Tratat de Biotehnologie Cap.

4 Funciile materialului genetic

F

4 UNCIILE MATERIALULUI GENETIC
4.1 REPLICAREA ADN
Replicarea ADN reprezint transmiterea fidel a informaiei genetice la celulele fiice, n urma
diviziunii celulare. Replicarea este una dintre cele dou funcii eseniale ale materialului genetic. Mai
mult dect att, replicarea ADN este procesul de baz al continuitii vieii pe Pmnt.
4.1.1 Principalele etape ale replicrii ADN
Ca i alte procese din biologia molecular, i procesul de replicare se desfoar n 3 etape
iniierea, elongarea i terminarea :
Iniierea implic recunoaterea regiunii de pe o molecul ADN unde va
ncepe procesul de replicare
Elongarea cuprinde evenimetele ce se desfoar la o bifurcaie de replicare,
unde catenele parentale sunt copiate n catene fiice
Terminarea este o etap destul de puin cunoscut i se desfoar atunci
cnd molecula parenatl a fost complet replicat

Etapele chimice ale replicrii ADN

Din punct de vedere chimic, replicarea ADN presupune urmtoarele etape principale:
desfacerea iniial a dublului helix ntr-o zon denumit regiune de origine a replicrii
sinteza unor fragmente de ARN m.c. scurt ce ofer captul 3-OH liber pentru sinteza primelor
legturi fosfo-diesterice; aceste fragmente poart numele de primeri i sunt sintetizate de ARN
polimeraze speciale denumite primaze
n bucla de ADN desfcut procesul de replicare se va desfura n ambele direcii, formndu-se deci
2 bifurcaii de replicare
n faa fiecrei bifurcaii de replicare dublul helix va fi desfcut prin intervenia topoizomerazelor
(care dersucesc dublul helix) i a helicazelor (care desfac legturile de hidrogen dintre cele 2
catene); astfel, bucla de replicare se va lrgi n fiecare din cele 2 capete
fiecare din cele 2 catene ale helixului parental va servi drept matri pentru sinteza unei catene noi
sinteza catenelor noi se realizeaz de ctre enzime numite ADN polimeraze, pe baz de
complementaritate cu catena veche folosit ca matri; nucleotidele sunt legate ntre ele prin
formarea de legturi fosfo-diesterice; alungirea catenei noi se realizeaz n direcie 5 3
datorit faptul c ADN polimerazele nu pot sintetiza o caten nou dect n direcie 5 3, la
fiecare bifurcaie de replicare, sinteza celor 2 catene noi are loc oarecum diferit :
una din catenele noi este sintetizat continuu, pornind de la un singur primer: aceast caten este
denumit catena conductoare (leading) (Figura 4.1)
cealalt caten este sintetizat discontinuu, pe msur ce dublul helix parental este desfcut n
continuare; aceast caten este denumit caten ntrziat (lagging) i este format din multe
fragmente distincte, denumite fragmente Okazaki (de la numele celul care le-a descris prima oar)
de aproximativ 100 nucleotide; fiecare asemenea fragment este iniiat de la un primer
ntr-o faz mai avansat a replicrii primerii sunt ndeprtai att din structura catenei conductoare,
ct i din cea ntrziat, dup care golurile sunt umplute tot de o ADN polimeraz
aceste fragmente sunt apoi unite ntre ele prin refacerea legturilor fosfo-diesterice de ctre o ADN
ligaz
65
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

n timpul procesului de replicare monocatenele ADN (att cele vechi, ct i cele nou sintetizate)
sunt stabilizate i protejate de aciunea nucleazelor, de ctre o clas special de proteine numite
proteine Ssb (Single Stranded Binding)
terminarea replicrii unei molecule de ADN difer ntre moleculele circulare i cele lineare
la moleculele circulare, ntlnite n majoritatea cazurilor la cromozomul bacterian i la plasmide,
cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc ntr-o regiune denumit ter.
la moleculele ADN lineare din cromozomii de la eucariote, capetele acestora (telomerele) sunt
replicate printr-un mecanism diferit, iar fragmentele sunt apoi unite de ADN ligaze


Figura 4.1 Reprezentarea schematizat a unei bifurcaii de replicare.

Complementaritatea dintre bazele azotate de pe cele 2 catene ale moleculei de ADN determin
o structur perfect adaptat funciei de replicare, fiecare dintre cele 2 catene servind drept matri
pentru sinteza unei catene complementare.
In majoritatea cazurilor, replicarea se realizeaz pe model semiconservativ, macromoleculele
de ADN fiice fiind formate dintr-o caten veche i una nou (Figura 4.2).

Figura 4.2 Principalele trei modele de replicare a moleculelor ADN.

La majoritatea organismelor (chiar i la genomuri virale) replicarea ADN se desfoar
bidirecional, ceea ce presupune formarea a dou bifurcaii de replicare ce avanseaz de la secvena
de origine a replicrii (denumit secven oriC pentru cromozomul bacterian) ctre regiunea de
terminare a replicrii (denumit secvna ter n cromozomul bacterian).
66
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

Dei procesul de replicare a moleculelor de ADN se desfoar enzimatic n mod similar la
toate organismele, att la cele procariote, ct i la cele eucariote, totui exist suficiente diferene ntre
cele 2 tipuri principale de organisme.
Astfel, cromozomul bacterian este un replicon unic, adic are o singur secven de origine a
replicrii. n contrast, cromozomii de la eucariote sunt fiecare dintre ei structuri multirepliconice (au
mai multe regiuni de origine a replicrii ADN) (Figurile 4.3 i 4.4).




Figura 4.3 Replicarea bidirecional a unui cromozom
bacterian (A) i a unui cromozom de tip eucariot (B)
Figura 4.4 Reprezentarea schematic
a replicrii cromozomului bacterian.

Mai mult chiar, apar diferene i datorate structurii teriare. Cromozomul bacterian are o
structur circular i, ca urmare, cele 2 bifurcaii de replicare se ntlnesc la nivelul secvenei ter
(Figura 4.5). Cromozomul de tip eucariot are o structur linear, iar capetele lui (denumite telomere)
se replic diferit de restul cromozomului.













Figura 4.5. Imaginea de microscopie electronic i
reprezentarea schematizat a unei molecule
circulare de ADN n timpul replicrii.


67
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

4.1.2 Enzimologia replicrii cromozomului bacterian
Cercetrile asupra procesului de replicare a moleculei ADN precum i asupra enzimelor
implicate au debutat pe cromozomul de Escherichia coli i, ca urmare, majoritatea datelor
experimentale provin de la bacterii (Figura 4.6).
4.1.2.1 Complexul primozom
Complexul primozom este format dintr-o serie de proteine ce determin iniierea replicrii
ADN. Cele mai importante proteine sunt:
primaza: la bacterii este denumit DnaG i este codificat de gena dnaG; aceast
enzim sintetizeaz scurte fragmente de ARN ce au funcie de primeri, adic ofer capul 3-OH
liber pentru polimerizare.
proteinele de iniiere: n, n, n, DnaA, DnaB, DnaC i DnaT
Iniierea replicrii presupune detaarea secvenei oriC de membrana plasmatic, dup ce, n
prealabil, a fost atins o anumit mas celular (denumit mas de iniiere) i n urma acumulrii unei
cantiti substaniale de fosfolipide acide pe faa intern a membranei plasmatice.

Secvena oriC din cromozomul de E.coli are 245 bp i prezint 2 regiuni importante:
- o regiune cu 4 cutii dnaA (sunt formate din cte 9 bp, denumite 9-meri) la care se va
ataa proteina DnaA
- o regiune cu 3 cutii de tip 13-meri, bogate n adenin-timin, la care se vor ataa
complexe proteice DnaB-DnaC
Zece pn la 12 molecule de DnaA se leag la cutiile dnaA, determinnd buclarea moleculei
de ADN i, ca atare, desfacerea dublului helix n cutiile dnaB. Zonele monocatenare aprute se
complexeaz cu proteina DnaB (cu funcie de helicaz), adus de proteina DnaC. Ulterior, primaza
(DnaG) ncepe aici sinteza moleculelor de ARN primeri (Figura 4.7).



Figura 4.6 Reprezentarea schematic a unei bifurcaii de replicare.



Figura 4.7 Originea replicrii n cromozomul de E. coli.
68
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic


Figura 4.8 Structura regiunii de origine a
replicrii la drojdia de bere
(Saccharomyces cerevisiae).
(A) Structura secvenei ARS1, o secven ARS
tipic de la S.cerevisiae, cu poziionarea
secvenelor funcionale A, B1, B2 i B3.
Desfacerea dublului helix are loc n regiunea B2
prin ataarea proteinei ABF1 la regiunea B3.
Proteinele complexului de origine a replicrii
sunt ataate permanent la regiunile A i B1.


n procesul de replicare a ADN, n diverse etape, apar zone monocatenare ce sunt stabilizate
(i aprate) fa de aciunea nucleazelor prin ataare de proteine de tip Ssb (Single Stranded Binding
proteine ce se ataeaz la monocatene ADN).
4.1.2.2 Topoizomerazele
Superspiralizarea cromzomului bacterian impune intervenia unor enzime care s realizeze
relaxarea dublului helix ADN. Aceste enzime se numesc topoizomeraze i acioneaz asupra
topoizomerilor ADN (Figura 4.9). Topoizomerii sunt molecule ADN cu structur primar i secundar
identic i care difer n structura teriar.
Dou molecule ADN d.c. ce au aceeai secven de nuceotide dar numr diferit de nlnuiri i
suporarsuciri sunt topoizomere datorit diferenelor de natur topologic.
La bacterii, ca de altfel i la eucariote, exist 2 clase de topoizomeraze cu mecanisme diferite
de aciune (Figura 4.9) :
topoizomeraze tip I induc rupturi monocatenare (i tranzitorii) n ADN
topoizomeraze tip II induc rupturi bicatenare n ADN (Figura 4.10)
La bacterii, topoizomeraza de tip I cea mai bine caracterizat este TopA de la E.coli, care
relaxeaz suprarsuciri negative nalt rsucite. Topoizomerazele de tip II, n absena ATP, au rolul de a
relaxa macromolecula ADN ca i TopA, n timp ce n prezena ATP induc suprarsuciri negative n
moleculele circular covalent nchise (CCC) relaxate. Cea mai cunoscut enzim din aceast clas este
ADN giraza, care poate introduce aproximativ 100 de suprarsuciri negative per minut.


Figura 4.9 Desfacerea dublului helix ntr-o bifurcaie de replicare, prin aciunea topoizomerazelor.

69
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic


Figura 4.10 Modul de aciune al ADN topoizomerazelor de tip I i II.
(A) Topoizomerazele de tip I realizeaz ruperi monocatenare, conduc catena intact prin aceast rupere, refcnd
apoi legtura fosfo-diesteric. (B) Topoizomerazele de tip II taie ambele catene dintr-un dublu helix; prin acest
spaiu este trecut un alt fragment al dublului helix, iar apoi se refac cele 2 legturi fosfo-diesterice.



Figura 4.11 Rolul secvenelor terminator i al proteinelor Tus n replicarea cromozomului la E.coli.
4.1.2.3 ADN polimeraze
Procesul de replicare propriu-zis a ADN este realizat de un complex de enzime denumite
ADN polimeraze. Cea mai important activitate enzimatic desfurat de o asemenea enzim este
formarea de legturi fosfo-diesterice ntre nucleotide adiacente, cu creterea lanului n direcie 5 3.
Toate ADN polimerazele descrise pn n prezent polimerizeaz n direcie 5 3 i nu pot
realiza acest proces dect pornind de la capul 3OH liber al unei nucleotide. De obicei, acest cap este
oferit de un scurt fragment monocatenar de ARN denumit primer.
La bacterii au fost descrise 3 tipuri de ADN polimeraze ce coexist n aceeai celul:
70
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

ADN polimeraza I (ADN pol I) este codificat de gena polA i are o g.m. de aprox 100 Md.
n celula de E.coli exist circa 400 molecule de ADN pol I care are o vitez de polimerizare de 667
nucleotide / min. n afar de activitatea de polimerizare, aceast enzim poate desfura i activitate de
exonucleaz (adic de desfacere de legturi fosfo-diesterice i eliminare de nucleotide dintr-o caten).
Astfel, ADN pol I are un domeniu polipeptidic ce realizeaz activitate exonucleazic n direcie 3 5
, activitate foarte important ce i asigur enzimei i posibilitatea de a i corecta singur eventualele
erori de ncorporare a unor nucleotide mperecheate greit. Aceast funcie este denumit citire
corect (proof-reading). Totodat, ADN pol I poate desfura i activitate exonucleazic n direcie
5 3, activitate ce i permite ndeprtarea primerilor ARN.
ADN polimeraza II (ADN pol II) este codificat de gena polB. i aceast enzim poate avea
i activitate exonucleazic 5 3.
ADN polimeraza III (ADN pol III) este principala replicaza a cromozomului bacterian i
reprezint un adevrat complex enzimatic format din cel puin 10 subuniti funcionale (Tabelul din
Figura 4.12).

Figura 4.12 Subunitile ADN polimerazei III de la procariote.
Denumirea
subunitii
Masa
molecular
Gena Funcii Subansamblu
130 pol C (dnaC) ADN pol Exo 5 3
27 dnaQ Exo 3 5
10 holE structural

Miezul enzimei

71 dnaXZ Dimerizarea miezului
enzimei
complexul
47 dnaXZ
35 holA
33 holB
15 holC
12 holD
ATPaze complexul
favorizeaz transferul sub.
la matria ADN
40 dnaN Leag miezul enzimei
la ADN i l
recicleaz
complexul

Holoenzima ADN pol III acioneaz ca dimer, fiecare din cei 2 monomeri realiznd sinteza pe
una din cele 2 catene. O excepie o reprezint complexul care acioneaz doar pe catena ntrziat.


Figura 4.13 Reprezentarea schematizat a interveniei subunitilor ADN polimerazei la eucariote.
71
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

4.1.3 Replicarea plasmidelor bacteriene
Indiferent dac confer bacteriei gazd caractere eseniale sau neeseniale, toate plasmidele au
n structura lor o regiune foarte important pentru replicarea i meninerea stabil a plasmidului
respectiv n populaia bacterian. n prezent se consider c aceast regiune esenial ar conine:
a) secvene de origine a replicrii plasmidiale, denumite convenional oriV (fata de oriC
- originea replicrii cromozomului bacterian); o secven oriV trebuie s indeplineasca
urmatoarele conditii:
- regiunea ADN minimal, cu activitate n cis, ce poate sustine replicarea plasmidial
- regiunea ADN n care cele 2 catene se despart pentru a iniia procesul de replicare
- nucleotidul/nucleotidele la care incepe sinteza catenei leading
b) multe plasmide codific o protein implicat n iniierea replicrii plasmidiale,
denumita proteina de tip Rep
c) gene implicate n controlul replicrii plasmidiale
4.1.3.1 Replicarea plasmidelor lineare (ADN d.c. linear)
n ceea ce privete replicarea plasmidelor lineare, aceasta se desfoar prin mecanisme
diferite funcie de tipul de telomere.
a) plasmide cu telomere hairpin
Datorit capetelor legate covalent, ADN polimeraza poate trece peste ele continund
replicarea printr-un intermediar replicativ concatemeric. Asemenea plasmide ar putea
reprezenta un caz special de plasmide circulare monocatenare, n care jumtate din cerc este
complementar cu cealalt jumtate.

b) plasmide cu telomere invertroni
se replic printr-un mecanism de replicare ADN primat de proteine, n cazul de fa
proteina TP (Telomeric Protein). n cazul unor asemenea plasmide, telomerele reprezint
originea replicrii i sunt recunoscute de proteine de iniiere care desfac dublul helix ADN.
Plasmidele cu telomere invertroni sunt replicate de o ADN polimeraz ce seamn mai mult cu
ADN polimeraza de la eucariote, dect cu ADN polimerazele de la procariote.
Ultima nucleotid de la capul 5 al fiecarei din cele 2 catene (nucleotida la care este ataat
covalent proteina TP), este o adenin (A). Separat de molecula plasmidial, se formeaz
complexe din alt monomer TP i alt molecul de adenin. Cei 2 monomeri TP (unul ataat la o
adenin, iar cellalt ataat la adenina din telomera plasmidial) se atrag i are loc procesul de
dimerizare, iar ntre A i primul nucleotid (T) de pe catena complementar se formeaz legturi
de hidrogen. Tototdat, acest al doilea A ofera capul 3 liber pentru primarea polimerizarii
(Figura 4.14).


Figura 4.14 Replicarea plasmidelor lineare cu telomere invertroni.

72
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

4.1.3.2 Replicarea plasmidelor circulare.
Au fost descrise 3 mecanisme generale de replicare a plasmidelor circulare .
4.1.3.2.1 Mecanismul THETA
Acest mecanism prezint asemnri foarte mari cu procesul de replicare a cromozomului
bacterian. Ca i n cazul acestuia, acest mecanism poart numele de theta datorit faptului c
intermediarii de replicare sunt molecule cu forma literei grecesti theta. Mecanismul theta de replicare
se intlnete cu precdere la plasmidele de la bacteriile Gram-negative, dar i la unele plasmide de la
Gram-pozitive (streptococ, enterococ, unii lactococi).
Replicarea acestor plasmide necesit o protein iniiator, codificat plasmidial i denumit
proteina Rep, iar procesul pornete de la o regiune denumita oriV, ce are organizare similar cu oriC
din cromozomul bacterian.
Intreg procesul de replicare de tip theta depinde de mai multe clase de proteine, din care ns
doar proteinele de tip Rep sunt codificate plasmidial, celelalte sunt codificate cromozomal i sunt
aceleasi proteine ce intervin i n replicarea cromozomului bacterian. O excepie o reprezint
plasmidul Col E1, care se replic printr-un mecanism de tip theta, dar nu necesit prezena unei
proteine iniiator de tip Rep.
La plasmidele ce se replic prin mecanism theta, regiunea oriV cuprinde: 4-5 secvene ADN
n repetitie direct i denumite iteroni, la care se ataeaz proteina Rep (iteronii exist i n cazul
celorlalte dou mecanisme de replicare plasmidial), o regiune bogat n A/T, unde este iniiat
desfacerea dublului helix, cutii dnaA, la care se ataeaz proteina DnaA.
Proteinele Rep sunt proteine de tip leucine-zipper cu un domeniu HTH (-helix-
turnhelix) i se ataeaz la ADN intr-o manier situs-specific, i anume la secvenele iteroni.
Ataarea se realizeaz astfel nct moleculele Rep sunt aliniate pe aceeai fa a moleculei ADN.

Etape
Procesul de replicare a plasmidelor prin mecanism theta se desfoar n urmatoarele etape :
a) n prima etap are loc ataarea proteinelor Rep la secvenele iteroni; acest lucru determin
o curbare a moleculei ADN n aceast zon, fapt ce faciliteaz etapa urmtoare;
b) ataarea proteinelor DnaA la cutiile dnaA; la rndul ei, aceast etap o faciliteaz pe
urmtoarea;
c) ataarea complexului proteic DnaB-DnaC la regiunea din oriV bogat n A/T; DnaB este
o helicaz i desface dublul helix n aceast zon;
d) are loc sinteza unui ARN primer de ctre o ARN polimeraz codificat de o gen
cromozomal;
e) incepe procesul de polimerizare desfurat, la majoritatea plasmidelor din aceast clas,
de ctre ADN polimeraza III (excepie face plasmidul Col E1, care este replicat prin mecanism theta,
dar de ctre ADN polimeraza I);
f) sinteza celor 2 catene (leading i lagging) este cuplat i se desfoar cvasi-simultan;
g) sinteza se desfoar n majoritatatea cazurilor unidirecional, spre deosebire de replicarea
cromozomului bacterian care la marea majoritate a speciilor bacteriene se desfoar bidirecional.
Dintre cele mai cunoscute plasmide ce se replic prin mecanism theta, amintim pSC101, P1,
RK2, RP4, R6K, R1, CColE2, ColE3.
4.1.3.2.2 Mecanismul STRAND-DISPLACEMENT (SD)
Denumirea provine din termenul strand-displacement (dislocarea catenei) i se refer la faptul
c n timpul procesului de replicare are loc dislocarea uneia din cele 2 catene ADN. Acest mecanism
se ntlnete mai ales la plasmidele promiscue din grupul de incompatibilitate IncQ. La aceste
plasmide regiunea oriV este alcatuit din 3 secvene ADN de tip iteroni, 1 regiune bogat n G/C (174
bp), 1 regiune bogat n A/T (31 bp)
Procesul de replicare ADN de tip strand-displacement nu depinde de proteine ale celulei
gazd (codificate cromozomal, cum ar fi DnaA, DnaB, DnaC), ci de trei proteine codificate
plasmidial:
RepA este o helicaz ce intra n dublul helix ADN n regiunea bogat n A/T i faciliteaza
dislocarea catenei parentale nereplicate sub forma buclei D (forma literei D);
73
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

RepB este o primaz care sintetizeaz un primer ARN necesar iniierii polimerizrii ADN;
RepC este o protein iniiator care se ataeaz la secvenele iteroni din oriV.
Replicarea pornete de la dou origini (ssiA i ssiB) simetrice i adiacente, ce funcioneaz n
forma monocatenar i sunt situate pe cele 2 catene. Procesul de replicare ncepe cnd aceste 2 origini
sunt expuse monocatenar.

Etape
Procesul de replicare SD se desfoar n urmtoarele etape:
1. monomeri ai proteinei RepC se ataeaz la secvene iteroni din oriV;
2. proteina RepA (helicaza) se ataeaz la regiunea din oriV bogat n A/T, determinnd
desfacerea dublului helix;
3. proteina RepB (primaza) se ataeaz la bucla A/T i sintetizeaz un primer ARN;
4. ncepe procesul de polimerizare ADN;
5. helicaza RepA faciliteaz dislocarea catenei parentale nereplicate sub forma unei bucle D.
Produsele intermediare ale unui proces de replicare SD sunt:
- o molecul ADN circular d.c.
- o molecul ADN circular m.c. pe aceasta va fi iniiat un nou proces de replicare
care va conduce la formarea catenei complementare, i deci, a formei dublucatenare a
plasmidului.

n cazul unui asemenea mecanism de replicare sinteza celor dou catene noi ale moleculei de
ADN nu este cuplat i simultan.
4.1.3.2.3 Mecanismul ROLLING-CIRCLE (RC)
Denumirea provine din faptul c n timpul procesului, molecula de ADN are forma unui cerc
rotativ. Acest mecanism de replicare este ntlnit la plasmide din multe bacterii Gram-pozitive, de
exemplu plasmidul pT181 (de la Staphylococcus), pUB110 i pC194 (de la Bacillus subtilis).
Ca i n cazul mecanismului SD, replicarea de tip RC depinde de o protein iniiator codificat
plasmidial (propteina Rep) i de o serie de proteine codificate pe cromozomul bacterian.
Plasmidele ce se replic prin mecanism RC au doua secvene ori situate distanat una de alta:
dso (double-stranded origin), de la care este iniiat replicarea primei catene noi (catena
leading); dso are 2 regiuni: regiunea bind, la care are loc ataarea proteinei iniiator Rep i
regiunea nick, n care proteina Rep produce ruptura monocatenar initial
sso (single-stranded origin), de la care este iniiat sinteza celei de-a doua catene noi (catena
lagging)

Etape
n procesul de replicare RC se parcurg urmtoarele etape:
- proteina Rep se ataeaz la regiunea bind a secvenei dso;
- proteina Rep taie o legtur fosfodiesteric (ruptur monocatenar) i rmne ataat la
capul 5 Tyr-fosfodiesteric; capul 3 va servi ca primer pentru sinteza catenei leading;
- n procesul de sintez a catenei leading intervin o serie de proteine codificate pe
cromozomul bacterian: helicaza, Ssb, ADN polimeraza III;
- replicarea catenei leading continu mai mult de o rund complet depind regiunea dso;
- pentru terminarea replicrii catenei leading are loc o reacie de transfer de caten: prin
monomerul liber, proteina Rep atac regiunea dso a catenei vechi, taie o legatur fosfodiesteric i
reface alta, rezultnd o molecul circular d.c. care a eliberat i un dimer de Rep inactiv i, respectiv, o
molecul circular m.c. pe care, de la sso, este sintetizat un primer i apoi o caten noua
Deci, i n cazul acestui mecanism sinteza celor dou catene ADN noi nu este cuplat.
Intr-un asemenea proces proteina Rep are un rol mai complex dect ntr-o replicare SD :
- se ataeaz la dso, avnd rol n iniierea replicrii;
- taie o legtur fosfodiesterica, producnd nick-ul iniial;
- la terminarea sintezei primei catene noi, Rep taie i reface legturi fosfodiesterice
Datorit activitatii sale catalitice, proteina Rep de la plasmidele ce se replic printr-un
mecanism RC este similar cu topoizomerazele din clasa I.
74
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

n general, plasmidele ce se replic prin RC au o alctuire modular, cel mai important modul
fiind LIC (Leading strand Initiation and Control region) care este format din dso, gena rep i
elemente de control al replicrii plasmidei. Pe baza structurii LIC au fost definite 4 familii de plasmide
ce se replic prin mecanism RC, familii ce au drept reprezentani urmatoarele plasmide: pT181,
pC194, pMV158, pSN2. Alte module importante n aceste plasmide sunt: 1-2 sso, 1 mob, 1 gen de
antibiorezisten.
4.1.3.3 Mecanisme de control al replicrii ADN plasmidial
Replicarea acestor plasmide se desfoar unidirecional i este realizat de ADN polimeraza
I i nu de ADN pol III care replic cromosomul bacterian.

Plasmidele din familia Col E1

Procesul de replicare ncepe cu sinteza unui ARN primer (=ARN II), ce este transcris
ncepnd de la un situs localizat la 555 pb n amonte fa de oriV. Iniial, acest transcript este separat
de ADN, ca n cazul unei transcrieri obinuite. Pe msur ce ARN polimeraza se apropie de oriV,
transcriptul ncepe s ramn hibridizat cu matria ADN; cauza probabil: ARN II contine 6 G
consecutive situate la circa 265 nucleotide n amonte fa de oriV; aceste 6 G interacioneaz probabil
cu 6 C consecutive din ADN matri, ce se gsesc la cca 20 nucleotide n amonte fa de oriV. Apoi
hibridul este tiat de RNaza H, iar capul 3 al ARN va fi elongat de ADN pol I.
O modalitate de control negativ al replicrii plasmidelor din familia Col E1 este prin formarea
unui al doilea ARN (=ARN I), care are funcie de ARN antisens, contine 108 nucleotide i este
transcris de la -445 fa de oriV, dar n direcie opus, de pe cealalt caten ADN.
Prin legarea lui ARN I (antisens) de ARN II (primer) este alterat conformaia secundar a
acestuia din urm, astfel nct ARN primer nu mai poate hibridiza cu oriV.
Acest ARN antisens este transcris constitutiv, dar este instabil, iar legarea lui la ARN II este
mediat de o protein numit Rop (codificat de gena rop).
Aplicarea unui inhibitor al sintezei proteice (de exemplu, cloramfenicolul) blocheaz sinteza
proteinei Rop, rezultatul fiind o crestere a frecvenei de iniiere a replicrii plasmidelor Col E1. Acest
lucru se bazeaz pe faptul c n citoplasma bacterian exist suficiente molecule de ADN pol I (cca
300), chiar dac este blocat proteosinteza.

pSC101

Prima citare a lui pSC101 n literatura de specialitate a fost n 1973 - Cohen care a folosit-o ca
vector n experimente de clonare. Ulterior ns, aceast plasmid a fost identificat ca plasmid
natural la Salmonella i Escherichia coli. Ea prezint un numr mediu de copii (6-7) per echivalent
cromosomal i are o gen de rezisten la tetraciclin. ntreaga plasmida (9263 pb) a fost complet
secveniat.
Regiunea replicativ a acestei plasmide are 3 zone majore:
(1) regiunea par - foarte important pentru stabilitate i afecteaz i numrul de copii;
(2) regiunea ori - de la care pornete replicarea unidirecional i care conine
majoritatea situsurilor necesare pentru replicare i pentru incompatibilitate;
(3) gena repA - care este o gen specific plasmidial i codific o protein de
replicare.
pSC101, mpreun cu fagul P1 i cu o serie de alte plasmide (F, R6K), aparine unei clase de
repliconi a caror replicare nu este realizat de ADN polimeraza I. Aceti repliconi codific o protein
autoreglat (RepA) esenial pentru replicare i poseda copii repetate direct ale unei secvene ce este
specific pentru fiecare plasmid i la care se ataeaza proteina RepA. RepA se ataeaz la cele 3
secvene RS din regiunea ori , participnd la iniierea replicrii.






75
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic












Figura 4.15 Controlul replicrii la plasmidul Col E1.

Meninerea stabil a lui pSC101 n celula bacterian presupune intervenia a mai multor clase
de proteine: DnaA (esenial i n iniierea replicrii cromosomului bacterian), IHF (Integration Host
Factor, protein histone-like implicat n reglarea unei serii de procese celulare), DnaB, DnaC,
DnaG (primaza), componente ale holoenzimei ADN polimeraza III.
Regiunea ori din plasmidul pSC101 conine situsuri multiple de legare pentru proteine
eseniale n replicarea plasmidial:
- un situs de ataare a proteinei DnaA
- 2 secvene repetate, formate din cte 13 pb (13-mer), omoloage cu secvenele din
oriC i la care se ataeaz complexul DnaB-DnaC
- o regiune bogat n A/T
- ntre regiunea A i regiunea T se gasete situsul pentru IHF
- un cluster de 3 secvene repetate direct RS1 (24 pb), RS2 (18 pb), RS3 (24 pb) la
care se atasaza proteina RepA
- ARN polimeraza se ataeaza la un promotor localizat n i ntre aceste 3 secvene
RS (promotorul pentru ARN-Y)
Procesul de transcriere n regiunea oriV i implicat n iniierea replicrii este un fenomen
extrem de frecvent n lumea bacterian, att pentru replicarea cromosomului, ct i a unor plasmide. n
cazul lui pSC101, printr-un asemenea proces de transcriere la origine, este sintetizat ARN-Y care
ncepe din mijlocul lui RS2. Acest proces nu se afl sub controlul proteinei RepA, iar rolul moleculei
ARN-Y pare s fie acela de a facilita deschiderea dublului helix ADN n regiunea ori.
Regiunea par nu este esenial pentru replicare (plasmidele par
-
se replic), dar este esenial
pentru stabilitatea plasmidelor n celula bacterian, probabil prin situsul pentru giraza.
76
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

Legarea simultan a proteinelor Rep A, IHF, Dna A, DnaB-Dna C este favorizat de curbarea
ADN determinat de legarea IHF (curbeaza dublul helix ADN cu150
o
la situsul de atasare), i
determin formarea REPLISOMULUI.
Reglarea numrului de copii plasmidiale la pSC101 i, probabil, i la alte plasmide i sisteme
similare, nu este produsul unui singur mecanism de reglare, ci este o rezultant a unui set de
interaciuni moleculare (ADN-proteine, ADN-ADN, proteine-proteine), fiecare dintre ele contribuind
la replicarea, stabilitatea i partiia eficient a plasmidului.



Figura 4.16 Structura regiunii replicative la plasmidul pSC101.
4.2 TRANSCRIEREA GENETIC
Principii i definiii

Transcrierea genetic reprezint procesul de sintez, catalizat enzimatic, a moleculelor de
ARN, ca urmare a citirii informaiei codificate n molecule ADN. Procesul se desfoar pe baza
legilor de complementaritate chimic dintre cele 2 catene ale unei molecule de acid nucleic dublu
catenar i conduce la formarea de legturi fosfo-diesterice ntre ribonucleotide.
Prin transcriere genetic se sintetizeaz toate tipurile de molecule ARN proprii celulelor, att
la organisme procariote, ct i la eucariote, i anume: ARN mesager (ARNm), ARN ribozomal
(ARNr), ARN de transfer (ARNt), ARN heterogen nuclear (ARNhn).
Molecula ARN rezultat prin transcriere, nainte de orice alt procesare, poart numele de
transcript primar.
Procesul de transcriere a unei poriuni din ADN (denumit gen) presupune deci sinteza unei
copii a informaiei genetice, copie care din punct de vedere chimic este o molecula de acid nucleic
monocatenar, i anume ARN.
Transcrierea ncepe n anumite zone din molecula ADN, zone numite promotori. Acetia au
anumite secvene de nucleotide care i fac uor de recunoscut de ctre ARN polimeraze (enzimele ce
sintetizeaz molecule de ARN). n zona promotorilor dublul helix ADN este desfcut de ctre ARN
polimeraze, formndu-se o aa-numit bucl de transcriere. n interiorul acesteia, ARN polimeraza
sintetizeaz o molecul de ARN, copiind informaia genetic de pe una din catenele ADN pe care o
folosete ca matri.
Primul nucleotid de pe catena ADN matri care este citit i cruia i corespunde un prim
nucleotid n catena ARN, este numerotat convenional cu +1 i denumit startpoint (punct de pornire a
transcrierii). Urmtoarele nucleotide din matria ADN sunt numerotate +2, +3, +4 etc.
Fa de poziia nucleotidului +1, se definesc 2 zone n matria ADN :
- zona amonte (upstream), n care nucleotidele sunt numerotate cu semnul minus (-1, -2, -3
etc)
- zona aval (downstream), n care nucleotidele sunt numeortate cu semnul plus (+2, +3, +4 etc)
77
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

Procesul de transcriere pornit de la promotori continu pn n anumite zone din ADN, cu
anumite secvene, zone denumite terminatori. n aceste zone, ADN polimeraza se desprinde de pe
molecula de ADN, bucla de transcriere format n dublul helix ADN se nchide, iar transcriptul ARN
este eliberat.
O zon din ADN cuprins ntre un promotor i un terminator poart numele de unitate de
transcriere. Din cele 2 catene ale moleculei de ADN, catena care este folosit ca matri pentru
sinteza unui transcript ARN este complementar cu aceasta i este numit caten antisens. Catena ne-
matri este denumit caten codificatoare sau caten sens.
Admind c o gen reprezint o zon din ADN (sau mai exact, secvena de nucleotide de pe
una din catenele ADN dintr-o anumit zon) ce codific un polipeptid (sau o molecul de ARNr,
ARNt ARNhn), o unitate de transcriere poate include :
- o singur gen, caz n care se numete transcriere monocistronic
- sau mai multe gene, caz n care se numete transcriere policistronic
Dei exist i destule excepii, n general, transcrierea monocistronic este caracteristic
organismelor eucariote, iar cea policistronic procariotelor (Figura 4.16)


Figura 4.17 Reprezentarea schematizat a unui proces de transcriere monocistronic i, respectiv, policistronic.
4.2.2 Enzime
Procesul de transcriere genetic este catalizat de o clas special de enzime numite ARN
polimeraze.
La organismele procariote eixst cte o singur specie molecular de ARN polimeraz per
celul, aceasta realiznd sinteza tuturor tipurilor de ARN din celul.
La eucariote, majoritatea celulelor dein cte 3 specii moleculare de ARN polimeraze, fiecare
dintre ele sintetiznd anumite specii de ARN.
4.2.3 Transcrierea la procariote
4.2.3.1 Promotori
Promotorii reprezint secvene din structura ADN, aflate n amonte fa de ogen, la care se
ataeaz n mod situs-specific (n funcie de secvena de nucleotide) ARN polimeraza.
Un promotor de la procariote prezint 4 regiuni importante din punct de vedere funcional :
- o secven hexameric (adic format din 6 perechi de baze) n jurul poziiei -35; este
denumit generic hexamerul -35
- o secven hexameric n jurul poziiei -10, denumit generic hexamerul -10
- o regiune spaiatoare ntre cei 2 hexameri (ADN spacer)
78
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

- o regiune situat ntre poziiile -40 i -60, bogat n A i T, denumit elementul UP
(Upstream = amonte)

Cei 2 hexameri i elementul UP au secven de nucleotide nalt conservat, secvenele
consensus fiind 5-TTGACA-3 pentru hexamerul -35 i, respectiv, 5-TATAAT-3 pentru hexamerul
-10 (Figura 4.18).
Cu ct secvenele de nucleotide din cei 2 hexameri sunt mai apropiate de cele de mai sus, cu
att tria promotorului respectiv este mai mare, adic cu att ARN polimeraza se va ataa mai strns i
cu att gena respectiv va fi transcris cu o rat mai ridicat.
Cei 2 hexameri din promotori sunt recunoscui de subunitatea ARN polimerazei, iar la
elementul UP se ataeaz subunitatea -CTD a acestei enzime.


Figura 4.18 Structura promotorilor la procariote.
4.2.3.2 Terminatori
Transcrierea genetic continu de la promotori pn la terminatori. Acetia reprezint regiuni
din molecula ADN ce prezint o anumit secven de nucleotide:
- 2 copii ale unei secvene poli-GC n repetiie invers; aceast regiune prezint
complementaritate intracatenar i determin formarea n transcriptul ARN a unei structuri n ac-de-
pr (hairpin) ce mpiedic avansarea ARN polimerazei
- o regiune format din 4 10 adenine (ce corespunde pe transcript cu 4 10 resturi de uracil)
care reprezint semnalul propriu-zis de terminare a transcrierii
Dei regiunile terminator sunt identificate pe molecula ADN, terminarea transcrierii este de
fapt realizat de catena ARN (Figura 4.19).
Pn n prezent au fost identificate 2 clase de terminatori la procariote:
- terminatori Rho independeni : sunt regiuni de tip terminator n care cele 2 secvene poli-
GC prezint complementaritate intracatenar perfect, realiznd o structur n ac-de-pr stabil
- terminatori Rho dependeni : sunt regiuni terminator n care cele 2 poli-GC nu prezint
complementaritate intracatenar perfect; n acest caz structura n ac-de-pr este stabilizat de ctre o
protein numit proteina Rho (de la litera greceasc Rho - ) care alunec pe molecula ARN pn la
acul-de-pr i l stabilizeaz.


Figura 4.19 Structura terminatorilor la procariote.
79
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

4.2.3.3 ARN polimeraza de la procariote
Aceast enzim este una dintre cele mai mari proteine din celula bacterian, avnd o greutatea
de 480 kd, un diametru de aproximativ 100 Angstromi i fiind vizibil i la microscopul electronic. O
celul de E.coli conine n medie 7000 de molecule de ARN polimeraz.
Holoenzima este format din 4 tipuri de subuniti:, b, b i . Subunitatea este dimerizat,
formul general a enzimei fiind 2a .
Subunitatea este codificat de gena rpoA i este dimerizat. Ea are un prim rol n
asamblarea tuturor subunitilor enzimei, proces ce se desfoar n ordinea: 2 2- 2-
- 2---. Fiecare monomer de este format din 3 regiuni:
CTD reprezint domeniul carboxi-terminal al subunitii i se ataeaz direct la
ADN, recunoscnd secvena UP din structura promotorilor.
NTD reprezint domeniul amino-terminal al subunitii; nu se ataeaz direct la
ADN, ci la subunitatea
- linker polipeptidic ce are o structur flexibil i face legtura dintre cele 2 domenii
terminale
Subunitatea este codificat de gena rpoB i realizeaz formarea propriu-zis a legturilor
fosfo-diesterice ntre ribonucleotide, acest proces desfurndu-se ntotdeauna n direcie 5 3.
Subunitatea este codificat de gena rpoC i are rol n ataarea iniial, situs-nespecific a
ARN polimerazei la molecula de ADN (Figura 4.20).
Subunitatea
Celula procariot conine mai multe specii moleculare de subunitate , fiecare recunoscnd
anumii promotori i, deci, transcriind anumite gene. Astfel, n celula de E.coli, cele mai des ntlnite
specii moleculare de sunt:
70 are o g.m. de 70 kd i codificat de gena rpoD; acest recunoate cele 2 secvene
consensus TTGACA i TATAAT, fiind folosit de celula bacterian n condiii generale de mediu. Ca
urmare, marea majoritate a genelor bacteriene sunt transcrise cu ajutorul acestei subuniti 70.
60 are g.m. 60 kd, este codificat de gena rpoN i este folosit de celul n condiii de
privare de azot.
32 are g.m. de 32 kd, este codificat de gena rpoH i este folosit de celul n condiii de oc
termic; cu ajutorul acestei subuniti sunt transcrise genele de oc termic.
24 are g.m. 24 kd, nu este cunoscut gena codificatoare i este folosit de celul n condiii
de oc termic extrem; se pare c 24 particip la transcrierea unui set de gene ce determin o moarte
celular programat, o sinucidere celular (asemntoare proceselor de apoptoz de la celulele
eucariote).


Figura 4.20 Reprezentarea schematic a atarii ARN polimerazei procariote la promotori.



80
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

4.2.3.4 Fazele transcrierii genetice la procariote
Ca i alte procese realizate de materialul genetic, transcrierea genetic se desfoar n 3 etape
iniierea, elongarea i terminarea transcrierii.

Iniierea transcrierii
Aceast etap ncepe prin ataarea ARN polimerazei la un promotor, proces ce se desfoar
el nsui n mai multe etape:
a) etapa de promotor nchis I ARN polimeraza se ataeaz la hexamerul -35
b) etapa de promotor nchis II (promotor curbat) ARN polimeraza se ataeaz apoi i la
hexamerul -10; cei 2 hexameri nu sunt ns orientai steric optim fa de situsurile de ataare la ARN
polimeraz (i anume lla subunitatea s); ca urmare, pentru a se ataa la amndoi hexamerii, enzima
trebuie s distorsioneze molecula de ADN; deci, promotorul curbat prezint o tensiune torsional ce va
fi eliberat prin deschiderea dublului helix pe o distan de 10 18 pb, ajungndu-se astfel n cea de-a
treia etap, cea de
c) etapa de promotor deschis; se formeaz astfel bucla de transcriere care depete situsul
START (nucleotidul +1 al catenei matri)
Se formeaz astfel un complex binar: ADN ARN polimeraz. Iniierea transcrierii continu
cu ataarea primului nucleotid, care de obicei la procariote este ATP sau GTP. Complexul devine
astfel din binar, ternar: ADN ARN polimeraz ARN. Dup sinteza a aproximativ 8-10
ribonucleotide, subunitatea se desprinde din complex, considerndu-se c acest eveniment ncheie
etapa de iniiere a transcrierii.

Elongarea transcrierii
Aceast etap ncepe dup desprinderea subunitii i este realizat de subunitatea care
formeaz legturi fosfo-diesterice ntre ribonucleotide. Catena ARN crete n direcia 5 - 3. Odat cu
ARN polimeraza, i bucla de transcriere se deplaseaz pe molecula de ADN, transcriptul rmnnd n
hibrid cu matria ADN doar pe o poriune de aproximativ 12 nucleotide.
Rata de polimerizare a ARN polimerazei de la E.coli este de circa 30 40 nucleotide per
secund. Frecvena erorilor de ncorporare (a ribonucleotidelor greit mperecheate cu cele din catena
matri ADN) de ctre aceast enzim este de 1 baz greit per 10
4
baze ncorporate. Dup ce ARN
polimeraza a trecut de promotor, o alt enzim (cu tot cu subunitate ) se poate ataa la acesta i poate
ncepe o nou rund de transcriere.

Terminarea transcrierii
Terminarea transcrierii are loc n momentul n care ARN polimeraza ajunge n regiunea unui
terminator. Acul-de-pr format n catena transcriptului (vezi figura 4.18) blocheaz avansarea enzimei
i o determin s staioneze cteva milisecunde; acest timp este ns suficient pentru ca transcriptul s
se desprind din hibridul cu catena ADN matri (desprinderea este facilitat i de faptul c legturile
dintre poli-A de pe ADN i poli-U din ARN sunt slabe). Bucla de transcriere se inchide i astfel
procesul este ncheiat.
Moleculele de ARN transcript pot evolua fie ca ARN measger, ARN ribozomal, ARN de
transfer.
Majoritatea moleculelor de ARNm de la procariote sunt monocistronice i sunt altuie din 3
regiuni mai importante :
- regiunea cap (leader), care conine secvena SHINE-DALGARNO (5-AGGAGG3) ce
este complementar cu un hexamer de la capul 3 al moleculelor de ARNr de 16S
- regiunea codificatoare, care ncepe cu codonul start AUG i se termin cu un codon stop
- regiunea cozii





81
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

4.2.4 Transcrierea la eucariote
4.2.4.1 ARN polimerazele la eucariote
n sine, procesul de transcriere la organismele eucariote se desfoar n mod similar cu cel de
la procariote. Exist totui o serie de diferene.
Astfel, n timp ce la procariote exist o singur specie molecular de ARN polimeraz per
celul, la eucariote exist, n majoritatea cazurilor 3 specii moleculare de asemenea enzime. Cele 3
ARN polimeraze de la eucariote sunt nrudite i structural i funcional. Cu toate acestea, cele 3
enzime iniiaz transcrierea de la promotori diferii i transcriu gene diferite :
- ARN polimeraza I transcrie n mod special gene ce codific pentru ARN ribozomal
- ARN polimeraza II transcrie mai ales gene ce codific ARN mesager
- ARN polimeraza III transcrie mai ales ARN de transfer i o serie de molecule mici de
ARN, de exemplu ARN nuclear mic i nucleolar mic
Alte diferene importante apar i n ceea ce privete factorii de transcriere. Astfel, dac la
procariote iniierea transcrierii necesit doar facotrul , la eucariote debutul acestui proces necesit
mai multe proteine, denumite generic factori de transcriere generali.
n general, structura promotorilor pentru ARN pol I i III este mai simpla dect a promotorilor
pentru ARN pol II, dei i aceste 2 enzime necesit factori de transcriere.
4.2.4.2 Promotorul la eucariote
Regiunile promotor la eucariote prezint o zon miez care cuprinde un set minimal de
secvene necesare iniierii transcrierii de ctre ARN pol II. Un asemenea miez de promotor este de
obicei format din 40 de nucleotide ce cuprind de multe ori i situsul START (nucleotidul +1) i este
format din:
- elementul BRE ce reprezint elementul de recunoatere a factorului de transcriere TFIIB
(TFIIB Recognition Element)
- cutia TATA la care se ataeaz factorul TBP (TATA Binding Protein); aceast protein
reprezint de fapt o subunitate a factorului de transcriere TFIID
- regiunea Inr (Initiator) la care se ataeaz factorul TFIID
- regiunea DPE (Downstream Promoter Element = elementul n aval fa de promotor) la
care se ataeaz tot TFIID
Cei mai muli promotori de la eucariote includ doar 2 sau 3 din aceste regiuni (Figura 4.21).
4.2.4.3 Complexul de pre-iniiere
Factorii de transcriere necesari ARN polimerazei II au fost notai TFII (Transcription Factors
for RNA polymerase II).
La eucariote se formeaz mai nti un complex preoteic de pre-iniiere care se ataeaz la
elementul TATA. Succesiunea de evenimente este urmtoarea :
- elementul TATA este recunoscut de TFIID; aceast protein este un complex cu mai
multe subuniti, dintre care una (TBP) se va lega la cutia TATA.
- celelalte subuniti ale complexului TFIID poart numele de proteine TAF (TBP
Associated Factors = factori asociai cu TBP)
- TBP se leag la cutia TATA; prin legarea sa la cutia TATA, TBP distorsioneaz
molecula de ADN n acea regiune determinnd recrutarea i a altor factori de transcriere i a ARN
polimerazei
- TFIIA i TFIIB se ataeaz la promotor
- TFIIF se cupleaz cu ARN polimeraza i mpreun se ataeaz la promotor
- TFIIE i TFIIH se ataeaz i ei la ntreg acest complex nucleo-proteic
Ca urmare a atarii acestor proteine, dublul helix se deschide n zona promotorului. Spre
deosebire de procariote, la eucariote deschiderea dublului helix necesit energie (furnizat prin
hidroliza ATP) iar procesul este mediat de activitatea de tip helicaz a factorului TFIIH.
Sinteza catenei ARN poate acum s nceap.

82
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic


Figura 4.21 Structura unui promotor la eucariote.

Figura 4.22 Factorii generali de transcriere pentru ARN polimeraza II
Factori generali
de transcriere
Numrul de
subuniti
TBP 1
TFIIA 2
TFIIB 1
TFIIE 2
TFIIF 3
TFIIH 9
proteine TAF 11


Caseta 4. ....Rolul celorlalte proteine GTF
Proteinele TAF se asociaz cu factorul TBP, mediind ataarea acestuia la cutia
TATA. TFIIB se pare c mediaz legtura dintre complexul TBP-TATA i ARN
polimeraz. TFIIF modific conformaia steric a ARN polimerazei facilitnd
ataarea acesteia la promotor. TFIIE l aduce pe TFIIH i i regleaz activitatea.
TFIIH desface legturile de hidrogen dintre cele 2 catene ADN, cu formarea buclei
de transcriere.
S-a constatat c in vivo iniierea transcrierii la eucariote necesit i alte
proteine n afar de cele listate mai sus, inclusiv un aa-numit complex mediator, a














4.2.4.4 Factorii de elongare
n aceast etap, ARN polimeraza II se desprinde de marea majoritate a factorilor de iniiere.
Locul lor este luat de un set de factori de elongare (TFIIS, TEF). Astfel, TFIIS asigur corporarea
corect a ribonucleotidelor i corecteaz bazele ncorporate greit (funcie de proofreading). Factorul
TEF fosforileaz anumite reziduuri de serin din structura ARN polimerazei II, fapt ce stimuleaz
etapa de elongare.
Pe de alt parte, n timpul etapei de elongare, ARN polimeraza se asociaz cu o serie de
proteine necesare pentru procesarea tipurilor de ARN transcript.
- enzime ce adaug la capul 5 al transcriptului un rest de guanin metilat, ceea ce i va
conferi transcriptului rezisten la enzime de tip nucleaze i se ataeaz la structura ribozomului
- enzime ce produc poliadenilarea captului 3: enzime de tip poli-A polimeraze adaug o
coad de pn la 200 de resturi de A la capul 3 al transcriptului; ataarea unei asemenea enzime pare
s fie implicat n terminarea transcrierii




83
Tratat de Biotehnologie Cap.4 Funciile materialului genetic

84
BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P., 2002, Molecular Biology of the Cell. 4th ed.,
Garland Publishing House, New York.
2. Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L., 2002, Biochemistry. , W. H. Freeman and Co., New York.
3. Brown T.A., 2002, Genomes. 2nd ed., BIOS Scientific Publishers, Ltd, Oxford, UK.
4. Campbell A.M., 1992, Chromosomal insertion sites for phages and plasmids. Journal of Bacteriology
174(23):7495-7499.
5. Cohen S.N., 1993, Bacterial plasmids: their extraordinary contribution to molecular genetics. Gene 135:67-76.
6. Cooper G.M., 2000, The Cell - A Molecular Approach. 2nd ed., Sinauer Associates, Inc., SUA.
7. Cornea C.P., 1998, Elemente de Inginerie Genetic, Editura ALL, Bucureti.
8. Covic M., tefnescu D., Sandovici I., 2004, Genetic medical, Editura Polirom.
9. Dale J.W., 1998, Molecular Genetics of Bacteria, 3rd Edition.Anonymous Chichester, UK:John Wiley & Sons.
10. Del Solar G., Giraldo R., Ruiz-Echevarria M.J., Espinosa M., Diaz-Orejaz R., 1998, Replication and control of
circular bacterial plasmids. Microbiol Molec Biol Rev 62(2):434-464.
11. Embley T.M., Hirt R.P., Williams D.M., 1994, Biodiversity at the molecular level: the domains, kingdoms and
phyla of life. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 345(1311):21-33.
12. Espinosa M., del Solar G., Rojo F., Alonso J.C., 1995, Plasmid rolling circle replication and its control. FEMS
Microbiol Lett 130:111-120.
13. Freifelder D., 1987, Microbial Genetics. Jones and Bartlett Publishers. Boston, USA.
14. Gavril L., 2003, Genomica Un tratat despre genom, de la virusuri la om, vol.I, vol.II, Ed. Encicl., Bucureti.
15. Gilson E., Bachellier S., Perrin S., Perrin D., Grimont P.A.D., Grimont F., Hofnung M., 1990, Palindromic unit
highly repetitive DNA sequences exhibit species specificity within Enterobateriaceae.. Researches in
Microbiology 141:1103-1116.
16. Griffiths A.J.F., Miller J.H., Suzuki D.T., Lewontin R.C., Gelbart W.M., 1999, Introduction to Genetic
Analysis. 7th ed., W. H. Freeman & Co., New York.
17. Hardy K.G., 1988, Plasmids: A Practical Approach. IRL Pres. Oxford, UK.
18. Herlea V., 1998 Microbiologie general, Ed. Univ., Bucureti.
19. Hinnebusch H., Barbour A.G., 1992, Linear- and circular-plasmid copy numbers in Borrelia burgdorferi. J.Bact.
174(16):5251-5257.
20. Hinnebusch J., Tilly K., 1993, Linear plasmids and chromosomes in bacteria. Molecular Microbiology
10(5):917-922.
21. Hiraga S., 1992, Chromosome and plasmid partition in E.coli. Annu Rev Biochem 61:283-306.
22. Lewin B. , 1997, Genes. 6th ed., Oxford University Press, New York, USA.
23. Lodish H., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J.E., 2000, Molecular Cell Biology. 4th
ed., W. H. Freeman & Co. Publishing, New York.
24. Manen D., Caro L., 1991, The replication of plasmid pSC101. Molecular Microbiology 5(2):233-237.
25. Margulis L., 1992, Biodiversity: molecular biological domains, symbiosis and kingdom origins. Biosystems
27(1):39-51.
26. Moller-Jensen J., Gerdes K.J.R., 2000, Plasmid and chromosome segregation in prokaryotes. Trends in
Microbiology 8(7):313-320.
27. Nester E.W., Evans Roberts C., Nester M., 1995, Microbiology, A Human Perspective, WCB Publishers, SUA.
28. Pettijohn D.E., 1988, Histone-like proteins and bacterial chromosome structure. J Biol Chem 263(26):12793-6.
29. Prescott L.M., Harlez J.P., Klein D.A., 1996, Microbiology. Third Edition, WCB Publishers, SUA.
30. Raicu P., Stoian V., 1991, Genetica dezvoltrii la eucariote, Editura Academiei Romne.
31. Russel P.J., 1994, Fundamentals of Genetics, Harper Collins College Publishers, SUA.
32. Sakaguchi K., 1990, Invertrons, a class of structurally and functionally related genetic elements that includes
linear DNA plasmids, transposable elements and genomes of adeno-type viruses.. Microbiol Rev 54(1):66-74.
33. Stoica I., Vassu T., Ssrman E., 2002 Biologia i taxonomia molecular a microorganismelor. Colecia de
culturi microbiene. Ed. Arvin Press.
34. Strachan T., Read A.P., 1999, Human Molecular Genetics 2. 2nd ed., BIOS Sci. Publishers, Ltd,Oxford, UK.
35. Summers D.K., 1996, The Biology of Plasmids.Anonymous Anonymous Oxford, UK:Blackwell Science Ltd.
36. Sykora P., 1992, Macroevolution of plamids: a model for plasmid speciation. J Theor Biol 159:53-65.
37. Trun N.J., 1998, Architecture of a bacterial chromosome. ASM News 64(5):276-283.
38. Vassu T., Stoica I., Cstuak O., Muat F., 2001, Genetica microorganismelor i Inginerie genetic microbian.
Note de curs i Tehnici de laborator. Editura Petrion, Bucureti.
39. Watson J.D., Baker T.A., Bell S.P., Gann A., Levine M., Losick R., 2004, Molecular Biology of the Gene. Fifth
Edition, CSHL Press.
40. Weaver R.F., 1999, Molecular Biology, WCB McGraw-Hill Press.
41. Woese C.R., Kandler O., Wheelis M.L. , 1990, Towards a natural system of organisms: proposal for the
domains Archaea, Bacteria and Eucarya., Proc Natl Acad Sci USA, 87, pp 4576-4579.
42. Zarnea G., Tratat de Microbiologie Generala. vol I (1983), II (1984) i V (1994), Editura Academiei Romane.