NTC 5652

NORMA TCNICA NTC
COLOMBIANA 5652

2009-03-11

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS
PARA ANIMALES.
MTODOS HORIZONTALES PARA LA DETECCIN
Y ENUMERACIN DE ENTEROBACTERIAS.
PARTE 1: DETECCIN Y ENUMERACIN
MEDIANTE LA TCNICA DE NMP CON PRE-
ENRIQUECIMIENTO

E: MICROBIOLOGY OF FOOD AND ANIMAL FEEDING
STUFFS - HORIZONTAL METHODS FOR THE
DETECTION AND ENUMERATION OF
ENTEROBACTERIACEAE- PART 1: DETECTION AND
ENUMERATION BY MPN TECHNIQUE WITH PRE-
ENRICHMENT

CORRESPONDENCIA: esta norma es idntica (IDT) con
respecto a su documento de referencia,
la norma ISO 21528-1:2004.

DESCRIPTORES: microbiologa; alimentos para
consumo humano; alimentos para
animales; deteccin y numeracin de
enterobacterias; tcnica de NMP;
tcnica con pre-enriquecimiento.

I.C.S.: 07.100

Editada por el Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin (ICONTEC)
Apartado 14237 Bogot, D.C. - Tel. (571) 6078888 - Fax (571) 2221435

Prohibida su reproduccin Editada 2009-03-27

PRLOGO

El Instituto Colombiano de Normas Tcnicas y Certificacin, ICONTEC, es el organismo
nacional de normalizacin, segn el Decreto 2269 de 1993.

ICONTEC es una entidad de carcter privado, sin nimo de lucro, cuya Misin es fundamental
para brindar soporte y desarrollo al productor y proteccin al consumidor. Colabora con el
sector gubernamental y apoya al sector privado del pas, para lograr ventajas competitivas en
los mercados interno y externo.

La representacin de todos los sectores involucrados en el proceso de Normalizacin Tcnica
est garantizada por los Comits Tcnicos y el perodo de Consulta Pblica, este ltimo
caracterizado por la participacin del pblico en general.

La NTC 5652 fue ratificada por el Consejo Directivo de 2009-03-11.

Esta norma est sujeta a ser actualizada permanentemente con el objeto de que responda en
todo momento a las necesidades y exigencias actuales.

A continuacin se relacionan las empresas que colaboraron en el estudio de esta norma a
travs de su participacin en el Comit Tcnico 25 Microbiologa.

3 M COLOMBIA
ALIMENTOS POLAR COLOMBIA S.A.
ALPINA PRODUCTOS ALIMENTICIOS S.A.
BIOQUILAB LTDA.
BIOTRENDS LABORATORIOS LTDA.
CALIDAD INDUSTRIAL LTDA.
CARULLA VIVERO S.A.
CASA LUKER
ENZIPN DE COLOMBIA LTDA.
IVONNE BERNIER LABORATORIO LTDA.
KOYOMAD S.A.
LABCONTROL E.U.
LABORATORIO SFC LTDA.
LABORATORIOS ERMA S.A.
LABORATORIOS GRAM
LABORATORIOS MICROLAB LTDA.
MERCADEO DE ALIMENTOS DE
COLOMBIA S.A.
MULTIDIMENSIONALES
NULAB LTDA.
PURIFICACIN Y ANLISIS DE FLUIDOS LTDA.
QUALA S.A.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
LABORATORIO DE GENTICA
VECOL S.A.

Adems de las anteriores, en Consulta Pblica el Proyecto se puso a consideracin de las
siguientes empresas:

ACEGRASAS S.A.
ACUAGYR S.A. E.S.P.
ALGARRA S.A.
ANNAR DIAGNOSTICA IMPORT LTDA.
AQUALAB
ARCHIVO BOGOT
AREPAS DOA ALEJA
ASBIOQUIM LTDA.
ASEBIOL
ASINAL
ASOCIACIN COLOMBIANA DE CIENCIA Y
TECNOLOGA COSMTICA ACCYTEC
ASOCIACIN COLOMBIANA DE
MICROBIOLOGA
BAVARIA S.A.
BECTON DICKINSON DE COLOMBIA LTDA.
CALIDAD INDUSTRIAL LTDA.
CARULLA VIVERO S.A.
CASA LUKER
CERVECERA LEONA S.A.

COLOMBIANA S.A.
COMPAA NACIONAL DE CHOCOLATES S.A.
CONGELAGRO S.A.
CORPORACIN PARA EL AVANCE DE LA
MICROBIOLOGA Y LA MICROSCOPIA
MICROS
DUPONT QUALICON
EMPRESA DE ACUEDUCTO Y
ALCANTARILLADO DE BOGOT E.S.P.
FBRICA DE ESPECIAS Y
CONDIMENTOS EL REY S.A.
FRUGAL S.A.
JOHNSONDIVERSEY

KLIK S.A
LA CAMPIA
LABORATORIO A.B.B.A
LABORATORIO DE GENTICA Y BIOLOGA
MOLECULAR
MICROBIOLOGOS ASOCIADOS LTDA.
NESTL DE COLOMBIA S.A.
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
QUIK LTDA.
ROCHE DIAGNOSTICS
SERVICIOS DE LABORATIO CLNICO LTDA.
UNIVERSIDAD DE LOS ANDES
UNIVERSIDAD MANUELA BELTRN

ICONTEC cuenta con un Centro de Informacin que pone a disposicin de los interesados
normas internacionales, regionales y nacionales y otros documentos relacionados.

DIRECCIN DE NORMALIZACIN

NORMA TCNICA COLOMBIANA NTC 5652

CONTENIDO

Pgina

INTRODUCCIN

1. ALCANCE ....................................................................................................................1

2. REFERENCIAS NORMATIVAS...................................................................................1

3. TRMINOS Y DEFINICIONES.....................................................................................2

4. PRINCIPIO....................................................................................................................2

4.1 DETECCIN DE ENTEROBACTERIAS (VASE EL ANEXO A) ...............................2

4.2 ENUMERACIN MEDIANTE LA TCNICA DE NMP (VASE EL ANEXO B)...........3

5. DILUYENTE, MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVO......................................................4

5.1 DILUYENTE: AGUA PEPTONADA TAMPONADA (APA) ..........................................4

5.2 MEDIO DE CULTIVO ...................................................................................................4

5.3 REACTIVO DE OXIDASA............................................................................................7

6. EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO...........................................................................7

7. MUESTREO..................................................................................................................8

8. PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO.......................................................8

9. PROCEDIMIENTO........................................................................................................9

9.1 INFORMACIN GENERAL..........................................................................................9


Pgina

9.2 MTODO DE DETECCIN..........................................................................................9

9.3 MTODO DE ENUMERACIN (MTODO NMP)........................................................9

9.4 AISLAMIENTO Y SELECCIN PARA LA CONFIRMACIN....................................10

9.5 SUBCULTIVO DE LAS COLONIAS SELECCIONADAS ..........................................10

9.6 ENSAYOS DE CONFIRMACIN BIOQUMICA........................................................10

10. EXPRESIN DE RESULTADOS ...............................................................................11

10.1 TUBOS POSITIVOS CONFIRMADOS.......................................................................11

10.2 MTODO DE DETECCIN........................................................................................11

10.3 MTODO DE ENUMERACIN: CLCULO DEL NMERO MS PROBABLE.......11

11. PRECISIN................................................................................................................11

12. INFORME DE ENSAYO.............................................................................................11

DOCUMENTO DE REFERENCIA..........................................................................................15

ANEXOS

ANEXO A (Normativo)
DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO PARA EL MTODO DE DETECCIN.......................13

ANEXO B (Normativo)
DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO PARA LA TCNICA DE NMERO MS
PROBABLE............................................................................................................................14


INTRODUCCIN

El presente documento est destinado a brindar una orientacin general para el examen de los
productos que no son tratados en normas existentes y para ser tomada en consideracin por
organizaciones que preparen mtodos de ensayo microbiolgico para la aplicacin en
alimentos o productos alimenticios para animales. Debido a la gran variedad de productos
dentro de este campo de aplicacin, estas directrices pueden no ser apropiadas en todo detalle
para algunos productos y para algunos otros puede ser necesario usar mtodos diferentes. No
obstante, se espera que en todos los casos se hagan todos los intentos para aplicar las
directrices suministradas en la medida de lo posible y que las desviaciones con respecto a ellas
nicamente se lleven a cabo si es absolutamente necesario por razones tcnicas.

En la prxima revisin de este documento, se tomar en consideracin toda la informacin que
est disponible con respecto a la extensin en la cual las directrices se han cumplido y las
razones para las desviaciones en el caso de productos particulares.

La armonizacin de los mtodos de ensayo no puede ser inmediata y para algunos grupos de
productos pueden existir ya normas nacionales, o internacionales o ambas, que no cumplen
con este mtodo horizontal. Se espera que cuando se revisen tales normas se les realicen
cambios para satisfacer esta norma de tal manera que, eventualmente, las nicas desviaciones
de ste mtodo horizontal sern aquellas necesarias y bien establecidas por razones tcnicas.


1 de 15

MICROBIOLOGA DE ALIMENTOS Y ALIMENTOS PARA ANIMALES.
MTODOS HORIZONTALES PARA LA DETECCIN Y ENUMERACIN
DE ENTEROBACTERIAS. PARTE 1: DETECCIN Y ENUMERACIN
MEDIANTE LA TCNICA DE NMP CON PRE-ENRIQUECIMIENTO

1. ALCANCE

Esta norma especfica un mtodo con pre-enriquecimiento para la deteccin de enterobacterias. Se
aplica a:

- productos destinados para consumo humano y alimentacin de animales, y

- muestras ambientales en el rea de produccin y manipulacin de alimentos.

La enumeracin se realiza mediante clculo del nmero ms probable (NMP) despus de la
incubacin a 37 C (o 30 C)
1)
en un medio lquido.

Este mtodo se aplica cuando:

- se espera que los microorganismos que se buscan necesiten activacin antes del
enriquecimiento, y

- se espera que la cantidad que se busca est en el rango entre uno y 100 por ml o por
gramo de muestra de ensayo.

Una limitacin en la aplicabilidad de esta norma est impuesta por la susceptibilidad del
mtodo a un alto grado de variabilidad (vase el numeral 11).

2. REFERENCIAS NORMATIVAS

Los siguientes documentos normativos referenciados son indispensables para la aplicacin de
este documento normativo. Para referencias fechadas, se aplica nicamente la edicin citada.
Para referencias no fechadas, se aplica la ltima edicin del documento normativo referenciado
(incluida cualquier correccin).

NTC 4092, Microbiologa de alimentos y de alimentos para animales. Reglas generales para el
anlisis microbiolgico.

1)
La temperatura de 37 C se usa generalmente cuando la enumeracin de enterobacterias es para un
indicador higinico. Como alternativa se puede seleccionar la temperatura de 30 C cuando la enumeracin
de enterobacterias se ejecuta con propsitos tecnolgicos e incluye enterobacterias psicrfilas.


2
NTC 4491-1, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Preparacin de muestras para
ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para anlisis microbiolgico. Parte 1: Reglas
generales para la preparacin de la suspensin inicial y de diluciones decimales. (ISO 6887-1).

NTC 4491-2, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Preparacin de muestras
para ensayo. Suspensin inicial y diluciones decimales para anlisis microbiolgico. Parte 2.
Reglas especificas para la preparacin de carne y productos crnicos. (ISO 6887-2).

para ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para anlisis microbiolgico. Parte 3.
Reglas especificas para preparacin de muestras de pescado y productos de la pesca.

para ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para anlisis microbiolgico. Parte 4:
Reglas especificas para la preparacin de productos diferentes de leche, productos lcteos,
carne, productos crnicos, pescados y productos de la pesca.

para ensayo, suspensin inicial y diluciones decimales para anlisis microbiolgico. Parte 5:
Reglas especificas para la preparacin de productos la de leche y derivados lcteos (ISO 8261).

GTC 78, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Gua para la preparacin y
produccin de medios de cultivo. Gua general para el aseguramiento de la calidad para la
preparacin de los medios de cultivo en el laboratorio.

GTC 171, Microbiologa de alimentos y alimentos para animales. Gua para la preparacin y
produccin de medios de cultivo. Gua general para los ensayos de desempeo de medios de cultivo.

3. TRMINOS Y DEFINICIONES

Para los propsitos de este documento, se aplican los siguientes trminos y definiciones.

3.1 Enterobacterias. Microorganismos que forman colonias caractersticas sobre caldo violeta
rojo bilis glucosa, que fermentan la glucosa y presentan una reaccin negativa a la oxidasa,
cuando los ensayos se realizan segn los mtodos que se especifican en esta norma.

3.2 Deteccin de enterobacterias. Determinacin de la presencia o ausencia de estas
bacterias, en una cantidad particular de producto, cuando los ensayos se realizan de acuerdo
con esta norma.

3.3 Enumeracin de enterobacterias. Nmero ms probable de enterobacterias halladas por
ml o por gramo de muestra de ensayo, cuando los ensayos se realizan de acuerdo con el
mtodo que se especifica en esta norma.

4. PRINCIPIO

4.1 DETECCIN DE ENTEROBACTERIAS (VASE EL ANEXO A)

4.1.1 Pre-enriquecimiento en un medio no selectivo

El agua peptonada tamponada (APA) se inocula con la porcin de ensayo, luego se incuba a
37 C (o 30 C)
1)
durante 18 h 2 h.


3
4.1.2 Enriquecimiento en un medio lquido selectivo

El caldo de enriquecimiento [caldo de glucosa bilis verde brillante amortiguado (caldo EE)] se
inocula con el cultivo que se obtiene despus del pre-enriquecimiento, luego se incuba a 37 C
(o 30 C)
1)
durante 24 h 2 h.

4.1.3 Aislamiento y seleccin para la confirmacin

Un medio slido selectivo (agar violeta rojo bilis glucosa) se inocula con el cultivo que se
obtiene despus del enriquecimiento en el caldo EE. Despus se incuba a 37 C (o 30 C). Se
examina despus de 24 h 2 h para verificar la presencia de colonias presuntivas por sus
caractersticas para enterobacterias.

4.1.4 Confirmacin

Las colonias de enterobacterias presuntivas se subcultivan sobre un medio no selectivo y se
confirman por medio de ensayos para la fermentacin de glucosa y la presencia de oxidasa.

4.2 ENUMERACIN MEDIANTE LA TCNICA DE NMP (VASE EL ANEXO B)

4.2.1 Pre-enriquecimiento en un medio no selectivo

Se adiciona una porcin de ensayo de x g a 9 x ml de agua peptonada tamponada y se
homogeniza. Se preparan una o ms diluciones de potencia 10
n
(donde n es el nmero de
diluciones realizadas) en el agua peptonada tamponada (segn el nivel esperado de
contaminacin). Se trasfieren alcuotas (10 ml) de esta dilucin inicial a tres tubos. Luego se
aaden 3 ml x 1 ml de la dilucin inicial a 9 ml de agua peptonada tamponada y 3 ml x 1 ml de
cada dilucin adicional se agregan a 9 ml de agua peptonada tamponada. Estos tubos se
incuban a 37 C (o 30 C)
1)
durante 18 h 2 h.

4.2.2 Enriquecimiento en un medio lquido selectivo

Los tubos con caldo de enriquecimiento lquido (caldo EE) se inoculan con cada tubo de cultivo
obtenido despus del pre-enriquecimiento (por lo menos 3 x 3). Los tubos se incuban a 37 C
(o 30 C)
1)
durante 24 h 2 h.

4.2.3 Aislamiento y seleccin para la confirmacin

Se inocula un medio slido selectivo (agar violeta rojo bilis glucosa) con un asa proveniente de
cada uno de los cultivos incubados obtenidos despus del enriquecimiento en el caldo EE,
despus se incuban a 37 C (o 30 C)
1
. Se examina despus de 24 h 2 h para verificar la
presencia de colonias presuntivas por sus caractersticas para enterobacterias.

4.2.4 Confirmacin

Las colonias de enterobacterias presuntivas se subcultivan sobre un medio no selectivo y se
confirman por medio de ensayos para la fermentacin de glucosa y la presencia de oxidasa.

4.2.5 Clculo

El nmero ms probable de enterobacterias por ml o por gramo de muestra de ensayo se
calcula a partir del nmero de tubos positivos confirmados utilizando la tabla para NMP (vase
la NTC 4092).


4
5. DILUYENTE, MEDIO DE CULTIVO Y REACTIVO

Para la prctica actual del laboratorio, vase la NTC 4092, la GTC 78 y la GTC 171.

5.1 DILUYENTE: AGUA PEPTONADA TAMPONADA (APA)

Vase la NTC 4491-1, numeral 5.2.2.

El agua peptonada tamponada se usa como un medio no selectivo de pre-enriquecimiento para
el mtodo de enumeracin.

5.2 MEDIO DE CULTIVO

5.2.1 Medio de pre-enriquecimiento: caldo de glucosa bilis verde brillante amortiguado
(caldo EE)

5.2.1.1 Composicin

Producto de digestin enzimtica de tejidos animales 10,0 g

Glucosa 5,0 g

Disodio hidrgeno fosfato (Na
2
HPO
4
) 6,45 g

Potasio hidrgeno fosfato (KH
2
PO
4
) 2,0 g

Bilis de carne para uso bacteriolgico 20,0 g

Verde brillante (calidad bacteriolgica) 0,013 5 g

Agua 1 000 ml

5.2.1.2 Preparacin

Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua mediante ebullicin. No
caliente el medio por ms de 30 min. Enfre rpidamente el medio.

Ajuste el pH, si es necesario, de manera tal que despus de la ebullicin est en 7,2 0,2 a
25 C.

Dispense el medio en cantidades de 10 ml en tubos estriles con capacidad adecuada (vase
el numeral 6.5).

No esterilice el medio.

El medio se puede almacenar hasta por un mes a 5 C 3 C.

5.2.1.3 Ensayo de desempeo para aseguramiento de la calidad del medio de cultivo

Para la definicin de selectividad y productividad, consulte la GTC 78. Para los criterios de
desempeo, consulte la GTC 171 Tabla D.3.

5.2.2 Agar violeta rojo bilis glucosa (VRBG)


5
5.2.2.1 Componentes


Extracto de levadura 3,0 g

Sales de bilis No. 3 1,5 g

Glucosa 10,0 g

Cloruro de sodio 5,0 g

Rojo neutro 0,03 g

Cristal violeta 0,002 g

Agar 9 g a 18 g
a)

Agua 1 000 ml

a)
Dependiendo del potencial de gelificacin del agar.

5.2.2.2 Preparacin

Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua mediante ebullicin.

Ajuste el pH, si es necesario, de manera tal que despus de la ebullicin est en 7,4 0,2 a 25 C.

Dispense el medio de cultivo en tubos o frascos estriles (vase el numeral 6.5) que tengan
capacidad adecuada.

No esterilice el medio.

Utilice el medio fundido en un periodo mximo de 4 h a partir de su preparacin.

5.2.2.3 Preparacin de las cajas de Petri con agar

Transfiera inmediatamente 15 ml aproximados del medio de cultivo, enfriado a una temperatura
entre 44 C y 47 C (vase el numeral 6.4), a cajas de Petri (vase el numeral 6.7) y permita
que se solidifique.

Inmediatamente antes del uso, seque las placas, de preferencia sin las tapas y con la superficie
de agar hacia abajo, en una incubadora (vase el numeral 6.3) hasta que el agar est seco.

Si se preparan con anticipacin, las placas sin secar se pueden almacenar en condiciones que
no cambien su composicin hasta durante dos semanas a 5 C 3 C.


desempeo, consulte la GTC 171, Tabla D.1.


6
5.2.3 Agar nutritivo

5.2.3.1 Composicin

Extracto de carne 3,0 g



Agar 9 g a 18 g
a)

Agua 1 000 ml

a)

5.2.3.2 Preparacin

Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua, mediante calentamiento,
si es necesario.

Ajuste el pH, si es necesario, de manera tal que despus de la esterilizacin est en 7,3 0,2 a
25 C.

Dispense el medio de cultivo en tubos o frascos estriles (vase el numeral 6.5) que tengan
capacidad adecuada.

Esterilice durante 15 min en un autoclave (vase el numeral 6.1) ajustado a 121 C.

5.2.3.3 Preparacin de las cajas de Petri con agar

Transfiera porciones de 15 ml aproximadamente del medio de cultivo, fundido y enfriado hasta
aproximadamente 47 C, a cajas de Petri (vase el numeral 6.7) y permita que se solidifique.

Inmediatamente antes del uso, seque las placas, de preferencia sin las tapas y con la superficie
de agar hacia abajo, en un incubadora (vase el numeral 6.3) hasta que el agar est seco.

Si se preparan con anticipacin, las placas sin secar se pueden almacenar en condiciones que
no cambien su composicin hasta durante dos semanas a 5 C 3 C.


desempeo, consulte la GTC 171, Tabla D.1.

5.2.4 Agar de glucosa

5.2.4.1 Composicin


Extracto de levadura 1,5 g

Glucosa 10,0 g


7

Prpura de bromocresol 0,015 g

Agar 9 g a 18 g
a)

Agua 1 000 ml

a)

5.2.4.2 Preparacin

Disuelva los componentes o el medio completo deshidratado en agua, mediante calentamiento,
si es necesario.

Ajuste el pH, si es necesario, de manera tal que despus de la esterilizacin est en 7,0 0,2 a
25 C.

Dispense el medio de cultivo en tubos (vase el numeral 6.6) con capacidad adecuada (por
ejemplo, 10 ml de medio de cultivo para tubos de 16 mm x 160 mm).

Esterilice durante 15 min en autoclave (vase el numeral 6.1) ajustado a 121 C. Deje los tubos
en posicin vertical.

El medio se puede almacenar hasta por una semana a 5 C 3 C.

Con el fin de eliminar el oxgeno, inmediatamente antes del uso, caliente el medio en agua
hirviendo o en un flujo de vapor durante 15 min, luego enfre rpidamente hasta la temperatura
de incubacin.

5.3 REACTIVO DE OXIDASA

5.3.1 Composicin

N,N,N,N-Tetrametil-p-fenilenediamina dihidrocloruro 1,0 g

Agua 100 ml

5.3.2 Preparacin

Disuelva el componente en agua fra.

Prepare el reactivo inmediatamente antes del uso.

Se pueden utilizar las barras o discos disponibles en el comercio. En este caso, siga las
recomendaciones del fabricante.

6. EQUIPOS Y MATERIAL DE VIDRIO

Equipos comunes para el laboratorio microbiolgico y, en particular los siguientes (vase la
NTC 4092).


8
6.1 Equipos para esterilizacin seca (horno) o esterilizacin hmeda (autoclave). Vase la
NTC 4092.

6.2 Incubadora, con capacidad para operar a 37 C 1 C o con capacidad para operar a
30 C 1 C.

6.3 Incubadora para secado (ventilado por conveccin) o incubadora con capacidad para
operar a una temperatura entre 37 C y 55 C.

6.4 Bao de agua o equipo similar con capacidad de mantener una temperatura entre 44 C
y 47 C.

6.5 Recipientes (por ejemplo botellas, tubos, frascos) adecuados para esterilizar y
almacenar el medio de cultivo.

6.6 Tubos de ensayo, con dimensiones de 16 mm x 150 mm y 20 mm x 200 mm y frascos o
botellas con capacidad de 150 ml y 500 ml.

6.7 Cajas de Petri, de vidrio o plstico con dimetro de 90 mm a 100 mm.

6.8 Asas (con dimetro aproximado de 3 mm) y alambres elaborados de platino/iridio o
nquel/cromo, barras de cristal, asas desechables estriles equivalentes o agujas de
inoculacin.

6.9 Pipetas Graduadas, de 1 ml de capacidad nominal graduadas con divisiones de 0,1 ml y
con una abertura de salida de flujo de dimetro adecuado, o pipetas automticas debidamente
calibradas.

6.10 Medidor de pH con una exactitud de 0,1 unidad de pH a 25 C.

6.11 Homogeneizador. Vase la NTC 4092.

7. MUESTREO

Es importante que el laboratorio reciba una muestra que sea verdaderamente representativa
del producto y que no se haya deteriorado ni haya cambiado durante el transporte o el
almacenamiento.

El muestreo se debera realizar de acuerdo con la norma especfica para el producto en
cuestin. Si no existe tal norma, se recomienda que las partes interesadas logren un acuerdo
con respecto a este tema.

8. PREPARACIN DE LA MUESTRA DE ENSAYO

Prepare la muestra de ensayo de acuerdo con la NTC 4491 (Parte 1, 2, 3, 4 y 5), o la norma
especfica adecuada para el producto en cuestin. Si no existe tal norma, se recomienda que
las partes interesadas logren un acuerdo con respecto a este tema.


9
9. PROCEDIMIENTO

9.1 INFORMACIN GENERAL

Vase la NTC 4092.

Por lo general, el medio de cultivo se incuba a 37 C. Como alternativa, se puede utilizar una
temperatura de incubacin de 30 C.

9.2 MTODO DE DETECCIN

9.2.1 Porcin de ensayo y suspensin inicial

Tome una porcin de ensayo (x g o x ml) de acuerdo con la sensibilidad que se requiere y
homogenice en 9x ml de agua peptonada tamponada (vase el numeral 5.1). Transfiera el
volumen adecuado a un tubo o recipiente estril (vase el numeral 6.5) de acuerdo con el lmite
de deteccin que se requiere.

9.2.2 Pre-enriquecimiento no selectivo

Incubar la suspensin inicial (vase el numeral 9.2.1) a 37 C (30 C)
1)
durante 18 h 2 h.

9.2.3 Enriquecimiento selectivo

Transfiera 1 ml del cultivo obtenido en el numeral 9.2.2 a un tubo que contenga 10 ml del medio
de enriquecimiento (vase el numeral 5.2.1).

Incube el medio inoculado a 37 C (30 C)
1
durante 24 h 2 h.

Contine el procedimiento con aislamiento y seleccin para la confirmacin (vase el numeral 9.4).

9.3 MTODO DE ENUMERACIN (MTODO NMP)

9.3.1 Porcin de ensayo, suspensin inicial y diluciones adicionales

Dependiendo de la exactitud que se busca en los resultados, inocule una cantidad adecuada
de frascos o tubos con la misma dilucin (por ejemplo tres, cinco o diez frascos o tubos). Como
regla general, las tcnicas especficas requieren de tres frascos o tubos por cada dilucin.

Para la preparacin de las suspensiones iniciales y las diluciones adicionales, utilice el
diluyente (vase el numeral 5.1).

Para preparar la suspensin inicial, tome una porcin de ensayo de x g o x ml y homogenice en
9x ml de agua peptonada tamponada (vase el numeral 5.1). Se obtiene as una dilucin 10
-1
.

NOTA 10 ml de la dilucin 10
-1
contiene el equivalente de 1 g o 1 ml de muestra.

Prepare diluciones adicionales tomando 1 ml de la dilucin 10-1 y aada a 9 ml de agua
peptonada tamponada. Repita este procedimiento para elaborar las diluciones decimales
adicionales necesarias.

Transfiera tres volmenes de 10 ml de la suspensin 10-1 a tubos (vase el numeral 6.5).
Transfiera tres volmenes de 1 ml de cada dilucin posterior a tubos que contenga 9 ml de
agua peptonada tamponada (vase el Anexo B).


10
9.3.2 Pre-enriquecimiento no selectivo

Incube las suspensiones iniciales y las diluciones (9 tubos en total) (vase el numeral 9.3.1) a
37 C (30 C)
1
durante 18 h 2 h.

9.3.3 Enriquecimiento selectivo

Transfiera 1 ml de los cultivos obtenidos en el numeral 9.3.2 a tubos que contengan 10 ml del
medio de enriquecimiento (vase el numeral 5.2.1).

Incube los medios inoculados a 37 C (30 C)
1)
durante 24 h 2 h.

9.4 AISLAMIENTO Y SELECCIN PARA LA CONFIRMACIN

9.4.1 Aislamiento

Utilizando un asa (vase el numeral 6.8), siembre con el medio de enriquecimiento incubado
(vase el numeral 9.2.3) o con cada uno de los tubos incubados (vase el numeral 9.3.3) la
superficie de una placa que contenga el medio selectivo (vase el numeral 5.2.2) e incube la
placa a 37 C (30 C)1 durante 24 h 2 h.

9.4.2 Seleccin de las colonias para la confirmacin

Las colonias caractersticas son de color rosa a rojo o prpura (con o sin halos de
precipitacin).

Entre las placas incubadas (vase el numeral 9.4.1) en las cuales se desarrollaron colonias
caractersticas, seleccione una colonia caracterstica bien aislada para el subcultivo (vase el
numeral 9.5) para los ensayos de confirmacin bioqumica (vase el numeral 9.6).

Si en las colonias est presente ms de una morfologa, seleccione una colonia de cada
morfologa para el subcultivo.

Algunas enterobacterias pueden ocasionar decoloracin de sus colonias o del medio. Por lo
tanto, cuando no estn presentes colonias caractersticas, seleccione las colonias amarillentas
para la confirmacin.

9.5 SUBCULTIVO DE LAS COLONIAS SELECCIONADAS

Siembre en las cajas de Petri con agar nutritivo (vase el numeral 5.2.3) cada una de las
colonias seleccionadas para la confirmacin (vase el numeral 9.4.2).

Incube estas placas a 37 C (30 C)
1
durante 24 h 2 h.

Seleccione una colonia bien aislada de cada una de las placas incubadas para los ensayos de
confirmacin bioqumica (vase el numeral 9.6).

9.6 ENSAYOS DE CONFIRMACIN BIOQUMICA

9.6.1 Reaccin de oxidasa

Utilizando un asa de platino/iridio, un alambre o una barra de cristal (vase el numeral 6.8),
tome una porcin de cada una de las colonias bien aisladas (vase el numeral 9.5) y siembre
sobre papel filtro humedecido con el reactivo de oxidasa (vase el numeral 5.3) o sobre un


11
disco de los que se encuentran en el comercio. No se debe utilizar asas ni alambre de
nquel/cromo.

El ensayo se considera negativo si el color del papel filtro no se torna oscuro en un lapso de 10 s.

Consulte las instrucciones del fabricante para la utilizacin de los discos listos para usar.

9.6.2 Ensayo de fermentacin

Utilizando un asa (vase el numeral 6.8), introduzca las mismas colonias seleccionadas en el
numeral 9.5 que dieron un ensayo negativo para oxidasa en tubos que contengan agar glucosa
(vase el numeral 5.2.4).

Incube estos tubos a 37 C (30 C)
1
durante 24 h 2 h.

Si se presenta color amarillo en todo el contenido de los tubos, considere la reaccin como positiva.

10. EXPRESIN DE RESULTADOS

10.1 TUBOS POSITIVOS CONFIRMADOS

Si alguna de las colonias tpicas seleccionadas (vase el numeral 9.4.2) provenientes de un
subcultivo (vase el numeral 9.4.1), es negativa para oxidasa y positiva para glucosa, el tubo
del cual se deriv el subcultivo se debe considerar positivo para enterobacterias.

10.2 MTODO DE DETECCIN

De acuerdo con los resultados de la interpretacin (vase el numeral 10.1), indique la
presencia o ausencia de enterobacterias en una porcin de ensayo de x g o x ml del producto
(vase la NTC 4092).

10.3 MTODO DE ENUMERACIN: CLCULO DEL NMERO MS PROBABLE

Calcule el nmero ms probable a partir del nmero de tubos positivos en cada dilucin. Vase
la NTC 4092, numeral 9.4.

11. PRECISIN

Se sabe que se pueden presentar variaciones amplias en los resultados con la tcnica del
nmero ms probable. Los resultados obtenidos mediante este mtodo se deberan utilizar con
precaucin. Los lmites de confianza se indican en la NTC 4092, Anexo A.

12. INFORME DE ENSAYO

El informe de ensayo debe especificar:

- toda la informacin necesaria para la identificacin completa de la muestra;

- el mtodo de muestreo utilizado, si se conoce;

- el mtodo de ensayo utilizado, con referencia a esta norma;


12
- la temperatura de incubacin utilizada;

- todos los detalles operativos que no se especifican en esta norma o que se consideran
opcionales, junto con los detalles de todos los incidentes que pueden haber tenido
influencia en los resultados de ensayo;

- los resultados de ensayo obtenidos.


13
ANEXO A
(Normativo)

DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO PARA EL MTODO DE DETECCIN

Porcin de ensayo (1g o 1 ml) + 9 ml de agua
peptonada tamponada o porcin de ensayo
(x g o x ml) + 9 x ml de agua peptonada tamponada
Incube a 37 C (30 C) durante 18 h 2 h
1 ml de cultivo + 10 ml de caldo EE
Incube a 37 C durante 24 h 2 h
Siembre sobre placas que contengan agar VRBG
Seleccione las colonias caractersticas y
siembre sobre agar nutritivo
Confirme Enterobacterias Mediante
- Reaccin de oxidasa (-)
- Fermentacin de glucosa (+)


14
ANEXO B
(Normativo)

DIAGRAMA DEL PROCEDIMIENTO PARA LA TCNICA DE NMERO MS PROBABLE

Muestra
de ensayo
Sin adiciones
Adicione x g de la porcin de ensayo a 9x ml de
agua peptonada tamponada y homogenice.
Adicin de 1 ml
de la porcin de
ensayo a 9 ml de
agua peptonada
tamponada
y mezcle
10
3 x 10 ml
-1
10
3 x 10 ml
-1
10
3 x 10 ml
-1
Tubo
2
Tubo
1
Tubo
2
Tubo
3
Tubo
2
Tubo
1
Tubo
2
Tubo
3
Tubo
2
Tubo
1
Tubo
2
Tubo
3
Adicione 9 ml de agua peptonada tamponada y mezcle
Incube todos los nueve tubos inoculados a 37 C (o 30 C) durante 18 h 2 h
Subcultive 1 ml de cultivo para 10 ml de caldo de enriquecimiento
e incube a 37 C (o 30 C) durante 24 h 2 h
Siembre sobre placas que contengan agar VRBG e incube a 37 C (o 30 C
durante 24 h 2 h
Seleccione las colonias caractersticas y siembre sobre agar nutritivo
Confirme Enterobacterias Mediante
- Reaccin de oxidasa (-)
- Fermentacin de glucosa (+)


15
DOCUMENTO DE REFERENCIA

INTERNATIONAL ORGANIZATION FOR STANDARDIZATION. Microbiology of Food and
Animal Feeding Stuffs - Horizontal Methods for the Detection and Enumeration of
Enterobacteriaceae - Part 1: Detection and Enumeration by MPN Technique with Pre-
enrichment. Geneva: ISO, 2004, 12 p (ISO 21528-1:2004 (E)).

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