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corrigé_tp06

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Corrigé examen TP 2006
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05/16/2013

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TECHNIQUES D’ANALYSES BIOLOGIQUES
Corrigé : Année 2005/2006
Examen de travaux Pratiques
Nom : Prénom :
Exercice n°1
La méthode colorimétrique de Bradford (Bradford, M. (1976)) permet de déterminer la concentration enprotéines totales d'une solution contenant des protéines. Cette méthode utilise le bleu de Coomassie (lecolorant) et une protéine globulaire "standard" : l'albumine de sérum bovin ou BSA ("Bovine SerumAlbumin"). Cette droite étalon est obtenue de la manière suivante :-
dans une série de tubes à essais, on met différents volumes d'une solution de BSA (100 µL au MAXIMUM)
complétés par une solution tampon ; on ajoute 1 mL de colorant, on mélange et après 10 min à l'obscurité onmesure l'absorbance à 595 nm.
a
. Sachant que l'on dispose d'une solution stock de BSA à 1 mg.mL
.1
, calculez les volumes (et éventuellement la dilutionà effectuer au préalable) à prélever de la solution de BSA et de la solution tampon pour faire une gamme étalon : 0, 2, 4,
6, 8 et 10 µg de BSA.
Les valeurs d'absorbance à 595 nm sont les suivantes :
 
Quantité de BSA (µg)
0 2 4 6 8 10A
595
0,13 0,40 0,48 0,85 0,95 1,21
b
. La détermination de la concentration de la solution de protéines à doser se fait EN PARALLÈLE, de la manièresuivante :-
dans une autre série de tubes à essais, on prélève des volumes différents (100 µL au MAXIMUM) de la solution de
protéines à doser (éventuellement diluée) complétés par une solution tampon ;- après avoir ajouté 1 mL de colorant et mélangé, on mesure l'absorbance à 595 nm de ces solutions EN MÊME TEMPSque l'absorbance des solutions de la gamme étalon. Les résultats sont les suivants :Volume prélevé de solution à
doser (µL)
 10sérum 160sérum 2Dilution préalable de la solution à doser Non diluée 3A
595
0,51 0,84
A partir de la droite étalon et de ces valeurs, calculez la concentration en protéines de la solution à doser enmg/ml.
Réponse
 
a
: (complétez le tableau suivant). De combien est diluée la BSA avant la préparation de la gammed’étalonnage ?
Volume de BSA (µL)
à 
0.1µg/µl
 0 20 40 60 80 100
Volume de tampon (µL)
 100 80 60 40 20 0
Quantité de BSA (µg)
 0 2 4 6 8 10Réactif (bleu de Coomassie) (mL)1 1 1 1 1 1
Réponse b :
sérum 1 :0.46 mg/ml; sérum 2 :0.39 mg/ml; dilution de la BSA :1/10…  .Attention :
l'absorbance du tube SANS BSA n'est pas nulle (A
595
= 0,13).
C'est parce que l'absorbance du colorant non complexé n'est pas nulle à 595 nm.
Cette absorbance RESIDUELLE doit être retranchée aux valeurs obtenues avant de tracer la droite étalon.
.Exercice n°2
 Quel est le pH d’un mélange de 5 ml d’acétate de sodium et de 4 ml d’acide acétique 0,1mol/l avant (pH1) et après (pH2)ajout de 1ml d’HCl à 0,1 mol/l ? (le pK
a
de l’acide à 25 °c = 4,76).
 
Réponse :
pH1 :4,86pH2 :4,66 Quelle conclusion tirez vous de la solution décrite ci-dessus ?
Réponse :
(très brève)…Solution tampon (le pH a subi une variation de 0,2 unités seulement). Exercice n°3Le mode opératoire classique réalisé au laboratoire, est une méthode de précipitation sélective par un hétéropolyacide(A) de concentration de 7 mmol/l (PM=5708) en présence d’un cation bivalent (B) à 2 M. Le tableau récapitulatif ci-dessous (à compléter) permet d’avoir chaque fraction de lipoprotéines
séparément
, en utilisant des concentrationsconnues et précises pour chaque fraction de lipoprotéines indépendamment. Exercice n°4
Préparation de solutions de caféine de différentes concentrations
Avec la caféine extraite que l'on a purifiée, on fabrique une solution de caféine dans le dichlorométhane de concentration 32 mg.L
-1
.On désire préparer des solutions de concentrations 4 mg.L
-1
, 8 mg.L
-1
, 12 mg.L
-1
et 16 mg.L
-1
Parmi le matériel suivant, indiquer celui utilisé pour préparer la solution de caféine deconcentration 16 mg.L
-1
. Justifier votre choix.Matériel à disposition :- béchers de 100 mL et 200 mL- fioles jaugées de 5,0 mL ; 10,0 mL et 50,0 mL- pipettes jaugées de 2,0 mL et 5,0 mL- éprouvette graduée de 5 mL
Réponse :
Fioles et pipettes jaugées 
M
ESURE D
'
ABSORBANCE
 
On a tracé ci dessous (figure n°l) le spectre d'absorption de la caféine entre 220 nm et 320 nm pour une des solutions de caféine.
 a-
 
 
À quel domaine appartiennent ces longueurs d'onde ?
Réponse 
Ultra violet
.
(
< 400 nm, donc les radiations utilisées appartiennent au domaine des ultraviolets).
On veut tracer la courbe d'étalonnage A = f(c) de la caféine à l'aide des différentes solutions précédemment préparées.Quelle longueur d’onde faut-il choisir ?pourquoi ?
Réponse : 
271nm qui correspond à un maximum d’absorption. 
Réactifs PréBétalipoprotéinesBéta lipoprotéines Alpha lipoprotéinesA 0.05% 0.2% 2%B 0.1M 0.1M 0.2MSérum sanguin+ réactifs A et B (ml)0.1 0.1 0.1
Réactif A (µl)
 
1,25 µl
 (dilution 1/80)
5 µl
 (dilution 1/20)
50 µl
 (dilution 1/2)
Réactif B (µl)
 
5 µl
 (dilution 1/20)
5 µl
 (dilution 1/20)
10 µl
 (dilution 1/10)

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