
PCH = 100 10,6 HEPES 65 AU 10 89,3 0,7
PCH = 100 10,6 HEPES 55 AU 10 84,0 0,6
PCH = 100 10,6 Succinato 65 AU 10 74,5 0,4
PCH = 100 10,6 Succinato 55 AU 10 90,8 0,1
AU = modo de hidratao com adio do meio hidratante de uma nica vez.

Os testes preliminares apontam que a melhor condio experimental para a
hidratao dos lipossomas meio tampo succinato 0,02 mol L
-1
, pH 5,6 e temperatura
de hidratao 55 C. O sucesso da estabilizao qumica do frmaco, com o tampo
succinato (pH 5,6) j era esperado. As pesquisas de Zeichner e col., (2001)
determinaram atividade antifngica de dois confrmeros interconvertveis da NYS,
isoladas por HPLC preparativa e as frmulas estruturais moleculares determinadas por
anlises com RMN (Fig. 31) contra cepas de Candidas spp. em RPMI (pH 7,5). O
confrmero que apresentou maior atividade biolgica existiu, preferencialmente, em pH
6,0 (CASTANHO e col., 1992).

83

Figura 31. Estruturas moleculares das formas isomricas interconvertveis do antibitico NYS.
A maior atividade biolgica; B - menor atividade biolgica.

Para confirmar esses resultados, uma nova formulao foi preparada e testada
nas mesmas condies experimentais j avaliadas. Na Tabela 9, tem-se os teores de
NYS obtidos para a nova formulao (80 % PC e 20 % de colesterol).
84
Tabela 9. Teores obtidos de NYS recuperada na formulao 80 % PCH e 20 % de Colesterol,
hidratada com os tampes HEPES (0,01 mol.L
-1
; pH 7,4) ou tampo succinato (0,02
mol.L
-1
; pH 5,6), isotnicos, a 55 C e 65 C.

Composio/conc./
teor(%)
C
total

lipdios
(mM)
Meios
hidrat
Modo
hidrat
Temp.
hidrat
(C)
Rel.
NYS:lip
(%)
Teor (%)
frmaco
PCH= 80% (8,5 mM)
Colesterol=20% (2,1 mM)
10,6 HEPES AU 65 10 62,6 0,5
PCH=80% (8,5 mM)
10,6 HEPES AU 55 10 82,7 0,6
PCH=80% (8,5 mM)
10,6 Succinato AU 65 10 80,7 0,1
PCH=80% (8,5 mM)
10,6 Succinato AU 55 10 98,1 0,4
AU = modo de hidratao com adio do meio hidrante de uma nica vez.

Mesmo introduzindo colesterol e diminuindo o teor de PCH, a melhor condio
experimental quanto ao meio e temperatura de hidratao foi confirmada (tampo
succinato, 55 C), sendo que o colesterol parece melhorar o teor de recuperao do
frmaco presente.
A Fig. 32 mostra os cromatogramas das duas formulaes para as quais foram
obtidos os maiores teores (90,8 % (Tabela 8) e 98,1 % (Tabela 9)) de NYS recuperada.
Os teores obtidos para as formulaes das Tabelas 8 e 9 e ainda a anlise dos
cromatogramas (presena de mais compostos de degradao para formulao B) de
duas formulaes (formulao A, composta de PCH e colesterol e formulao B,
composta somente por PCH) indicam que as compostas somente por PCH apresentam
menor estabilidade qumica do que as constitudas de PCH e colesterol.

85

Figura 32. Cromatogramas das duas formulaes (Etapa 1). (A) 80 % de PC e 20 % de
colesterol e teor de 98,1 0,4 % de NYS e (B) 100% de PCH e teor de 90,8 0,1 %
de NYS. O pico em 2 min corresponde a fase mvel.

A Fig. 33 apresenta os cromatogramas da formulao preparada na Etapa 1, que
possui em sua composio 80 % de PCH e 20 % de colesterol. Verificou-se a presena
de menos compostos de degradao quando na hidratao dos lipossomas, utilizou-se
o tampo succinato 0,02 mol L
-1
, pH 5,6 como soluo hidratante a 55 C
(cromatograma A). Todavia, a degradao aumenta se a temperatura for aumentada
para 65 C (cromatograma B) e a soluo hidratante modificada para tampo HEPES
0,01 mol L
-1
, pH 7,4 (cromatogramas C e D).

86

Figura 33. Cromatogramas das formulaes com 80% de PCH e 20% de Colesterol (Etapa1).
(A): tampo succinato (0,02 mol.L
-1
), pH 5,6 e 55 C; (B): tampo succinato (0,02 mol
.L
-1
), pH 5,6 e 65 C; (C): tampo HEPES (0,01 mol.L
-1
), pH 7,4 e 55 C; (D): tampo
HEPES (0,01 mol.L
-1
), pH 7,4 e 65 C. Todos os meios de hidratao foram
isotonizados.

Na sequncia (Etapa 2), foi utilizada a formulao com maior teor (98,1 %) at
ento preparada (80 % PCH e 20 % Col.) e adicionou-se outra formulao sem
colesterol, mas com DSPG. Modificou-se a concentrao de lipdios (11 e 15 mM) e o
modo de hidratao (AU e AE) e foi diminuda a relao NYS/lipdio de 10 % para 7 %
(Tabela 10).
87
Tabela 10. Teores de NYS recuperada nas formulaes lipossomais (Etapa 2), compostas de
lipdios PCH, colesterol e DSPG, contendo NYS (NYS/lipdio 7 %), hidratadas com
tampo succinato (0,02 mol.L
-1
), isotnico, a 55 C.

Composio/Conc./Teor
(%)
C
total

lipdios
(mM)
Meio
hidrat
Temp
hidrat
(C)
Relao
NYS:lip
(%)
Modo
hidrat
Teor (%)
frmaco
PCH = 80 % (8,5 mM)
colesterol =20% (2,2 mM)
10,7 Succinato 55 7,0 AU 79,5 0,9
PCH = 80 % (8,5 mM)
colesterol = 20% (2,2 mM)
10,7 Succinato 55 7,0 AE 93,3 0,7
PCH = 66 % (10,0 mM)
DSPG = 34% (5,1 mM)
15,1 Succinato 55 7,0 AU 77,6 0,5
AE = modo de hidratao com adio do meio hidratante em 3 etapas.

Com esses resultados, pode-se sugerir que o modo de hidratao AE favorece a
encapsulao do frmaco, estando o composto menos vulnervel degradao
trmica.
A Tabela 11 mostra os teores % e as condies experimentais das formulaes
lipossomais estudadas no Etapa 3, a seguir.
88
Tabela 11.Teores % obtidos de NYS recuperada nas formulaes: 80 % PCH e 20 % de
Colesterol e 70 % PCH e 30 % de DSPG, quando as formulaes so hidratadas com
tampo succinato (0,02 mol L
-1
), pH 5,6, isotnico. As formulaes foram hidratadas a
55 C e foram variadas as concentraes de lipdios de 10 para 15 mM. A relao
frmaco/lipdio de 7 % para 10 %.

Composio/ conc./ Teor
(%)
C
total

lipdios
(mM)
Meio
hidrat
T
hidrat
(C)
Relao
NYS: lip
(%)
Modo
hidrat
Teor (%)
frmaco
PCH = 80 % (8,5 mM)
colesterol = 20% (2,2mM)
10,7 Succinato 55 10,0 AE 94,8 0,3
PCH = 80 % (12,0 mM)
colesterol = 20% (2,2mM)
15,2 Succinato 55 7,0 AE 98,4 0,5
PCH = 68,5 % (7,4 mM)
DSPG = 31,5 % (3,4 mM)
10,8 Succinato 55 10,0 AE 75,2 0,7
PCH = 70 % (10,7 mM)
DSPG = 30 % (4,6 mM)
15,3 Succinato 55 7,0 AE 76,7 0,7

Considerando os resultados obtidos para as formulaes testadas neste Etapa 3,
no qual foram preparados dois tipos de formulaes (PCH 80 %:Colesterol 20 % e PCH
70 %:DSPG 30 %), verificou-se que os teores entre as mesmas formulaes
praticamente no variaram. Entretanto, houve uma sensvel superioridade quanto aos
teores (%) de NYS recuperadas na formulao PCH 80 %:colesterol 20 % em relao
PCH 70%:DSPG 30 %.
A Tabela 12 mostra condies experimentais e teores de NYS nas formulaes
da Etapa 4.
89
Tabela 12.Teores de NYS nas formulaes lipossomais compostas de PCH, colesterol e DSP,
BHT e NYS em uma relao frmaco/lipdio de 7 %, hidratadas com tampo
succinato (0,02 mol L
-1
), isotnico, a 60 C.

Composio/Conc./Teor
(%)
C
total

lipdio
(mM)
Meio
hidrat
Temp.
hidrat
(C)
Relao
NYS: lip
(%)
Modo
hidrat
Teor (%)
frmaco
PCH = 54 % (8,0 mM)
colesterol = 26 %(3,9 mM)
DSPG = 20 % (2,9 mM)
BHT = 1,3 %
14,8 Succinato 60 7,0 AE 92,3 0,9
PCH = 80,0 % (11,8 mM)
colesterol=20,0 %(2,9 mM)
BHT = 1,3 %
14,7 Succinato 60 7,0 AE 82,2 0,3
PCH = 69 % (10,9 mM)
colesterol = 21 % (3,1 mM)
DSPG = 10 % (1,5 mM)
BHT = 1,3 %
15,0 Succinato 60 7,0 AE 95,3 0,4
PCH = 70 % (10,5 mM)
DSPG = 30 % (4,5 mM)
BHT = 1,3 %
15,0 Succinato 60 7,0 AE 64,9 0,5
90
Variou-se a composio lipdica e a temperatura de hidratao que foi
intermediria s utilizadas, 60 C. Devido sensibilidade da NYS ao oxignio no estado
slido ou em soluo, introduziu-se o antioxidante BHT que deve ser usado em uma
concentrao de 1 % a 1,5 % em relao massa de frmaco empregado (MICHEL,
1972). Conforme Lasic, (1993), lipossomas empregados em terapia antimicrobiana em
geral apresentam contedo de colesterol de 10 30 mol % de colesterol e fosfolipdios
com carga, com cabea polar de PS ou PG a uma concentrao de 5 a 30 mol%. Na
literatura (VARGAS e col.,2000 & DEF, 2000), verifica-se que as duas formulaes
liofilizadas contendo os antibiticos antifngicos polinicos NYS (NYOTRAN
) e AnfB
(AMBISOME
) tm a seguinte composio (% molar) e meio de reconstituio:

NYOTRAN
(DMPC 70,5 % e DMPG 29,4 %, antioxidante no citado, salina) e o

AMBISOME
(Epikuron 53,6 %; Colesterol 26,3 % e DSPG 20,4 %; -tocoferol 1,3 %

(antioxidante); sacarose (crioprotetor); succinato de sdio e gua). Assim, foram
preparadas formulaes lipossomais contendo NYS, em que foram empregados
Epikuron 200 SH (PCH), colesterol, DSPG e BHT.

A formulao que apresentou maior teor de NYS recuperada foi a com PCH 70
%, colesterol 20 % e DSPG 10 % (P3). Contudo, nas duas outras formulaes,
denominadas P1 (PCH 54 %, colesterol 26 % e DSPG 20 %) e P2 (PCH 80 % e
colesterol 20%), houve pouca degradao do frmaco. A afirmativa anterior
demonstrada nos cromatogramas da Figura 33, na qual se tem o cromatogramas A
(P1), B (P2) e C (P3). A formulao com PCH 70 % e DSPG 30 % (P4) apresentou
maior degradao da NYS (Fig. 34). Esses resultados parecem evidenciar a
importncia do colesterol na formulao, para a estabilizao do frmaco.
91

Figura 34. Cromatogramas das formulaes P1 (PCH 54 %, colesterol 26 % e DSPG 20 %) (A),
P2 (PCH 80 % e colesterol 20%) (B), P3 (PCH 70 %, colesterol 20 % e DSPG 10 %)
(C) e P4 (PCH 70 % e DSPG 30 %) (D), respectivamente, em tampo succinato
(0,02 mol L
-1
), pH 5,6 e 60 C.

Aps a seleo da melhor formulao encontrada na Etapa 4, teve-se ainda que
otimizar as condies de formulao da suspenso lipossomal. Assim, na 5
a
etapa de
preparao, foram variadas as temperaturas de hidratao a 55 C e 60 C e o modo de
hidratao em AU (adio do meio hidratante de uma nica vez) e AE (adio do meio
hidratante em 3 etapas). As formulaes lipossomais e condies experimentais esto
descritas na Tabela 13.
92
Tabela 13. Teores de NYS recuperada na formulao lipossomal composta de PCH, colesterol,
DSPG, BHT e NYS em uma relao frmaco/lipdio de 6,5 %, hidratada com tampo
succinato (0,02mol L
-1
), isotnico, a 55 C e 60 C, modo de hidratao AU e AE.

Composio/Conc./Teor (%)
C
total

lipdios
(mM)
Meios
hidrat
Temp.
hidrat
(C)
Relao
NYS: lip
(%)
Modo
hidrat
Teor (%)
frmaco
PCH = 69,9% (10,3 mM)
colesterol = 20,3 % (2,99 mM)
DSPG = 9,8 % (1,45 mM)
BHT = 1,3 %

14,7

Succinato

55

6,5

AE

80,6 0,6
PCH = 69,9 % (10,3 mM)
DSPG = 9,8% (1,45 mM)
BHT = 1,3 %

14,7

Succinato

55

6,5

AU

92,2 0,2
PCH = 69,9% (10,3 mM)
colesterol = 20,3 %
(2,99 mM)
DSPG = 9,8% (1,45 mM)
BHT = 1,3 %

14,7

Succinato

60

6,5

AE

97,3 0,1
PCH = 69,9% (10,3 mM)
DSPG = 9,8% (1,45 mM)
BHT = 1,3 %
14,7 Succinato 60 6,5 AU 95,2 0,2
___________________________________________________________Resultados e Discusso
93
Os teores obtidos mostram que aps a seleo adequada da formulao, o modo
de hidratao influencia pouco na estabilizao qumica de frmaco, mas a temperatura
contribui muito para sua degradao. Embora o teor de frmaco seja maior a 60 C,
picos de compostos de degradao so verificados nos cromatogramas (dados no
mostrados).

5.3.Caracterizao fsico-qumica das suspenses lipossomais

A formulao composta de PCH (70 %), colesterol (20 %), DSPG (10 %), 1,05
mM de NYS e 1,3 % de BHT foi aquela em que o frmaco apresentou maior
estabilidade qumica. A caracterizao fsico-qumica foi realizada aps a diminuio de
tamanho e separao do frmaco livre do encapsulado. O primeiro mtodo empregado
para diminuio do tamanho das vesculas foi extruso, mas o entupimento dos poros
das membranas empregadas e a formao de compostos de degradao do frmaco
levaram ao abandono dessa tcnica. O entupimento pode ter ocorrido devido
presena de frmaco livre no estado agregado. Outra metodologia usada foi a
ultracentrifugao/sonicao. Aps esse procedimento, o frmaco livre foi separado do
encapsulado via centrifugao. As amostras caracterizadas foram as duas formulaes
hidratadas a 55 C (L1) e 60 C (L2) com tampo succinato (0,02 mol L
-1
; pH 5,6).

5.3.1.Raio hidrodinmico

A distribuio de tamanho das formulaes L1 e L2 foram determinadas 13 dias
aps o preparo das mesmas (Fig. 35) obtendo os valores de 52,5 nm a 263,4 nm
(polidispersidade 0,087) para L1 e 56,0 nm a 196,3 nm (polidispersidade 0,079) para
L2. Para as classes com maior freqncia , o dimetro mdio foi 64,3 nm para L1 e 68,1
nm para L2.

94

(A)

(B)
Figura 35. Distribuio Multimodal de tamanho. (A) Formulao L1; (B) Formulao L2

Considerando que as formulaes foram desenvolvidas para uso parenteral,
caracterstica fundamental que formulaes injetveis sejam estreis e livres de
pirognios (substncias contaminantes que causam febre, quando administradas,
intravenosamente, no organismo humano e de certos animais (PINTO e col., 2003)). A
esterilizao de injetveis pode ser feita por filtrao em membranas com poros de 0,22
ou 0,45 m, de modo que as formulaes obtidas so esterilizveis (DEF, 2000,
USP24-NF19, PINTO e col., 2003).

95
5.3.2.Potencial zeta

Reflete o potencial de superfcie das partculas, sendo influenciado pelo meio
dispersante, devido dissociao de espcies inicas presentes e constituintes das
partculas.

As formulaes L1 e L2 tiveram os seguintes potenciais zeta mdios: 35,31
1,54 mV e 42,50 0,8 mV, respectivamente, sugerindo que L2 teria maior estabilidade
fsico-qumica, pois mostra potencial zeta maior, existindo maiores foras repulsivas
entre as partculas e que evitam sua agregao. Os valores de potencial zeta tambm
justificam a polidispersidade menor para L2.

5.3.3.Teor de fosfato

A concentrao de fosfolipdios determinada quantificando-se os ons fosfatos
em soluo por espectrofotometria na regio do Visvel. Os fosfolipdios utilizados
possuem apenas um tomo de fsforo por molcula, de modo que a concentrao de
fsforo determinada corresponde de fosfolipdios.

O rendimento mdio da formulao lipossomal, multilamelar vazia hidratada a
60C foi 88 %. Contudo, quando a mesma formulao (L2) foi ultracentrifugada,
sonicada e centrifugada novamente, o teor de fosfato passou a 57,7 0,1 %. A
formulao hidratada a 55 C (L1), que sofreu o mesmo tratamento que L2, apresentou
teor de 63,3 0,1 %. Os teores encontrados para as duas formulaes fornecem
massas de lipdios totais (massas de PC e DSPG) de 9,5 mM e 8,7 mM para L1 e L2,
respectivamente. Desta forma, os teores lipdios so muito semelhantes, embora L1
apresente um teor de fosfolipdeos sutilmente maior.

96
5.3.4.Eficincia de encapsulao

O teor de frmaco encapsulado foi determinado em anlise por CLAE das
formulaes L1 e L2 que foram ultracentrifugadas, sonicadas e centrifugadas para
separar a NYS livre da encapsulada.

A ultracentrfugao foi necessria porque os picos cromatogrficos de possveis
compostos de degradao eram eliminados ou diminuam de tamanho quando esse
procedimento era feito (Fig. 36).

Figura 36. Cromatogramas da NYS presente em formulao lipossomal MLV (L2) sem
ultracentrifugar (A) e ultracentrifugada (B). Suspenso em tampo succinato (0,02
mol L
-1
); pH 5,6; isotnico. O Pico com tempo de reteno prximo a 3 min o pico
do solvente e em cerca de 10 min o da NYS.

A eliminao/diminuio da degradao das formulaes lipossomais aps a
ultracetrifugao pode ser devida maior solubilidade dos produtos de degradao no
meio aquoso quando comparado a NYS. Na ultracentrifugao, o sobrenadante
eliminado retirando-se os compostos de degradao do meio e o pellet
ressuspendido ao mesmo volume anterior a ultracentrifugao.

97
Duas tcnicas de separao do frmaco livre foram empregadas: dilise e
centrifugao (NEW, 1990). A cromatografia de excluso em gel no pode ser
empregada devido aos problemas enfrentados na extruso (item 4.2.4) da formulao
MLV com NYS. Contudo, com cada uma dessas tcnicas houve dificuldades para
separar o frmaco livre do encapsulado por causa da difcil solubilizao e agregao
imediata em meio aquoso da NYS, causada pelo uso de uma concentrao acima de 3
M (CMC da NYS em meio aquoso, corroborando Castanho, e col., 1992) no preparo
das formulaes lipossomais. Anlises realizadas nas suspenses dialisadas
mostraram que a NYS no foi dialisvel, ou seja, permaneceu junto a NYS encapsulada
no saco de dilise (marca: Sigma, tamanho 23 x 15 mm, retm 99,9 % de citocromo C,
(MW 12.400)). Com relao centrifugao, por causa da agregao do frmaco em
meio aquoso, quando centrifugada a suspenso com o frmaco livre, o mesmo
sedimentava junto s vesculas. Por isso, foi necessrio diminuir o tamanho das
vesculas para que ficassem suspensas no sobrenadante e o frmaco livre
sedimentasse no tubo de centrfuga, ocorrendo separao. A centrifugao tambm
removeu as partculas de titnio desprendidas do sonicador. A Tabela 14 apresenta os
teores determinados por anlises por CLAE das suspenses L1 e L2.

Tabela 14.Teores de encapsulao de NYS em preparaes lipossomais L1 e L2.

Suspenses Lipossomais Eficincia de encapsulao
EE (%)
L1 28,9 1,0 %
L2 37, 3 1,7 %
EE (%) = Massa de NYS encapsulada/massa de NYS total adicionada X 100

Observou-se pequeno teor de encapsulao para ambas as formulaes. Isto
pode ser decorrente de ter-se medido o teor de encapsulao somente das vesculas
pequenas em suspenso. Vesculas maiores que sedimentaram junto com as partculas
de titnio podem apresentar maiores teores de encapsulao. A partir dos teores de
98
lipdios totais obtidos na anlise do teor de fosfato (item 5.3.3) e teores de frmaco
encapsulado, pode-se relacionar as concentraes molares efetivas de frmaco e
lipdios. Pelos dados encontrados, para cada 9,5 m mol.L
-1
de lipdios, foi encapsulado
0,3 m mol.L
-1
de NYS (1 m mol.L
-1
lipdio/0,03 m mol.L
-1
NYS) para L1 e em 8,7 m
mol.L
-1
de lipdio, foi encapsulados 0,4 m mol.L
-1
de NYS (1 m mol.L
-1
lipdio/0,04 m
mol.L
-1
NYS) para L2.

5.3.5.Determinao do grau de anisotropia de fluorescncia

Esse parmetro fornece informaes sobre as propriedades intrnsecas (rotao
molecular) da molcula, bem como sobre o ambiente no qual ela se encontra.
Castanho e col., (1992) afirmam que NYS na concentrao de at 3 mol.L
-1
em
meio aquoso est na forma monomrica e, acima, agregada. Os resultados
apresentados na Tabela 15 mostram os graus de anisotropia obtidos temperatura
ambiente, para NYS em tampo pH 5,6, acima e abaixo da CMC e na presena das
preparaes L1 e L2.

Tabela 15. Grau de anisotropia de fluorescncia (r) da NYS livre e encapsulada em lipossomas
em tampo succinato (0,02mol.L
-1
), isotnico, pH 5,6 a 25 C.

Amostra r
NYS em tampo(1,0 M) 0,07
NYS em tampo (9,9 M) 0,24
NYS em lipossoma L1 (1,0 M) 0,40

Verifica-se um aumento do valor da anisotropia quando o composto passa do
99
estado monomrico (r = 0,07) para o estado agregado (r = 0,24), indicando maior
impedimento estrico do estado agregado e, assim, menor liberdade rotacional da
molcula do frmaco. Valores ainda maiores do grau de anisotropia foram observados
quando a NYS foi incorporada nas formulaes lipossomais L1 e L2 nas concentraes
1,0 (monomrica) e 9,9 mol.L
-1
(agregada). Estes resultados indicam que o fato das
molculas estarem na forma monomrica ou agregada no interfere nos graus de
anisotropia do frmaco em lipossomas. Entretanto, maiores valores do grau de
anisotropia da NYS nas formulaes lipossomais indicam restries aos movimentos
rotacionais das molculas, causadas pela sua incorporao na bicamada lipdica.

Informaes do estado monomrico e agregado da NYS em tampo succinato
0,02 mol L
-1
, pH 5,6 (forma livre) e em lipossomas (forma encapsulada) foram obtidas
pela anlise dos espectros de fluorescncia da NYS nas concentraes de 1,0
(monomrica) e 9,9 M (agregada) a 25 C e 60 C. Na Tabela 16, observa-se aumento
da intensidade de fluorescncia, pela rea registrada sob a curva dos espectros de
fluorescncia, que compara a NYS em tampo (forma livre) versus na formulao
lipossomal (forma encapsulada): NYS na forma livre, versus NYS agregada e a 25 C
versus 60 C.

A maior polarizao de fluorescncia em meio aquoso provavelmente resulta da
formao de agregados de NYS (ZEICHNER e col., 2001).

Na formulao lipossomal, os lipdios presentes na formulao esto: na fase gel
a 25 C e na fase lquida cristalina a 65 C.

100

Tabela 16. Variao da fluorescncia da NYS em concentraes e temperaturas diferentes, na
ausncia e presena de lipossomas, em tampo succinato (0,02mol.L
-1
), isotnico,
pH 5,6.
Antibitico Concentrao
(M)
Temperatura
(C)
reas sob os espectros de
fluorescncia
NYS em tampo 1 25 702,1
NYS em
lipossomas (L1)
1 25 2416,6
NYS em
lipossomas (L2)
1 25 2939,7
NYS em tampo 1 60 202,8
NYS em
lipossomas (L1)
1 60 1001,54
NYS em
lipossomas (L2)
1 60 1104,3
NYS em tampo 9,9 25 2712,4
NYS em
lipossomas (L1)
9,9 25 15749,5
NYS em
lipossomas (L2)
9,9 25 17725,3
NYS em tampo 9,9 60 1264,9
NYS em
lipossomas (L1)
9,9 60 4553,2
NYS em
lipossomas (L2)
9,9 60 5507,7

Coutinho e col., (2003), asseveram que as anlises fluorimtricas da interao de
NYS com membranas lipdicas de DPPC mostraram aumento da intensidade
fluorescncia das suspenses analisadas, sendo esse fenmeno atribudo auto-
associao do antibitico, fortemente fluorescente, presente nas membranas lipdicas,
na fase gel. Os resultados obtidos (Tabela 16) indicam que o frmaco parece se
agregar tanto quando em soluo quanto na presena de lipossomas temperatura
ambiente. Contudo, verifica-se que as reas obtidas quando o frmaco est em
101
lipossomas so ainda maiores, pois nos lipossomas h a presena de colesterol, que
pode associar-se ao frmaco (mecanismo de ao de antibiticos polinicos) e formar
complexos fluorescentes (COUTINHO e col., 2004, 2006). Ainda observa-se que
maiores reas so obtidas para a formulao L2, que apresenta maior teor de frmaco
encapsulado, conforme relatado na seo 5.3.4.

5.3.6.Estudo da interao da NYS em lipossomas

Anlises da supresso de fluorescncia da NYS em lipossomas permitiram
avaliar a localizao do composto na bicamada lipdica. Na estimativa da localizao do
antibitico nas vesculas lipdicas, foram utilizados supressores de ambientes hidroflico
(iodeto de potssio (KI)) e hidrofbico (acrilamida).
A Fig. 37 ilustra a diminuio da intensidade de emisso de fluorescncia
medida que se aumentou a concentrao dos agentes supressores na presena de
lipossomas contendo NYS. Pelas supresses obtidas, pode-se constatar que h NYS
em ambiente hidroflico e lipoflico. Nas anlises da supresso de fluorescncia da NYS
em lipossomas, utilizando como sondas de ambiente lipdico os cidos 5-doxil esterico
(ambiente interfacial lipdio/gua) e 16 doxil esterico (ambiente lipdico), realizadas por
Coutinho e col., (2003), estes verificaram que a NYS monomrica est
preferencialmente ancorada na interface fosfolipdio/gua e que forma oligmeros
(agregados moleculares) que se inserem no interior da membrana lipdica.

102
350 400 450 500 550
0
200
400
600
L1 com KI
I
E
m
i
s
s
o
Comprimento de onda (nm)

(A)

350 400 450 500 550
0
200
400
600
L2 com KI
I
E
m
i
s
s
o

(B)

103
350 400 450 500 550
0
200
400
600
L1 com Acrilamida
I
E
m
i
s
s
o

(C)
350 400 450 500 550
0
200
400
600
L2 com acrilamida
I
E
m
i
s
s
o

(D)
Figura 37. Sobreposio de espectros de emisso de fluorescncia da NYS (C = 9,9 mol.L
-1
)
nos lipossomas L1 (hidratado a 55C) e L2 (hidratado a 60C) aps a adio
sucessiva dos agentes supressores iodeto de potssio (A e B) e acrilamida (C e D),
a 25C. As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L
-1
.
104
Quando foram adicionados KI e NYS livre, verificou-se uma supresso de
fluorescncia importante, pois a supresso por halogenetos grandes como o iodeto
pode ser resultado de cruzamento entre sistemas para um estado triplete excitado,
promovido pelo acoplamento spin-orbital do fluorforo (singlete) excitado e o
halogeneto. Desde que a emisso do estado triplete lenta, a emisso triplete
altamente suprimida (LAKOWICZ, 1999).

Todavia, o mesmo no ocorreu ao se adicionar acrilamida, o que era esperado,
porque a NYS encontra-se livre em soluo aquosa (tampo succinato) e a acrilamida,
por ser um supressor de ambiente apolar, suas molculas se encontram organizadas
em soluo(Fig. 38).

350 400 450 500 550
0
20
40
60
80
100
Nistatina livre comKI
I
E
m
i
s
s
o
350 400 450 500 550
0
20
40
60
80
100
Nistatina livre com acrilamida
I
E
m
i
s
s
o

Figura 38. Sobreposio de espectros de emisso de fluorescncia da NYS (C = 9,9 mol.L
-1
)
livre em tampo succinato aps a adio sucessiva dos agentes supressores iodeto
de potssio(A) e acrilamida (B) a 25C. As concentraes dos supressores variaram
de 0 a 0,29 mol.L
-1
.

Na anlise da supresso da fluorescncia, correlacionaram-se as intensidades
de emisso de fluorescncia, obtidas a 416 nm, na ausncia e presena dos
supressores (KI e acrilamida) com a concentrao dos mesmos e para obteno dos
grficos de Stern-Volmer para as NYS lipossomais (L1 e L2) e livre (Fig. 39).

105

(A)

(B)
Figura 39. Grficos de Stern-Volmer relativos ao estudo da supresso de fluorescncia, no
estado fixo da NYS (C = 9,9 mol.L
-1
) livre e em lipossomas com os supressores
iodeto de potssio (A) e acrilamida (B). As concentraes dos supressores variaram
de 0 a 0,29 mol.L
-1
.

Os grficos de Stern-Volmer (equao 4) indicam que ocorreu um desvio positivo
da linearidade, para os dados relacionados as NYS
s
lipossomais (L1 e L2) quando
empregamos os dois supressores. No entanto, em relao a NYS livre somente verifica-
se supresso e o mesmo perfil de desvio da Stern-Volmer quando utilizada o KI.

Realizando uma anlise inicial, os desvios podem estar indicando a ocorrncia
0 , 0 0 0 , 0 5 0 , 1 0 0 , 1 5 0 , 2 0 0 , 2 5 0 , 3 0
0 , 8
1 , 0
1 , 2
1 , 4
1 , 6
1 , 8
2 , 0
2 , 2
2 , 4
2 , 6
L 1
L 2
N Y S L i v r e
F
0
/
F
[ K I ] ( m o l . L
- 1
)
0 , 0 0 0 , 0 5 0 , 1 0 0 , 1 5 0 , 2 0 0 , 2 5 0 , 3 0
0 , 8
1 , 0
1 , 2
1 , 4
1 , 6
1 , 8
2 , 0
2 , 2
2 , 4
L 1
L 2
N Y S L i v r e
F
0
/
F
[ A c r i l a m i d a ] ( m o l . L
- 1
)
106
de supresso esttica e dinmica da fluorescncia da NYS em lipossomas e em tampo
succinato.

Para elucidar os desvios positivos nos dados de supresso da equao 4 foram
empregadas as equaes modificadas de Stern-Volmer (equaes 5 e 6). A primeira a
ser testada foi a que descreve as supresses combinadas esttica e dinmica (equao
5). A Fig. 40 apresenta os resultados dos dados de supresso para as NYS
s

lipossomais e livre, de acordo com a equao 5.

(A)

0 , 0 5 0 , 1 0 0 , 1 5 0 , 2 0 0 , 2 5 0 , 3 0
0
1
2
3
4
5
6
L 1
L 2
N Y S L i v r e
F
0
/
F
-
1
/
[
K
I
]
)
[ K I ] ( m o l . L
- 1
)
107

(B)
Figura 40. Grficos da equao de Stern-Volmer modificada (equao 5) empregada para
supresso de fluorescncia combinada dinmica e esttica, no estado fixo, da NYS
livre (C = 9,9 mol.L
-1
) e em lipossomas com os supressores iodeto de potssio (A)
e acrilamida (B). As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L
-1
.

Na Fig. 41, verifica-se que em toda faixa de concentrao de supressores
utilizados no houve um ajuste linear dos dados de supresso quando empregada a
equao de supresso combinada. Se forem utilizados intervalos de concentrao de
supressores, h duas regies com ajuste linear; todavia, as constantes de supresso
dinmica e esttica no puderam ser calculadas. Os valores numricos das constantes
no apresentaram significado fsico.

Como no foi alcanado um ajuste adequado na equao de Stern-Volmer
modificada para supresso esttica e dinmica, foram testados os dados de supresso
para uma equao de Stern-Volmer modificada (equao 6), o que denota a frao de
acessibilidade de duas diferentes populaes de fluorforos ao supressor. Pesquisas de
Coutinho e col., (2003) descrevem a presena de duas diferentes populaes de NYS
0 , 0 5 0 , 1 0 0 , 1 5 0 , 2 0 0 , 2 5 0 , 3 0
0
1
2
3
4
5
L 1
L 2
N Y S L i v r e
F
0
/
F
-
1
/
[
a
c
r
i
l
a
m
i
d
a
]
[ A c r i l a m i d a ] ( m o l . L
- 1
)
108
lipossomal: uma no estado monomrico e outra no estado oligomrico.

2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
1 / [ K I ] ( m o l
- 1
. L )
L 1
L 2
N Y S L i v r e
F
0
/
(
F
0
-
F
)

(A)
2 4 6 8 1 0 1 2 1 4 1 6 1 8
0
1 0
2 0
3 0
4 0
5 0
6 0
7 0
8 0
9 0
L 1
L 2
N Y S L i v r e
F
0
/
(
F
0
-
F
)
1 / [ A c r i l a m i d a ] ( m o l
- 1
. L )

Figura 41. Grficos para a equao Stern-Volmer modificada (equao 6) para fraes de
acessibilidade ao supressor no estudo da supresso de fluorescncia da NYS livre
(C = 9,9 mol.L
-1
) e em lipossomas com os supressores iodeto de potssio ( A) e
acrilamida (B). As concentraes dos supressores variaram de 0 a 0,29 mol.L
-1
.
109

Na Fig. 41, observa-se que os dados de supresso de NYS livre e lipossomal
tambm no se ajustam em todo o intervalo de concentrao dos supressores
utilizados. No obstante, se no forem utilizadas as concentraes iniciais dos
supressores iodeto de potssio e acrilamida, ou seja, empregadas as concentraes
acima de 0,1591 mol. L
-1
, tm-se ajustes lineares, visualizados na Fig. 42.

3 , 5 4 , 0 4 , 5 5 , 0 5 , 5 6 , 0 6 , 5
0 , 0
0 , 5
1 , 0
1 , 5
2 , 0
2 , 5
3 , 0
3 , 5
L 1
L 2
N Y S L i v r e
F
0
/
(
F
0
-
F
)
1 / [ K I ] ( m o l . L
- 1
)

(A)

(B)
Figura 42. Grficos para a equao Stern-Volmer modificada (equao 6) para os estudos da
supresso de fluorescncia da NYS livre (C = 9,9 M) e em lipossomas, com os
supressores KI (A) e acrilamida (B). As concentraes dos supressores variaram de
0,16 a 0,29 mol.L
-1
.
3 , 5 4 , 0 4 , 5 5 , 0 5 , 5 6 , 0 6 , 5
0
2
4
6
8
1 0
1 2
1 4
1 6
L 1
L 2
N Y S L i v r e
F
0
/
(
F
0
-
F
)
1 / [ A c r i l . ] ( m o l . L
- 1
)
110
A inclinao da correlao F0/(F) versus 1/[Q] igual a (fa . Ka)
-1
, sendo fa a
frao de fluorescncia inicial acessvel ao supressor [69]. No entanto, os valores de fa
-
1
encontrados apresentaram valores numricos negativos que no tm significados
fsicos (Tabela 17).

Tabela 17. Valores de 1/fa obtidos para a NYS encapsulada em lipossomas (L1 e L2), usando
supressores como iodeto de potssio e Acrilamida.

NYS lipossomal Supressor 1/fa
NYS Livre Acrilamida -4,5135 1,8097
L1 Acrilamida 0,1836 0,0229
L2 Acrilamida 0,0569 0,0369
NYS Livre KI -0,4228 0,1511
L1 KI -0,2813 0,0317
L2 KI -0,2159 0,0252

Considerando que L1 e L2 com acrilamida apresentaram valores de 1/fa
positivos, podemos calcular os valores das constantes de supresso para L1 e L2. O
valor de Ka (constante de Stern-Volmer da frao acessvel aos supressores) para L1
foi de 0,4144 mol
-1
.L. para L2 de 0,1083 mol
-1
.L indicando uma melhor interao da
nistatina com o agente supressor acrilamida em L1, provavelmente devido a maior
imobilizao do frmoco em L1, segundo resultados obtidos pelas anlises do grau de
anisotropia.

5.3.7.Avaliao da atividade antifngica in vitro da NYS e NYS
lipossomal

Os testes de susceptibilidade in vitro avaliam a concentrao mnima do frmaco
que inibe o crescimento de determinado microrganismo. A NYS pura dos lotes NT:
C645743 (NYS 1) e NT:C645655 (NYS 2) tiveram Concentraes Inibitrias Mnimas
(MIC ou CIM), determinadas para vrias espcies dos gneros Candida e
111
Cryptococcus (Tabela 18). Para os microrganismos do gnero Candida foram utilizadas
cepas padro. Entretanto para os do gnero Cryptococcus utilizou-se cepa padro e
microrganismo isolado de licor de paciente do HU/UNICAMP.

Tabela 18. Resultados do teste de susceptibilidade in vitro (MIC (g/mL)) para as NYSs 1 e 2
em leveduras do gnero Candida, das espcies krusei, albicans, parapsilosis e do
gnero Cryptococcus, espcie neoformans.

Microrganismo MIC
NYS 1
MIC
NYS 2
C. krusei ATCC 6258 2 - 8 2 - 8
C. albicans ATCC 90028 2 - 8 2 - 8
C. albicans ATCC 76615 2 - 8 1 - 8
C. parapsilosis ATCC 22019 4 - 8 4 - 8
C. neoformans ATCC 90012 1 - 4 1 - 8

Anlises de MIC tambm foram realizadas para as NYSs 1 e 2 com fungos
filamentosos isolados de pacientes do HC/UNICAMP. Os resultados com esses fungos
dos gneros Trichophyton (dermatfito) foram isolados de raspados de pele (amostras
9, 10, 11, 12, 47, 142, 178, 233, 367, 393 e 434) e unha (amostras 45, 136, 208, 249,
280, 424, 437 e 438). Para o gnero Fusarium o microrganismo foi isolado de crnea e
para o Aspergillus de lavado brnquico (Tabela 19)

112
Tabela 19.MIC (g/mL) para as amostras de NYS 1 e 2 em fungos dos gneros Trichophyton
(espcies rubrum, mentagrophytes e espcie indefinida (spp.)); Fusarium spp. e
Aspergillus fumigatus.

Microrganismos
MIC
NYS 1
MIC
NYS 2
T. mentagrophytes (amostra 9 e 11, 208) 1 1
T. mentagrophytes (amostra 10 e 47) 2 2
T. mentagrophytes (amostra 178, 393) 1 2
T.spp. (amostra 12, 136,142, 249, 280, 367, 424,
437)
1 1
T. spp. (amostra 438) 1 2
T. rubrum (amostra 45, 233, 434) 1 1
Fusarium. spp. (amostra 829) 8 8
Aspergillus fumigatus (amostra 1000) 4 4

Os resultados de MIC das Tabelas 18 e 19 mostram que as duas amostras de
NYS so mais efetivas na inibio dos crescimentos dos fungos filamentosos do que
no filamentosos.
Anlises preliminares foram realizadas para avaliao comparativa do MIC e do
CFM (Concentrao Fungicida Mnima) de NYS lipossomal MLV e de NYS livre com
NYS 1. As amostras de NYS lipossomal foram hidratadas a 55 C (L1A) e 60 C (L2A),
ultracentrifugadas, mas no houve separao do frmaco livre do encapsulado. Na
Tabela 20, esto os valores dos MICs e CFMs para as referidas amostras,
empregando as leveduras dos gneros Candida e Cryptococcus. Foi testada a levedura
C. glabrata, denominada LIF 4681, que foi isolada de material biolgico (secreo
vaginal) de paciente do HC/UNICAMP. A referida levedura foi resistente a fluconazol,
cetoconazol e itraconazol.

____________________________________________________________________________________Resultados e Discusses
113

Tabela 20.MIC (g/mL) e CFM (g/mL) para a NYS livre, NYS 1 e NYSs L1A (hidratadas a 55 C) e L2A (hidratadas a 60 C),
em leveduras dos gneros Candida e Cryptococcus.

Microrganismos
MIC
NYS livre
CFM
NYS livre
MIC
L1A
CFM
L1A
MIC
L2A
CFM
L2A
C. albicans ATCC 76615 1,01 -
4,06
1,01 - 4,06 1,17 2,34 2,34 0,95 1,90 1,90
C. albicans ATCC 90028 1,01
2,03
1,01 4,06 1,17 2,34 2,34 4,68 0,95 1,90 1,90 3,81
C.parapsilosis ATCC 22019 2,03
4,06
2,03 4,06 1,17 2,34 2,34 0,95 1,90 1,90
C. krusei ATCC 6258 2,03
4,06
2,03 4,06 2,34 2,34 4,68 1,90 1,90 3,80
C. glabrata LIF 4681 2,03 2,03 1,17 2,34 2,34 4,68 0,95 1,90 3,81
C. neoformans ATCC 90012 1,01
4,06
1,01 2,03 0,58 1,17 0,58 1,17 0,47 1,90 0,47 0,95
OBS : Foram realizadas anlises em quadriplicata.
114
As amostras utilizadas para determinao da MIC e CFM, mostradas na Tabela
20, no foram esterilizadas. Desta forma, houve um crescimento bacteriano muito
intenso, prejudicando a avaliao da CFM. A avaliao da CFM mais prejudicada foi
para o gnero Cryptococcus, em todas as amostras. Amostras de lipossomas vazios de
L1A e L2A foram analisadas comparativamente e no interferiram nestes resultados.
Os resultados registrados na Tabela 20 indicam que a formulao L2A mais
fungisttica e fungicida do que a NYS livre para quase todas as espcies do gnero
Candida, exceto a C. glabrata, para a qual L2A fungisttico. Todavia, os menores
MIC e CFM foram encontrados para o gnero Cryptococcus.
Outras formulaes de NYS lipossomal hidratadas a 55 C e 60 C,
respectivamente L1 e L2, sofreram tratamentos para diminuio de tamanho e
separao do frmaco livre do encapsulado, conforme item 4.2.4. As amostras L1 e L2,
assim como dois lotes de NYS pura, passaram pelo teste de susceptibilidade in vitro.
Os lotes analisados foram: NT/C 645743/Medley, NYS 1 e 04102/2004/Cristlia, NYS 3.
As NYSs lipossomais foram preparadas com NYS 1.
Nas Tabelas 21 e 22, h os resultados de MIC e CFM, sendo os resultados
obtidos aps um ms de preparo das formulaes (L1 e L2). Foram testadas leveduras
padro dos gneros Candida e Cryptococcus. Ainda testamos levedura isolada de licor
de paciente do HC/UNICAMP, que foi identificada como LIF 217. A mesma pertence ao
gnero Cryptococcus e foi resistente a AnfB (Tabela 22).

115
Tabela 21.MIC(g/mL) e CFM (g/mL) para dois lotes de NYS livre (NT/C 645743/Medley e
04102/2004/Cristlia) e preparaes lipossomais L1 e L2, empregando as espcies
albicans e krusei.

C. albicans
ATCC 90028
C. albicans
ATCC 76615
C. krusei
ATCC 6258
MIC CFM MIC CFM MIC CFM
NYS 1
livre
2,0 2,0 2,0 2,0 4,0-8,0 4,0 - 16
NYS 3
livre
2,0 2,0 1,02,0 1,02,0 4,0 4,0
Lipossomal
L1(55C)
1,69 1,69 1,69 1,69 1,69 1,69
Lipossomal
L2 (60C)
1,13-2,25 1,13-2,25 1,13 1,13 4,5 4,5

116
Tabela 22.MIC(g/mL) e CFM (g/mL) para dois lotes de Nys livre (NT/C 645743/Medley e
04102/2004/Cristlia) e preparaes lipossomais L1 e L2, empregando os gneros
Candida (parapsilosis) e Cryptococcus(neoformans).
C. parapsilosis
ATCC 22019
C. neoformans
ATCC 90112
C. neoformans
LIF217
CIM CFM CIM CFM CIM CFM
Nys 1
livre
4,08,0 4,08,0 2,0 2,0 2,0 4,0
NYS 3
livre
4,0 4,0 2,0 2,0 4,0 4,0
Lipossomal
L1(55C)
1,69 1,69 0,84 0,84 1,69 3,38
Lipossomal
L2 (60C)
4,5 4,5 1,13 1,13 2,25 4,5

Os resultados indicam que a atividade biolgica das formulaes lipossomais
superior das formulaes com NYS livre. No entanto, a formulao L1 apresentou
maior atividade biolgica do que L2. Os resultados de MIC e CFM para L1 indicam
que a referida formulao mais fungisttica e fungicida do que L2 para os
microrganismos padres testados e C. neoformans LIF217. Esses resultados so
bastante satisfatrios e evidenciam o sucesso da NYS lipossomal frente ao frmaco
livre para a ao antifngica in vitro. Verifica-se tambm uma estabilidade das
formulaes lipossomais obtidas, pois mesmo aps um ms de preparo elas ainda
mostram atividade biolgica in vitro maior do que a NYS livre.

5.3.8.Concluses sobre as formulaes lipossomais selecionadas

Atravs dos resultados obtidos nas formulaes lipossomais selecionadas pode-
se concluir:
117
Selecionou-se a formulao: 70 % PC; 20 % Colesterol; 10 % DSPG e 1,3 % BHT e 7
% de NYS;

Caracterizaram-se as preparaes da formulao selecionada, hidratadas a 55 C (L1)
e 60 C (L2);

L2 apresentou menor polidisperdidade de seu raio hidrodinmico, maior carga de
superfcie e maior eficincia de encapsulao. Assim, pode-se considerar que L2 um
sistema fsico-quimicamente melhor, que L1, isto , mais estvel;

O teor de lipdios foi sutilmente maior para L1 do que para L2;

Pelos resultados do grau de anisotropia de fluorescncia, confirmou-se a
encapsulao do frmaco em lipossomas. Todavia, observamos que o frmaco est
mais imobilizado em L1, provavelmente devido menor teor de frmaco naquela
formulao.

Os resultados de supresso de fluorescncia para L1 e L2 demonstram que o frmaco
provavelmente encontra-se ligado superfcie do lipossoma (interface lipdio/cabeas
polares (susceptvel a KI)). Ainda o frmaco encontra-se inserido na bicamada, pois a
fluorescncia emitida por NYS tambm foi suprimida pela acrilamida;

A formulao L1 mostrou, aps sonicao, atividade biolgica in vitro maior que L2,
talvez pela possvel degrao do frmaco a 60 C (L2).
118

_______________________________________________________________Concluses Gerais
119

6.CONCLUSES GERAIS
120

121
Caracterizamos fsico-quimicamente o frmaco NYS, verificando que nas
amostras utilizadas prevalece o cristal de NYS do tipo A. Anlises de DSC indicaram
que as amostras so caracterizadas por uma mistura de compostos, NYS A1, A2 e A3.
Esse fato j era esperado, devido s caractersticas prprias do composto, visto que ele
produzido por fermentao. O antibitico mostrou-se sensvel luz, de modo que sua
manipulao foi feita com luz ambiente. O frmaco tambm termosensvel, quando
em soluo.

No desenvolvimento das formulaes lipossomais, empregaram-se os lipdios
Epikuron 200 SH (PCH), colesterol e DSPG, solues tampes hidratantes (HEPES
0,01 mol.L
-1
, pH 7,4 e Succinato 0,02 mol.L
-1
,pH 5,6), temperaturas de hidratao 55,
60 e 65 C; diferentes relaes frmaco/lipdiode 7 e 10 % e modos de hidratao AU
(nica adio de soluo hidratante) e AE (adio em etapas de soluo hidratante).
Depois de vrias combinaes desses parmetros, observou-se que a melhor
formulao, ou seja, na qual foi obtida a maior recuperao de frmaco, era composta
de 70 % de PC, 20 % de colesterol, 10 % de DSPG e 1 mmol.L
-1
de NYS. A formulao
selecionada passou por tratamentos fsicos (sonicao e centrifugao), o que permitiu
diminuio do tamanho das vesculas e separao entre o frmaco livre e encapsulado.

Na caracterizao fsico-qumica da formulao selecionada, foram testadas
duas preparaes (hidratada a 55 C (L1) e 60 C (L2)). Os resultados obtidos
indicaram que as preparaes continham vesculas com pequenos dimetros (~ 60 nm)
e carga negativa na superfcie (-35 (L1) e 40 mV (L2)). Medidas do grau de anisotropia
de fluorescncia sugerem que o frmaco se encontra agregado com restries dos
movimentos rotacionais causadas por sua encapsulao na bicamada lipdica. Anlises
da eficincia de encapsulao mostraram um teor de 28 % para L1 e 37 % para L2.

A avaliao da atividade antifngica in vitro das formulaes lipossomais indicou
maiores atividades antifngicas para as formulaes lipossomais do que para o frmaco
livre. Esses resultados apontam o grande potencial da NYS encapsulada em
lipossomas no tratamento de doenas infecciosas, como micoses sistmicas.
122

__________________________________________________Sugestes para Trabalhos Futuros
123

7.SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS

124

125
Adio de crioprotetores as formulaes, tais como trealose ou sacarose e avaliao
do comportamento fsico e qumico das mesmas;
Liofilizao, reconstituio e caracterizao as formulaes lipossomais
Avaliao da atividade biolgica in vitro das formulaes lipossomais reconstitudas
Estudo da estabilidade de prateleira das formulaes lipossomais reconstitudas.

126

_________________________________________________________Referncias Bibliogrficas
127

8.REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
128

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS

com doxorrubicina e DAUNOSOME

com Anfotericina B), j comercializadas em vrias partes do

) foi preparada pela Aronex

AMPHOCIL) para o tratamento de leishmania visceral

). O meio, a concentrao e composio de lipdios

) tm a seguinte composio (% molar) e meio de reconstituio:

(DMPC 70,5 % e DMPG 29,4 %, antioxidante no citado, salina) e o

(Epikuron 53,6 %; Colesterol 26,3 % e DSPG 20,4 %; -tocoferol 1,3 %

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