J3[OLOGfA VTRUSURTLOR. OJAGNOSrrCUL OE LABOJ:tA TOR AL VIROZEt·OR.

('·Particularitatile virusurilor

e Reprezinta strueturi acelulare eu potential infectios

{Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind paraziti obligati intraeelulari ClNu crese pe medii artifieiale, numai pe eelule vii

G1Genomul viral este eonstituit dintr-un singur tip de AN (ADN sau ARN) r.<Nu crese si nu se divid, se reprodue In eelule vii

",Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm)

CiRezistenta naturala la antibiotiee

CLASIFICAREA VIRUSUR1LOR ·"'Dupa tipul AN (eu genom ARN/ADN)

eDupa dimensiuni (miei - 20-50 nm, medii - 50-150 nm, mari - peste 150 nm) -Dupa tipul de simetrie a capsidei (helicoidala, cubica, mixta)

eOupa compozitia chimica (simple, complexe)

t; Dupa gazda (om, animal, insecta, bacterie)

.·Dupa sensibilitatea in mediul extern, substante chimice, etc

ClVirusuri ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae

f'Virusuri AR1"{+: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Retroviridae

... Virusuri ARN- : Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Fi loviridae CVirusuri ARNd.c. : Reoviridae

Virion - unitate structural a infectioasa a virusului Viroid - ARNm.c., circular, asoeiat eu boli la plante

Prien - proteina terrnostabila infectioasa, cauzeaza la om boala Kuru, Creutzfeldt-Jacob, sindrornul GerstmannStraussler, scrapie Ja oi

COMPOZITIA CHIMICA $1 STRUCTURA VIRIONULUI

eVirusurile simple - acid nucleic (AN) si invelis proteie - capsida (ansamblu nurnit nucleocapsida) eVimsurile complexe - nucleocapsida si un invelis extern, lipoglieoproteic (supercapsida, peplos) Acidul Nucleic - ADN sau ARN, mono- sau bieatenar, linear, circular sau fragmentat.

ARN monocatenar : ARN+ (catena ell sens, functie de ARt~m) sau ARN- (catena tara §eBB)

Functia AN - asigurarea replicarii si expresia genomului pentru sinteza proteinelor virale Capsida - formate din unitati proteice, capsomere, aranjate simetrie .

• Simetrie helicoidala - capsomerele se fixeaza pe catena de AN, forma de bastonas

.Simetrie cubica (icosaedrica) - eapsomerele se aranjeaza in jurul AN, formand lin ieosaedru (poiiedru regulat ell 20 fete triunghiulare si 12 varfuri), eikos=Ztl

.Simetrie mixta (baeteriofagii, poxvirusuriIe)

Functia capsidei- protectia AN, rol antigenic, adeziune

Supercapsida - structura glucido-lipido-proteica, derivata din membrana eelulei gazda. Lipidele provin din

membrana celulara, iar gIieoproteinele sunt de origine virala (ex.: hemaglutinina, neuraminidaza)

Functie - protectie, antigene de suprafata, adeziune

Unele virusuri contin enzime - polimeraze, transcriptaze, etc. Actiunea factorilor fizici, chimici

Virusurile sunt foarte sensibile la caldura, desicare, raze UV. Detergentii ~i solventii inactiveaza virusurile eu supercapsida,

Pot fi eonservate prin liofilizare sau Ia -80°C

REPRODUCEREA VIRUSURILOR

I ADSORBTIA virusului ia celula-gazda prin interrnediul receptorilor specifici (tropism) II PENETRAREA virusului in celula

.;Pinocitoza (viropexis)

eFuziunea membranelor

eTranslocare

ernjectareaAN in citoplasma (bacteriofagi)

III DECAPSIDAREA ( cu enzime celulare). Din acest moment urmeaza faza de eclipsa, IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor si replicarea AN)

Are loc in citoplasma (virusuri eli ARN) sau nucleul celulei (virusuri eu l'.D"t'--J) Biosinteza virusurilor ADN

ADNdc '---':;> transcrierea ARNm '----;:,> replicarea, translatia (precoce, tardive) '--> sinteza proteica Biosinteza virusuriIor ARN

ARN+ .--> replicare, translatie ,_" 7 sinteza proteica

ARN--:;) transcriere '-,?ARNm ~-:> replicare, translatie , sinteza proteica Retrovirusuri (ARN+)~·> transcriere v-> ADN- '-?"ADNdc --;-7transcriere .-:;;;»ARNm-.>-replicare, translatie, sinte za pr. (sau integrare in cromosom)

V. MORFOGENEZA (asamblarea) ~i maturizarea virionilor

Proteinele capsidale participa la formarea nucleocapsidei (in nucleu sau citoplasma), glicoproteinele surit inserate in Mep, substituind proteinele celulare. In aceasta faza apar incluziunile virale sau corpusculii elementari ,

VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, inmugurire, exocitoza). Nr lor poate atinge 100.000 per/celu 13.

Ciclul reproductiv viral are durata variabila - de la cateva ore pana la cateva zile (ex.: 8h - poliovirus, 72hcitornegalovirus).

Interferenta virala - fenomen in care, consecutiv infectiei unei celule cu 2 virusuri, multiplicarea unuia este inhibata (virus interferat / virus interferent)

RELA TIl VIRUS-CELULA GAZDA .Infectie virala productiva, citocida

Virusul este infectios iar celula perrnisiva (receptiva). La nivelul malo corespunde infectiilor acute, aparente sau inaparente (grips, rujeola ... )

.Infectii virale persistente

Celulele infectate supravietuiesc, cu producerea permanents sau intermitenta a virusului.

1. Infectii abortive (cu virioni defectivi) - infectia nu se exprima, are loc transformarea celulelorprin proteine virale. Ele devin tintil pentru efectorii imunitatii (macrofage, T-limfocite) in cursul unor infectii cronice (pESS

, post-rujeolica)

2. Infectiiintegrate (virusuri ADN sau copii ADN ale Retrovirusurilor). Consecinte: -Transformarea maligna a celulei gazda

-Infectii lente - rnanifestarea infectiei dupa 0 perioada de incubatie indelungata eu expresia integrala a genomului

viral (ex.: HIV-SIDA)

-Infectii latente - reactivari ocazionale, repetate ale infectiei cu exprimarea integral a a informatiei genetice virale (ex.: infectia herpetica)

-Infectii cronice - perioade de remisie ~i acutizare, virusul este prezent permanent, chiar in absenta simptomelor (ex.: hepatita virala B)

CULTIVAREA VIRUSURILOR

Virusurile sunt cultivate pentru:

-Stabilirea diagnosticului etiologic

-Testarea infectiozitatii virusurilor

-Testarea preparatelor antivirale

-Producerea vaccinurilor

2

SlSTEME DE CULTIVARE GiCulturi de celule

'Ou embrionat de gaina f'Animale de laborator

Animalele de laborator se utilizeaza limitat (receptivitate selectiva, preexistenta infectiilor, cost avanssat). Se recurge numai cand nu exists aIte posibilitati (VHB, HI V, Coxsackie, etc). Constituie modele de cerceteue sau de control al vaccinurilor. Animalele utilizate curent - soriceii albi nou-nascuti, dar pot fi utilizati sobolani , cobai, maimute, etc.

Regulile de lucru eu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt identice eu cele din in.fectiile bacteriene,

Oul embrionar de gaina (5-13 zile) reprezinta un mediu de celule nediferentiate, cu multiplicare activa, steril ~i lipsit de mijloace de aparare antiinfectioasa, Se utilizeaza in prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal)

- Initial se verifies viabilitatea embrionului la ovoscop in camera obscura.

-Prelevatul se inoculeaza steril cu seringa in cavitatea amniotica sau alantoideana, sau pe membrana

chorioalantoideana (utilizand metoda deschisa sau inchisa) .

-Orificiul se parafineaza si se incubeaza la 35-37°C timp de 48-72 ore

Culturile de celule (1949 - Enders, Weller, Robbins).

Celulele provenite din tesuturi adulte sau embrionare, normale sau tumorale, plasate intr-un mediu adecvat (nutrienti, pH, t) raman viabile si se rnultiplica, Pentru cultivarea virusurilor se utilizeaza culturile in monostrat celular.

TipuriIe de culturi de ceiule (CC):

.Culturi primare (primar tripsinizate). Sunt obtinute din tesuturi adulte sau embrionare de origine animala sau urnana. Suporta 4-6 pasaje (subcultivari)

.Culturi diploide. Obtinute din [esut embrionar (MRS 5, fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generatii .Linii continui de celule. Obtinute din tesut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat.

HeLa - carcinom de col uterin

KB - tumoare a rinofaringelui

Hep-2 - tumoare canceroasa a laringelui

Obtinera culturilor de celule primar tripsinizate: -Prelevarea tesutului (ex.: rinichi de maimuta)

-Fragmentarea §i spalarea cu sol fiziologica

-Dezagregarea tisulara eu enzime proteolitice (tripsina)

-Separarea celulelor prin centrifugate

-Dozarea suspensiei 105 - 106 celule/ml

-Introduccrca celulelor in mediu nutritiv ~i repartizarea in recipiente sterile

-Incubarea pana la formarea monostratului eelular (inhibitie de contact)

-Monostratul poate fi infectat cu virus sau serveste drept sursa de eelule pentru 0 noua cultivare (pasaj)

Mediile de cultura pentru culturi de eelule (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbumina, etc), con tin AA, Vit, factori de crestere, saruri minerale, rosu fenol pentru monitorizarea pH (vireaza in gal ben in mediu acid)

eMediiIe de crestere sunt imbogatite eu ser sangvin (uman, animal) - pentru eultivarea CC

e Mediile de Intretinere se utilizeaza pentru mentinerea monostratului in procesul reproducerii virale. Nu con tin ser.

CC reprezinta sistemul virus-gazda predilect in virologia clinics si cercetare.

3

Inocularea CC

-Se aleg tub uri cu monostrat bine format

-Se inlatura mediul de crestere, se spala cu sol. Hanks

-Se inoculeaza 0, I - 0,2 ml de prelevat

-Peste 30-60 min in tub uri se toarna cate

I ml mediu de intretinere

-Se introduc in termostat la temperatura adecvata 3 - 4 zile DIAGNOSTICUL DE LABORATOR

AL VIROZELOR

Indicatii:

-Boli cu mas uri terapeutice sau profilactice speciale (SIDA, hepatite, rubeola, etc)

-Elucidarea etiologiei virale a unor izbucniri epidemice (meningite, gastro-enterite, pneumonii, etc)

-Supravegherea epidemiologies

Prelevate: LCR, sange, exsudate, secretii nazale, rino-faringiene, mase fecale, urina, continutul veziculelor ~i ulceratiilor cutaneo-mucoase, bioptate, etc.

Eficacitatea diagnosticului este conditionata de:

.Alegerea corecta a prelevatelor, calitatea lor si transportarea in laborator CExaminarea precoce (Ia debutul bolii)

eTransportarea rapida a probelor sau utilizarea mediului de transport

.'Respectarea regulilor de autoprotectie si de protectie a anturajului la recoltarea, transportarea si exam inarea probelor

METODELE DE DIAGNOSTIC AL VIROZELOR METODE DlRECTE

-Examenul virusoscopic (evidentierea directa a virionului sau a componentelor lui in prelevate)

-Exarnenul virusologic (izolarea si identificarea virusului)

-Detectarea Ag virale in prelevat

-Identificarea genomului viral (hibridizarea AN, amplifiearea genica - PCR)

METODE INDlRECTE

- SerodiagIiosticul (cresterea de eel putin 4 ori a titrului Ac in dinamica) EXAMENUL VIRUSOSCOPIC

.Microscopia optica - depistarea in prelevat a incluziunilor virale specifiee (eorpuseulii Guarnieri In variola, Babes-Negri In rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau nucleare. Se prepara frotiuri sau frotiuri-amprente colorate Romanovschi-Giemsa sau cu fluorocrom

• Microscopia electro nidi

.Imunoelectronomicroscopia - mai sensibila, mai specifica, Se examineaza complexele imune virus - Ac .Imunofluorescenfa (directa si indirecta) - utilizata in diagnosticulrapid al virozelor

EXAMEl\TUL VIRUSOLOGIC Prelucrarea prealabila a prelevatelor: -Omogenizarea (dupa necesitate)

-lnlaturarea elementelor celulare, incIusiv bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare)

-Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea cresterii bacteriilor si fungilor contaminanti (penicilina - 500 UAlml,

streptomicina -

500 UAlmI, nistatina - 20 UAlmI)

ETAPELE DIAGNOSTICULUI VIRUSOLOGIC .Izolarea virusului

.Evidentierea (indiearea) reproducerii virale

4

.'Identificarea virusului

Izolarea virusului se realizeaza prin inocularea cu material de examinat a animalelor de laborator, embcionilor de gaina sau a culturilor de celule. Alegerea sistemului de cultivare se efectueaza in functie de particularitagile biologice ale agentului etiologic probabil ~i posibilitatile Iaboratorului.

Indicarea virusului

ein culturi de celule

• ECP - modificari degenerative si distrugere celulara, rezultat al rnultiplicarii virale (rotunj ire sau retra-ctie celulara, citoliza, aparitia vacuolelor sau granulelor In citoplasma, picnoza nucleului, fuziunea membran elor, etc). ECP poate fi studiat la microscopul optic pe celule necolorate sau colorate cu hernatoxilin-eozina, Giem sa, fluorocrom.

2 Incluziuni virale

Reprezinta acurnulari paracristaline de virioni sau de componente virale in aria de replicare si asamblare, a virusurilor (citoplasma, nucleu). ColoratiaGiemsa, hem-eozina, fluorocrom. Localizarea, forma si afinitatea tinctoriala (bazofile, acidofile) sunt particularitati diagnostice pentru unele viroze.

3. Hemadsorbtia (RHAd) - pentru virusuri cu hernaglutinina (HA)

Unele virusuri poseda in cornponenta capsidei, in special supercapsidei, glicoproteine care pot ad era la suprafata hematiilor - HA.

HAd este caracteristica virusurilor in pozitie intracelulara, In procesul asamblarii acestor virusuri, HA lor se afla deja inserate inMCP la nivelul viitorului mugure. Daca la aceasta etapa in recipientul cu monostrat celular se adauga suspensie de hematii si se mentine 15-20 min la t caracteristica fiecarui virus, la microscop pot fi urmarite hematiile fixate la suprafata celulelor infectate (RJIAd).

4. Hemaglutinarea (RHA)

Pentru virusurile cu HA acumulate in mediul de intretinere. in acest caz mediul de intretinere aglutineaza eritrocitele unor specii de mamifere sau pasari,

5. Proba culorii

- Metabolismul celular neafectat - virajul culorii mediului din rosu in galben (PH acid)

-Metabolisrnul celular inhibat - culoarea mediului nu se modifica

6 Interferenta

Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar determina fenornenul de interferenta, Pentru detectarea V.rubeolei se infecteaza CC cu virus citopatogen, Lipsa multiplicarii acestui virus confirms prezenta V.rubeolei .

• Indicarea vlrusului in oul embrionat de gaina

Quale se racesc 18 ore la +4 grade C pentru 0 vazoconstrictie maxima, apoi aseptic se taie coaja, se recolteaza lichidul alantoic sau amniotic, iar MeA ~i embrionul se introduc in cutii Petri sterile. Se observa:

.Moartea embrionului

.Aparitia modificarilor (hemoragii, pustule) pe MCA • Acumularea de HA in lichide

.Indicarea virusului pe animale de laborator

• Boala rnanifesta a animalului, deces

• Urmarirea virusului in organele-tinta: -Hernagl utinare

-Infectiozitatea omogenatelor

-Examene histopatologiee (leziuni inflamatorii, degenerare, incluzii virale specifice: corp. Babes-Negri in neuronii

infectati eu V.rabie, etc)

5

Identificarea virusu rilor

Determinarea genului, speciei si serotipului de virus prin stabilirea strueturii antigenice. Se efectueaza eu ajutorul serurilor imune specifice antivirale in diferite reactii serologice: -RN

-RIHA/RlHAd

-RFC

-RTF

-RIE (EUSA)

-ARI, etc

DETECTAREA AG VlRALE IN PRELEV ATE

Avantaje: simplitatea si rapiditatea examenului, nu necesita mentinerea infectiozitatii virusului Dezavantaje: sensibilitate direct proportionala eu eantitatea virusului dinprelevat

Se utilizeaza Ae polielonali de origine umaria (seruri imune) sau Ac monoclonali (de origine rnurina) Reactii: RHAI, RLA, RIF, RIE (ELISA), Western-blot, ARI, etc.

IDENTIFICAREA GENOMULUI VIRAL

(punerea in evidenta a AN virali din prelevate in cursul infectiilor virale acute sau eronice si monitorizarea tratamentului).

Pot fi examinate toate tesuturile si lichidele biologice, eHibridizarea acizilor nucleici tara amplificare eHibridizarea dupa amplificare (pCR si variantele ei)

DIAGNOSTICUL SEROLOGIC

Esenta: depistarea Ac sintetizati de gazda in raspuns la 0 infectie virala,

Dupa 0 primo-infectie are loc inducerea formarii Ac, iar dupa 0 reinfectie sau reactivare titrul Ac creste in dinamica.

. In serodiagnosticul virozelor este obligator de a examina 2 probe de ser de la bolnav (seruri-perechi): prima prelevata la debutul bolii, a doua prelevata peste ·15 zile.

Ac sunt depistati in ser, uneori in LCR, exsudate, lichid articular, etc.

Pentru depistarea Ac se utilizeaza Ag virale de referinta (suspensie virala inactivata, proteine virale native sau recombirtante, oligopeptide sintetiee).

Tehnici utilizate: RFe, RIHA, RHAI, RN, RIFI, ARI, AlE (ELISA), etc.

Semnlficatie diagnostica prezinta treeerea titrului de Ae de fa 0 fa pozitiv (seroconversie, primo-infectie) sau cresterea titrului Ac de eel putin 4 ori in cursul infectiei. Ambele seruri vor fi testate in aceeasi zi, prin tehniei identice ~i in acelasi laborator.

TERAPIA ANTIVlRALA. Dificultati:

-Toxicitate (imposibil de a distruge virusul tara afectarea celuleil)

-Aparitia mutantelor rezistente

-Activitate asupra virusului in faza de multiplicare

-Costul avansat al tratamentului

Prime le preparate antivirale -r- anticanceroase. Preparatele antivirale contemporane:

- Nu manifests activitate virucida, doar inhiba reproducerea viral a

-Sunt dirijate contra etapelor reproducerii virale

6