Técnicas de tinción. Fundamentos
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con elmicroscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que larodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estospueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la presencia dedeterminados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredescelulares, centros de actividad respiratoria, etc.Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas, procesollamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque tambiénpuede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes. Después de lafijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios estruturales en elprotoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido fijadas sobre unportaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo inmediatamente elproceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción,por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de maneraque las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con muchaprecisión.La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad específica porlos materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son moléculas cargadaspositivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargadosnegativamente, tales como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos decolorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina. Otros colorantesson moléculas cargadas negativameute (aniones) y se combinan con los constituyentes celularescargados positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, lafucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; loscolorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose amenudo para revelar la localización de las gotículas o depósítos de grasa. Un ejemplo decolorante liposoluble es el negro Sudán.Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con otrasustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se denomina mordiente;un mordiente habitual es el ácido tánìco. El mordiente se combina con un constituyente celular ylo altera de tal modo que ahora sí podrá atacar el colorante.Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía, sonsuficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen colorantesimple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no produce un color tanintenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente útil para detectar la presencia debacterias en muestras naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tiñe.
La tinción negativa es el reverso del procedimiento de tinción usual: las células se dejan sinteñir, pero se colorea en cambio el medio que las rodea. Lo que se ve, por tanto, es el perfil delas células. La sustancia utilizada para la tinción negativa es un material opaco que no tieneafinidad por los constituyentes celulares y que simplemente rodea las células, tal como la tintachina (que es una suspensión de particulas de carbono coloidal) o la nigrosina (un colorantenegro insoluble en agua). La tinción negativa es un modo satisfactorio de aumentar el contrastede las células en la microscopia óptica, pero su máxima utilidad está en revelar la presencia decápsulas alrededor de las células bacterianas.Los métodos de tinción son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaución, ya quepueden conducir a errores. Las moléculas de colorante forman en ocasiones precipitados oagregados que parecen estructuras celulares auténticas, pero que son formacionescompletamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominanartefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nosestamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente.
Preparación de un frotis
Sobre un portaobjetos de vidrio, limpio y seco, se coloca una gota del material que se va a teñir(si es líquido) o se hace rodar el hisopo con que se tomó la muestra. Una vez que el hisopo hatocado la superficie del portaobjetos, que no está estéril, ya no puede ser empleado parainocular los medios de cultivo. Puede usarse una aguja estéril para transferir una pequeñacantidad de un cultivo bacteriano a la superficie del portaobjetos. Este material es suspendido enuna gota de agua o solución salina previamente colocada sobre el portaobjetos. Cuando se tratade colonias muy pequeñas que pueden perderse en una gota de líquido se emplea una varilladelgada de madera estéril con la cual se toca la colonia obteniéndose así una fracción apreciabledel desarrollo. El material se frota directamente sobre el portaobjetos, donde puede visualizarsecon facilidad. El material colocado en el portaobjetos se deja secar al aire o bien se pasa variasveces por la zona azul de la llama de un mechero de Bunsen hasta que el vidrio esté tan calienteque moleste al tacto pero no queme.
Examen de muestras al microscopio
Según la manipulación que efectuemos sobre la muestra a observar y según los colorantes queempleemos durante el proceso, podemos hablar de diferentes modalidades de tinción.
Examen microscópico directo de las muestras clínicasSin Tinción
No se utiliza ningún tipo de colorante.Es el montaje directo húmedo o examen en fresco: lasmuestras se extienden directamente sobre la superficie de unportaobjetos para su observación. El material que es
demasiado espeso para permitir la diferenciación de sus elementos puede diluirse con igualvolumen de solución salina fisiológica estéril. Se deposita suavemente un cubreobjetos sobre lasuperficie del material.Este tipo de preparación se emplea para detectar trofozoítos móviles de parásitos intestinalescomo
Giardia
,
Entamoeba
, huevos y quistes de otros parásitos, larvas y gusanos adultos,
Trichomonas
, hifas de hongos, etcEn la imagen:
Candida
sp en un examen en fresco.
Examen microscópico de las muestras clínicas levemente modificadasTinción Simple
Se utiliza un solo colorante, por lo que todas las estructurascelulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, AzulMetileno de Loeffler, Azul de lactofenol).El Hidróxido de potasio al 10% (solución de KOH) permite verelementos de hongos ya que el KOH digiere parcialmente loscomponentes proteicos, por ejemplo de la célula huésped,pero no actúa sobre los polisacáridos de las paredes celularesde los hongos.La tinta china o Nigrosina permite observar células levaduriformes capsuladas (
Cryptococcus
),sobre todo en LCR. Los polisacáridos capsulares rechazan la tinta china y la cápsula aparececomo un halo claro alrededor de los microorganismos. Azul de metileno de Loeffler puedeagregarse a las preparaciones en fresco de heces para observar la presencia de leucocitos.En la imagen:
Cryptococcus neoformans
en una tinción con tinta china.
Examen microscópico de las muestras clínicas muy modificadasTinciónDiferencial
Se utilizan varios colorantes combinados. Las estructurascelulares se diferencian en función de los diferentescolorantes que fijan de acuerdo con su propia constituciónquímica.Los ejemplos clásicos sería la tinción de GRAM o la de Ziehl-NeelsenEn la imagen: BGN y levaduras en una tinción GRAM
microfotografía: Daniel Val
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