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Procedimentos Analíticos para Investigação de Antocianinas

Procedimentos Analíticos para Investigação de Antocianinas

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Procedimentos para extração de Antocianinas. Trabalho realizado no Brasil, e publicado na revista Química Nova.
Procedimentos para extração de Antocianinas. Trabalho realizado no Brasil, e publicado na revista Química Nova.

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11/08/2012

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Quim. Nova,
Vol. 31, No. 5, 1218-1223, 2008
       R     e     v       i     s       ã     o
*e-mail: ronei@iqm.unicamp.br
PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE ANTOCIANINAS PRESENTES EM EXTRATOSNATURAISPaulo Henrique Março e Ronei Jesus Poppi*
Instituto de Química, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13083-970 Campinas – SP, Brasil
Ieda Spacino Scarminio
Departamento de Química, Universidade Estadual de Londrina, CP 6001, 86051-970 Londrina – PR, BrasilRecebido em 19/7/07; aceito em 20/9/07; publicado na web em 2/4/08
ANALYTICAL PROCEDURES FOR IDENTIFYING ANTHOCYANINS IN NATURAL EXTRACTS. Anthocyanins are amongthe most important plant pigments. Due to their potential benefits for human health, there is considerable interest in these naturalpigments. Nonetheless, there is great difficulty in finding a technique that could provide the identification of structurally similarcompounds and estimate the number and concentration of the species present. A lot of techniques have been tried to find the bestmethodology to extract information from these systems. In this paper, a review of the most important procedures is given, from theextraction to the identification of anthocyanins in natural extracts.Keywords: anthocyanins; analytical procedures; identification.
INTRODUÇÃO
A cor é um dos mais importantes atributos de qualidade de umalimento, exercendo uma enorme influência em seu valor estético eservindo de base para a aceitação de uma grande variedade de pro-dutos alimentícios por parte dos consumidores.
1
Em produtos na-turais, a maioria das substâncias responsáveis pela coloração per-tence à classe dos flavonóides. Os flavonóides possuem estruturamarcada pela presença de um esqueleto com 15 átomos de carbo-no na forma C
6
-C
3
-C
6
, e são divididos em classes dependendo doestado de oxidação do anel central de pirano.
2
A Figura 1 apresentaa estrutura química dos principais tipos de flavonóides.
3
A classificação do tipo de flavonóide presente em um extrato deplanta baseia-se inicialmente no estudo das propriedades de solubili-dade e reações de coloração. Este procedimento é seguido por análisecromatográfica do extrato da planta. Os flavonóides podem ser separa-dos por procedimentos cromatográficos e os componentes individuaisidentificados, quando possível, por comparação com padrões.As duas classes de flavonóides consideradas como mais importan-tes são os flavonóis e as antocianidinas.
4
As antocianidinas apresen-tam como estrutura fundamental o cátion flavílico
5
(2-fenilben-zopirilium), representado na Figura 2a. A Figura 2b apresenta um exem-plo de estrutura de antocianidina, conhecida como cianidina.Os pigmentos ocorrem geralmente na forma de antocianinas,
6
que são derivadas das antocianidinas. As antocianidinas não possu-em grupos glicosídeos e a maioria possui hidroxilas nas posições 3,5 e 7. Já nas antocianinas, uma ou mais destas hidroxilas estãoligadas a açúcares, sendo os mais comuns glicose, xilose, arabinose,ramnose, galactose ou dissacarídeos constituídos por esses açúca-res, aos quais podem estar ligados ácidos fenólicos, como
 p
-coumárico, cafêico, fenílico e vanílico. O açúcar presente nas molé-culas de antocianinas confere maior solubilidade e estabilidade aestes pigmentos, quando comparados com as antocianidinas.
5
AFigura 3 é um exemplo de estrutura de antocianina presente namaioria dos vegetais, a cianidina 3-glucosídeo.O termo antocianina, derivado do grego de flor e azul (
anthos
=flores;
kianos
= azul), foi inventado por Marquart em 1853 para sereferir aos pigmentos azuis das flores. Percebeu-se mais tarde quenão apenas a cor azul, mas também várias outras cores observadasem flores, frutos, folhas, caules e raízes são atribuídas a pigmentosquimicamente similares aos que deram origem ao “flor azul”.
7
Com a mesma origem biossintética dos outros flavonóides na-
 Figura 1.
 Estrutura química dos principais tipos de flavonóides
3
 Figura 2.
(a) Estrutura do cátion flavílico e (b) estrutura da antocianidinacianidina
 Figura 3.
 Estrutura da antocianina cianidina 3-glucosídeo
 
1219Procedimentos analíticos para identificação de antocianinas presentes em extratos naturais
Vol. 31, No. 5
turais, as antocianinas são estruturalmente caracterizadas pela pre-sença do esqueleto contendo 15 átomos de carbono na forma C
6
-C
3
-C
6
, porém, ao contrário dos outros flavonóides, as antocianinasabsorvem fortemente na região visível do espectro, conferindo umainfinidade de cores, dependendo do meio de ocorrência.
7
Devido sua solubilidade em água,
8
as antocianinas ocorrem nostecidos de plantas dissolvidas no fluído da célula vegetal, que geral-mente apresenta pH levemente ácido.
6
As antocianinas mais comumenteencontradas em frutas são derivadas principalmente de seisantocianidinas: pelargonidina, cianidina, delfinidina, peonidina,petunidina e malvidina. A nomenclatura dos pigmentos é derivada dafonte (do vegetal) em que eles foram primeiramente isolados.
9
As di-ferenças entre as várias antocianinas estão no número de gruposhidroxílicos na molécula, no grau de metilação destes grupos, na natu-reza e no número de açúcares ligados à molécula e na posição dessasligações, bem como na natureza e no número de ácidos alifáticos e/ouaromáticos ligados ao(s) açúcar(es) na molécula de antocianina.
1
Uma característica marcante das antocianinas está no fato deque em soluções aquosas, apresentam diferentes estruturas em fun-ção do pH. De modo geral, em meio extremamente ácido (pH entre1-2), as antocianinas apresentam coloração intensamente avermelhadadevido ao predomínio da forma cátion flavílico (AH
+
). Para um meiocom pH maior que 2, é observado um equilíbrio entre o cátion flavílicoe uma estrutura conhecida como pseudobase carbinol (B). Com oaumento do pH, as antocianinas perdem a cor até se tornarem prati-camente incolores em pH aproximadamente 6, devido à predomi-nância da espécie pseudobase carbinol. Em valores de pH acima de6,0, tanto a estrutura pseudobase carbinol quanto anidrobase quinoidal(A) podem formar a espécie cis-chalcona (C
C
). A formação destaocorre com a ruptura do anel heterocíclico o que, dependendo dotipo de antocianina, pode tornar a reação irreversível. A formação dacis-chalcona a partir da anidrobase quinoidal pode ocorrer por doiscaminhos diferentes: de maneira direta, resultado de um aumentobrusco de pH, ou com a formação das espécies anidrobase ionizadas(A
-
), possivelmente provenientes de um aumento gradual de baseentre os valores de pH 6,5 e 9. Ao iniciar-se a ionização dasantocianinas, são formadas estruturas de anidrobases que exibemcoloração azul. Em meio extremamente alcalino, observa-se o equi-líbrio entre formas ionizadas de chalconas cis e trans, apresentandocoloração amarelada. Baseando-se em trabalhos anteriores,
10,11
jun-tamente com estudos recentes, sugere-se que as possíveis transfor-mações estruturais das antocianinas em meio aquoso em função dopH podem ser representadas pela Figura 4.O aquecimento é um fator que acelera a degradação dasantocianinas. Em presença de cátions de Al, Fe, Sn e outros metais,as antocianinas formam produtos insolúveis que, no caso do alumí-nio, encontram aplicações como corantes que apresentam estabili-dade ao calor, pH e oxigênio superior à das antocianinas livres. Alémdo pH, a luz é um outro fator de grande importância na alteração dacor das antocianinas. A transformação é mais intensa quando o fatorluz é combinado com o efeito do oxigênio. As antocianinas tambémpodem se combinar com HSO
3-
presente em muitos alimentos for-mando produtos incolores provenientes da ligação deste com o car-bono 4 (Figura 2a) da antocianina. A estabilidade das antocianinasao descoramento é aumentada consideravelmente pela presença deácidos fenólicos. O mesmo efeito é observado pela presença deflavonóides não-antociânicos, especialmente os flavonóis, como porexemplo a rutina. Compostos como o acetaldeído, amino ácidos,taninos, dentre alguns outros, também conferem aumento na estabi-lidade da molécula. Esse aumento na estabilidade é atribuído àcopigmentação, ou seja, associação entre antocianina e flavonol(copigmento) por ligações de hidrogênio, de modo que o flavonolvenha a formar uma estrutura protetora envolvendo a antocianina.
11
Existe um grande interesse no estudo das antocianinas em diver-sas áreas, como na saúde, devido ao seu grande potencial terapêutico,na indústria, com destaque para as aplicações na fabricação de vi-nhos e como corantes naturais,
12
e também na área de ensino emquímica, onde servem como indicadores de pH.
5,13
No entanto, a
 Figura 4.
Possíveis transformações estruturais das antocianinas em meio aquoso em função do pH 
 
1220
Quim. Nova
Março
et al.
utilização de antocianinas apresenta restrições em função de limita-ções, como a disponibilidade de matéria-prima produtora de pig-mentos na quantidade e qualidade requerida, as dificuldades envol-vendo processos de obtenção (extração, purificação e isolamento), opoder corante reduzido quando comparado aos produtos sintéticos e,principalmente, a baixa estabilidade apresentada pelas antocianinas.
1
O conhecimento da estrutura dos pigmentos, a influência defatores como pH, temperatura, a presença de ácidos, açúcares,íons metálicos e de substâncias chamadas de copigmentos assu-me importância fundamental no estudo da estabilidade deantocianinas, visando seu possível uso em alimentos.
1
A determi-nação de compostos fenólicos é de grande importância devido àrelação destes compostos com as qualidades sensoriais dos ali-mentos, como cor, sabor e aroma.
14
No entanto, os extratos deplantas apresentam misturas de diferentes substâncias, incluindodiferentes classes de flavonóides. As antocianinas, por exemplo,presentes em pétalas de flores, estão sempre acompanhadas deflavonas incolores que se apresentam como copigmentos, sendoessenciais para a expressão da cor e fornecendo estabilidade àantocianina.
15
O conhecimento do tipo de antocianina também semostra fundamental no estudo de plantas ornamentais, onde apredominância de uma antocianina individual pode determinar acor do produto, influenciando diretamente na aceitação e no va-lor comercial do mesmo.
16
Outra razão para a identificação deantocianinas individuais está na análise de vinhos adulterados: ostipos de antocianinas dependem da espécie do gênero
Vitis
utili-zada na fabricação do vinho, e são determinantes da coloração,aroma e, principalmente, do sabor desta bebida.
17
Como os extratos vegetais são matrizes complexas, às vezes énecessário que se purifique a amostra para realizar a identificaçãodas substâncias presentes. Para o caso de identificação de substân-cias individuais, se faz necessária a remoção de substâncias interfe-rentes e a separação de compostos de uma mesma classe, e paraestes fins a cromatografia é um método indispensável, possibilitan-do a posterior identificação e quantificação de compostos, comalta sensibilidade e eficiência.
18
METODOLOGIA ANALÍTICA
O estudo de antocianinas presentes em extratos vegetais é de-pendente do objetivo da análise: a detecção da presença de antocia-ninas em uma planta pode ser realizada utilizando-se a técnica decromatografia em papel (CP), baseando-se na propriedade de mu-dança de cor em função do pH apresentada pelas antocianinas; parafins de identificação de antocianinas individuais, como é o caso deestudos de plantas ornamentais onde a identificação do tipo deantocianina é de fundamental importância, podem ser empregadastécnicas mais avançadas, como cromatografia líquida de alta efici-ência (CLAE), espectrometria de massas (MS), ressonância mag-nética nuclear de prótons (RMN de
1
H) e de carbono (RMN de
13
C), eletroforese capilar por zonas
19
(ECZ –
Capillary Zones Electrophoresis, CZE 
), além de equipamentos que combinam es-tas e outras técnicas (equipamentos hifenados).Na identificação de um constituinte de uma planta, uma vezque este tenha sido isolado e purificado, é necessário primeira-mente determinar a classe do composto e, então, encontrar qualsubstância em particular está presente dentro desta classe. Para asantocianinas, a classe de compostos pode ser facilmente distinguidapor testes de coloração.
15
Como etapa inicial para o estudo de antocianinas, a detecção dapresença do pigmento na amostra pode ser realizada utilizando-se atécnica de cromatografia em papel, onde a presença ou ausência dopigmento antocianina pode ser determinada baseando-se em umareação que envolve mudança reversível na coloração em função dopH. Para isso, o primeiro passo é a obtenção do extrato da planta.As antocianinas são instáveis em soluções com pH neutro ou alca-lino, e mesmo em soluções com pH ácido a cor pode desaparecergradualmente quando a solução sofre exposição à luz. Como estespigmentos são solúveis em solventes polares, devem ser extraídos uti-lizando-se soluções alcoólicas de metanol ou etanol contendo ácidoacético ou ácido clorídrico. O ácido empregado na solução diminui opH, prevenindo a degradação de antocianinas não aciladas.
12
A maio-ria dos estudos emprega soluções alcoólicas de metanol acidificadascom HCl, no entanto, na análise de alimentos a solução de metanoldeve ser substituída por etanol, devido à toxicidade do metanol.
20
Apósa maceração de quantidade adequada de amostra embebida na soluçãoextratora, pode-se obter um extrato suficientemente concentrado paraa aplicação direta em cromatografia em papel.No caso de necessidade de armazenamento, o extrato deve sermantido em local escuro e, preferencialmente, a baixas temperatu-ras.
15
A cromatografia em papel é uma técnica de separação por parti-ção líquido-líquido: a celulose é constituída por várias unidades deglicose anidra ligadas por átomos de oxigênio, de modo que umlíquido polar como a água tem grande afinidade pelas hidroxilas decada glicose, formando ligações de hidrogênio, ficando retido e fun-cionando como fase estacionária, e os líquidos menos polares(solventes orgânicos) são repelidos e funcionam como fase móvel.
21
No estudo de antocianinas o solvente mais utilizado é a solução deBAW (butanol - ácido acético - água, na maioria das vezes na pro-porção 4 : 1 : 5).
22
Como a fase estacionária é um líquido, o processode separação ocorre por partição, baseando-se nas diferentes solubi-lidades dos componentes da amostra na fase estacionária.Após o desenvolvimento cromatográfico, o aparecimento demancha(s) colorida(s) é o primeiro indício da possibilidade de exis-tência de antocianinas no extrato.
23
Baseando-se na propriedade apre-sentada pelas antocianinas de variar a coloração de forma reversívelem função do pH,
10,22
é possível detectar se a mancha observada édevido à presença de antocianinas ou outras substâncias, como porexemplo as betacianinas, presentes em beterraba (planta da família
Centrospermae
). As betacianinas são pigmentos solúveis em água eapresentam coloração vermelho-escura quando em meio levementeácido, o que pode causar grande confusão em uma tentativa inicialde classificação do tipo de pigmento. A principal betacianina é abetanina. No entanto, as antocianinas e as betaninas não ocorremsimultaneamente em uma mesma planta: algumas plantas substitu-em biossinteticamente as antocianinas por betaninas, como é o casode plantas da família
Centrospermae
, como cacto (
cacti
), flores dotipo
bougainvillea
, arbustros como os conhecidos como
 pokeweed 
,
Phytolacca
e algumas plantas ornamentais como rabo de gato(
 Amaranthus
).
15
Neste caso, baseando-se na mudança de estruturasdecorrentes da variação do pH do meio (Figura 4), ao mudar o pH docromatograma para levemente alcalino pela exposição a vapores deamônia, a mancha deve mudar de coloração. Devem-se tomar osdevidos cuidados para não tornar o meio alcalino a ponto de causar aformação das chalconas ionizadas (ruptura do anel) o que, em al-guns casos, torna a reação irreversível. Caso a substância mude decor, deve-se borrifar solução ácida, revertendo o pH para o valorinicial e, dessa forma, voltando à cor inicial. As betacianinas dife-rem das antocianinas por serem mais instáveis,
15
de modo que aomudar o pH para valores mais elevados (de 2 para 7, por exemplo) asbetaninas sofrem transformações irreversíveis em sua estrutura, en-quanto que as antocianinas retomam a forma inicial.Para estudos com finalidades apenas de detecção da presença deantocianinas em extratos vegetais, o teste de cromatografia em papel ésuficiente. Em estudos com finalidade de identificação de antocianinas

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