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Trabajo de Transformación Genética

Trabajo de Transformación Genética

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03/23/2013

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Transformación genética
En
,
transformación
es la alteración
de una
que resulta dela introducción y expresión de material genético externo (
). Se usan diferentestérminos para las alteraciones genéticas resultantes de introducir DNA por 
(
) o por contactos intercelulares entre
(
). A latransformación de células animales se le llama
.El término transformación es también usado, de manera más general, para describir mecanismos de transferencia de DNA o
en biología molecular (es decir, teniendo encuenta más que las consecuencias genéticas). Por ejemplo la producción de
como
requiere la inserción de nueva información genética en el
del
usando el mecanismo apropiado de transferencia de DNA; el proceso se le llamacomúnmente transformación.El RNA también puede ser transferido en las células usando métodos similares, pero estono provoca normalmente cambios heredables y por lo tanto no es información realEl proceso de transformación fue demostrado en
por  
, unbacteriólogo inglés, que estaba en busca de una vacuna contra la
.Griffith descubrió que una cepa no-virulenta de
podía ser transformada en virulenta al exponerla a cepas virulentas que habían sido matadas concalor.El
experimento de Griffith
, llevado a cabo en
, fue unos de los primerosexperimentos que demostró que las
eran capaces de transferir informacióngenética mediante un proceso llamado
.En
, el microbiólogo
, que investigaba varias cepas de
(
Streptococcus pneumoniae
), inyectó en ratones la
cepa S
y la
cepa R
de la
. Lacepa S era dañina, mientras que la rugosa (R), no lo era ya que la cepa S se cubre a simisma con una cápsula de
que la protege del
 del ser que hasido infectado, resultando en la muerte de este, mientras que la cepa R no contiene esacápsula protectora es derrotada por el
. Cuando, inactiva por calor, lacepa S era inyectada, no había secuelas y el ratón vivía. Sorprendentemente, al combinar 
cepa R
(no letal), con cepa S inactivada por calor (no letal), el ratón murió. Además,Griffith encontró células de cepa S vivas. En apariencia la cepa R se convirtió en cepa S.
 
Este hallazgo no se pudo explicar, hasta que en
 
,
, y
cultivaroncepa S y:Produjeron extracto de lisado de células (extracto libre de células).Luego que los lípidos, proteínas y polisacaridos se removieron, el
aúnconservó su capacidad de replicar su
ADN
e introducirlo en
R.La inactivación por calor de Griffith habría dejado intacto el
de los
de las
, que era el causante de la formación del
S, y podía ser liberado por lascélulas destruidas e implantarse en cultivos sucesivos de cepa R.
Conclusiones
El principio de transformación observado por Griffith era el
de la bacteria de cepa S(virulenta). Si bien la bacteria había muerto, su ADN sobrevivió al proceso de altatemperatura y fue tomado por la bacteria R (inofensiva). EL ADN de la cepa S contiene losgenes que forman la cápsula de protección de polisacárido. Equipado con este gen, lacepa de bacteria R estaba ahora provista de protección frente al sistema inmune delanimal y por lo tanto podía matar al animal. La naturaleza exacta del principio detransformación de ADN fue verificada en los experimentos realizados por Avery, McLeod yMcCarty, y por Hershey y ChaseEn 1944, se demostró que este
 principio transformante
era de índole genética, cuandoOswald Avery, Colin McLeod y Maclyn McCarty demostrarón la transferencia génica en
S. pneumoniae
. Avery, McLeod y McCarty llamaron a la introducción e incorporación de ADNen bacterias,
transformación
Bacterias
En bacterias, la transformación refiere a un cambio genético estable producido alincorporar ADN desnudo (ADN sin células o proteínas asociadas), y la competenciarefiere al estado de ser capaz de incorporara ADN exógeno del ambiente. Dos formasdistintas de competencia deben ser distinguidas: natural y artificial.
Competencia Natural
Algunas bacterias (cerca del 1% de todas las especies)son capaces de incorporar demanera natural, ADN bajo condiciones de laboratorio; y muchas más pueden ser capacesde hacerlo en sus ambientes naturales. Estas especies traen un conjunto de maquinariagenética específica para llevar el ADN a través de la membrana o membranas.
Competencia artificial
La competencia artificial no esta codificada en los genes celulares. Sino que es inducidapor procedimientos en el laboratorio, en donde las células son convertidas en permeablesde forma pasiva, a través de condiciones que normalmente no ocurren en la naturaleza.
 
Las células enfríadas en presencia de cationes divalente como Ca
2+
(en 
2
)preparalas membranas celulares para ser permeables al
. Las células sonincubadas en hielo con el ADN y luego darles brevemente un
(ej: 42°C por 30-120 segundos), lo que causa que el ADN entre en la célula. Éste método funciona muybien en ADN plasmidial circular. Una excelente preparación de células competentesentrega ~10
8
colonias por microgramo de plasmidio. Una pobre preparación entregaaproximadamente 10
4
/μg o menos. Buenas preparaciones no-comerciales debiesenarrojar 10
5
a 10
6
transformantes por microgramo de plasmidio.Este método no funciona muy bien con moléculas lineares, como fragmentos de ADNcromosomal, probablemente porque las enzimas
en la célula rápidamentedegradan el DNA lineal. Las células naturalmente competentes son generalmentetransformadas de manera más eficiente con ADN linear que con plasmidios.La
es otra manera de crear agujeros en células bacterianas (y otros tipostambién), mediante golpes de electricidad en un campo eléctrico de 10-20
/cm. El ADNplasmidial puede entrar en la célula a través de ésos agujeros. Se aconseja usar éstemétodo con ADN plasmidial de gran tamaño. Los mecanismos de reparación demembrana, cerrará rápidamente estos agujeros después del shock.
Transformación de plasmidio
Para ser mantenido de manera estable por la célula, el ADN plasmidial debe contener un
origen de replicación
, que permitirá la replicación en la célula, independientemente delcromosoma. Debido a que la transformación usualmente produce una mezcla deinusuales transformaciones y abundantes células no-transformadas, se necesita de unmétodo para identificar las células que han adquirido el plasmidio. Los plasmidiosutilizados en este tipo de experimentos, contienen usualmente un gen que les otorgueresistencia a un antibiótico. La cepa bacteriana a transformar, debe ser sensible a éste.Las células capaces de crecer en un medio de cultivo con este antibiótico, serán las quehan sido transformadas por el plásmido, y las células que no puedan crecer carecerán deéste.Otro marcador, usado para identificar bacterias
que han adquirido plásmidiosrecombinantes, es el gen
lacZ 
, que codifica para
. Debido a que la β-galactosidasa es un homo
,en que cada monómero esta hecho de una proteína
lacZ-α 
y
lacZ-ω
, si solo una de estas proteínas se expresa en la célula resultante, no seformará la enzima funcional. De esta manera, si una cepa de
E. coli 
que ni tenga el gen
lacZ-α 
en su genoma, es transformado usando un plasmidio que contiene el gen faltante,las células producirán β-galactosidasa, mientras que las no-transformadas no lo harán.En éste tipo de transformación, la región que contiene el
, ositio
polylinker 
, reside en el fragmento del gen
lacZ-α 
, lo que significa que los plasmidiosrecombinantes tendrán el gen deseado insertado en alguna parte dentro de
lacZ-α 
.Cuando este fragmento genético interrumpido sea expresado por la
E. coli 
, no seproducirá una proteína
lacZ-α 
utilizable, por lo que no se formará β-galactosidasautilizable. Cuando es crecida en un medio que contiene la galactosa modificada
, lascolonias que son capaces de metabolizar el sustrato (y por lo tanto, han sidotransformadas, pero no por plasmidios recombinantes) aparecerán en color azul; lascolonias que no puedan metabolizar el sustrato (y por ende no han sido transformadas por plásmidios recombinantes) aparecerán de color blanco. y eso se llama pezuña

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