Tincin de Gram

J. Granado
La tincin de Gram







Su nombre al bacterilogo dans Christian
Gram, que desarroll la tcnica en 1884.




Sigui el mtodo de Paul Ehrlich,
utilizando una solucin de anilina y violeta
de genciana. Despus un tratamiento con
lugol (iodo en yoduro potsico acuoso) y
etanol observ que algunas bacterias
retenan el colorante (por ejemplo los
neumococos) mientras que otras no lo
hacan. Esto permiti dividir las bacterias
en Gram-positivas y en Gram-negativas,
clasificacin que es de gran utilidad hoy
da para elegir un tratamiento antibitico.
La tincin de Gram







Es un tipo de tincin diferencial empleado
en microbiologa para la visualizacin de
bacterias, sobre todo en muestras clnicas.




Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfologa celular bacteriana, como para
poder realizar una primera aproximacin a
la diferenciacin bacteriana,
considerndose Bacteria GRAM
POSITIVA a las bacterias que se
visualizan de color moradas y Bacteria
GRAM NEGATIVA a las que se visualizan
de color rosa o rojo o grosella.

La tincin de Gram



Materiales usados para la Tincin de
Gram





Microscopio ptico
Colorantes para Tincin de Gram
Mechero Bunsen
Asa de digralsky
Pizeta (Recipiente de plstico para las tinciones)
Muestra de Cultivos bacterianos
Aceite de inmersin (Es til ya que
disminuye la refraccin, y se consigue mayor
resolucin a dems de una mejor imagen.)
La tincin de Gram





Pasos para la fijacin de Frotis





1. Con la ayuda de un mechero, flamear un
asa de digralsky y esperar que enfre un
poco.


2. Tomar el asa (previamente flameada) y con
sta tomar un poco de muestra.


3. Una vez obtenida una pequea cantidad de
la muestra (con el asa), hacer que sta
tenga contacto con una lmina portaobjetos,
la cual servir para depositar la muestra
contenida en el asa.
La tincin de Gram





Pasos para la fijacin de Frotis




4. Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina
portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la
muestra en el portaobjetos mediante movimientos
giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal forma
que al terminar la extensin, tengamos como producto una
espiral en la parte media de la lmina.


5. Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de
un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que
el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama),
puesto que el calor excesivo puede cambiar la morfologa
celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aqul en
el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser colocado
sobre el dorso de la mano.
La tincin de Gram





Pasos para la Tincin de Gram




Tincin


Con violeta cristal, violeta de genciana,
azul de metileno o en todo caso tinta
china utilizando una cantidad suficiente
de dicho colorante sobre la muestra,
como para lograr cubrirla por completo.


Se deja actuar al colorante por 1 minuto.
Esta tincin de 1 minuto est dada para
trabajar a una temperatura ambiente de
25 C.

La tincin de Gram



Pasos para la Tincin de Gram





Enjuague


Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina
conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el
lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO
debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer
sobre la parte superior de la lmina que no contiene
muestra.


1. El chorro debe ser un chorro delgado, aproximadamente de
medio a un milmetro de espesor.
2. Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina
portaobjetos en posicin inclinada hacia abajo
3. La solucin de cristal violeta, se recomienda sea al 1% .

La tincin de Gram



Pasos para la Tincin de Gram




Mordiente










Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o
lugol durante 3 minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que
forme compuestos insolubles con colorantes y determine su fijacin a
las bacterias..

La tincin de Gram



Pasos para la Tincin de Gram




Decoloracin








Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora
con etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta
que ya no escurra ms lquido azul.


Para esto se utiliza el gotero del frasco del decolorante.
Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr
que ste salga totalmente transparente, es decir, (hasta que ya no escurra
ms lquido azul.)
La tincin de Gram





Pasos para la Tincin de Gram




Lavado y secado


Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque
la lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma
anteriormente descrita.
La tincin de Gram





Pasos para la Tincin de Gram



Tincin de contraste


Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir
nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un colorante
de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar
durante 1 minuto.


Esto es para teir las bacterias que fueron decoloradas
con el alcohol-acetona; en cierto modo esta tincin son
para las bacterias Gram negativo
La tincin de Gram





Pasos para la Tincin de Gram






Nuevo enjuague


Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con
agua, se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente
descrita.




De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva
observacin microscpica.
La tincin de Gram





Tincin de las Bacterias





Las bacterias se tien Gram positivas
(+), Gram negativas () o no se tien
debido a sus diferencias en la
composicin de su pared y arquitectura
celular.
La tincin de Gram





Tincin de las Bacterias




Las bacterias Gram Positivo tienen una
gruesa capa de pptidoglucano y gran
cantidad de cidos teicicos que no son
afectados por la decoloracin con alcohol
y/o acetona, reteniendo el colorante inicial
acomplejado con iodo y visualizndose en
distintos grados de tonos desde el violeta al
azul claro, dependiendo de si la naturaleza
de su pared celular est intacta o daada.
La tincin de Gram





Tincin de las Bacterias



Las bacterias Gram negativo tienen en su
pared celular una delgada capa de
peptidoglucano ligada a una membrana
externa por molculas de lipopolisacridos.
Esta membrana externa es daada por el
alcohol y/o acetona de la decoloracin,
permitiendo que el primer colorante
acomplejado con iodo escape y sea
reemplazado por el colorante de contraste.
La tincin de Gram (Resultados)





Resultado Gram


Positivo: de violeta fuerte a azul claro.


Negativo: rosa o rojo (en el caso de carbol-fucsina el rojo ser intenso).


Variable: microorganismos parcialmente positivos y negativos. Puede ser
debido a una mala extensin, fijacin o tincin, presencia de clulas viejas,
dao en la pared celular o por particularidades especiales de la pared
celular de ciertos microorganismos.


Neutro: no toman ningn color, siendo generalmente el fondo alrededor
de ellos de un ligero Gram (-).


Otras caractersticas: a examinar en el Gram son si la tincin de los
microorganismos es homognea, bipolar, en cuentas o gotas, punteada,
en barras o irregular.
La tincin de Gram (Resultados)





Su forma


Totales: cocos, cocoides, cocobacilares, bacilos, filamentosos (ramificados
o no) y levaduriformes.


Extremos: redondeados, afilados, romos, en forma de palo de tambor o
inflado (por vacuolas, esporas, acmulos de cualquier naturaleza) y
cncavos.


Lados: paralelos, ovoides, cncavos e irregulares.


Eje mayor: recto, curvado o en espiral.


Pleomorfismos: variacin en la forma de un mismo conjunto de
microorganismos. Ocurre en algunas espcies de difteromorfos, Bacteroides
spp., filamentosos ramificados (Actinomyces spp, ), por tratamientos
antibiticos
La tincin de Gram (Resultados)





Tamaos:


Teniendo en cuenta que el tamao medio de un hemate es de 7 mm y el de
los grnulos citoplasmticos de los leucocitos polimorfonucleares son de
0,2-0,3 mm:






Totales: minsculo (< 0,3 mm), pequeo (0,3-0,5 mm), medio y grande.


Longitud: corto (0,5-1 mm), medio, largo y filamentoso (10-30 mm).


Anchura: delgado, medio y grueso.


Pleomrficos: variacin en el tamao de un mismo conjunto de bacterias.
La tincin de Gram (Resultados)






Caractersticas agrupacionales:


Microorganismos aislados, en pares, en cadenas, ttradas, en grupo o
arracimados, en empalizada, en letras chinas, empaquetados, en formas
angulares tipo V o L


Gracias


"Muchas veces, cuando creemos estar realizando una experiencia sobre los dems, la estamos verificando
sobre nosotros mismos.
Oscar Wilde