LAPORAN PRAKTIKUM ANALISA INSTRUMENT

SPEKTROFOTOMETER
ULTRAVIOLET-VISIBLE




Disusun oleh :
kelompok 4 kelas A:










PROGRAM STUDI FARMASI
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH
JAKARTA
2013
Yeyet Durotul Yatimah 1110102000013
Myra Kharisma 1110102000027
Anas 1110102000035
Yanti Puspitaningrum 1110102000043
RM. Rendy H 1110102000045
Jaga Paramudita 1110102000063
Melia Puspitasari 1110102000065
Raden Atras S 1110102000073
Sri Wahyuni 1110102000077



I. Tujuan Praktikum
1. Memahami prinsip kerja alat spektrofotometer ultraviolet-visible
2. Mencari panjang gelombang maksimum dan optimum suatu senyawa obat
(paracetamol & kofein)
3. Membuat kurva kalibrasi suatu senyawa parameter validasi (kurva kalibrasi,
akurasi, presisi, LOD, LOQ)
4. Membuat parameter validasi (akurasi, presisi, uji perolehan kembali, LOD, LOQ)
5. Penetapan kadar dalam sediaan (paracetamol generic 500 mg)

II. Dasar Teori
Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari
spectrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan
panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang di
transmisikan atau yang di absorpsi. Spektrofotometri juga merupakan suatu metode
analisis yang berdasarkan pada pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur
larutan berwarna pada panjang gelombang yang spesifik dengan menggunakan
monokromator prisma atau kisi difraksi dan detector vacuum phototube atau tabung foton
hampa. Alat yang digunakan adalah spektrofotometer, yaitu sutu alat yang digunakan
untuk menentukan suatu senyawa baik secara kuantitatif maupun kualitatif dengan
mengukur transmitan ataupun absorban dari suatu cuplikan sebagai fungsi dari
konsentrasi.
Secara umum spektrofotometri dibedakan menjadi empat macam, yaitu :
a) Spektrofotometer ultraviolet
b) Spektrofotometer sinar tampak
c) Spektrofotometer infra merah
d) Spektrofotometer serapan atom

Spektrum elektromagnetik terdiri dari urutan gelombang dengan sifat-sifat yang
berbeda. Kawasan gelombang penting di dalam penelitian biokimia adalah ultra
lembayung (UV, 180-350 nm) dan tampak (VIS, 350-800 nm). Cahaya di dalam kawasan
ini mempunyai energi yang cukup untuk mengeluarkan elektron valensi di dalam molekul
tersebut (Harjadi, 1990). Penyerapan sinar UV-Vis dibatasi pada sejumlah gugus
fungsional atau gugus kromofor yang mengandung elektron valensi dengan tingkat
eksutasi rendah. Tiga jenis elektron yang terlibat adalah sigma, phi, dan elektron bebas.
Kromofor-kromofor organik seperti karbonil, alkena, azo, nitrat, dan karboksil mampu
menyerap sinar ultraviolet dan sinar tampak. Panjang gelombang maksimumnya dapat
berubah sesuai dengan pelarut yang digunakan. Auksokrom adalah gugus fungsional
yang mempunyai elektron bebas seperti hidroksil, metoksi, dan amina. Terkaitnya gugus
kromofor akan mengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju ke panjang gelombang
yang lebih besar dan disertai dengan peningkatan intensitas. Ketika cahaya melewati
suatu larutan biomolekul, terjadi dua kemungkinan. Kemungkinan pertama adalah cahaya
ditangkap dan kemungkinan kedua adalah cahaya discattering. Bila energi dari cahaya
(foton) harus sesuai dengan perbedaan energi dasar dan energi eksitasi dari molekul
tersebut. Proses inilah yang menjadi dasar pengukuran absorbansi dalam
spektrofotometer (sutopo, 2006). Cara kerja spektrofotometer dimulai dengan
dihasilkannya cahaya monokromatik dari sumber sinar. Cahaya tersebut kemudian
menuju ke kuvet (tempat sampel/sel). Banyaknya cahaya yang diteruskan maupun yang
diserap oleh larutan akan dibaca oleh detektor yang kemudian menyampaikan ke layar
pembaca (Sastrohamidjojo, 1992)
Hasil pengukuran yang baik dari suatu parameter kuantitas kimia, dapat dilihat
berdasarkan tingkat presisi dan akurasi yang dihasilkan.Akurasi menunjukkan kedekatan
nilai hasil pengukuran dengan nilai sebenarnya. Untuk menentukan tingkat akurasi perlu
diketahui nilai sebenarnya dari parameter yang diukur dan kemudian dapat diketahui
seberapa besar tingkat akurasinya. Presisi menunjukkan tingkat reliabilitas dari data yang
diperoleh. Hal ini dapat dilihat dari standar deviasi yang diperoleh dari pengukuran,
presisi yang baik akan memberikan standar deviasi yang kecil dan bias yang rendah. Jika
diinginkan hasil pengukuran yang valid, maka perlu dilakukan pengulangan, misalnya
dalam penentuan nilai konsentrasi suatu zat dalam larutan larutan dilakukan pengulangan
sebanyak n kali. Ilmu yang mempelajari interaksi radiasi dengan materi sedangkan
spektrofotometri adalahpengukuran kuantitatif dari intensitas radiasi elektromagnetik
pada satu atau lebih panjanggelombang dengan suatu transduser (detektor).
Spektrofotometri adalah analisis kuantitatif yang paling sering digunakan karena
mempunyai sensitivitas yang baik yaitu 10
-4
sampai 10
-6
. Analisis jenis ini juga relatif
selektif dan spesifik, ketepatannya cukup tinggi, relatif sederhana, dan murah ( Mathias,
2005).
Spektofotometri adalah metode dalam kimia analisis yang digunakan untuk
menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan kualitatif yang
didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Peralatan yang digunakan dalam
spektrofotometri disebut spektrofotometer. Cahaya yang dimaksud dapat berupa cahaya
visibel, UV dan inframerah, sedangkan materi dapat berupa atom dan molekul namun
yang lebih berperan adalah elektron valensi ( Sutopo, 2006 ).
Interaksi materi dengan cahaya atau radiasi elektromagnetik, radiasi
elektromagnetik kemungkinanan dihamburkan, diabsorbsi atau dihamburkan sehingga
dikenal adanya spektroskopi hamburan, spektroskopi absorbsi ataupun spektroskopi
emisi. Interaksi antara materi dengan cahaya disini adalah terjadi penyerapan cahaya,
baik cahaya Uv, Vis maupun Ir oleh materi sehingga spektrofotometri disebut juga
sebagai spektroskopi absorbsi ( Eka, 2007).
Spektrofotometer UV-VIS
Spektrofotometri ini merupakan gabungan antara spektrofotometri UV dan
Visible. Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber
cahaya visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu
sumber sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan
monokromator. Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan
paling populer digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk
sample berwarna juga untuk sample tak berwarna. Spektroskopi ultraviolet-visible atau
spektrofotometri ultraviolet-visible (UV-Vis atau UV / Vis) melibatkan spektroskopi dari
foton dalam daerah UV-terlihat. Ini berarti menggunakan cahaya dalam terlihat dan
berdekatan (dekat ultraviolet (UV) dan dekat dengan inframerah (NIR)) kisaran.
Penyerapan dalam rentang yang terlihat secara langsung mempengaruhi warna bahan
kimia yang terlibat. Di wilayah ini dari spektrum elektromagnetik, molekul mengalami
transisi elektronik. Teknik ini melengkapi fluoresensi spektroskopi, di fluoresensi
berkaitan dengan transisi dari ground state ke eksited state. Penyerapan sinar uv dan sinar
tampak oleh molekul, melalui 3 proses yaitu :
a) Penyerapan oleh transisi elektron ikatan dan electron anti ikatan
b) Penyerapan oleh transisi electron d dan f dari molekul kompleks.
c) Penyerapan oleh perpindahan muatan.
Absorbsi radiasi oleh suatu sampel diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan
oleh suatu perkam untuk menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen
yang berbeda.Absorbsi sinar oleh larutan mengikuti hukum Lambert-Beer, yaitu :
A = log ( Io / It ) = a b c
Keterangan :
Io = Intensitas sinar datang
It = Intensitas sinar yang diteruskan
a = Absorptivitas
b = Panjang sel/kuvet
c = konsentrasi (g/l)
A = Absorban
Spektrofotometri merupakan bagian dari fotometri dan dapat dibedakan dari filter
fotometri sebagai berikut :
1.Daerah jangkauan spectrum
Fotometer hanya dapat digunakan untuk mengukur serapan sinar tampak (400-750 nm).
Sedangkan spektrofotometer dapat mengukur serapan di daerah tampak, UV (200-380
nm) maupun IR (> 750 nm).
2. Sumber sinar
Sesuai dengan daerah jangkauan spektrumnya maka spektrofotometer menggunakan
sumber sinar yang berbeda pada masing-masing daerah (sinar tampak, UV, IR).
Sedangkan sumber sinar filter fotometer hanya untuk daerah tampak.
3. Monokromator
Filter fotometere menggunakan filter sebagai monokrmator. Tetapi pada spektro
digunakan kisi atau prisma yang daya resolusinya lebih baik.
4. Detektor
- Filter fotometer menggunakan detektor fotosel
- Spektrofotometer menggunakan tabung penggandaan foton atau fototube.
Panjang gelombang pada alat spektrofotometer lazim disajikan dalam satuan nm di mana
1 m = 10-9 nm.
B. Larutan standar
Larutan baku/ larutan standar adalah larutan yang konsentrasinya sudah diketahui.
Larutan baku biasanya berfungsi sebagai titran sehingga ditempatkan buret, yang
sekaligus berfungsi sebagai alat ukur volume larutan baku. Larutan yang akan ditentukan
konsentrasinya atau kadarnya, diukur volumenya dengan menggunakan pipet volumetri
dan ditempatkan di erlenmeyer (Basset, 1994).
Larutan baku primer
Larutan yang mengandung zat padat murni yang konsentrasi larutannya diketahui secara
tepat melalui metode gravimetri (perhitungan massa), dapat digunakan untuk menetapkan
konsentrasi larutan lain yang belum diketahui. Nilai konsentrasi dihitung melalui
perumusan sederhana, setelah dilakukan penimbangan teliti dari zat pereaksi tersebut dan
dilarutkan dalam volume tertentu. Contoh: K2Cr2O7, As2O3, NaCl, asam oksalat, asam
benzoat. Menurut Basset (1994) Syarat-syarat larutan baku primer :

Zat harus mudah diperoleh, dimurnikan, dikeringkan (jika mungkin pada suhu 110-120
derajat celcius) dan disimpan dalam keadaan murni. (Syarat ini biasanya tak dapat
dipenuhi oleh zat- zat terhidrasi karena sukar untuk menghilangkan air-permukaan
dengan lengkap tanpa menimbulkan pernguraian parsial.)
Zat harus tidak berubah berat dalam penimbangan di udara; kondisi ini menunjukkan
bahwa zat tak boleh higroskopik, tak pula dioksidasi oleh udara atau dipengaruhi
karbondioksida.
Zat tersebut dapat diuji kadar pengotornya dengan uji- uji kualitatif dan kepekaan
tertentu.
Zat tersebut sedapat mungkin mempunyai massa relatif dan massa ekuivalen yang besar.
Zat tersebut harus mudah larut dalam pelarut yang dipilih.
Reaksi yang berlangsung dengan pereaksi harus bersifat stoikiometrik dan langsung.
Larutan baku sekunder
Larutan suatu zat yang konsentrasinya tidak dapat diketahui dengan tepat karena berasal dari
zat yang tidak pernah murni. Konsentrasi larutan ini ditentukan dengan pembakuan
menggunakan larutan baku primer, biasanya melalui metode titrimetri. Contoh: AgNO3,
KmnO4, Fe(SO4)2.
Menurut Basset (1994) Syarat-syarat larutan baku sekunder :
Derajat kemurnian lebih rendah daripada larutan baku primer
Mempunyai berat ekivalen yang tinggi untuk memperkecil kesalahan penimbangan
Larutannya relatif stabil dalam penyimpanan.
Syarat larutan yang dapat digunakan untuk analisis campuran dua komponen adalah
Komponen-komponen dalam larutan tidak boleh saling bereaksi
Penyerapan komponen-komponen tersebut tiak sama
Komponen harus menyerap pada panjang gelombang tertentu
Senyawa-senyawa yang diukur dengan metoda spektrofotometri harus memenuhi hukum
Lambert-Beer, yaitu
Bila suatu sinar monokromatis dilewatkan pada medium pengabsorbsi,maka berkurangnya
intensitas cahaya per unit tebal medium sebanding dengan intensitas cahaya tersebut
Berkurangnya intensitas cahaya per unit konsentrasi akan berbanding lurus dengan
intensitas cahaya
Dari hukum Lambert Beer didapat rumus sebagai berikut
A = a.b.c A = -log T
Rumus yang digunakan untuk analisis dua komponen adalah :
A1 = ax1. b. cx + ay1 . b . cy
A2 = ax2 . b. cx + ay2 . b . cy
Dimana :
A1 = serapan campuran pada panjang gelombang maksimum pertama
A2 = serapan campuran pada panjang gelombang maksimum kedua
C = konsentrasi larutan


Keabsahan Hukum Beer
Kondisi berikut adalah keabsahan hukum Beer. Cahaya yang digunakan harus
monokromatis, bila tidak demikian maka akan diperoleh dua nilai absorbansi pada dua
panjang gelombang. Hukum tersebut tidak diikuti oleh larutan yang pekat. Konsentrasi lebih
tinggi untuk beberapa garam tidak berwarna justru mempunyai efek absorbsi yang
berlawanan. Larutan yang bersifat memancarkan pendar-fluor atau suspensi tidak selalu
mengikuti hukum Beer. Jika selama pengukuran pada larutan encer terjadi reaksi kimia
seperti polimerisasi, hidrolisis, asosiasi atau disosiasi, maka hukum Beer tidak berlaku.
Cara Kerja Spektrofotometer
Cara kerja spektrofotometer secara singkat adalah sebagai berikut. Tempatkan larutan
pembanding, misalnya blanko dalam sel pertama sedangkan larutan yang akan dianalisis
pada sel kedua. Kemudian pilih fotosel yang cocok 200-650 nm ( 650-1100 nm ) agar daerah
yang diperlukan dapat terliputi. Dengan ruang fotosel dalam keadaan tertutup nol
galvanometer dengan menggunakan tombol dark-current. Pilih h yang diinginkan, buk
fotosel dan lewatkan berkas cahaya pada blanko dan nol galvanometer didapat dengan
memutar tombol sensitivitas. Dengan menggunakn tombol transmitansi, kemudian atur
besarnya pada 100 %. Lewatkan berkas cahaya pada larutan sampel yang akan dianalisis.
Skala absorbansi menunjukkan absorbansi larutan sampel.
Parasetamol
Parasetamol atau asetaminofen adalah obat analgesic dan antipiretik yang populer dan
digunakan untuk melegakan sakit kepala, sengal-sengal dan sakit ringan, dan demam.
Digunakandalam sebagian besar resep obat analgesic salesma dan flu. Ia aman dalam dosis
standar, tetapikarena mudah didapati, overdosis obat baik sengaja atau tidak sengaja sering
terjadi.Parasetamol (Asetaminofen) merupakan salah satu obat yang paling banyak
digunakan sehari-hari. Obat ini berfungsi sebagai pereda nyeri dan penurun panas. Setelah
berpuluh tahundigunakan, parasetamol terbukti sebagai obat yang aman dan efektif. Tetapi,
jika diminum dalamdosis berlebihan (overdosis), parasetamol dapat menimbulkan kematian

Kafein
Kafein dikenal sebagai trimethylxantine dengan rumus kimia C8H10N4O2 dan termasuk
jenis alkaloida. Bentuk alami kafein adalah Kristal putih, prisma heksagonaldan dan
berbobot molekul 194,19 dalton. Kafein memiliki titik leleh 238C dan mengalami sublimasi
pada suhu 178C. Kafein terdapat secara alami pada biji kopi, bijicoklat, daun teh serta cula
nuts.Rumus Molekul kafeinKafein sebagai zat stimulant sering dituding sebagai penyebab
kecanduan. Haltersebut tidak sepenuhnya benar. Kafein hanya dapat menimbulkan
kecanduan jika dikonsumsi dalam jumlah yang sangat banyak dan rutin.
Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter
tertentu, berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut
memenuhi persyaratan dalam penggunaannya. Tujuan utama validasi adalah untuk
menjamin metode analisis yang digunakan mampu memberikan hasil yang cermat, handal
dan dipercaya.
Parameter yang diuji dalan validasi meliputi akurasi, presisi, linearitas, rentang,
limit deteksi, limit kuantitas, spesifikasi, ketangguhan, kekuatan, stabilitas dan uji
kesesuaian system.
1. Selektivitas
Adalah kemampuan metode analisis untuk mengukur kadar analit secara cermat dan
seksama degan adanya komponen-komponen lain dalamm sampel. Setiap sampel blangko
harus diuji iterferensinya pada batas terendah dari limit kuantitasi (LLOQ) dan
selektivitas harus menjamin tidak ada interferensi pada LLOQ.
2. Kecermatan
Adalah suatu metode analisis yang menggambarkan kedekatan hasi penetapan yang
diperoleh dengan kadar analit sesungguhnya. Pengukuran dapat dilakukakan intra assay
(dalam satu run) dan inter assay (day to day variation). Pengukuran akurasi memenuhi
syarat jika nilai rata-rata %diff yang diperoleh 2%.
3. Keseksamaan
Adalah metode analisis yang menunjukkan kedekatan antara hasil pengujian dengan hasil
pengujian lainnya. Presisi diukur minimal lima kali pengukuran untuk tiap konsentrasi,
minimal digunakan tiga konsentrasi berbeda yaitu pada konsentrasi rendah, sedang dan
tinggi. Pengukuran presisi dilakukan secara intra assay dan inter assay. Suatu metode
dikatakan presisi jika nilai koefisien variasi (KV) untuk masing-masing tingkat
konsentrasi tidak boleh 2%/
4. Kurva kalibras
Adalah hubungan antara respon instrument dengan konsentrasi anailt yang diketahui.
5. Linieritas dan rentang
Adalah kemampuan metode yang memberikan respon secara langsung, proporsional
terhadap konsentrasi analit dalam sampel. Linieritas diperoleh dari koefisien korelasi (r )
pada analisis regresi ;inier yang di dapat dari kurva kalibrasi. Dengan diakukan ujian ini,
maka dapat diketahui batas-batas konsentrasi dari analit yang memberikan respon
detektor yang linier. Rentang metode adalah pernyataan konsentrasi terendah dan
tertinggi analit yang dianalisis memberikan kecermatan, keseksamaan dan linieritas yang
dapat diterima.
6. Batas deteksi dan batas kuantitas
Adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi dan masih memberikan
respon signifikan dibandingkan dengan blangko. Batas deteksi merupakan parameter uji
batas. Batas kuantitasi diartikan sebagai kuantitas terkecil sampel yang masih dapat
memenuhi criteria cermat dan seksama.
7. Uji perolehan kembali
Merupakan perbandingan antara respon detektor analit yang diekstraksi dari sampel
biologis dengan respon detektor kadar yang sebenarnya daristandar murni. Uji perolehan
kembali dari analit tidak perlu 100%,, tetapi perolehan kembali dari analit dan baku
dalam presisi dan keberulangan harus konsisten. Persyaratan uji perolehan kembali
adalah 85-115%.




III. Alat dan Bahan
Alat
1. Spektrofotometer ultraviolet-visible
2. Timbangan Analitik
3. Pipet Mikro
4. Gelas Ukur
5. Baker Glass
6. Labu Ukur
Bahan
1. Bahan Baku Standar (Parasetamol, Coffein)
2. Sampel Parasetamol Generik 500 mg
3. Aquadest

IV. Prosedur Kerja
I. Pencarian panjang gelombang optimum
a. Siapkan alat dan bahan
b. Buat larutan induk Koffein dengan konsentrasi 100 ppm dengan menimbang 10 mg
Kafein kemudian ad aquadest 100 ml
c. Buat larutan Koffein 10 ppm sebanyak 25 ml dengan mengambil 2.5 ml dari larutan
induk 100 ppm.
d. Ukur dengan spektrofotometer UV-Vis, hingga di dapat panjang gelombang optimum
e. Hitung konsentrasi minimum dan maksimum dari hasil absorbansi yang didapat.

II. Kaliberasi Kafein pada panjang gelombang optimum
a. Buat larutan dengan variasi konsentrasi antara konsentrasi maksimum dan minimum :
6,8,10,12,14 ppm.
b. Buat larutan konsentrasi 6 ppm dengan memipet 1,5 ml larutan 100 ppm kemudian ad
aquadest 25 ml.
c. Buat larutan konsentrasi 8 ppm dengan memipet 2 ml larutan 100 ppm kemudian ad
aquadest 25 ml.
d. Buat larutan konsentrasi 10 ppm dengan memipet 2,5 ml larutan 100 ppm kemudian
ad aquadest 25 ml.
e. Buat larutan konsentrasi 12 ppm dengan memipet 3 ml larutan 100 ppm kemudian ad
aquadest 25 ml.
f. Buat larutan konsentrasi 14 ppm dengan memipet 3,5 ml larutan 100 ppm kemudian
ad aquadest 25 ml.
g. Ukur serapan masing-masing konsentrasi dengan spektrofotometer UV-Vis pada
panjang gelombang 243 nm ( optimum PCT) dan 273 nm ( optimum koffein).
h. Hitunglah nilai a,b dan r masing-masing menggunakan regresi linier.

III. Validasi Metode (presisi dan akurasi)
a. Ambil 2 konsentrasi (misal 6 dan 8 ppm ) yang digunakan dalam kalibrasi Koffein di
awal praktikum.
b. Konsentrasi 8 ppm untuk uji akurasi dan 6 ppm untuk uji presisi.
c. Buat larutan Koffein 100 ppm dengan menimbang 10 mg Kofein dan kemudian ad
aquadest 100 ml.
d. Pipet 1,5 ml larutan Koffein 100 ppm dan ad aquadest 25 ml untuk membuat larutan
Koffein 6 ppm. Lakukan sebanyak 5 kali.
e. Pipet 2 ml larutan Koffein 100 ppm dan ad aquadest 25 ml untuk membuat larutan
Koffein 8 ppm. Lakukan sebanyak 5 kali.
f. Ukur serapan masing-masing larutan dan hitung presisi dan akurasinya.

IV. Uji sampel Parasetamol dan Koffein
a. Timbang 20 tablet parasetamol generik lalu gerus dan timbang setara 500mg.
b. Buat larutan induk parasetamol 5000 ppm dengan melarutkan parasetamol setara 500
mg yang di ad aquadest 100 ml.
c. Buat larutan parasetamol 100 ppm dengan memipet 2 ml larutan induk dan ad
aquadest 100 ml.
d. Kemudian buatlah larutan parasetamol-koffein 10 ppm dengan memipet 2,5 ml
larutan parasetamol 100 ppm dan 2,5 ml larutan koffein 100 ppm kemudian ad
aquadest 25 ml.
e. Ukur serapan masing-masing parasetamol dan koffein dengan menggunakan
spektrofotometer UV-Vis.

V. Analisa Data
Prosedur 1 : pembuatan spektrum.
Hasil:
1. Coffein di serap pada panjang gelombang maksimum 273 nm.
2. Paracetamol diserap pada panjang gelombang maksmum 243 nm.
3. Tidak melakukan penggabungan spektrum sehingga tidak diperoleh panjang gelombang
optimum.

Prosedur 2 : Pembuatan kurva kalibrasi.
Hasil:
1. Mencari seri konsentrasi untuk pembuatan kurva kaibrasi.

A coffein = a.b.c.
0,48 = a . 1 . 10
a = 0,048
Mencari C min dan Cmax dengan memasukkan nilai A sebesar masng-masing 0,2 dan 0,8.
Untuk Cmin = 0,2 = 0,048 x 1 x Cmin
Cmin = 4,1667
Untuk Cmax = 0,8 = 0,048 x 1 x Cmax
Cmax = 16,6667
Maka konsentrasi seri yang dibuat harus berada pada rentang 4,1667 ppm 16,6667 ppm.
Kami membuat seri dengan konsentrasi 6ppm, 8ppm, 10 ppm, 12ppm, 14ppm.

2. Mencari absorbansi coffein dalam coffein pada serapan 273 nm.




3. mencari Absorbansi coffein dalam paracetamol pada serapan 243 nm.







y = 0,0497x + 0,001
R = 0,9995
R = 0,9998
0.0000
0.1000
0.2000
0.3000
0.4000
0.5000
0.6000
0.7000
0.8000
0.0000 2.0000 4.0000 6.0000 8.0000 10.000012.000014.000016.0000
A
x
i
s

T
i
t
l
e

Axis Title
coffein dalam coffein
X y
0,0000 0,0000
6,0000 0,3000
8,0000 0,3990
10,0000 0,5030
12,0000 0,5870
14,0000 0,7000
x y
0,0000 0,0000
6,0000 0,0850
8,0000 0,1070
10,0000 0,1370
12,0000 0,1630
14,0000 0,1910



4. Menghitung daya resap coffein dalam coffein.
A = a.b.c
A= absorbansi
a = serapan
b = tebal kuvet
c = konsentrasi

A A b C
0,3000 0,0500 1 6,0000
0,3990 0,0499 1 8,0000
0,5030 0,0503 1 10,0000
0,5870 0,0489 1 12,0000
0,7000 0,0500 1 14,0000
Nilai a rata-rata = 0,04982

5. Menghitung daya resap coffein dalam paracetamol.
A = a.b.c
A= absorbansi
a = serapan
b = tebal kuvet
c = konsentrasi


y = 0,0136x + 0,0007
R = 0,9994
R = 0,9997
0.0000
0.0500
0.1000
0.1500
0.2000
0.2500
0.0000 2.0000 4.0000 6.0000 8.0000 10.000012.000014.000016.0000
A
x
i
s

T
i
t
l
e

Axis Title
coffein dalam paracetamol
A A b c
0,085 0,0142 1 6,0000
0,1070 0,0134 1 8,0000
0,1370 0,0137 1 10,0000
0,1630 0,0136 1 12,0000
0,1910 0,0136 1 14,0000
Nilai a rata-rata = 0,0137

Prosedur 3: pembuatan parameter validasi.
Hasil:
1. Mencari konsentrasi LOD dan LOQ coffein.
x Y y' y-y' (y-y')
2

6,0000 0,3000 0,3002 -0,0002 4 x 10-8
8,0000 0,3990 0,399 0 0
10,0000 0,5030 0,498 0,0050 0,000025
12,0000 0,5870 0,5966 -0,0096 9,216 x 10-5
14,0000 0,7000 0,6954 0,0046 2,116 x 10-5
Sigma (y-y)
2
1,3836 x 10
-4


a = 3,8 x 10
-3
b = 0,0494
r = 0,9993
y = 3,8 x 10
-3
+ 0,0494 x

Sb =

Sb =

= 6,791 x 10
-3

LOD = 3Sb/b
= 3

= 0,4124

LOQ = 10 Sb/b
= 10

= 1,3747


2. Membuat absorbansi menggunakan konsentrasi LOQ.
X Y
2,0000 0,1026
4,0000 0,2270
6,0000 0,3000
8,0000 0,3990
10,0000 0,5030
12,0000 0,5870
14,0000 0,7000




3. Menentukan nilai akurasi.
% recovery = Cf/Ca x 100%
Cf = konsentrasi yang diperoleh
Ca = konsentrasi yang ditambahkan
Cf Ca
%
recovery
8,109 8 101,36%
7,837 8 97,96%
8,044 8 100,55%
7,877 8 98,46%
y = 0.0485x + 0.0148
R = 0.9977
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0 2 4 6 8 10 12 14 16
A
x
i
s

T
i
t
l
e

Axis Title
Kalibrasi Coffein dengan batas LOQ
7,622 8 95,28%

98,72%

4. Menentukan nilai presisi.
Conc. (x yang
dibuat)
Abs (y) Conc (x) (x-x)
2

6 0,335 6,726 0,0640
6 0,379 7,621 1,3179
6 0,285 5,720 0,5670
6 0,354 7,100 0.627
6 0,259 5,198 1,6256
Rata-rata x=
6,473
4,2015





Presisi :
SD =

= 1,0249
RSD =

x 100% =

= 15,8335%

Prosedur 4: Penentuan kadar dalam sampel.
Hasil:

A
tot
= A
1
+ A
2
Ket : A
1
= kofein
A
2
= PCT
A
1
= a
x

1
. b. c
x
+ a
y

1
. b. c
y
0,602 = 0.04982 c
x
+ 0.02259 c
y (1)

A
2
= a
x

2
. b. c
x
+ a
y

2
. b. c
y
0,797 = 0.0137 c
x
+ 0.0737 c
y(2)
Eliminasi persamaan 1 dan 2
0,797 = 0.0137 c
x
+ 0.0737 c
y
x0.04982

0,602 = 0.04982 c
x
+ 0.02259 c
y
x0.0137

0,0397065 = 0,00068253 Cx + 0,00367173 Cy
0,0082474 = 0,00068253 Cx + 0,00030948 Cy

0,0314591 = 0,0033623 Cy
Cy = 9,3564227 ppm

0,797 = 0,0137 Cx + 0,0737 Cy
0,797 = 0,0137 Cx + 0,0737 x 9,3564227
0,797 = 0,0137 Cx + 0,68956835
Cx = 7,8417 ppm

Persentase Kadar
Paracetamol =

Coffein =

VI. Pembahasan
Pada praktikum kali ini bertujuan untuk memahami kerja alat spektrofotometer
ultraviolet- visible, mencari panjang gelombang maksimum dan optimum suatu seyawa
obat, serta membuat kurva kalibrasi suatu senyawa parameter validasi (kurva validasi,
akurasi, presisi, LOD, LOQ) dan penetapan kadar dalam sediaan. Sampel yang digunakan
adalah paracetamol dan kofein dan menggunakan alat spektrofotometer UV-VIS. Waktu
praktikum selama 2 kali pertemuan.
Spektrofotometer ultraviolet visible merupakan alat dengan teknik
spektrofotometer pada daerah ultra-violet dan sinar tampak. Alat ini digunakan untuk
mengukur serapan sinar ultra violet atau sinar tampak oleh suatu materi dalam bentuk
larutan.Prinsip dasar Spektrofotometri UV-Vis adalah serapan cahaya. Bila cahaya jatuh
pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul sesuai dengan
struktur dari molekul senyawa tersebut. Serapan cahaya oleh molekul dalam daerah
spektrum UV-Vis tergantung pada struktur elektronik dari molekul. Spektra UV-Vis dari
senyawa-senyawa organik berkaitan erat dengan transisi-transisi diantara tingkatan-
tingkatan tenaga elektronik. Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul
organik aromatik, molekul yang mengandung elektron- terkonjugasi dan atau atom yang
mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital terluarnya dari tingkat
energi elektron tereksitasi lebih tinggi. Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding
dengan banyaknya molekul analit yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk
analisis kuantitatif. Dalam hal ini, hukum Lamber beer dapat menyatakan hubungan
antara serapan cahaya dengan konsentrasi zat dalam larutan. Dibawah ini adalah
persamaan Lamber beer:





Spektrofotometer UV-VIS dapat menganalisa secara kualitatif dan kuantitatif.
Pada analisa kualitatif karakteristik resapan suatu zat dalam pelarut tertentu, yaitu
panjang gelombang maksimum dan daya resapnya. Penentuan panjang gelombang
maksimum dengan membuat spektrum dengan cara membuat larutan baku primer/induk.
Pipet sejumlah volume larutan induk dan diencerkan kedalam labu hingga diperoleh
konsentrasi 10 um/mL . setelah itu ukur serapannya dengan spektrofotometer untuk
menentukan panjang gelombang maksimum. Setelah dispektrofotometer didapatkan
panjang gelombang maksimum pada kofein 273 nm dan untuk paracetamol 243 nm.
Berdasarkan iteratur panjang gelombang kofein adalah 272 nm dan panjang gelombang
paracetamol 242 nm. Sehingga hasil dari praktikum tersebut masih sesuai dengan panjang
gelombang maksimum sebenarnya karena hasilnya tidak terlalu jauh berbeda. Lalu
gabungkan kedua spektrum paracetamol dan kofein untuk menentukan panjang
gelombang optimum. Setelah itu membuat kurva kalibrasi berdasarkan data panjang
gelombang maksimum yang diperoleh, dibuat lima seri konsentrasi larutan dari larutan
induk dengan menggunakan rumus Lambert Beer. Untuk membuat lima seri konsentrasi
larutan sebelumnya kami menentukan nilai konsentrasi minimum dan maksimum dengan
rumus A=a.b.c. Nilai konsentrasi minimum yang didapat adalah 4,167 ppm dan nilai
konsentrasi maksimumnya 16,667 ppm. Selanjutnya dibuat lima seri konsentrasi larutan
yaitu 6,8,10,12,14 ppm. Setelah itu ukur serapan masing-masing larutan pada panjang
gelombang maksimum baku. Sehingga didapatkan persamaan regresi linear yaitu
y=0,0497x + 0,001. sehingga diperoleh nilai resapan 0,04982 .
Setelah itu kami mencari nilai LOD dan LOQ. Nilai LOD didapat yaitu 0,4124
dan nilai LOQ yaitu 1,3747 nilai LOD merupakan konsentrasi analit terendah dalam
sampel yang masih dapat dideteksi meskipun tidak selalu dapat dikuantifikasi. Sedangkan
nilai LOQ merupakan konsentrasi analit terendah dalam sampel yang masih dapat
ditentukan dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima pada kondisi operasional
metode yang digunakan.
Selanjutnya kami menghitung parameter validasi. Parameter validasi berguna
untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan dalam
penggunaannya. Tujuan utama validasi parameter adalah untuk menjamin metode analisi
yang digunakan mampu memberikan hasil yang cermat dan handal serta dapat dipercaya.
Parameter yang diuji dalam validasi meliputi akurasi, presisi, linearitas, rentang, limit
deteksi, limit kuantitasi, sepesifikasi, ketangguhan, kekuatan, stabilitas, dan uji
kesesuaian sistem.
Pada praktikum untuk menentukan metode validasi penetapan kadar kafein
dengan menggunakan spektrofotometer Uv-Vis, yang dilakukan hanya menentukan
akurasi dan presisi. Pada percobaan ini sampel yang diperoleh adalah kafein
yang berkhasiat sebagai stimulan saraf otak dan kardiotonikum. Parameter akurasi
merupakan parameter yang digunakan untuk melihat kedekatan hasil uji dengan nilai
yang sebenarnya. Syarat nilai akurasi antara 80%-110%. Untuk menentukan nilai akurasi
kami membuat lima buah larutan dengan konsentrasi yang sama yaitu 8 ppm. Setelah itu
di spektrofotometer uv-vis, dan nilai akurasi yang didapat adalah 98,72 % sehingga dapat
dikatakan bahwa nilai perolehan kembali ini memenuhi persyaratan dan hal ini
menunjukkan bahwa penetapan kadar kofein dengan spektrofotometri memiliki akurasi
yang cukup baik, karena berada pada rentang persyaratan.
Sedangkan untuk menentukan nilai presisi, kamu juga membuat lima buah larutan
dengan konsentrasi yang sama yaitu 6 ppm. Setelah itu di spektrofotometer Uv Vis.
Nilai presisi yang didapat adalah 15,8335 %. Berdasarkan literatur syarat nilai presisi
atau RSD adalah < 2 %. Sedangkan pada kelompok kami nilai presisi yang didapt jauh
dari syarat yang ditentukan. Sehingga hal ini menunjukkan bahwa penetapan kadar kofein
secara spektrofotometri memiliki presisi yang tidak baik atau derajat kesesuaiannya
rendah. Ketidaksesuaian ini bisa disebabkan karena kurang teliti dan kurang hati-hati
dalam pembuatan larutan konsentrasi, seperti pada saat memipet atau mngambil larutan
kurang teliti atau kurang tepat serta peralatan yang digunakan kurang higienis sehingga
dikhawatirkan adanya pengotor dalam larutan.
Selain itu kami juga melakukan penetapan kadar kofein dan paracetamol. Untuk
menenetapkan kadar kofein dan paracetamol kami membuat larutan dengan masing-
masing konsentrasi 10 ppm. Setelah itu, ukur serapan pada panjang gelombang optimum
dengan spektrofotometer. Untuk menghitung kadar sampel menggunakan nilai regresi
linear. Kadar sampel paracetamol adalah 93.564 % sedangkan kadar kofein adalah 78.417
%. Dari hasil perhitungan tersebut kadar paracetamol sangat baik karena mendekati
100%, namun kadar kofein yang didapat cukup baik walaupun tidak terlalu mendekati
100%, kemungkinan hal ini dikarenakan kurang telitinya praktikan dalam melakukan
setiap tahap demi tahap dalam praktikum.

VII. Kesimpulan dan Saran
1. Kesimpulan
Prinsip dasar Spektrofotometri UV-Vis adalah serapan cahaya. Bila cahaya
jatuh pada senyawa, maka sebagian dari cahaya diserap oleh molekul-molekul
sesuai dengan struktur dari molekul senyawa tersebut. Serapan cahaya oleh
molekul dalam daerah spektrum UV-Vis tergantung pada struktur elektronik
dari molekul. Radiasi ultraviolet dan sinar tampak diabsorpsi oleh molekul
organik aromatik, molekul yang mengandung elektron- terkonjugasi dan atau
atom yang mengandung elektron-n, menyebabkan transisi elektron di orbital
terluarnya dari tingkat energi elektron tereksitasi lebih tinggi.
Besarnya serapan radiasi tersebut sebanding dengan banyaknya molekul analit
yang mengabsorpsi sehingga dapat digunakan untuk analisis kuantitatif.
Panjang gelombang maksimum Parasetamol adalah 243 nm dan koffein 273
nm.
Parameter validasi adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu
berdasarkan percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa parameter
tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya.
Parameter validasi yang diuji yaitu LOD, LOQ, akurasi dan presisi dengan
hasil sebagai berikut:
LOD = 0,4124 ppm
LOQ = 1,3747 ppm
Akurasi (%recovery) = 98,72%
Presisi (Koefisien Variant)= 15,8335%
Penetapan kadar dalam sediaan (paracetamol generic 500 mg)
Kadar PCT yang diperoleh : 93,56%
Kadar Coffein yang diperoleh : 78,42%

2. Saran
Ketelitian dan ketepatan dalam pengerjaan harus diperhatikan benar agar
mengurangi faktor kesalahan.
Pemipetan sebaiknya dilakukan oleh satu orang saja untuk mengurangi
kesalahan.
Untuk satu volume dilakukan satu kali pemipetan saja.




DAFTAR PUSTAKA