PEMBUATAN INSULIN

MENGGUNAKAN E.coli
By: jenggod
penggunaan

alasan

langkah
m
p

n
u
a

a
s
i
 Alasan Kenapa Bakteri
• Rentang umur bakteri yang pendek.
• Jumlah generasi yang banyak.
• Susunan genetik bakteri lebih mudah di
rekombinasi,
• Lingkungan luar dapat dimodifikasi untuk
mempengaruhi ekspresi gen.
• Menghasilkan produk hampir sama dengan
insulin yang disekresi oleh β-pankreas.
• Lebih ekonomis.

Bakteri yang sering digunakan adalah Escheriscia

coli
 Penggunaan Mikroba e.choli dalam
pembuatan insulin
• Produksi protein komersial
– Protein pengobatan
• Insulin untuk pengobatan diabetes
• Hasil cadangan:
–Interferon-gamma untuk pengobatan kanker
–Faktor VIII untuk pengobatan hemofili
–Erythropoetin untuk pencairan gumpalan
darah
 Lankah pembuatan
1. Pengisolasian veltor dan DNA sumber gen.
2. Penyelipan DNA ke dalam vektor.
3. Pemasukan vektor pengklon ke dalam sel.
4. Penklonan vektor dan gen-gen asing.
5. Identifikasi klon yang membawa gen yang
diinginkan.
6. Produksi.
 Pengisolasian vektor dan DNA
sumber gen
 Gen yang kita inginkan:
 Merupakan rangkaian gen yang mengkode insulin, dapat
kita isolasi dari gen manusia yang sebelumnya telah
ditumbuhkan dalam kultur di laboratorium.
 Vektor:
 Merupakan plasmid dari E.coli yang digunakan dalam
proses ini harus mengandung:
 amp-R yang terbukti memberikan resistensi pada sel inang
terhadap antibiotik amphiliin.
 lac-Z yang mengkode β-galaktosidase, yang menghidrolisis gula
laktosa.
Plasmid ini memiliki pengenalan tunggal untuk
enzim retriksi yang digunakan, dan urutan ini
terdapat dalam gen lac-z
 isolasi
Sel E.coli

plasmid
Sel pankreas

DNA manusia
 Penyelipan DNA ke dalam vektor
• Pencernaan plasmid dan DNA menggunakan
enzim restriksi yang sama.
• Mencampurkan fragmen DNA manusia
dengan plasmid yang telah di potong.
• Penambahan enzim ligase untuk mebentuk
ikatan kovalen diantara keduannya.
 Pemasukan vektor pengklon
ke dalam sel
• Plasmid yag telah termodifikasi dicampurkan
kedalam kultur bakteri.
• Bakteri akan mengambil plasmid rekombinan
secara spontan melalui proses transformasi.
• Namun tidak semua bakteri akan menggambil
plasmid tersebut.
 Penklonan vektor dan gen-gen asing
• Kita memanfaatkan plasmid untuk
mengidentifikasi bakteri yang kita inginkan.
• Medium nutrien bakteri mengandung
amphisilin dan gula yang disebut X-gal.
• Amphisilin akan memastikan hanya bakteri
yang mengandung plasmid yang akan tumbuh,
karena adanya resistensi dari amp-R.
• X-gal akan memudahkan identifikasi koloni
bakteri yang mengandung gen asing yang
disisipkan. Plasmid yang mengandung gen lac-
z tidak dapat menghidrolisis gula karena tak
mampu menghasilkan β-galaktosidase
sehingga berwarna putih.
 Identifikasi klon yang membawa gen
yang diinginkan
• Dilakukan dengan proses yang disebut
hibridisasi asam nukleat.
• Sintesis suatu probe asam nukleat yang
mengandung urutan komplementer dari gen
penghasil insulin, probe dilengkapi dengan
isotop radioaktif atau etiket pendar
(fluoresen)
 Produksi
• Setelah diidentifikasi,klon sel yang membawa
materi genetik yang diinginkan dapat
ditumbuhkan dalam medium cair tangki besar
dan kemudian mudah mengisolasi gen
tersebut dalam jimlah besar.
 Produksi rekombinan insulin
manusia dalam E. coli (2)

DNA manusia
 Produksi rekombinan insulin
manusia dalam E. coli (3)
Promoter lac, ekspresi diinduksi
Polipeptida A dan B yang telah
dimurnikan dicampur

Kondisi campuran dibuat

oksidatif agar terbentuk ikatan
disulfida

Purifikasi dan penghilangan b-

gal dari polipeptida insulin

Humulin
 KELEMAHAN PENGGUNAAN BAKTERI
• Adanya daerah intron yang cukup panjang
yang mencegah ekspresi gen secara benar
oleh sel bakteri, hal ini diatasi dengan sintesis
gen eukariotik tanpa intron.
• Adanya perbedaan proses trankripsi dan
translasi antara eukariotik dengan prokariotik.
• Adanya perbedaan promoter dan urutan DNA
(diatasi dengan vektor ekspresi)
Materi Baru Untuk Produksi Insulin
• Para ahli mengalihkan perhatian pada
penggunaan sek eukariotik, diantaranya fungi
dan ragi bersel satu.
• Keunggulan yang dimilki diantaranya:
– Tumbuh secepat bakteri.
– Memiliki plasmid (langka pada eukariotik)
– Proses pasca translasi yang identik.
 Produksi rekombinan insulin manusia dalam
E. coli
• Prepronsulin diproduksi oleh se-sel dalam
kelenjar pankreas.
• Preproinsulin adalah polipeptida tunggal.
• Preproinsulin diproses oleh enzim proteolitik
menjadi Insulin.
• Pada Insulin, rangkaian polipeptida A dan B
dihubungkan oleh ikatan disulfida.
N
B chain
A chain C
C chain
Pasien diabetes perlu menyuntikkan
insulin untuk mengontrol kandungan
glukosa dalam darah mereka