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UNIVERSIDAD DE COSTA RICA
1 Prctica #5 FOTOSNTESIS Y RESPIRACIN I. Objetivos * Diferenciar entre los tipos de respiracin celular. * Observar la produccin de dixido de carbono durante el proceso de la respiracin. * Identificar la clorofila y otros pigmentos presentes en las hojas por medio de las tcnicas de cromatografa. * Observar la formacin de almidn como una de las etapas finales de la fotosntesis. * Identificar la absorcin de CO 2 del medio como un indicador del proceso de fotosntesis en diferentes condiciones de luz. II. Introduccin Las clulas llevan a cabo diversos procesos para mantener su funcionamiento normal, muchos de los cuales requieren energa. La respiracin celular es una serie de reacciones mediante las cuales la clula degrada molculas orgnicas y produce energa. Todas las clulas vivas llevan a cabo respiracin celular para obtener la energa necesaria para sus funciones. Usualmente se usa glucosa como materia prima, la cual se metaboliza a dixido de carbono y agua, producindose energa que se almacena como ATP y se utiliza en la mayora de las reacciones metablicas
glucosa dixido de agua carbono La molcula de ATP est formada por adenina, ribosa y tres grupos fosfatos con enlaces ricos en energa. Cuando la molcula se hidroliza, el fosfato terminal se separa para formar ADP (difosfato de adenosina) y se libera energa. El ATP es la fuente de energa que se usa como combustible para llevar a cabo el metabolismo celular. La respiracin celular incluye una secuencia de etapas metablicas definidas como: gliclisis en el citoplasma y el ciclo de Krebs y las reacciones de transferencia de electrones (redox) en la mitocondria. Esta secuencia de pasos puede seguir una ruta diferente en presencia o ausencia de oxgeno. En ausencia de oxgeno, a partir del piruvato (producto de la gliclisis), ocurre fermentacin o respiracin anaerbica. Dependiendo del organismo, existen dos tipos de respiracin anaerbica: fermentacin alcohlica y fermentacin lctica. Por otra parte, el proceso de fotosntesis es uno de los fenmenos ms extraordinarios de - O2 + O2 Acetaldehido Lactato Etanol Acetil-CoA Piruvato Ciclo de Krebs mitocondria
Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 2 la naturaleza y tiene una gran influencia sobre la mayora de los seres vivos. Las algas y las plantas tienen la capacidad de sintetizar materia orgnica a partir de compuestos simples de la naturaleza (CO 2 y H 2 O). Tanto la vida vegetal como la animal dependen de la biomasa vegetal obtenida por la fotosntesis para subsistir, ya que no existe otra fuente de materia orgnica que pueda servir de alimento a la mayora de los seres vivos. Si las algas y las plantas desaparecieran, la gran mayora de animales perderan, tarde o temprano, todas sus fuentes de alimento. Las algas y las plantas realizan fotosntesis en presencia de luz solar; sta es captada por la clorofila presente en los cloroplastos. Las clorofilas a y b son pigmentos de color verde azulado. En la captacin y la transformacin de la energa de la luz intervienen otros pigmentos que conforman un complejo junto con la clorofila: las xantofilas, de color amarillo, y los carotenos, de color rojo-anaranjado. Las clorofilas estn formadas por carbono, hidrgeno, oxgeno, nitrgeno y magnesio, siendo los pigmentos ms importantes y que pueden ser separados con facilidad de los otros compuestos. El fenmeno de la fotosntesis, que desde el punto de vista bioqumico tiene numerosas etapas complejas, consiste en tomar agua a travs de las races y dixido de carbono por medio de los estomas, para elaborar a partir de estos dos compuestos las molculas orgnicas necesarias para la vida del vegetal. Para que el proceso pueda ocurrir, se requiere de energa que proviene del sol. Los compuestos orgnicos sintetizados son fundamentalmente carbohidratos. El primero que se forma de modo estable es la glucosa. Este azcar forma polmeros tales como el almidn, que se acumula como sustancia de reserva en los vegetales y es uno de los productos finales elaborados a partir de la fotosntesis. III. Procedimiento Durante la sesin de laboratorio se realizarn 5 experimentos que le permitirn conocer algunos aspectos de los procesos de fotosntesis y respiracin. Para lograr ste objetivo, los miembros pares o impares de cada uno de los subgrupos de laboratorio definidos en la primera sesin de laboratorio, realizarn y analizarn un experimento, de acuerdo a las indicaciones del instructor. Al finalizar los experimentos, todos los miembros de cada subgrupo se renen para hacer una discusin de los resultados obtenidos y completar el reporte. Cada subgrupo debe estar preparado para presentar y discutir sus resultados. Experimento 1.- Respiracin celular (a) Respiracin anaerbica Este mecanismo no es tan eficiente como la respiracin aerbica, ya que slo produce 2 molculas de ATP, pero permite obtener alguna energa a partir del piruvato que se produjo en la gluclisis. Hay dos tipos de respiracin celular anaerbica: fermentacin lctica, que ocurre en algunas bacterias y en el msculo esqueltico humano y fermentacin alcohlica (levaduras, ciertos hongos y algunas bacterias) que tiene como productos finales alcohol (etanol) y CO 2 . En este ejercicio se estudiar el proceso de fermentacin alcohlica que llevan a cabo las levaduras (Saccharomyces cerevisiae). Antes de iniciar, redacte una hiptesis que trate de explicar el efecto del tipo y concentracin de carbohidratos sobre la tasa de fermentacin en levadura. 1. Se le entregar un frasco que contiene un cultivo de levadura al 2% (preparado antes de iniciar el laboratorio). 2. Rotule 2 tubos de ensayo y prepare la mezcla siguiente (el instructor asignar un tubo a cada subgrupo):
Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 3 Tubo 1: 1 ml de glucosa(5%) y 1 ml de levadura Tubo 2: 1 ml fructosa (5%) y 1 ml de levadura Tubo 3: 1 ml sacarosa (5%) y 1 ml de levadura Tubo 4: 1 ml de maltosa (5%) y 1 ml de levadura Tubo 5: 1 ml de dH 2 O y 1 ml de levadura 3. Utilizando una pipeta Pasteur, llene una jeringa graduada de 1 ml con la solucin del tubo 1 hasta prcticamente desbordar. Sea cuidadoso de no formar burbujas a lo largo de la columna de solucin que contiene la jeringa y no tomar sedimentos del frasco de cultivo. 4. Selle el extremo libre de la jeringa con el tapn. Invierta la jeringa. Debe asegurarse de tener una columna de solucin sin burbujas y libre de sedimentos que obstruyan el flujo de solucin y gases en la jeringa. 5. Coloque la jeringa invertida dentro de un tubo de ensayo y anote el tiempo inicial en la columna correspondiente en el cuadro del reporte. 6. Luego de un perodo de 30 segundos, registre la produccin de CO 2 (volumen de burbujas que se acumula en la punta de cada jeringa) como la diferencia entre la lectura real cada 30 segundos y la lectura anterior. 7. Repita el procedimiento (pasos 3-5) con la solucin del tubo 2 u otras soluciones experimentales. Recuerde registrar el tiempo de inicio.
(b)Respiracin aerbica En este experimento se determinar en forma cuantitativa la tasa de respiracin aerbica en plantas y animales, midiendo el volumen de O 2 consumido. Para ello, se utiliza un respirmetro (ver figura) el cual consiste de un envase ancho de vidrio (tubo de ensayo, erlenmeyer, etc) el cual contiene semillas germinadas o un animal pequeo (invertebrado). Esta cmara cierra hermticamente con un tapn (cmara de respiracin), al que se le inserta una pipeta graduada y una entrada de aire (respirador) conectado a una jeringa. En el extremo libre de la pipeta se coloca un colorante lquido al inicio del experimento. En el tiempo, a medida que se reduce (consume) el volumen de O 2 en la cmara experimental, el colorante se desplazar a lo largo de la pipeta graduada, permitiendo medir la cantidad de ml de aire consumido en funcin del tiempo. Es importante mencionar que con ste diseo, es necesario eliminar los cambios en el volumen de CO 2 que se produce por la respiracin. Para ello se coloca en el respirmetro una cantidad de KOH ( desecante) el cual reacciona con el CO 2 para formar carbonato de potasio en forma slida CO 2 + 2KOH K 2 CO 3 + H 2 O Otro parmetro importante de controlar en stos experimentos jeringa frijoles germinados ( animal pequeo) pipeta graduada algodn seco KOH ( desecante) Respirmetro
Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 4 es la temperatura ya que produce expansin o contraccin de los gases. Para minimizar fluctuaciones en la temperatura del ambiente, es importante mantener el respirmetro sumergido en un bao a temperatura ambiente (ver figura) Recuerde verificar que no haya fuga de aire ni entrada de agua en el respirmetro una vez que coloque los organismos vivos en la cmara experimental. Finalmente, si realiza el experimento con un animal, es importante no generar ruido extremo durante la toma de datos ya que altera la calidad de sus resultados. 1. En la mesa de laboratorio encontrar el respirmetro parcialmente ensamblado 2. Verifique que las conexiones entre el tapn/jeringa y tapn/pipeta estn selladas hermticamente. 3. Verifique que la cmara experimental tiene en el fondo una capa de algodn absorbente impregnado con una solucin de KOH al 15% (se puede sustituir el algodn de KOH colocando algunos pellets de desecante). Esta capa de algodn debe estar cubierta con otra capa de algodn seco no absorbente, para evitar el contacto de la preparacin biolgica con el KOH o desecante 4. Dispense una cantidad de frijoles germinados hasta llenar la mitad del frasco. Cuente el nmero de semillas que coloc en la cmara experimental 5. Repita los pasos 2 y 3 con un segundo respirmetro, pero sta vez coloque, en lugar de semillas germinadas, cualquier animal pequeo disponible (anlidos, grillos, cucarachas) 6. Cierre cada una da las cmaras experimentales con el tapn respectivo. Asegrese que en ambos, la entrada de aire a travs de la jeringa (respiradero) queda abierta, permitiendo el flujo de aire hacia la cmara experimental. 7. Transfiera ambos respirmetros hacia el contenedor de agua. Verifique que ambos respirmetros no tienen fuga de aire o agua desde o hacia la cmara experimental. 8. Use un gotero para colocar en ambos respirmetros una gota de colorante en el extremo de la pipeta. Asegrese de apretar suficientemente el bulbo del gotero de forma que la burbuja del colorante se ubique en la regin de la pipeta donde pueda leer fcilmente. Esto es muy importante porque usted necesita medir el desplazamiento de la burbuja a lo largo de la pipeta en funcin del tiempo. 9. Antes de comenzar a tomar sus datos, cierre la entrada de aire con el mbolo de la jeringa. Anote el tiempo y la posicin de la burbuja. Anote la temperatura. 10. Mida la posicin de la burbuja cada 5 min por espacio de 30 min. Durante el tiempo de espera, formule una hiptesis que relaciones las diferencias en la tasa respiratoria entre animales y plantas. Prediga los posibles resultados. Al finalizar el experimento, remueva los respirmetros del bao, desrmelos cuidadosamente y lave los restos de colorante Experimento2.- El papel de la luz en la fotosntesis La importancia de la luz en el proceso de la fotosntesis puede observarse mediante los siguientes procesos: (1) absorcin de dixido de carbono de una planta de Elodea en condiciones de luz y sombra (4 masking tape termmetro pipetas Muestras experimentales
Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 5 grupos), y (2) diferencias en la formacin de almidn en las plantas de Coleus o Geranio mantenidas en condiciones de luz y sombra (4 grupos) (a)Absorcin del dixido de carbono La absorcin del dixido de carbono por las plantas en presencia de luz es una evidencia indirecta del proceso de fotosntesis. Uno de los mtodos ms simples para demostrarlo es estimar cambios en los niveles de CO 2 disuelto en una solucin que contiene una planta acutica bajo condiciones de iluminacin (Elodea). En el siguiente experimento se estudiar si Elodea lleva a cabo el proceso de fotosntesis en la oscuridad y en presencia de luz. El CO 2 en solucin acuosa se convierte en un cido (cido carbnico), cuya concentracin se medir por medio de una titulacin usando un indicador de pH (fenolftalena). Con este indicador se observar el punto de cambio en pH, donde se obtiene el equilibrio entre pH cido y bsico. Este cambio en pH sucede al aadirle una solucin bsica de NaOH a la muestra cida, y se observa por un cambio en color; de esta forma se podr calcular la produccin de CO2 para cada organismo Formule una hiptesis de trabajo en el reporte y haga una prediccin de los posibles resultados . Prepare el siguiente material: 1. Agregue en tres frascos de vidrio etiquetados, 25 ml de dH 2 O. En el frasco nmero 1 no agregue ninguna planta, mientras a los frascos nmero 2 y 3 agregue en cada uno una rama de Elodea. 2. Sople con una pajilla cada uno de los frascos. 3. Tape hermticamente los frascos, y al frasco 3 cbralo completamente con papel de aluminio. 4. Coloque los frascos1 y 2 cerca de una fuente de iluminacin y espere unos 30 minutos. 5. Al finalizar los 30 minutos, aada 5 gotas de fenolftalena (ste indicador es incoloro en soluciones cidas y se torna rosado en soluciones alcalinas) y mezcle bien. 6. Llene la bureta de titulacin con la solucin de 0.0025 mM de NaOH. 7. Mueva el frasco en crculos y aada gotas de la solucin de NaOH hasta obtener un color rosado persistente. 8. Anote en el cuadro de resultados la cantidad de NaOH que utiliz para obtener un cambio en el color del frasco, mediante la titulacin. 9. Calcule el consumo de CO2 mediante esta ecuacin:
[CO 2 ] = ml de NaOH (experimental) ml de NaOH (control) * [NaOH] Volumen de la Elodea (ml)
10. Repita el proceso con los dems frascos. Para determinar el volumen de Elodea, siga el siguiente procedimiento: a.- Coloque la Elodea en un vaso (beaker) pequeo con 50 ml de agua. b.- Haga una marca donde queda el menisco. c.- Remueva cuidadosamente el organismo con la precaucin de no derramar agua. d.- Con una pipeta llena aada agua hasta llegar a la marca. e.- La diferencia de lectura en la pipeta indicar el volumen del organismo.
Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 6 (b)Formacin de almidn en las plantas (Demostrativo) Una de las etapas finales de la fotosntesis es la formacin de almidn. Para demostrarlo se toman hojas nuevas de plantas de Coleus blumei con diferentes patrones de coloracin (o en su defecto hojas nuevas de Geranio que fueron cultivadas en condiciones de luz u oscuridad). 1. Haga un dibujo del patrn de coloracin. 2. Hierva cada hoja por unos minutos en agua, y observe cules pigmentos desaparecen y cules permanecen en la hoja, posteriormente, proceda a hervir por varios minutos en alcohol al 90% hasta que las hojas tomen un color totalmente blanquecino. Posteriormente, y con cuidado de no daar o doblar la superficie de la hoja, se transfiera a una caja de petri con una solucin yodada. 3. Observe en que rea de la hoja hubo reaccin. Haga un dibujo del patrn de coloracin en presencia de Lugol y responda las preguntas especificadas en el reporte. Experimento 3.- Separacin de los pigmentos vegetales (a) Cromatografa La cromatografa es una tcnica fsico-qumica que se usa para separar e identificar sustancias en sus constituyentes individuales. Consiste en una migracin de los componentes de la mezcla entre la fase fija, que es la fase estacionaria y otra fase mvil. La separacin es posible debido que algunas sustancias se retienen mejor en la fase estacionaria, mientras que otras se mueven mejor en la fase mvil. Se puede identificar varios tipos de cromatografa dependiendo del estado fsico de las fases que participan: (1) cromatografa de adsorcin en la cual, la fase estacionaria es slida y la fase mvil es lquida, y (2) cromatografa de reparto. En este caso, la fase lquida o gaseosa se desplaza sobre una fase lquida estacionaria colocada en la superficie de un soporte slido. La cromatografa de papel se fundamenta en una combinacin entre la cromatografa de adsorcin y cromatografa de reparto. La particin ocurre entre el agua que hidrata la celulosa y la fase mvil orgnica. Siga el siguiente procedimiento 1. Marque en una tira de papel a 1,5 cm de distancia del fondo del papel un punto, donde colocar una gota del extracto de pigmentos, el cual consiste en hojas frescas de espinacas (Spinacia oleracea, Chenopodiaceae) o gitite (Acnistus arborescens, Solanaceae), cuando esta gota est seca aada 2 gotas ms, esperando que cada una seque antes de poner la siguiente. 2. En el borde superior de la tira de papel marque una raya a 2 cm. del borde superior, sta lnea indica el frente, y ser el punto final al que debe llegar la solucin reveladora (cuando el frente llegue a este punto, saque inmediatamente el papel del tubo de ensayo). 3. Suspenda la tira de papel con un gancho dentro de un tubo de ensayo que contenga la solucin reveladora (acetona al 8% y ter de petrleo del 92%). Cuide que el papel no haga contacto con las paredes del tubo de ensayo. 4. Regule la superficie de contacto con el lquido sacando o introduciendo el gancho dentro del corcho. El papel debe tocar la superficie del lquido, pero no debe introducirse en el mismo. 5. Cuando el frente llegue al punto final (2 cm. del borde) saque el papel y pngalo a secar al aire, en un sitio oscuro. 6. Cada una de las bandas coloreadas del extracto de las plantas es un pigmento diferente. Para cada uno de los pigmentos que observa aplique la siguiente frmula:
Prohibida la reproduccin parcial o total de este manual UNIVERSIDAD DE COSTA RICA 7 Rf = distancia recorrida por el pigmento distancia recorrida por el disolvente El Rf es un indicador de la afinidad de cada pigmento por las fases slida y lquida. Se utiliza para caracterizar pigmentos; por lo tanto, el pigmento que tenga mayor Rf, ser el ms afn a la fase lquida y el de menor Rf ser el ms afn a la fase slida. Haga un esquema en el reporte de sus resultados.
Experimento 4.- Observacin de estomas La funcin de los estomas es la regulacin de la prdida de vapor de agua y el ingreso de dixido de carbono. Su estudio se ha centralizado principalmente en el estudio de la transpiracin y fotosntesis. Tambin, la funcin de los estomas es importante para mantener la homeostasis de la planta, la cual es indispensable en todo ser vivo para regular el medio interno cuando se relaciona con el ambiente. Observe al microscopio los estomas de una hoja de zebrina(Tradescantia zebrina) realizando las siguientes preparaciones: 1. Coloque un pedacito de envs de hoja sobre un portaobjetos. 2. Obsrvela al microscopio. 3. Observe las clulas guardas y pigmentos. De ser necesario, aada un poco de agua carbonatada para observar los estomas abiertos. 4. Observe corte transversal de una hoja. Haga un esquema de sus observaciones e identifique las distintas estructuras que la componen.
PARA LA PRXIMA PRCTICA: Cada subgrupo deber realizar el siguiente procedimiento: en un pequeo frasco de vidrio, ponga a enraizar un bulbo de cebolla por aproximadamente 4 das. Tenga cuidado de no sumergir la cebolla en el agua.