บทปฏิบัติการที่ 3

เทคนิ คทางชีวเคมี
1. การทำาให้เซลล์แตก
(Cell lysis)
2. การทำาไดอะไลซิส
(Dialysis)
3. โครมาโทกราฟี
(Chromatography)
4. อิเล็กโทรโฟรีซิส (Electrophoresis)
การทำาให้เซลล์แตก (Cell lysis)
 ส่วนของเซลล์ท่ีตอ ้ งทำาให้แตก
เยื่อห้ม
้ เซลล์
 การทำาให้เซลล์แตก มี 3 วิธี

1. ทางกายภาพ (Mechanical
Homogenization)
2. ทางเคมี (Chemical)
3. ทางชีวภาพ (Biological)
 1. ทางกายภาพ (Mechanical)

1.1 Mechanical
Homogenization
 Mortar and Pestle
 Pestle
Homogenizer
 Glass Bead
Homogenizer
ElectricalDisintegration
1.2 Thermal
Homogenizer
Freezing and Thawing
1.3High
SonicPressure Extrusing
Disintegration
 1.1 Mechanical Homogenization

 Mortar and
Pestle
 Pestle
Homogenizer
 Electrical Homogenizer Sonic Homogenizer
 2. ทางเคมี (Chemical)

- ใช้สารเคมี เช่น Butanol, Saponin,

Digitonin
3. ทางชีวภาพ (Biological)
- ใช้เอนไซม์จากแบคทีเรีย พืช หรือสัตว์ เช่น
Cellulase, Collagenase
เทคนิ ค Cell lysis นั้ นอาจใช้วิธีใดวิธีหนึ่ ง หรือ
หลายวิธีร่วมกัน แต่ข้ ึนอย่่กับ 
วัตถ้ประสงค์ของการทดลอง
 ชนิ ดของเซลล์ท่ีต้องการศึกษา
. การทำาไดอะไลซิส (Dialysis)

การแยกสารขนาดเล็กและขนาดใหญ่ออกจากกัน โดยผ่าน
สารบางชนิ ดผ่านได้ (Permeable Membrane)

มใช้แยกสารละลายเกลือแร่ออกจากสารชีวโมเลก้ลขนาดให
คลีอิก โปรตีน และคาร์โบไฮเดรต

รทำา Salting – Out (การทำาให้โปรตีนตกตะกอนโดยใช้เกล

มเนี ยมซัลเฟต) แล้วนำาไปทำาไดอะไลซิสต่อ
ปั จจัยที่มผ
ี ลต่อการทำาไดอะไลซิส

1. ขนาดและร่ปร่าง
2. อ้ณหภ่มิ
3. เวลา
 โครมาโทกราฟี (Chromatography)

เป็ นวิธีการแยกสารโดยอาศัยค้ณสมบัติของสารเช่น การละ

าดโมเลก้ล ประจ้ และความจำาเพาะตัวทางชีวภาพ

ารนี้ มีประโยชน์ เช่น การแยกสาร (Separation) การทำาให้ส

ation) และพิส่จน์ชนิ ดของสาร (Identification)

 มีองค์ประกอบสำาคัญ 2 ส่วน คือ

ส่วนคงที่ (Stationary Phase)
 ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase)
โครมาโทกราฟี (Chromatography)

1. แบบไม่เป็ นคอลัมน์ 2. แบบคอลัมน์

(Non-column (Column
Chromatography) Chromatography)
1) Adsorption
1) Paper Chromatography
Chromatography
2) Ion-exchange
2) Thin-layer Chromatography
Chromatography
3) Gel Filtration
Chromatography
4) Affinity
Chromatography
มาโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ (Nom-column Chromatography)

โครมาโทกราฟี แบบกระดาษ (Paper Chromatography)

ส่วนคงที่ (Stationary Phase)  นำ้าที่จับ

แน่นกับเส้นใยเซลล่โลส
ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase)  ตัวทำา
ละลาย
ตัวกลางคำ้าจ้น (Supporting medium) 
กระดาษ
มาโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ ---> โครมาโทกราฟี แบบกระดาษ

Stationary Phase

Separation

Mobile Phase

Mixtu Compon
re ent
Components Affinity to Stationary Phase Affinity to Mobile Phase

Blue ---------------- Insoluble in Mobile Phase

Black  

Red  

Yellow          
มาโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ ---> โครมาโทกราฟี แบบกระดาษ

PC chromatogram

The final
chromatogram can be
compared with other known
mixture chromatograms to
identify sample mixes.
Compounds can be
identified by calculating Rf
(Retention).
มาโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ ---> โครมาโทกราฟี แบบกระดาษ

 สารมีค่า Rf มาก แสดงว่าสารมี

ค้ณสมบัติ
- สารเคลื่อนที่ได้เร็วหรือมาก -
สารถ่กด่ดซับได้น้อย
- 
สารละลายได้
สารมีค่า Rfดี น้อย แสดงว่าสารมี
สมบัติ
- สารเคลื่อนได้ช้าหรือน้อย - สารถ่ก
ด่ดซับได้มาก
ครมาโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ ---> โครมาโทกราฟี แบบกระดาษ

ค้ณสมบัติของค่า Rf

1. ค่า Rf ไม่มห
ี น่วย
2. ค่า Rf หาได้จากการทดลองเท่านั้ น
3. ค่า Rf มีค่าไม่เกิน 1
4. ค่า Rf ขึ้นอย่่กับชนิ ดของสารและชนิ ด
ของตัวทำาละลาย
5. ค่า Rf เป็ นค่าเฉพาะค่าคงที่ของแต่ละ
 มาโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ ---> โครมาโทกราฟี แบบกระดาษ

รวิเคราะห์สารเป็ นสารชนิ ดเดียวกันหรือไม่ มีหลักการดังนี้

1. มีสีเดียวกัน
2. มีค่า Rf เท่ากัน
3. มีระบบการทดลองเดียวกัน
าโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ ---> โครมาโทกราฟี แบบกระดาษ

ประโยชน์ของวิธโี ครมาโทกราฟี แบบกระดาษ

1. ใช้แยกสารที่มีปริมาณน้อย ๆ ได้ ซึ่งวิธีอ่ ืน
แยกไม่ได้
2. ใช้แยกได้ท้ ังสารมีสีและไม่มีสี
สารไม่มีสี ทำาให้ภายหลังการแยกโดย
- อบด้วยไอของไอโอดีน
- ฉายด้วยรังสี UV
- พ่นสารบางชนิ ดไปทำาปฏิกริ ย
ิ า
และเกิดสีข้ ึน
าโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ ---> โครมาโทกราฟี แบบกระดาษ

ข้อจำากัดหรือข้อเสียของวิธีโครมาโทกราฟี แบบกระดาษ

องการจะแยกออกจากกันมีความสามารถในการละลายในต
ละถ่กด่ดซับด้วยตัวด่ดซับเท่ากันไม่สามารถแยกออกจากกัน
จะเคลื่อนที่ไปพร้อมกันด้วยระยะทางเท่ากัน
วิธีแก้ไข
1. เปลี่ยนชนิ ดของตัวทำาละลาย
2. เพิ่มระยะทางของตัวด่ดซับให้ยาวขึ้น
มาโทกราฟี แบบไม่เป็ นคอลัมน์ (Nom-column Chromatography)

รมาโทกราฟี แบบเยื่อบาง (Thin-layer Chromatography)

ส่วนคงที่ (Stationary Phase)  นำ้า

ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase)  ตัวทำา
ละลาย
ตัวกลางคำ้าจ้น(Supporting medium) 
Silica gel (SiO2),
Alumina (Al2O3) ,Calcium sulfate(CaSO4)
โครมาโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์ (Column Chromatography)

- ตัวกลางคำ้าจ้นและส่วนคงที่ บรรจ้อย่่ใน Column

- สารละลาย (Eluent) เป็ น Mobile Phase ในการชะสาร
ตัวอย่าง แยกเก็บสารเป็ นส่วน ๆ
1) Adsorption Chromatography

 แยกสารตามความสามารถในการด่ดซับของสาร
ที่มต
ี ่อตัวกลางคำ้าจ้น
ส่วนคงที่ (Stationary Phase)  อะล่มินา, ซิลิกาเจล,
แคลเซียมไฮดรอกไซด์
ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase)  เฮกซีน เบนซีน อีเทอร์
คลอโรฟอร์ม
โครมาโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์

2) Ion-exchange Chromatography

 แยกสารตามชนิ ดของ
ประจ้
ส่วนคงที่ (Stationary Phase)  เรซิน
(Resin) ที่มป
ี ระจ้
เรียกว่า ตัวแลกเปลี่ยนประจ้ (Ion -
exchanger)
ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase)  ตัวทำา
ละลาย หรือบัฟเฟอร์
าโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์ ---> Ion-exchange Chromatography

ตัวแลกเปลี่ยนประจ้ (Ion-exchanger)
ราฟี แบบเป็ นคอลัมน์ ---> Ion-exchange Chromatography ---> ตัวแลกเปลี่ยนประจ้
ราฟี แบบเป็ นคอลัมน์ ---> Ion-exchange Chromatography ---> ตัวแลกเปลี่ยนประจ้
โครมาโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์

3) Gel filtration Chromatography

 แยกสารตามขนาด
โมเลก้ล
ส่วนคงที่ (Stationary Phase)  เจล
สังเคราะห์ (เป็ นสารพวก
Polysaccharide) เช่น Sephadex, Sepharose,
Bio-gel
ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase)  ตัวทำา
ละลาย หรือบัฟเฟอร์
โครมาโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์

4) Affinity Chromatography

 แยกสารโดยอาศัยการจับกันอย่างจำาเพาะเจาะจง
กันของสาร
เช่น แอนติเจน – แอนติบอดี, เอนไซม์- ซับส
ส่วนคงที่ (Stationary เตรต
Phase)  ติดโมเลก้ล
ชนิ ดใดชนิ ดหนึ่ งเข้า กับตัวกลางคำ้าจ้น
ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase)  ตัวทำา
ละลายหรือบัฟเฟอร์
โครมาโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์

5) Gas-Liquid Chromatography

แยกสารที่มส ี มบัติระเหยได้ โดยอาศัยความแตก

ต่างของจ้ดเดือดของสาร
ส่วนคงที่ (Stationary Phase)  เป็ นของเหลว
ที่ไม่ระเหยหรือเป็ น ของเหลวที่มจ ี ้ดเดือดส่งมาก
ฉาบอย่่บนตัวกลางคำ้าจ้นซึ่งเป็ นของแข็งที่เฉื่อย
ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase)  แก๊สเฉื่อย
เช่น ฮีเลียม ไนโตรเจน หรืออาร์กอน
าโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์ ---> Gas-Liquid Chromatography

Chromatogram

Suggest identities of some of the unlabelled peaks.

โครมาโทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์

6) High Performance Liquid Chromatography

 แยกสารได้ท้กชนิ ด ทั้งที่ละลายได้ในนำ้าและใน
ตัวทำาละลายอินทรีย์
ส่วนคงที่ (Stationary Phase) 
คอลัมน์ขนาดเล็กแต่ยาว บรรจ้ด้วย
ตัวกลางคำ้าจ้นที่ทำาด้วยพลาสติกหรือแก้ว
ส่วนเคลื่อนที่ (Mobile Phase)  ตัวทำา
ละลาย
โทกราฟี แบบเป็ นคอลัมน์ ---> High Performance Liquid Chromatography
อิเล็กโตรโฟรีซิส (Electrophoresis)

 เป็ นเทคนิ คที่ใช้ในการแยกและวิเคราะห์

สารชีวโมเลก้ลที่มีประจ้ด้วยกระแสไฟฟ้ า และ
สามารถใช้ในการศึกษาค้ณสมบัติ และพิส่จน์
ความบริส้ทธิข์ องสารได้
Electrophoresis

หลักการ

 เป็ นการแยกและวิเคราะห์สารชีวโมเลก้ลที่มีประจ้
ภายใต้สนามไฟฟ้ า
 สารที่มป
ี ระจ้บวกจะเคลื่อนที่เข้าหาขั้วลบ ประจ้
ลบเคลื่อนที่เข้าหาขั้วบวก
 โดยความเร็วในการเคลื่อนที่ของสาร
ขึ้นอย่่กับ ค่าความแรงของสนามไฟฟ้ าและ
ประจ้ส้ทธิของโมเลก้ล
หลักการทำางานของ
Electrophoresis
จ้ดเริม
่ ต้น

+ - -
-2
Catio +3 Anio
n n
ประจ้=
0
 Electrophoresis

Factors affected the mobility of molecules

1. Molecular factors
• Charge
• Size
• Shape

2. Environment factors
• Electric field strength
• Supporting media (pore: sieving effect)
• Running buffer
Electrophoresis

อ้ปกรณ์พื้นฐานของเทคนิ คอิเล็กโทรโฟรีซิส

1. เครื่องจ่ายกระแสไฟฟ้ า (Power
supply)
2. ตัวกลางคำ้าจ้น (Supporting
medium)
3. สารละลายบัฟเฟอร์ (Buffer
solution)
4. ภาชนะอิเล็กโทรโฟรีซส
ิ
Electrophoresis

ชนิ ดของอิเล็กโทรโฟรีซิส

1. อิเล็กโทรโฟรีซส
ิ แบบกระดาษ (Paper Electrophoresis)
2. อิเล็กโทรโฟรีซส
ิ แบบเซลล่โลสอะซิเตต (Cellulose
Electrophoresis)
3. อิเล็กโทรโฟรีซิสแบบแป้ งเจล (Starch Gel
Electrophoresis)
4. อิเล็กโทรโฟรีซส
ิ แบบพอลิอะคริลไมด์เจล
(Polyacrylmide Gel Electrophoresis)
5. อิเล็กโทรโฟรีซิสแบบเอสดีเอส–พอลิอะคริลาไมด์เจล
(SDS-Polyacrylmide Gel Electrophoresis)
 Electrophoresis

อิเล็กโทรโฟรีซิสแบบกระดาษ (Paper Electrophoresis)

ตัวกลางคำ้าจ้นคือ  กระดาษกรอง
นิ ยมใช้แยกสาร  โมเลก้ลขนาดเล็ก
เช่น กรดอะมิโน เพปไทด์
เส้นสั้นๆ และนิ วคลีโอไทด์
 Electrophoresis

กโทรโฟรีซิสแบบเซลล่โลสอะซิเตต (Cellulose Electropho

ตัวกลางคำ้าจ้นคือ  แผ่นเซลล่โลสอะ
ซิเตต
นิ ยมใช้แยกสาร  โปรตีนใน
พลาสมา และซีรม
ั
 Electrophoresis

อิเล็กโทรโฟรีซิสแบบแป้ งเจล (Starch Gel Electrophoresi

ตัวกลางคำ้าจ้นคือ  แป้ งมันสำาปะหลังที่

ย่อยด้วยกรด แล้วนำามาต้มกับสารละลาย
บัฟเฟอร์ ทิ้งให้เย็น กลายเป็ นเจล
นิ ยมใช้แยกสาร  โปรตีนเพื่อนำาไปศึกษา
ต่อเช่น เอนไซม์
 Electrophoresis

ทรโฟรีซส
ิ แบบพอลิอะคริลไมด์เจล (Polyacrylmide Gel Electroph

ตัวกลางคำ้าจ้นคือ  พอลิเมอร์ของอะคริลาไมด์
และ บิสอะคริลาไมด์
นิ ยมใช้แยกสาร  ชีวโมเลก้ลขนาดใหญ่ เช่น
โปรตีน กรดนิ วคลีอิก
ectrophoresis ---> Polyacrylmide Gel Electrophoresis

Polyacrylamide Gels
 Acrylamide polymer; very stable gel
 can be made at a wide variety of
concentrations
 gradient of concentrations: large variety of
pore sizes (powerful sieving effect)
Electrophoresis

5. อิเล็กโทรโฟรีซิสแบบเอสดีเอส–พอลิอะคริลาไมด์เจล
(SDS-Polyacrylmide Gel Electrophoresis)

ตัวกลางคำ้าจ้นคือ  พอลิอะคริลาไมด์
นิ ยมใช้แยกสาร  แยกโปรตีนตามความแตก
ต่างของขนาด โมเลก้ลหรือนำ้าหนั กโมเลก้ล
 Electrophoresis

กโทรโฟรีซิสแบบอะกาโรสเจล (Agarose Gel Electrophor

ตัวกลางคำ้าจ้นคือ  อะกาโรสที่ต้มกับบัฟเฟอร์
ทิ้งให้เย็น ได้เป็ นเจล
นิ ยมใช้แยกสาร  แยกโปรตีนขนาดใหญ่ และ
กรดนิ วคลีอิก
ectrophoresis ---> Agarose Gel Electrophoresis

Agarose Gel

 purified large MW
polysaccharide (from
agar)

 very open (large

pore) gel

 used frequently for