Professional Documents
Culture Documents
Oleh:
SWASTIKA OKTAVIA
B1J007013
Oleh
SWASTIKA OKTAVIA
B1J007013
Hardi Febrianto
B1J006128
PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat,
hidayah dan karunia-Nya sehingga laporan praktikum yang berjudul Isolasi dan
Identifikasi Lactobacillus spp. dan Pewarnaan Bakteri Tahan Asam dapat disusun
dengan baik. Laporan praktikum mata kuliah Bakteriologi ini disusun sebagai
prasyarat mengikuti ujian akhir praktikum mata kuliah Bakteriologi di Fakultas
Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.
Penulis ingin menyampaikan terimakasih kepada :
1. Seluruh staf dosen pengampu mata kuliah Bakteriologi di Fakultas Biologi
Universitas Jenderal Soedirman.
2. Seluruh asisten Bakteriologi yang telah memberikan waktu dan mengarahkan
pelaksanaan praktikum Bakteriologi.
3. Semua pihak yang telah membantu penyusunan laporan ini yang tidak dapat
penulis sebutkan satu per satu.
Penulis menyadari bahwa laporan praktikum Bakteriologi ini jauh dari
sempurna, karena itu penulis mengharapkan kritik dan saran demi sempurnanya
laporan ini.
Penulis
DAFTAR ISI
Halaman
A. Latar Belakang
spesies yang asing atau spesies yang belum diketahui namanya. Morfologi suatu
mikroba dapat diperiksa dalam keadaan hidup maupun mati. Bagian-bagian sel
mikroba dapat dilihat dengan memberi warna terlebih dahulu, dimana warna bisa
berbagai habitat seperti materi tanaman, hewan, tanah, limbah, aliran air, dan
mikroorganisme tertentu. Teknik ini disebut isolasi. Isolasi yaitu suatu usaha
uji. Ketika suatu organisme tidak dapat diidentifikasi atau seperti spesies asing,
kita dapat menduga mungkin kultur tersebut tidak murni, atau kita sudah membuat
terletak pada banyaknya uji yang dilakukan, tetapi pada hasil dari uji tersebut.
Pernyataan ini tidak sepenuhnya benar, karena kebanyakan taksonomi saat ini
mendukung konsep yang menyatakan bahwa untuk klasifikasi, bobot yang sama
harus diberikan terhadap masing-masing karakter atau ciri. Hubungan antar strain
(Ketchum, 1984), atau dengan menjumlahkan antara ciri-ciri yang positif dan
yang negatif. Hasil dari perbandingan ini dapat dianalisa secara laborat melalui
tujuan identifikasi kita memberikan bobot yang tinggi untuk beberapa karakter
karena mempunyai nilai perbedaan yang sangat besar, dan memberikan bobot
yang kecil untuk yang lain, atau bahkan tidak samasekali untuk karakter tertentu.
bakteri asam laktat (BAL). Habitat Lactobacillus ini sangat luas dan beragam
karena produk-produk makanan yang memanfaatkan bakteri ini telah teruji dapat
A. Materi
Alat yang digunakan dalam praktikum adalah pipet ukur, tabung reaksi,
alkohol 95%, crystal violet, safranin, lugol iodine, pepton water, media selektif
Man Rogosa Sharpe Agar (MRSA), medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA),
mannosa, raffinosa, galaktosa, reagen H2O2, Nitrate Broth, Nitrate Reagent A dan
sampel.
B. Metode
1. Dipilih satu koloni yang nampak terdiri dari satu tipe sel
primer kesatu atau kedua dan kemudian dilanjutkan streak sekunder tanpa
3. Biakan lalu difiksasi dan digenangi dengan gram A atau crystal violet,
5. Biakan lalu ditetesi dengan gram B atau lugol iodine dan dibiarkan selama
1 menit.
8. Biakan lalu ditetesi dengan gram D atau safranin dan dibiarkan selama 45
detik
f. Uji Motilitas
j. Uji Katalase
3. Perubahan diamati, hasil positif jika terbentuk gelembung gas dan hasil
3. Perubahan diamati, hasil positif jika media berubah warna dari ungu
menjadi kuning dan hasil negatif jika media tetap berwarna ungu.
1. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium cair Nitrate Broth sebanyak 1 ose
7. Jika tidak terbentuk warna merah tua selama 5 menit ditambahkan bubuk
seng dan didiamkan, jika terbentuk warna merah menandakan uji negatif
Data-data yang diperoleh dibandingkan dengan data karakter dari bakteri yang
telah diketahui.
Persen homologi ditentukan dengan rumus:
dengan tujuan untuk mendapatkan strain unggul yang diinginkan serta memelihara
kultur isolasi tersebut dalam metode isolasi dan pemeliharaan kultur hasil isolasi.
Langkah selanjutnya yang penting untuk mendapatkan isolat agar tetap bertahan
hidup dan stabil dalam pertumbuhannya adalah dengan metode pretreatment atau
metode penapisan khusus. Metode penapisan khusus ini adalah metode isolasi
dengan pendekatan baru berupa produk yang diinginkan. Metode isolasi lain
adalah dengan pendekatan baru berupa pencapaian atau perolehan suatu produk
DNAnya. Dari hasil isolasi DNA, maka dapat dianalisis sekuens 16S DNAnya
(Ketchum, 1984).
dapat sekaligus melihat bentuk sel mikroba tersebut. Hasil ujinya kemudian
dibandingkan dengan hasil uji standar, sehingga dapat diketahui genus bahkan
mencocokkan urutan basa gen 16 S isolat uji dengan data yang ada pada
pangkalan data gen/ gen bank, kemudian dianalisis kedekatan hubungan dan
pada makanan fermentasi, produk olahan ikan, daging, susu, dan buah-buahan.
Keberadaan bakteri ini tidak bersifat patogen dan aman bagi kesehatan sehingga
Tabel 1. Pengamatan Morfologi Sel, Uji TSIA, Motilitas, Katalase dan Suhu
Suhu
Kelompok TSIA Motilitas Katalase Gram
45 C 15 C
1 S: Merah Motil - + + +
B: Hitam
2 Menghasilkan Non - + - -
Gas, Warna motil
Tetap
3 Pecah/terangkat Non - + + -
motil
4 S : Merah Motil - + + -
B : Hitam
Uji O2
Kelompok
Rafinosa Mannosa Galaktosa Permukaan Tengah Dalam
1 - + + - - -
2 - + + + + +
3 - + + + + +
4 - + + - - -
metabolisme dan fisiologi yang memiliki karakter umum. Bakteri ini termasuk
dalam kelompok gram positif, non motil, tidak membentuk spora, katalase negatif,
tepian halus, elevasi cembung, permukaan halus mengkilap, dan berwarna putih
sp. adalah bentuk koloni bulat, tepian halus, elevasi cembung, permukaan halus
pewarnaan gram. Uji pewarnaan gram bertujuan untuk mengetahui sifat bakteri
gram negatif atau gram positif. Hasil praktikum pewarnaan gram menunjukkan
bahwa bakteri uji merupakan bakteri gram positif karena selnya berwarna ungu.
Menurut Prescott (2002), Lactobacillus sp. merupakan bakteri gram positif.
Iodium, larutan safranin, dan alkohol 95%. Menurut Pelczar and Chan (1986)
positif untuk bakteri uji, dari hasil ini diketahui bahwa bakteri uji mempunyai
digunakan khusus untuk bakteria yang dikulturkan dalam media broth karena
tidak dapat tumbuh dengan baik pada media padat (agar). Hasil pengamatan
berbeda dengan pustaka. Menurut Lengkey et al. (2009), bakteri asam laktat
golongan Lactobacillus memiliki ciri non motil. Oleh karena itu, bakteri yang
diuji ini kemungkinan adalah bukan spesies Lactobacillus melainkan bakteri asam
laktat lainnya. Namun, kelompok 2 dan 3 mendapatkan hasil untuk bakteri yang
diuji memiliki sifat non motil, sehingga kemungkinan isolat yang didapatkan
disebut aerob obligat. Fakultatif anaerob dapat tumbuh jika tidak ada O2 tetapi
dapat tumbuh lebih baik bila ada O2. Anaerob obligat dapat tumbuh tanpa
disebut mikroaerofilik.
tumbuh pada permukaan medium. Oleh karena itu, bakteri yang diuji bersifat
fakultatif anaerob. Hal ini sesuai dengan pustaka bahwa bakteri spesies
kelompok 4 yaitu bakteri yang diisolasi dari susu basi adalah tumbuh pada suhu
45 C. Hal ini sesuai dengan pustaka bahwa Lactobacillus sp. dapat tumbuh
TSIA adalah uji yang dirancang untuk membedakan beberapa jenis bakteri
bakteri gram negatif intestinal lain. Perbedaan ini didasarkan pada pola fermentasi
karbohidrat dan produksi H2S pada tabung reaksi. Untuk mengamati fermentasi
1%, dan mengandung glukosa dengan konsentrasi yang lebih rendah yaitu 0,1%.
warna menjadi kuning menandakan asam, sedangkan warna menjadi lebih merah
Selain itu ditambahkan FeSO4 untuk mendeteksi adanya gas H2S. Berdasarkan
hasil praktikum diperoleh bahwa medium muncul H2S sebagai hasil samping dari
metabolisme protein karena slant berwarna merah dan butt berwarna kehitaman.
diinkubasi pada suhu 370C selama 2x24 jam. Pengamatan dilakukan setelah
apabila ditambahkan alfanaftol dan KOH akan menghasilkan warna pink yang
mengandung asetil metil karbinol. Hasil uji positif apabila pada media tersebut
terbentuk warna pink (Helmich et al., 2001). Berdasarkan hasil praktikum, isolat
Uji Katalase
berkaitan dengan tebal tipisnya selaput lendir yang menyelimuti permukaan sel.
Tebal tipisnya selaput lendir akan mempengaruhi penetrasi H2O2 ke dalam sel.
yaitu ditandai dengan tidak terbentuknya gelembung gas. Hal ini sesuai dengan
katalase negatif.
2H2O2 2H2O + O2
untuk produksi energi (Lay,1993). Proses respirasi dihasilkan H2O dan O2 yang
menerima dua pasang elektron dan NADH. Kadang-kadang elektron diterima oleh
oksigen kurang dari dua pasang yang akan menghasilkan anion superoksidasi dari
e- H2O- O2
- H
O2 O2 H2O H2O2
Anion radikal hidrogen peroksida
superoksida hidroperoksil
anorganik yang lebih sederhana. Bakteri uji ditumbuhkan pada medium Mannosa,
Rafinosa, dan Galaktosa diberi BCP (Brom Cresol Purple) sebagai indikator.
Bakteri uji kemudian diinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 370C. Uji positif jika
mampu tumbuh pada medium berubah menjadi warna kuning dan terbentuk gas
menunjukkan hasil positif untuk mannosa, negatif untuk raffinosa, dan positif
untuk galaktosa.
Reduksi nitrat oleh beberapa mikroba aerob dan anaerob fakultatif terjadi
pada kondisi anerob, yaitu kondisi tidak ada oksigen molekuler, pada mikroba
senyawa anorganik seperti nitrat atau sulfat untuk mensuplai oksigen yang
energi. Beberapa organisme memiliki enzim yang mampu mereduksi nitrit lebih
Ion nitrat dapat diubah menjadi bahan organik oleh mikroba melalui
jamur dan algae dapat mereduksi nitrat. Proses ini menggunakan enzim nitrat dan
Mikroba pereduksi nitrat mempunyai tahap reaksi reduksi yang lebih lengkap
sebagai berikut:
menunjukan warna merah mekanisme yang mungkin terjadi adalah nitrat tidak
yang kuat dengan cepat mereduksi nitrat menjadi ammonia atau bahkan N
molekuler. Untuk mengetahui apakah nitrat dapat direduksi melalui fase nitrit atau
belum dapat dilakukan dengan penambahan sedikit serbuk seng terhadap biakan
yang tidak menunjukan warna merah setelah penambahan larutan A dan B. Seng
mereduksi nitrat menjadi nitrit. Adanya warna merah menunjukan bahwa nitrat
tidak direduksi menjadi nitrit (uji negatif) dan jika terjadi perubahan warna
menunjukan nitrat direduksi menjadi amonia atau molekul N (uji positif). Hasil
setelah ditambah katalisator seng, karena saat penambahan Nitrate Reagen A dan
B isolat tidak terbentuk warna merah yang diperkirakan NO belum bisa terdeteksi
(Sumarsih, 2003).
A. Kesimpulan
Berdasarkan hasil dan pembahasan diatas maka dapat diambil kesimpulan sebagai
berikut:
1. Berdasarkan uji karakteristik dari sampel yang diambil dari susu basi diperoleh
B. Saran
Metode yang praktis dan akurat sangat diperlukan dalam pengembangan proses
Dalam jalannya praktikum dan pengamatan lebih baik disiapkan hasil kontrol,
A. Latar Belakang
TBC adalah salah satu penyakit menular yang dapat menularkan bakteri
tuberculosis kepada orang lain di sekitar penderita, penyakit ini banyak ditemukan
pada masyarakat dengan tingkat sosial ekonomi rendah dan lemah. Untuk itu
cepat diobati dan sembuh sehingga tidak menular kepada orang lain (Girsang et
al., 2003).
paling tinggi dijumpai di India sebanyak 1.5 juta orang, urutan kedua dijumpai di
Cina yang mencapai 2 juta orang dan Indonesia menduduki urutan ketiga dengan
adalah 128 per 100.000 (2003) dengan perkiraan prevalens sebesar 295 per
100.000.
Robert Koch pada tahun 1882. Selanjutnya pada tahun 1819 Rene Laennec
dengan temuan Jean Antoine Villemin pada 1865 yang membuktikan bahwa
tubercolosis adalah penyakit menular. Tubercolosis pada manusia dapat merusak
jaringan tubuh mana pun, namun paru-paru adalah yang paling umum terinfeksi.
sampai 49 setiap tahun (Enarson et al., 2000). Oleh sebab itu diperlukan suatu
metode yang efektif untuk mencegah penularan yang lebih luas lagi dan
melalui pernapasan awalnya bakteri tersebut masuk melalui rongga hidung lalu
bakteri ini menyebar ke organ-organ lain pada tubuh melalui melalui aliran darah,
sistem limfa atau getah bening, dan melalui jaringan lain atau secara langsung
menyebar ke organ atau bagian badan lain. Penyakit TBC yang lebih parah lagi
limfa, nodus tulang belakang, genito urinary tract, sistem nervous atau abdomen
akan berakibat buruk seperti menurunkan daya kerja atau produktivitas kerja,
menularkan kepada orang lain terutama pada keluarga yang bertempat tinggal
yang paling sering diserang adalah paru - paru (95,9 %). Cara penularan melalui
ludah atau dahak penderita yang mengandung bakteri tuberkulosis paru. Pada
waktu batuk butir-butir air ludah beterbangan diudara dan terhisap oleh orang
yang sehat dan masuk kedalam parunya yang kemudian menyebabkan penyakit
diudara kering maupun dalam keadaan dingin, atau dapat hidup bertahun-tahun
dalam lemari es. lni dapat terjadi apabila kuman berada dalam sifat dormant
(tidur). Pada sifat dormant ini bakteri tuberkulosis suatu saat dimana keadaan
kemungkinkan untuk dia berkembang, bakteri ini dapat bangkit kembali (Hiswani,
2004).
B. Tujuan
pewarnaan bakteri tahan asam dari sputum penderita TBC dan mengetahui tingkat
A. Materi
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum pewarnaan bakteri tahan asam ini
adalah object glass, cover glass, mikroskop, pipet pasteur steril, jarum ose,
pembakar spirtus, pinset, timer, sarung tangan, dan masker. Sedangkan bahan-
B. Metode
1. Pembuatan Sediaan/ Preparat Apus Sputum
sedikit pada bagian yang kental dan berwarna kuning kehijauan (purulen)
menggunaka ose.
Sputum dioleskan pada object glass secara merata dengan ukuran 2x3 cm.
Sediaan yang telah dibuat lalu dikeringkan di udara terbuka sekitar 15-30
1. Sputum atau sediaan dahan diambil secukupnya lalu diletakkan pada gelas
obyek dan difiksasi diatas pembakar spiritus namun jangan sampai timbul
percikan aerosol.
2. Sediaan yang telah kering kemudian digenangi dengan karbol fuchsin
asam.
a. Pembacaan
1. Sediaan yang telah kering ditetesi dengan minyak mersi dilihat dengan
b. Penilaian
sebagai berikut :
dekolorisasi dengan asam HCl dalam alkohol. Bakteri tahan asam kaya akan lipid,
mencakup asam mikolat (asam lemak rantai panjang C78-C96), lilin dan fosfatida.
kabol fuksin berwarna merah (Brooks et al., 1996). Menurut Misnadiarly dan
sukar diwarnai dengan zat warna mikrobiologis biasa. Hal ini disebabkan karena
tingginya kadar lemak pada organisme ini sehingga warna tersebut tidak tercuci
oleh alkohol asam. Oleh sebab itulah dinamakan basil tahan asam atau bakteri
tahan asam dan tetap berwarna merah seperti warna yang diberikan pertama
(Pelczar dan Chan, 1986). Untuk mengamati bakteri tersebut, maka dilakukan
pewarnaan khusus berupa pewarnaan bakteri tahan asam yang dikenal dengan
nama metode Ziehl-Neelson dengan tujuan agar bakteri yang akan diamati dapat
dengan cara : larutan carbol fuchsin 0,3% dituang pada seluruh permukaan
sediaan, kemudian dipanaskan diatas nyala api sampai keluar asap tetapi tidak
sampai mendidih atau kering selama 5 menit. Sediaan kemudian dibiarkan dingin
selama 5-7 menit lalu kelebihan zat warna dibuang dan dicuci dengan air yang
ethanol) dituang pada sediaan dan dibiarkan 2-4 menit kemudian dicuci dengan air
mengalir selama 1-3 menit, kelebihan larutan dibuang. Larutan methylene blue
0,1% dituang sampai menutup seluruh permukaan, dibiarkan 1 menit lalu larutan
carbol fuchsin menyebabkan carbol fuchsin dapat mudah masuk ke dalam sel
bakteri yang diliputi oleh lipid. Zat warna pertama yang berupa carbol fuchsin
merupakan fuksin basa yang dilarutkan dalam larutan fenol 5%. Fenol digunakan
sebagai pelarut untuk membantu perasukan zat warna ke dalam sel bakteri
sewaktu proses pemanasan. Pada saat ini jika bakteri uji merupakan bakteri tahan
asam maka warna carbol fuchsin akan melekat kuat dan menyebabkan sel
berwarna merah. Asam alkohol memiliki fungsi sebagai pelarut terhadap fuchsin
pewarnaan tandingan dimana organisme lain pada sediaan tersebut akan terwarnai
M.tubercolosis dapat menahan zat warna dengan sangat kuat dan tidak dapat
dilunturkan.
tahan asam sebanyak 1-9 BTA/100 lapang pandang, sehingga hasilnya positif.
Menurut Misnadiarly dan Simanjuntak (1993), hasil reaksi dengan karbol fuksin
berkelompok, tidak bergerak dan tidak membentuk spora atau kapsul (Pelczar dan
merupakan bakteri yang berbentuk batang ramping, lurus atau sedikit bengkok
seperti kurva dengan ukuran 0,4 X 3 mikrometer dan kandungan lipidnya 20-40%
asam mikolat, lilin dan fosfolipida. Dalam sel lipid sebagian besar terikat pada
zat ini dengan asam panas merusak sifat tahan asam bakteri, yang bergantug pada
metode pewarnaan Gram. Namun yang berbeda antara kedua metode tersebut
adalah penggunaan jenis larutan. Pada pewarnaan Gram, larutan yang digunakan
dan sesuai urutan penggunaannya yaitu diawali dari ungu kristal (UK), larutan
yodium (Y), alkohol dan safranin. Teknik pewarnaan Gram pertama kali diuraikan
dalam suatu publikasi pada tahun 1884 oleh seorang ahli bakteriologi Denmark
yaitu Christian Gram, yang mengembangkan prosedur pewarnaan ini saat mencari
cukup banyak digunkan untuk mencirikan banyak bakteri. Pewarnaan ini amat
berarti pada laboratorium diagnostik rumah sakit karena informasi yang diperoleh
dari pengamatan spesimen yang diwarnai dengan pewarnaan Gram dengan cepat
sebagaimana diketahui bahwa struktur dinding sel bakteri yang mengandung lipid
cukup tebal sehingga saat digenangi dengan alkohol tetap mempertahankan warna
A. Kesimpulan
Berdasarkan pembahasan di atas, maka dapat disimpulkan bahwa:
1. M. tuberculosis memiliki lapisan lemak yang cukup tebal sehingga ketika
B. Saran
diperhatikan agar tidak terjadi infeksi yang dapat membahayakan praktikan dan
lainnya. Hal ini sangat penting untuk diperhatikan karena berdasarkan pedoman
Girsang, M., Sumarti, R. Dany, Tami, I. Olii, dan G. Wahyuhono. 2003. Teknik
sentrifugasi untuk meningkatkan penemuan bakteri tahan asam (BTA)
dari sputum penderita TBC melalui metode zielh-neelsen. Media Litbang
Kesehatan XIII (4).