TUGAS

KIMIA FARMASI KUANTITATIF

REVIEW:
ANALISIS KARBOHIDRAT



OLEH:
KELOMPOK VI FARMASI A
ANDI AMALIA AKO 70100111006
AYU TRY SARTIKA 70100111016
FEBRIYANTI HASDAN SALEH 70100111026
ILHAM ARIDANI 70100111037
MUH. LUTHFI AZAM 70100111046



JURUSAN FARMASI
FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS ISLAM NEGERI ALAUDDIN MAKASSAR
SAMATA-GOWA
2014
ANALISIS KARBOHIDRAT

Karbohidrat adalah salah satu bahan yang paling penting dalam makanan maupun
sebagai bahan mentah. Karbohidrat mungkin terjadi secara alami atau ditambahkan ke produk
makanan untuk menyediakan nutrisi serta untuk meningkatkan tekstur dan kualitas
keseluruhan dari produk pangan. Polisakarida alami dalam makanan merupakan bagian
intrinsik atau bawaan dari bahan baku. Misalnya, pati adalah zat karbohidrat terbanyak dalam
produk makanan, diikuti oleh pektin, hemiselulosa dan bahan dinding sel.
A. Analisis Kandungan Total Gula
1. Penyiapan Sampel
Sebelum menganalisis untuk setiap kelas karbohidrat, apakah itu monosakarida
atau bahan selulosa tidak larut, sampel harus dipersiapkan agar menghilangkan zat
yang dapat mengganggu analisis. Untuk sampel yang sudah dasarnya larutan gula (jus,
madu) sangat sedikit persiapan sampel diperlukan. Untuk sampel lainnya, seperti
minyak biji, sereal atau makanan utuh, lemak, protein, pigmen, vitamin, mineral, dan
berbagai senyawa lainnya harus dihilangkan sebelum analisis.

2. Uji Fenol-Asam Sulfat
a. Teori Reaksi
Pada asam kuat dan panas, karbohidrat menjalani serangkaian reaksi yang
mengarah pada pembentukan turunan furan seperti furanaldehyde dan
hydroxymethyl furaldehide. Reaksi awal, adalah reaksi dehidrasi diikuti dengan
pembentukan turunan furan yang terkondensasi atau senyawa fenolik untuk
menghasilkan warna gelap yang kompleks. Kompleks tersebut mengabsorpsi UV-
VI dan absorbansi setara dengan konsentrasi gula. Absorbansi maksimum pada
490 nm untuk heksosa dan 480 nm untuk pentose dan asam uronat dengan
spektrofotometer UV-VI.


b. Prosedur
Fenol, dalam larutan 5 atau 80% ditambahkan ke tabung reaksi yang berisi
larutan sampel yang jernih. Asam sulfat pekat ditambahkan dalam aliran cepat
langsung ke permukaan cairan dalam tabung reaksi. Campuran dilarutkan dan
dicampur dengan bantuan Vortex dan waktu yang cukup untuk memungkinkan
pengembangan warna. Solusi absorbansi dibaca pada 490 atau 480 nm
menggunakan spektrofotometer, tergantung pada jenis gulanya.
c. Kuantifikasi
Kurva kalibrasi dibuat dengan menggunakan gula yang diuji. Stok 1mg/ml larutan
gula standar digunakan untuk menyiapkan 5 atau 6 standar dengan range 10
hingga 100 g/ml. Setiap standar diberi perlakuan sesuai prosedur yang diuraikan
di atas, dipindahkan ke kuvet, dan absorbansi yang dibaca pada 480 atau 490 nm.
Absorbansi kosong harus dikurangkan dari absorbansi standar manual, atau
kosong harus digunakan untuk spektrofotometer zero. Sebuah grafik absorbansi
vs konsentrasi dibuat dan jumlah analit diturunkan dari kurva kalibrasi.
d. Penerapan
Metode fenol-sulfat banyak digunakan untuk menentukan konsentrasi total
karbohidrat dalam sampel. Hal ini dapat digunakan pada ekstrak bebas lipid dari
sereal, biji-bijian, dan tanaman. Selain itu, dapat digunakan untuk mengukur
monosakarida, oligosakarida, dan polisakarida. Metode ini memberikan hasil yang
paling akurat ketika diterapkan pada sampel yang mengandung hanya satu jenis
karbohidrat.

3. Uji Anthron-Asam Sulfat
a. Teori Reaksi
Serupa dengan uji asam fenol-sulfat, metode antron didasarkan pada
kondensasi dari furaldehide derivatif, yang dihasilkan oleh karbohidrat dengan
adanya asam kuat, dengan reagen, yaitu anthron (9,10-dihidro-9-ozoanthracene),
untuk menghasilkan senyawa berwarna. Reaksi karbohidrat dalam lingkungan
asam kuat dengan hasil anthrone berwarna biru-hijau dan absorbansi dibaca pada
625 nm.
b. Prosedur
Campuran dingin dari 2% anthrone dalam asam sulfat pekat dicampur dengan
sebuah aliquot dari larutan sampel yang jernih mengandung gula yang diuji.
Setelah inkubasi dalam suhu yang dikendalikan dalam waktu tertentu untuk
memungkinkan pengembangan warna, larutan dituangkan ke dalam yang sesuai
kuvet spektrofotometri dan absorbansi diukur pada 625 nm.
c. Kuantifikasi
Serupa dengan uji asam fenol-sulfat, reaksi anthrone adalah nonstoikemetrik dan
karena itu memerlukan pembangunan kurva standar untuk tujuan kuantitatif.
d. Penerapan
Metode anthrone-sulfat berlaku untuk larutan yang mengandung satu jenis
heksosa karena gula dengan struktur serupa menghasilkan angka yang berbeda
dan jumlah pembangunan warna. Gula lain, seperti pentosa dan asam heksuronat,
juga akan bereaksi untuk menghasilkan senyawa berwarna yang menyerap pada
panjang gelombang yang sama. Uji ini juga dapat digunakan untuk analisis
kuantitatif oligo-dan polisakarida yang hanya ada satu jenis dalam larutan.
4. Analisis Asam Uronat
Metode kolorimetri untuk menentukan asam uronic mirip dengan fenol-asam
sulfat dan uji anthrone didasarkan pada reaksi dari reagen dengan turunan karbohidrat
yang terbentuk dalam asam pekat.
a. Teori Reaksi Metode m-Hydroxydiphenyl
Sementara semua karbohidrat bereaksi asam pekat membentuk senyawa berwarna,
asam uronic bereaksi dengan m -Hydroxydiphenyl dalam asam kuat lingkungan
untuk membentuk kompleks berwarna pink. Pengukuran absorbansi dibaca pada
520 nm meningkat secara linear dengan konsentrasi asam uronat dari 0 sampai
100 g / ml.
b. Prosedur Operasi
Sebuah solusi sampel dicampur dengan asam sulfat yang mengandung tetraborat
dalam tabung reaksi dan ditempatkan dalam bak air mendidih selama 5 menit.
Setelah pendinginan cepat dalam air es, m-Hydroxydiphenyl ditambahkan ke
masing-masing sampel uji tabung dan di-vortex untuk memastikan pencampuran
yang memadai. Absorbansi untuk setiap sampel dibaca setelah memungkinkan
warna untuk mengembang selama 20 menit. Sebuah sampel blanko (yang
mengandung pelarut sampel) harus disiapkan pada saat yang sama sebagai
sampel.
c. Kuantifikasi
Suatu larutan standar asam uronat yang sesuai (yaitu, asam galakturonat)
digunakan untuk menyiapkan beberapa pengenceran dan ini digunakan untuk
mempersiapkan kurva standar. Sebuah grafik konsentrasi vs absorbansi dibuat dan
pembacaan absorbansi sampel diplot sepanjang kurva untuk mendapatkan nilai
konsentrasi. Kurva standar biasanya berkisar dari 10 hingga 100 g/ml.
d. Penerapan
Uji m-Hydroxydiphenyl dapat mentolerir adanya gula asam nonuronat hingga ~
200 g / ml. Tetapi konsentrasi yang lebih tinggi dari gula netral mungkin
meningkatkan pembacaan absorbansi. Selain itu, adanya protein dalam sampel
dapat mengganggu absorbansi. Metode ini sesuai untuk kuantifikasi bahan pektik
dalam buah-buahan dan sayuran dan telah diadaptasi untuk digunakan dengan
micro-plate.


B. Analisis Monosakarida
Metode yang paling sering digunakan untuk menentukan konsentrasi
monosakarida dalam sampel adalah kromatografi gas (GC) dan kromatografi cair kinerja
tinggi (HPLC). Tidak seperti metode enzimatik, yang cenderung lebih spesifik untuk satu
jenis monosakarida saja, teknik kromatografi memberikan informasi kualitatif dan
kuantitatif tentang satu atau beberapa monosakarida dalam sampel.
Persiapan sampel secara sederhana dengan sampel yang relatif murni, yaitu sampel
kering. Untuk analisis HPLC, sampel hanya perlu ditumbuk halus, dilarutkan, diencerkan
jika diperlukan, dan disaring sebelum diinjeksi ke dalam kolom. Dalam beberapa kasus,
terutama ketika menganalisis produk makanan yang kompleks, persiapan sampel menjadi
agak lebih kompleks dan satu atau lebih langkah selanjutnya mungkin diperlukan.
Senyawa larut lipid umumnya dihilangkan melalui ekstraksi dengan pelarut yang cocok,
seperti eter atau heksan. Protein dapat dihilangkan dari sampel secara enzimatik
menggunakan protease yang sesuai (papain). Keberadaan garam-garam anorganik negatif
dapat mempengaruhi kolom .
Ketika sampel awal adalah polisakarida dan analisis kuantitatif atau kualitatif
analisis monosakarida penyusunnya diperlukan, sampel harus di-Depolimarisasi. Hal ini
paling sering dilakukan.
1. Hidrolisis Asam
Pada asam kuat dan panas, ikatan glikosidik antara residu monosakarida
dalam polisakarida dipecah. Selama reaksi ini, satu molekul air yang dikonsumsi
untuk setiap keterkaitan glikosidik dipecah. Selama hidrolisis asam, dilepaskan
monosakarida yang rentan terhadap degradasi dengan adanya asam pekat panas.
Asam sulfat dan asam trifloroasetat (TFA) biasanya digunakan untuk
hidrolisis. Telah dilaporkan bahwa asam sulfat lebih unggul dari TFA untuk hidrolisis
substrat berserat seperti dedak gandum, jerami, apel, dan mikrokristalin selulosa.
Namun, asam sulfat bisa sulit untuk menghilangkan gangguan setelah analisis. TFA
mudah menguap dan dapat dengan mudah dihilangkan sebelum analisis HPLC.
Sesuai prosedur hidrolisis untuk gums polisakarida netral menggunakan TFA
membutuhkan pemanasan ~ 10 mg bahan polisakarida dalam 1 ml 1M TFA pada
121 C selama 1 jam. Setelah pendinginan sampai suhu kamar, TFA dapat
dipindahkan di bawah aliran nitrogen. Prosedur hidrolisis menggunakan asam sulfat
untuk serat makanan larut air dalam makanan telah diuraikan. Hal ini membutuhkan
pencampuran sampel dengan 1M asam sulfat dan pemanasan pada 100C selama 2,5
jam. Prosedur lain direkomendasikan untuk polisakarida netral melibatkan
pencampuran 2 sampai 5 mg sampel kering ditimbang dengan 0,1-0,25 ml HCl 2M
dan pemanasan pada 100C selama 2 sampai 5 jam.

Sampel yang mengandung residu gula asam seperti pektin dan jamur polisakarida
tertentu bisa sulit untuk menghidrolisis secara kuantitatif menggunakan metode
tradisional yang menggunakan TFA atau asam sulfat.

2. Kromatografi Gas Cair (KG)
Kromatografi gas cair adalah teknik dimana komponen dalam campuran
dipisahkan berdasarkan tingkat afinitasnya atau interaksi dengan cairan fase diam.
Dalam kasus KG, komponen sampel dilarutkan dalam fase gas dan bergerak melalui
lubang kolom yang sangat kecil, interior yang dilapisi dengan fase diam. Pemisahan
ini terjadi pada tekanan tinggi dan suhu tinggi. Komponen dalam campuran sampel
dengan afinitas tinggi untuk fase diam akan tinggal di kolom lama dan yang kurang
afinitasnya untuk fase diam akan mengelusi. Tingkat afinitas atau interaksi dengan
fase diam pada molekul telah diatur berdasarkan struktur, sifat, dan sifat kimia fase
diam yang digunakan.
Prasyarat sampel KG harus mudah menguap, mengingat bahwa monosakarida
tidak mudah menguap, monosakarida harus diderivatisasi lebih dahulu untuk
dianalisis.

a. Derivatisasi
Monosakarida netral yang paling sering diderivatisasi menjadi alditol asetat lebih
dahulu sebelum dianalisis dengan KG. Unsur-unsur penting dari prosedur
derivatisasi ini adalah reduksi gula netral menjadi alditol dan selanjutnya
diasetilasi. Asetat alditol yang dihasilkan kemudian dilarutkan dalam pelarut yang
cocok dan disuntikkan ke dalam kolom KG. Gula Asam diperlakukan berbeda
untuk menghasilkan trimetilsilil (TMS) derivatif. Proses derivatisasi ditunjukkan
pada reaksi di atas.
1) Gula Murni
Bahan awal harus sampel kering dari satu atau lebih monosakarida. Bahan
polisakarida pertama harus dihidrolisis dan asam dihilangkan sebelum analisis.
Asam trifloroasetat bekerja dengan baik untuk tujuan ini karena mudah
menguap dan dapat dengan mudah dihilangkan dengan penguapan putar.
Sampel kering yang mengandung sejumlah kecil monosakarida (~ 10mg)
ditimbang secara akurat dan inositol heksaasetat (standar internal) dicampur
dengan larutan natrium borohidrida dalam amonium hidroksida mengkonversi
monosakarida menjadi alditols. Asam asetat ditambahkan untuk mengasamkan
sampel dan menghancurkan kelebihan natrium borohidrida setelah reaksi.
Campuran dikeringkan (dengan rotary evaporator atau dialiri nitrogen) dan
metanol ditambahkan dan dihilangkan dengan aliran nitrogen beberapa kali.
Perlakuan dengan metanol menghilangkan ion borat sebagai metil borat yang
volatil. Bila bagian akhir dari metanol telah dihilangkan dan sampel kering,
yaitu campuran alditol diasetilasi dengan menambahkan anhidrida asetat dan
pemanasan pada 121C selama beberapa jam. Beberapa tetes air ditambahkan
ke dalam vial untuk menghancurkan sisa reaksi anhidrida asetat dan seluruh
campuran dikeringkan. Alditol asetat yang dihasilkan dilarutkan dalam metilen
klorida dan dianalisis dengan KG.
2) Asam Gula
Seperti polisakarida netral, polisakarida yang mengandung asam uronat harus
dihidrolisis dan dikeringkan sebelum analisis.
Sampel yang mengandung sejumlah kecil karbohidrat (~ 10 mg) ditimbang
akurat, dilarutkan dalam natrium karbonat dan kemudian diperlakukan dengan
natrium borohidrida. Asam asetat ditambahkan untuk menghancurkan
kelebihan borohidrida dan ion borat dihilangkan dengan metanol seperti yang
dijelaskan untuk monosakarida netral. Campuran yang dihasilkan dari asam
aldonat dan aldosa (dari gula netral jika ada) dibuat menjadi turunan TMS
dengan memperlakukan residu kering dengan campuran yang mengandung
piridin, heksametildisilazane, dan asam trifloro asetat. Standar internal, seperti
dokosan, dapat digunakan untuk kuantifikasi.
b. Keuntungan/Kerugian
Keuntungan analisis karbohidrat dengan KG adalah teknik yang baik dan banyak
metode yang telah dioptimasi, membutuhkan ukuran sampel jumlah kecil dan
sangat sensitif. Kerugian dari teknik ini terutama dari langkah-langkah persiapan.
Jika salah pengurangan atau langkah-langkah asetilasi tidak dilanjutkan sampai
selesai, jumlah diderivatisasi gula akan di bawah perkiraan.

3. High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
Mirip dengan KG, HPLC adalah teknik pemisahan di mana senyawa dalam campuran
dipisahkan pada fase diam. Dalam kasus ini, fase gerak (eluen) yang berisi sampel dan
fase diam keduanya cairan.
Kinerja tinggi anion kromatografi penukar (HPAEC), pilihan yang semakin populer
untuk pemisahan karbohidrat, ditandai dengan fase diam anionik dan fase gerak
dengan pH yang tinggi. Pada pH tinggi (10 sampai 14), karbohidrat gugus hidroksil
mengion dan pemisahannya didasarkan pada perbedaan afinitas untuk muatan
berlawanan fase diam dan fase gerak.
a. High Performance Anion Exchange Chromatography (HPAEC)
Jenis kromatografi ini didasarkan pada kenyataan bahwa karbohidrat dalam
lingkungan basa kuat akan mengioni, sehingga membuatnya bisa dipisahan pada
kolom penukar ion. Kolom HPAEC digunakan untuk karbohidrat yang dilapisi
dengan anion penukar resin. Sebagai contoh, Dionex (Sunnyvale, CA) kolom PA1,
dioptimasi untuk pemisahan mono-, di-, oligo dan polisakarida BM rendah. Sistem
HPAEC biasanya menggunakan natrium hidroksida sebagai eluen untuk
memisahkan mono- dan disakarida, sementara eluen untuk molekul yang lebih
besar sering termasuk natrium asetat untuk meningkatkan kekuatan ioniknya.
Detektor untuk HPAEC adalah Pulse Amperometric Detector (PAD). Secara
umum, amperometry mengukur perubahan arus yang dihasilkan dari oksidasi atau
pengurangan senyawa pada elektroda.
b. Kuantifikasi
Menghitung jumlah setiap individu mono-, di-, oligo-atau polisakarida dari
kromatogram HPAEC cukup sederhana yang disediakan 4 sampai 5 pengenceran
standar yang sesuai dijalankan dengan satu set sampel. Perangkat lunak terkait
dengan sistem HPLC akan mengintegrasikan puncak, menyediakan area peak /
ketinggian, dan memberikan nilai konsentrasi yang disediakan standar dengan
konsentrasi diketahui telah dijalankan. Untuk heksosa memerlukan faktor
konversi 0,90 dan untuk pentosa 0,88.
c. Keuntungan/Kerugian
Keuntungan dari HPAEC untuk analisis karbohidrat adalah bahwa sampel tidak
memerlukan derivatisasi dan cukup cepat. Kerugian dari HPLC berasal dengan
sistem deteksi yang sebagian besar sangat tidak sensitif. Detektor indeks bias
merupakan detektor yang dipilih karena lebih sensitif, misalnya UV atau detektor
fluoresensi tidak cocok untuk menganalisis karbohidrat karena karbohidrat tidak
mengandung gugus yang merespon sistem deteksi ini.

4. Analisis Enzimatik
Metode ini digunakan untuk menentukan kandungan gula yang
mempercayakan pada kemampuan enzim untuk mengkatalisis suatu reaksi spesifik
dan menggunakan metode yang sesuai untuk memonitoring perkembangan reaksi atau
konsentrasi dari produk reaksi. Metode enzimatik sangat spesifik, biasanya cepat dan
sensitif untuk konsentrasi gula yang rendah.
a. Analisis Glukosa
1) Teori Reaksi
Salah satu yang paling awal dan paling luas menggunakan enzim untuk
penentuan kuantitatif glukosa adalah glukosa oksidase. Enzim yang spesifik
yang dapat diperoleh dari Penicillium notatum dan Aspergillis niger,
mengkatalisis oksidasi (kehilangan 2 atom hidrogen) dari beta-D-
glukopiranosa menjadi D-glukono-1,5-lakton, yang merupakan spesies yang
menghidrolisis menghasilkan asam D-glukonat. Reaksi dari glukosa dengan
glukosa oksidase juga menghasilkan H
2
O
2
dengan perbandingan 1:1.
Metode awal untuk mendeteksi jumlah glukosa dalam sampel setelah diberi
perlakuan dengan glukosa oksidase bergantung pada asam glukonat yang
terbentuk saat titrasi secara volumetrik. Saat ini, metode kolorimetri
berdasarkan penggunaan glukosa oksidase lebih umum. Dalam reaksi ini
peroksidase digunakan dalam kombinasi dengan kromogen untuk
menghasilkan kompleks berwarna dengan adanya H
2
O
2
. Glukosa dioksidasi
untuk menghasilkan asam glukonat dan peroksida dengan adanya glukosa
oksidase dan peroksidase mengkatalisis oksidasi dari kromogen (contohnya o-
dianisida) dengan adanya H
2
O
2
, dengan demikian penghitungan kuantitatif
secara spektrofotometri ketika kurva standar yang tepat telah ditetapkan.

Heksokinase adalah enzim lain yang sering digunakan pada penentuan
kuantitatif glukosa. Glukosa bereaksi dengan heksokinase dengan adanya
adenosine trifosfat (ATP) membentuk glukosa-6-fosfat dan adensin difosfat
(ADP). Glukosa-6-fosfat bereaksi dengan glukosa-6-fosfat dehydrogenase
dengan adanya adenin nikotinamid dinukleotida (NAD) memproduksi 6-
fosfoglukonat dan NADH. Konsentrasi NADH dihitung secara
spektrofotometri pada 340 nm atau reaksi dimodifikasi dengan penentuan
secara kolorimetri.

2) Prosedur (Glukosa Oksidase)
Sampel dicampur dengan larutan buffer yang mengandung glukosa oksidase,
peroksidase, dan kromogen dan diinkubasi pada suhu yang terkontrol dalam
waktu tertentu sesuai dengan metode analisis yang dipilih. Setelah beberapa
waktu untuk pengembangan warna, absorbansi dibaca pada panjang gelombang
yang tepat. Sebagai contoh, ketika menggunakan o-dianisodin HCl sebagai
kromogen dalam buffer asetat 0,1 M pH 5,5, larutan sampel diinkubasi pada
suhu 30oC selama 5 menit dan absorbansinya pada 525 nm berlawanan dengan
reagen blanko.
3) Kuantifikasi
Sebuah kurva kalibari dibuat dengan memplot absorbansi vs konsentasi untuk
5 larutan glukosa berbeda. Kuantifikasi diperoleh menggunakan kurva
kalibrasi.
b. Analisis Galaktosa dan Laktosa
D-galaktosa telah diuji secara enzimatik menggunakan galaktosa dehydrogenase
dan glukosa oksidase. Adanya oksigen, galaktosa dioksidasi menjadi D-galakto-
heksodialdo-1,5-piranosa oleh galaktosa oksidase. Reaksi ini menghasilkan
hidrogen peroksida yang dapat diukur secara kolorimetri dengan adanya pendonor
hidrogen. Secara terurut, D-galaktosa dioksidasi menjadi asam galaktonat oleh
NAD ketika ada beta-galaktosa dehydrogenase dan hasil pembentukan NADH
dapat dimoditor secara spektrofotometri. Laktosa dapat juga dideteksi sebagai
galaktosa setelah perlakuan dengan beta-galaktosidase, sebuah enzim yang
mengkatalisis hidrolisis laktosa menjadi D-glukosa dan D-galaktosa. Galaktosa
dan laktosa dapat ditentukan dalam sebuah sampel dengan mengkoreksi
kandungan laktosa dari sampel yang diperoleh setelah pencernaan -Galac-
tosidase dengan mengurangi galaktosa bebas ditentukan dalam tidak adanya
enzim.
1) Teori Reaksi
Galaktosa dioksidasi menjadi asam galaktonat oleh NAD dengan adanya
galaktosa dehydrogenase. NADH dihasilkan pada reaksi ini berada dalam
larutan pada konsentrasi sebanding dengan kandungan galaktosa.

2) Prosedur
Sampel yang mengandung galaktosa dicampur dengan buffer mengandung
NAD, absorbansi awal pada 340 nm dan diukur kembali setelah inkubasi
dengan galaktosa dehidrogenase. Laktosa yang mengandung sampel pertama-
tama harud diberi perlakuan dengan beta-galaktosidase untuk mengkonversi
laktosa menjadi glukosa dan galaktosa dan diinkubasi dengan galaktosa
dehidrogenase. Galaktosa dan laktosa dapat ditentukan dalam satu pengujian
menggunakan kedua enzim ini.
3) Kuantifikasi
Jumlah NADH yang terbentuk stoikiometri dengan jumlah galaktosa dalam
sampel. Perbedaan absorpsi sampel dan blanko harus ditentukan dahulu
dengan mengurangkan nilai absorbansi awal (sebelum penambahan galaktosa
dehidrogenase) dari nilai absorbansi akhir (setelah penambahan galaktosa
dehidrogenase).
4) Penerapan
Uji ini berlaku untuk menentukan konsentrasi galaktosa dalam larutan yang
bebas dari lemak dan protein. Sampel yang akan dianalisis harus jelas dan
kurang dari 0,5 g / L total galaktosa dan laktosa. Sampel yang mengandung
protein dapat diberi perlakuan dengan asam perklorat atau Carrez reagen, yang
mengendapkan protein dan menyerap beberapa senyawa berwarna.
Uji enzimatik untuk laktosa dan galaktosa dapat digunakan untuk banyak
produk makanan yang berbeda, termasuk daging, susu, dan produk roti,
disediakan perlakuan sampel mencakup langkah-langkah untuk mengekstrak
gula dan menghilangkan senyawa penganggu. Galaktosa dehidrogenase juga
mengoksidasi L-arabinosa, oleh karena itu, kehadiran arabinosa akan
mengganggu analisis.
c. Analisis Fruktosa, Glukosa, dan Sukrosa
1) Teori Reaksi
Fruktosa dapat diuji secara kuantitatif menggunakan heksokinase. Glukosa dan
fruktosa dapat diuji bersama mennngunakan heksokinase, glukosa-6-fosfat
dehydrogenase dan fosfoglukosa isomerase (PGI) untuk mengkatalisis reaksi
spesifik. Adanya ATP dan heksokinase, glukosa dan fruktosa difosforilasi
menjadi glukosa-6-fosfat dan fruktosa-6-fosfat (F-6-P). penambahan NAD dan
glukosa-6-fosfat dehydrogenase mengoksidasi G-6-P menjadi glukonat-6-
fosfat dan menghasilkan NADH yang dapat diukur pada 340 nm. Penambahan
fosfoglukosa isomerase mengubah F-6-P manjadi G-6-P yang kemudian
dioksidasi menjadi glukonat-6-fosfat dengan adanya NAD dan membentuk
NADH. Sukrosa jug adapt diuji dengan heksikinase atau glukosa oksidase
yang terlebih dahulu diberi perlakuan dengan invertase untuk melepaskan
glukosa dan fruktosa.

2) Prosedur
Buffer, NAD, ATP, dan larutan sampel mengandung glukosa dan fruktosa
dicampur dalam tabung uji. Campuran dari heksokinase dan glukosa-6-fosfat
dehydrogenase ditambahkan dan setelah didiamkan beberapa saat, absorbansi
larutan diukur pada 340 nm. Absorbansi diukur kembali setelah penambahan
fosfoglukosa isomerase.


3) Kuantifikasi
Glukosa diukur dari nilai absorbansi yang diperoleh setelah menambahkan
heksokinase dan dehidrogenase glukosa-6-fosfat. Untuk mengukur fruktosa
dalam sampel yang sama, nilai absorbansi dibaca setelah menambahkan
fosfoglukosa isomerase yang dikoreksi untuk nilai absorbansi glukosa awal.
Jumlah NADH yang dihasilkan stoikiometri dengan jumlah glukosa dan
fruktosa.
4) Penerapan
Metode ini sesuai untuk penentuan glukosa dan fruktosa dalam banyak varietas
yang berbeda dari bahan makanan termasuk selai, madu, dan es krim, selama
mereka telah diperlakukan untuk menghilangkan zat mengganggu seperti lipid
dan protein. Sampel harus jelas, relatif tidak berwarna, dan bebas dari bahan
endapan. Larutan yang keruh atau mengandung campuran materi penganggu
dapat disaring atau diperlakukan dengan reagen Carrez.
d. Analisis (13) (14)--D-Glukan
1) Teori Reaksi
(13) (14)--D-Glukan merupakan dinding sel polisakarida yang ditemukan
dalam jumlah yang banyak di sereal padi-padian seperti oats dan gandum,
sedangkan jumlah yang sedikit ditemukan pada terigu dan dandum hitam. -
glukan dari sereal gandum telah diteliti lebih dari beberapa dekade berdasarkan
manfaat kesehatan menurunkan kadar glukosa darah dan menurunkan kadar
kolesterol serum. Analisis dari -glukan dapat menggunakan hidrolisis
enzimatik dengan (13)(14)--D-glukan-4-glukanohidrolase untuk
membentuk oligosakarida dan kemudia dihdrolisis dengan -glukosidase.
Pelepasan glukosa diuji dengan glukosa oksidase seperti tercantum pada sub
Analisis Glukosa.

2) Prosedur
Sampel kering ditimbang secara akurat (biasanya tepung atau gilingan)
dicampur dengan buffer fosfat (pH 6,5), dididihkan dan diaduk. Campuran
diinkubasi dengan lichenase kemurnian tinggi pada suhu 50
o
C, campur dengan
buffer natrium asetat (pH 4,0) dan disentrifuge. Sejumlah supernatant diberi
perlakuan dengan glukosidase dan sisanya dengan buffer asetat sebagai blanko.
Setelah inkubasi pada suhu 40
o
C dengan glukosidase, sampel dicairkan dan
glukosa ditentukan secara enzimatik dengan metode glukosa oksidase-
peroksidase. Standar mengandung 50 dan 100 g/ml glukosa, reagen blanko
(mengandung buffer asetat dan reagen glukosa oksidase-peroksidase) dan
tepung kontrol dengan nilai -glukan yang diketahui disiapkan.
3) Kuantifikasi
Nilai absorbansi dari standar glukosa yang digunakan untuk mengevaluasi
persen glukosa dalam sampel. Ketika menghitung glukosa persen, penting
untuk menyertakan faktor konversi 0,9 untuk memperhitungkan perbedaan
berat molekul glukosa bebas vs glukosa dalam polisakarida.
4) Penerapan
Uji ini cocok untuk digunakan dengan tepung kering dan fraksi penggilingan
biji-bijian sereal seperti gandum, oat, barley, gandum, dan sereal tanpa
pemanis memberikan semua hal di atas telah digiling dan melewati ayakan
mesh 0,5 mm. Uji ini juga dapat digunakan untuk sampel yang mengandung
gula sederhana dengan mengekstraksi sampel dengan 50% etanol untuk
menghilangkan gula (yang dapat meningkatkan nilai glukosa yang diukur)
terlebih dahulu deberi perlakuan lichenase. Untuk sampel yang berbeda,
langkah ujinya telah dimodifikasi dan dioptimasi.
e. Analisis Galaktomanan
Galaktomanan adalah polisakarida yang terdiri dari -14 terikat substituen
manosil diganti pada posisi C6 dengan -galaktosa. Jumlah dari substituen yang
diganti tergantung pada sumber galaktomanan, contohnya galaktomanan dari guar
memiliki galaktosa:manosa (G:M) perbandingan 1:2 sementara perbandingan
untuk locust bean gum (carob gum) adalah 1:4. Metode enzimatik secara
kuantitatif untuk galaktoman dikembangkan berdasarkan pada perbandingan G:M
yang diketahui.
1) Teori Reaksi
Konsentrasi galaktoman dalam sampel ditentukan dari jumlah galaktosa yang
dilepaskan oleh -galaktosidase setelah pencernaan -mannanase. Galatosa
dihitung secara spektrofotometri setelah perlakuan dengan NAD dan galaktose
dehydrogenase.

2) Prosedur
Sampel berupa tepung kering dari guar atau locust bean gum diekstraksi
dengan etanol 80% untuk menghilangkan gula sederhana dan oligosakarida
yang mungkin mengandung galaktosa. Galatomanan dilarutkan dengan
pemanasan tepung dalam bufferdiikuti dengan inkubasi pada suhu 40
o
C
dengan -mannanase. Campuran sampel disentrifugasi untuk memisahkan
materi tak terlarutnya dan sejumlah supernatant diinkubasi dengan -
galaktosidase untuk melepaskan galaktosa dan sisa supernatant lainnya diberi
perlakuan dengan buffer asetat sebagai dan dijadikan blanko. Galaktosa secara
kuantitatif ditentukan dalam sampel setelah perlakuan dengan NAD dan
galaktose dehidrogenase.
3) Kuantifikasi
Nilai absorbansi blanko dikurangkan dari absorbansi sampel dan hasilnya
digunakan untuk penentuan galaktosa secara kuantitatif. Rata-rata persentase
galaktosa dalam guar dan locust bean gum adalah 38 dan 22%.

C. Analisis Oligosakarida
Oligosakarida adalah karbohidrat yang terdiri dari dua dan sepuluh residu
monosakarida yang terikat glikosidik. Sakarida dengan DP lebih besar dari 10 yang sering
disebut sebagai oligosakaarida. Misalnya, inulin, rafinosa dan stachyose, tri-dan
tetrasakarida terdiri dari galaktosa, glukosa, dan fruktosa yang ditemukan dalam kacang-
kacangan. Oligosakarida umum lainnya dalam makanan adalah dekstrin atau hidrolisat
pati, maltodekstrin dan terutama digunakan untuk menambahkan massal untuk produk
makanan serta mereka viskositas-memodifikasi dan pembentuk film.
Analisis oligosakarida dilepaskan melalui hidrolisis asam parsial atau serangan
enzimatik adalah teknik yang sering digunakan untuk memberikan informasi berharga
tentang struktur molekul. Sebagai contoh, (1 4) yang terikat pada (1 3) unit glukosa
dalam campuran terikat pada (1 3) (1 4)--D-glukan dipecah oleh (1 3) (1 4)-
-D-glukan-4-glukanohidrolase (lichenase). Oligosakarida dibebaskan dari pencernaan
lichenase dari -glucan terutama 3-O--cellobiosyl dan 3-O--cellotriosyl-D-glukosa.
Analisis oligosakarida ini dengan demikian merupakan langkah penting dalam memahami
sepenuhnya polisakarida induk.
Metode untuk menganalisis oligosakarida mirip dengan metode untuk
menganalisis monosakarida. Sebagai contoh, ekstraksi oligosakarida dari produk makanan
dicapai seperti untuk monosakarida, dengan etanol 80% panas. Mereka dapat dihidrolisis
dengan asam atau enzim untuk konstituen mereka monosakarida dan hidrolisat dikenakan
analisis dengan kromatografi, kimia, atau metode enzimatik. Selain itu, teknik eksklusi
ukuran dapat digunakan untuk memisahkan campuran oligosakarida berdasarkan ukuran.
1. Komposisi Monosakarida
Komposisi monosakarida oligosakarida dapat ditentukan oleh hidrolisis (asam
atau enzimatik) diikuti dengan metode yang cocok untuk mengidentifikasi
monosakarida yang diursikan. Monosakarida Dirilis dapat diidentifikasi dengan
menggunakan teknik kromatografi (HPLC, GC).

2. Size Exclusion Chromatography (SEC)
Kromatografi ekslusi ukuran adalah teknik kromatografi dimana molekul
dalam sampel dipisahkan berdasarkan ukuran mereka. Molekul dalam aliran eluan
(biasanya buffer) diarahkan ke dalam kolom berisi dengan gel berpori. Molekul yang
lebih kecil dalam sampel akan ditahan oleh pori, sehingga membutuhkan lebih banyak
waktu melewati kolom dan elusinya lambat dibandingkan molekul yang lebih besar
yang pada terelusi pada kolom lebih dulu. Detektor indeks bias sering digunakan
sendiri atau dalam kombinasi dengan detektor hamburan cahaya dan/atau detektor
viskosmetrik.
Dekstrin, atau hidrolisat pati, dapat menjadi campuran yang agak rumit dari
oligosakarida dengan ukuran dan proporsi oligomer linier dan bercabang bervariasi
tergantung pada bahan awal (pati beras, pati jagung, dll) dan metode hidrolisis (enzim,
asam) bahkan ketika DE adalah sama. Dekstrin dari DE berkisar 4-25 dianalisis pada
sistem SEC dilengkapi dengan multi-sudut detektor cahaya-hamburan, memungkinkan
perolehan informasi sehubungan dengan distribusi berat molekul. Dalam kombinasi
dengan kinerja tinggi kromatografi pertukaran anion (HPAEC), yang memberikan
informasi tentang terjadinya relatif oligosakarida individu, SEC ditambah dengan
berat detektor sensitif molekul diperbolehkan dekstrin lebih lengkap
profil sampel dari nilai DE saja (yang hanya mencerminkan jumlah mengurangi
ujungnya). Salah satu kelemahan dari sistem SEC adalah waktu yang diperlukan untuk
menganalisis sering membutuhkan beberapa jam atau bahkan berhari-hari.

3. High Performance Anion Exchage Chromatography (HPAEC)
Tidak seperti analisis monosakarida, di mana fase gerak biasanya natrium
hidroksida saja, fase gerak untuk oligosakarida mengandung sodium asetat juga untuk
meningkatkan kekuatan ionik dan untuk memastikan pendorongan oligosakarida dari
kolom. Kolom Dionex Carbopac PA1 telah digunakan untuk memisahkan dekstrin
hingga DP 30
40
menggunakan kombinasi fase gerak dari 80% A dan 20% B pada
waktu nol dengan gradien linier sampai 90% B dan 10% A (di mana A = 100 mM
NaOH dan B = 100 mM NaOH mengandung 600 mM NaOAc). Dalam hal ini,
dekstrin berupa sampel kering diencerkan dengan air secukupnya dan disaring (filter
0,45 um) sebelum injeksi. HPAEC juga telah digunakan sebagai teknik preparatif
untuk memisahkan oligosaccharides dalam bir. Sekali lagi, menggunakan buffer
NaOH / NaOAc. Oligosakarida (terdiri dari glukosa, galaktosa, dan xylose) diurai oleh
aksi dari selulase pada biji xyloglukan dipisahkan pada kolom CarboPak PA100
(Dionex, Sunnyvale, CA) menggunakan gradien elusi dari natrium hidroksida dan
natrium buffer asetat. Oligosakarida seperti isomaltose, kojibiose, gentiobiose,
nigerose, dan maltosa dari berbagai varietas madu juga telah dipisahkan menggunakan
HPAEC-PAD.
Tidak terbatas pada pemisahan oligosakarida netral, asam oligogalakturonat
dari jus strawberry telah dipisahkan pada sistem HPAEC menggunakan
gradient natrium hidroksida dan kolom CarboPac PA-100.
Asam oligogalaturonat hasil dari depolimerasi pektin enzimatik dipisahkan pada
kolom Mono-Q anion exchange (Pharmacia, Upsala, Swedia) menggunakan pengelusi
gradien (Na
2
SO
4
dalam buffer fosfat) dan terdeteksi pada detektor fotodioda array.
Kerugian utama menggunakan HPAEC-PAD untuk menganalisis oligosakarida
adalah tidak adanya standar yang memadai untuk berbagai jenis oligosakarida
(oligosakarida dari -glucan, malto-oligosakarida lebih dari DP 7). Selain itu, detektor
pulsed amperometric tidak sesuai untuk semua jenis sampel dan, pada kenyataannya,
respon detektor menurun dengan kenaikan DP.



4. Analisis Enzimatik
Hidrolisis enzimatik oligosakarida ditambah dengan pemisahan kromatografi dan
identifikasi penguraian oligosakarida umumnya digunakan untuk mengukur
oligosakarida pada sistem makanan sederhana dan kompleks. Metode ini telah berhasil
diterapkan untuk analisis frukto-oliosakarida dan inulin. Inulin dan oligofruktosa
adalah fruktans, (2 1) terikat pada unit -D-fructofuranosyl dengan atau tanpa
glukosa terminal, ditemukan secara alami dalam sawi putih, Jeruselem artichoke, dan
bawang. Kedua inulin dan oligofruktosa adalah campuran polydisperse dengan nilai
masing-masing DP berkisar antara 2 sampai 60 dan 2 sampai 10.
Kedua inulin dan oligofruktosa dalam produk pangan dapat diukur dengan
menundukkan ekstrak air panas untuk perlakuan enzimatik yang memungkinkan
penentuan fructan berdasarkan perbedaan (kadar gula sebelum dan sesudah
perlakuan). Fruktosa dan sukrosa bebas ditentukan dalam sampel asli, glukosa bebas
dan glukosa dari pati ditentukan setelah perlakuan amiloglukosidase, dan glukosa total
dan fruktosa total yang ditentukan setelah hidrolisis fruktozim. HPAEC-PAD cocok
untuk analisis hidrolisat enzim ini karena memungkinkan resolusi dasar dari semua
gula dan memfasilitasi kuantifikasi langsung.
Sebuah metode telah dikembangkan untuk ekstraksi, deteksi, dan kuantifikasi
inulin dalam produk daging. Inulin diekstrak dari produk daging di pelarut air panas,
diberi perlakuan dengan inulinase, dan menguraikan fruktosa diukur dengan HPLC
dengan deteksi RI. Jumlah inulin dan oligofruktosa ditentukan dengan mengurangi
jumlah fruktosa bebas (diperoleh dari blanko tanpa enzim) dari fruktosa total dalam
sampel setelah perlakuan enzim.
Fruktan dapat ditentukan sebagai glukosa dan fruktosa setelah hidrolisis enzim
menggunakan metode kimia/spektrofotometri. Metode ini menggunakan p-
hidroksibenzoat asam hydrazide (PAHBAH) untuk mengukur fruktan sebagai gula
reduksi setelah perlskusn dengan fruktanase. Fructans diekstraksi dalam air panas dan
ekstrak diperlakukan dengan suksesi enzim untuk memecah sukrosa menjadi glukosa
dan fruktosa dan pati menjadi glukosa. Monosakarida yang dilepaskan direduksi
menjadi gula alkohol untuk menghindari gangguan dalam uji fruktan. Fruktanase
ditambahkan untuk melepaskan fruktosa dan glukosa dari fruktan dan sejumlah gula
reduksi berada dalam larutan kemudian ditentukan dengan metode asam p-
hidroksibenzoat hydrazide dimana warna yang dihasilkan oleh reaksi diukur pada 410
nm.
D. Analisis Dietary Fiber (Serat Makanan)
1. Defenisi Dietary Fiber
Serat makanan adalah bahan dinding sel tanaman yang tahan terhadap enzim
pencernaan. Definisi ini kemudian diperluas untuk mencakup semua polisakarida yang
tidak dapat dicerna seperti gelatin, mucilago, selulosa yang dimodifikasi,
oligosakarida, dan pektin. Definisi itu diperluas karena zat tambahan tersebut
berperilaku fisiologis dengan cara mirip dengan senyawa yang termasuk dalam
defenisi serat makanan tersebut, mereka dapat dimakan dan tidak dicerna dan diserap
dalam usus kecil. Definisi AACC, tentang serat makanan adalah sebagai berikut:
Serat makanan adalah bagian yang dapat dimakan dari tanaman atau karbohidrat
analog yang resisten terhadap pencernaan dan penyerapan di usus kecil manusia
dengan fermentasi lengkap atau parsial pada usus besar. Serat makanan termasuk
polisakarida, oligosakarida, lignin, dan tanaman yang mengandung zat serat
makanan. Serat makanan memberikan efek fisiologis menguntungkan termasuk
laksasi, atau penurunan kolesterol darah atau penurunan glukosa darah.

2. Analisis Dietary Fiber
a. Metode Uppsala
Ada dua pendekatan yang berbeda secara fundamental untuk menganalisa serat
makanan. Metode Uppsala untuk mengukur gula netral, asam uronat (bahan
pektik), dan Klason lignin (serat makanan nonkarbohidrat termasuk lignin, tanin,
dan proteinatous) dan menjumlahkan komponen-komponen ini untuk
mendapatkan nilai serat makanan. Sampel pertama-tama direaksikan dengan
amilase dan amiloglukosinase untuk menghilangkan pati. Hidrolisat pati dan gula
BM rendah dipisahkan dari serat larut menggunakan etanol 80% meninggalkan
residu yang mengandung serat larut dan tidak larut. Gula netral ditentukan setelah
derivitisasi sebagai asetat alditol dengan GC, asam uronat yang diuji secara
kolorimetri, dan Klason lignin ditentukan secara gravimetri.
b. Enzimatik/ Metode Gravimetri
Metode kedua adalah pengukuran berdasarkan perbedaan di mana residu serat
makanan diisolasi, dikeringkan, ditimbang, dan kemudian berat ini disesuaikan
untuk nondietary bahan serat (yaitu, protein dan abu). Metode enzimatik-
gravimetri mereaksikan sampel untuk suksesi enzim (-amilase, miloglukosidase,
protease) untuk mengurangi material tercerna, langkah pengendapan etanol untuk
mengisolasi polisakarida non pati, dan terakhir penentuan abu dan protein. Jumlah
protein dan abu dikurangi dari berat residu kering untuk mendapatkan total nilai
serat makanan.