IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA ÀS ANÁLISES CLÍNICAS

Prof. Sérgio Lisboa Machado Prof. Raimundo Diogo Machado

IMUNOLOGIA BÁSICA E APLICADA ÀS ANÁLISES CLÍNICAS
Prof. Sérgio Lisboa Machado
Prof. Assistente do Departamento de Análises Clínicas e Toxicológicas da Faculda
de de Farmácia da Universidade Federal do Rio de Janeiro
Prof. Raimundo Diogo Machado
Prof. Titular Aposentado do Departamento de Virologia do Instituto de Microbiolo
gia da Universidade Federal do Rio de Janeiro
I
Prefácio
Esta publicação é uma atualização de um livro escrito pelo meu pai em 1992, e qu
e já há muito tempo eu tentava publicar. No entanto, como a imunologia está semp
re em constante renovação, muitas das vezes deixei de envia-lo a editora para ac
rescentar mais um dado novo. Este livro deverá servir para profissionais que bus
cam atualizar seus conhecimentos e mais do que repetir o que as bulas de nossos
ensaios laboratoriais nos fazem repetir, ele procura fazer com que você tome con
hecimento de como os ensaios se processam e o porque da não conformidade. Poder-
se-á observar, que esta publicação não é um livro, e sim uma coletânea dos melho
res livros e trabalhos existentes nesta área, onde a literatura em língua portug
uesa é escassa e, por isto mesmo fez-se mister lançar esta coletânea com os dado
s mais atualizados e importantes ao profissional das análises clínicas. Espero q
ue este agregado de informações seja bem aproveitado, assim como foi a publicaçã
o de meu pai, que muito contribuiu em minha formação profissional, e que por iss
o contribua também na de vocês caros leitores. Espero que esta publicação não se
ja a última e sim uma das que venham a incentivar o mercado a produzir novas pub
licações do mesmo gênero e desmistificar o “terror” como a imunologia se apresen
ta aos estudantes e profissionais da área da saúde.
Façam bom proveito, Prof. Sérgio Lisboa Machado e Prof. Raimundo Diogo Machado
II
SUMÁRIO
Defesas inatas do organismo Tipos de imunidade Mecanismos da imunidade Respostas
imunes adaptativas Resposta imune humoral Via clássica do complemento As imunog
lobulinas Anticorpos monoclonais Síntese das imunoglobulinas Reações mediadas po
r células Regulação da resposta imune O fenômeno da tolerância Reações de hipers
ensibilidade Hipersensibilidade tipo I Hipersensibilidade tipo II Teste de Coomb
s Pesquisa de anticorpos irregulares Hipersensibilidade tipo III Conglutinação e
imunoconglutinação Imunoconglutininas Hipersensibilidade tipo IV Hipersensibili
dade de contato Reação tuberculínica Hipersensibilidade granulomatosa Doenças au
toimunes 1 7 8 9 9 14 18 21 22 26 31 34 37 38 41 47 49 50 56 57 58 58 60 61 64
III
Lupus eritematoso sistêmico (LES) Artrite reumatóide Tiroidite de Hashimoto Doen
ça de Graves´ Diabetes insulino dependente Esclerose múltipla Miastia gravis Sín
drome de Goodpasture Reações imunológicas a vírus Imunidade a bactérias Imunidad
e a fungos Resposta imune a parasitos Princípio dos imunoensaios Detecção indire
ta de imunocomplexos Controle de qualidade nos imunoensaios Validação de um ensa
io Outras medidas para garantir qualidade Interferências nos imunoensaios Reaçõe
s cruzadas e analitos heterogêneos Reduzindo as reações cruzadas Anticorpos hete
rófilos e anticorpos para animais Reconhecendo e reduzindo a interferência dos a
nticorpos endógenos Interferências devido a antígenos que mascaram a reação Inte
rferências com o mecanismo indicador Efeitos matriz
66 70 71 72 73 74 75 75 76 79 83 84 93 99 101 102 106 108 110 111 113
116
118 118 119
IV
Ensaios de aglutinação Ensaios de dispersão de luz Neflometria Turbidimetria Apl
icações da neflometria e turbidimetria Fatores que afetam a performance dos ensa
ios Teste de Paul Bunnel & Davidsohn e monoteste Teste do látex Teste de Waaler-
Rose Teste de fixação do complemento Teste para avaliação da via clássica do com
plemento (CH50) Teste para avaliação da via alternada do complemento (AH50) Anti
estreptolisina O (ASLO) Teste de neutralização Teste de difusão em gel Teste da
DRS Teste da dupla difusão Imunoeletroforese ELISA (Enzyme-linked immunosorbent
assay) Imunofluorescência Quimioluminescência Teste de Western blot
120 124 125 127 128 130 130 133 134 136
147
150 151 155 158 159 160 162 163 170 176 178
V
DEFESAS INATAS DO ORGANISMO Chamamos de defesa inata aquela que nasce com o indi
víduo, é ela que age como primeira barreira para tentar evitar que um agente inf
eccioso, por exemplo, ao entrar no organismo consiga se replicar e propagar. No
entanto nem sempre a resposta inata é suficiente para fazer este bloqueio e aí,
quem toma parte neste processo é o sistema imune adaptativo que leva algum tempo
até que atinja sua eficiência máxima e consiga evitar a propagação do agente in
feccioso. Além disso o sistema de resposta imune adaptativo tem importante papel
na reinfecção pelo mesmo agente, pois aí sua resposta é mais rápida no combate
ao mesmo, isto se deve a chamada “memória” do sistema imune. No sistema de respo
sta inato, temos a participação por exemplo, de fatores solúveis como lisozima e
o sistema complemento (principalmente a via alternada deste), e da participação
de células fagocitárias. Já no sistema adaptativo temos principalmente a ação d
e mecanismos dependentes de linfócitos B que darão início a produção de anticorp
os e a coordenação da atividade e supressão ligada principalmente aos linfócitos
B. São os linfócitos os responsáveis pela memória do sistema imune, uma vez ati
vados eles conseguem estabelecer uma resposta específica e rápida quando ocorre
uma reinfecção. A fim de compreender melhor a imunologia devemos ter noção de al
guns conceitos básicos que determinam se um indivíduo possa se infectar ou não:
• REFRATARIEDADE - É um fenômeno inato, inespecífico e invariável que impede que
uma pessoa se infecte por determinados microrganismos. Nestes casos, mesmo que
variem as condições intrínsecas e extrínsecas do indivíduo, este não adquire det
erminadas infecções. Como exemplo existem microrganismos que infectam os animais
e jamais infectam o homem. O vírus da Bouba aviária, o vírus da peste suína clá
ssica, o vírus da peste suína africana que são virulentos para a galinha e o por
co respectivamente, jamais infectam o homem. As células humanas não possuem rece
ptores para estes vírus. Do mesmo modo, certas doenças infecciosas humanas, não
são reproduzidas em certos animais. Os vírus do sarampo, da caxumba e da rubéola
não infectam as aves, o cão o gato e outros animais. • RESISTÊNCIA - É um fenôm
eno inato, inespecífico e variável, e a variação vai depender das condições intr
ínsecas e extrínsecas de cada indivíduo e também da biologia do agente infeccios
o. Como exemplo, tem-se o Mycobacterium tuberculosis, que na maioria das vezes i
nfecta o homem, sem lhe causar danos e este, pelas suas defesas fique em estado
latente, permanentemente, ou por um longo período. Se houver problemas imunológi
cos por um conjunto de variáveis como infecções em que haja destruição da defesa
celular, administração de certos medicamentos, como corticosteroídes, desnutriç
ão, o Mycobacterium em fase latente pode reativar causando a tuberculose doença.
Um exemplo de doença destruindo a resistência é a SIDA. O HIV, além de destruir
o principal linfócito, o T4, produz uma série de outros distúrbios causados por
outros microrganismos tidos como normais.
1
• IMUNIDADE - É um fenômeno nato, específico e não raro sofre variação, principa
lmente quando há um desequilíbrio da imunidade celular. A infecção pelo HIV é um
exemplo clássico dessa alteração. A imunidade é realizada pelo sistema imune ad
aptativo, ou seja é realizado por células específicas para este fim. • IMUNIDADE
INATA - Muitos mecanismos eficazes podem proteger o indivíduo de infecções por
microrganismos altamente patogênicos, independente de qualquer contato prévio co
m os agentes etiológicos. Estes mecanismos tão eficientes impedem a ação de dife
rentes microrganismos. Toda defesa parece ser controlada geneticamente e há uma
diferença de espécie para espécie e mesmo intra espécie, com variações menores p
ara um mesmo indivíduo. Para um mesmo agente etiológico há variações na sensibil
idade de diferentes indivíduos. A galinha é altamente susceptível ao vírus da bo
uba, entretanto, qualquer mamífero é totalmente resistente, e mesmo as aves de e
spécies diferentes são também resistentes. Outro exemplo é a resistência dos fel
inos e caninos ao vírus Influenza A, entretanto este infecciona e produz doença
com facilidade em aves, suínos e equinos. Determinantes ambientais podem fazer a
parecer desde o início da vida uma imunidade adquirida que induz um mecanismo de
resistência a certas infecções. Com relação a esta resistência temos, por exemp
lo a grande sensibilidade da população indígena às várias doenças do homem civil
izado. Aquela população é muito mais sensível ao sarampo, à gripe, à tuberculose
do que o homem civilizado. A imunidade inata é correlacionada a um grande númer
o de determinantes. Estes podem ser específicos do hospedeiro, tais como: espéci
es e raças, fatores genéticos individuais, idade, variação hormonal, nutrição. T
ambém, é importante a participação de determinantes físicos como: pele, mucosas,
superfícies úmidas como é o caso dos olhos, sítios anatômicos que retêm a poeir
a e os microrganismos, etc. Aliado a estes determinantes, temos substâncias quím
icas como secreções diversas com atividade antimicrobiana, e as enzimas e os pol
ipeptídeos básicos que são substâncias com atividade bactericida ou bacteriostát
ica. A própria fagocitose com sua clássica digestão, é um fenômeno inespecífico.
A imunidade está diretamente relacionada às raças, às espécies e às famílias. C
omo exemplo citamos a hereditariedade, que está relacionada à resistência de det
erminadas famílias cujos membros são muito sensíveis à tuberculose, contrastando
com o que normalmente acontece com a população humana em geral. Também temos a
idade como fator de alteração na resposta inata, geralmente as crianças recém-na
scidas são sensíveis a uma variedade de agentes infecciosos e tal sensibilidade
está ligada à deficiência imunitária, por incapacidade do sistema linfóide reagi
r aos antígenos estranhos. Na velhice, os determinantes também desempenham anorm
alidades de resistência, ficando as pessoas mais sensíveis aos agentes estranhos
diversos.
2
A nutrição é outro fator de alteração marcante na variação da resistência. A sub
nutrição de animais de laboratório acarreta uma leucopenia e a atividade fagocit
ária diminui, induzindo o aparecimento de infecções diversas. Por outro lado, a
resistência inata pode variar com o agente etiológico. Sabe-se que o vírus da po
liomielite prefere as crianças bem nutridas, enquanto que as crianças desnutrida
s são mais resistentes a este vírus. O contrário acontece com o vírus do sarampo
que infecta a criança desnutrida produzindo processos infecciosos graves. Nas c
rianças bem nutridas a doença produzida por este vírus é mais suave. Fazem parte
da imunidade inata, as barreiras mecânicas e químicas conforme já citado anteri
ormente. A pele integra é um obstáculo a um grande número de agentes infecciosos
. A camada de queratina contribui muito para esta eficiente barreira. As mucosas
contendo secreções, células ciliadas com seus movimentos característicos remove
m os microrganismos e as enzimas oferecem efeitos bloqueadores. No estômago, o s
uco gástrico, pelo seu pH, tem ação bactericida sobre bactérias Gram negativas e
Gram positivas. Logicamente umas poucas espécies de bactérias como o Mycobacter
ium tuberculosis e o Helicobacter pylori resistem a esse pH e podem até coloniza
r na mucosa estomacal. Na pele, as secreções sebáceas e sudoríparas contém ácido
s graxos com propriedades bactericida, fungicida e viruscida. Na cavidade oral e
nos olhos encontra-se a lisozima, proteína básica de baixo peso molecular, enco
ntrada em alta concentração nos polimorfonucleares e com capacidade de hidroliza
r os glicopeptídeos da parede de muitas bactérias Gram negativas, resultando em
lise das mesmas. Menor ação é exercida sobre Gram positivas. Quando os microrgan
ismos conseguem vencer as barreiras naturais temos o processo inflamatório em qu
e, no decorrer deste, há lesão de um grande número de células, liberando vários
tipos de proteínas básicas. Incluem-se, entre estas as esperminas e as espermidi
nas que destroem o Mycobacterium tuberculosis e o Staphylococcus aureus. Além de
stas, são liberadas, também, proteínas básicas com alto teor de lisina e arginin
a, com função bactericida.
Os Fagócitos Os fagócitos são células especializadas na captura de microrganismo
s e substâncias estranhas ao organismo e, devido a sua especialidade são também
chamados de fagócitos profissionais. Estes fagócitos são formados por dois princ
ipais grupos celulares que compreende os grandes macrófagos e os pequenos granul
ócitos polinucleares. Os granulócitos polinucleares também são chamados de polim
orfos ou neutrófilos, baseado nas propriedades que tem ao terem seu citoplasmas
corados. Os macrófagos tem origem na medula óssea como promonócitos os quais ao
amadurecerem circulam no sangue como monócitos e por fim se transformam em macró
fagos, se espalhando pelos tecidos. Estes macrófagos estão presentes por todo o
tecido conectivo e estão associados a membrana basal de pequenos vasos. Eles est
ão concentrados em órgãos como pulmões (macrófagos alveolares), fígado (células
de Kupfer), na periferia dos seios medulares dos linfonodos, nos sinusóides do b
aço, tudo isso com a finalidade de atuar como uma barreira filtrante à entrada d
e microrganismos. Em geral
3
os macrófagos são células de vida longa e que dependem da mitocôndria para retir
arem sua energia, apresentam ainda um retículo endoplasmático extremamente rugos
o devido a grande quantidade de proteínas secretórias que esta célula produz e l
ibera. Os polimorfonucleares são as células encontradas em maior quantidade dent
re os leucócitos, assim como os macrófagos, se originam de uma mesma célula toti
potente na medula óssea. Estas células não possuem mitocôndria, mas faz uso de s
eu glicogênio citoplasmático (que é abundante) estocado justamente para servir d
e fonte de energia. A glicólise que estas células realizam permite que elas trab
alhem em condições de anaerobiose, como as que ocorrem num processo inflamatório
. Outra característica dos polimorfonucleares, é que são células que não se divi
dem e possuem um tempo de vida curto (algo entre 24 e 72 horas), apresentam um n
úcleo segmentado, seu citoplasma se caracteriza pela presença de grânulos azuróf
ilos, que contém mieloperoxidase, lisozima e proteínas catiônicas, grânulos secu
ndários específicos que contém lactoferrina e lisozima associadas e grânulos ter
ciários, que contém as hidrolases ácidas. De modo geral, podemos dizer que os po
limorfonucleares são a defesa contra as bactérias piogênicas enquanto que os mac
rófagos atuam melhor contra microrganismos intracelulares. O processo de fagocit
ose pelas células fagocitárias envolve primeiro a adesão do microrganismo a supe
rfície celular destas células. Esta adesão envolve o reconhecimento de carbohidr
atos do microrganismo e, uma vez aderido e identificado como estranho, o microrg
anismo é iniciada a ingestão, ativando o sistema de contração de actina e miosin
a o qual faz com que o citoplasma celular vá envolvolvendo a partícula estranha
até que esta fique dentro de um vacúolo (fagossomo). A etapa seguinte nesse proc
esso é a liberação de substâncias que tentarão destruir esta partícula ingerida.
Nessa etapa há um grande consumo de oxigênio pela célula resultando no aumento
do desvio da atividade da hexose monofosfato. Isto gera NADPH e reduz o oxigênio
molecular através da sistema da membrana citoplasmática de citocromos dando ori
gem a uma serie de agentes microbicidas poderosos, chamados de anion superóxido,
peróxido de hidrogênio, e radicais hidroxila. O peróxido formado, em associação
com a mieloperoxidase da origem a um potente sistema de halogenação que é capaz
de destruir tanto bactérias como vírus. Assim que o anion superóxido é formado,
a enzima superóxido desmutase atua de forma a converter o superóxido em oxigêni
o molecular e peróxido de hidrogênio, consumindo durante este processo ions hidr
ogênio. Deste modo há inicialmente um aumento do pH, facilitando a ação anti bac
teriana das proteínas catiônicas oriundas dos grânulos dos fagócitos. Estas molé
culas são capazes de lesar a membrana microbiana devido a ação da catepsina G e
pela aderência direta a membrana microbiana. Outros fatores oriundos dos grânulo
s são a lactoferrina e intermediários nitrogenados como o óxido nítrico, através
de sua capacidade de se complexar ao ferro, privando a bactéria de um elemento
essencial ao seu crescimento, e a lisozima que destroí a proteinaglicana da pare
de celular bacteriana. Deste modo o pH vai caindo de modo que os microrganismos
que estão mortos ou
4
morrendo vão sendo degradados pelas enzimas hidrolíticas. Assim que o processo t
ermina os produtos resultante desta degradação são liberados para o exterior da
célula. Como a fagocitose depende da adesão celular a membrana do fagócito, está
claro que deve haver um mecanismo que permita mobilizar um maior número de célu
las para o local de entrada do agente estranho. No caso das bactérias estas prod
uzem substâncias como a formil metionina a qual atrai os leucócitos, no entanto
este é um sinal ainda fraco, e existe um complexo mais eficiente realizado por n
osso próprio organismo que é a ativação da cascata do complemento (principalment
e a via alternativa). O complemento tem a propriedade de disparar o estímulo nec
essário a ativação de uma cascata que termina por destruir o organismo estranho
e atrair células fagocitárias para o local onde o microrganismo está. O principa
l elemento da cascata do complemento é o C3, e a sua clivagem dá inicio a via al
ternativa do complemento. O C3 entra em ativação expontânea em pequenas concentr
ações gerando uma nova molécula a C3b, a qual é capaz de se complexar com o fato
r B e interage com o fator D presente no plasma dando origem a enzima C3bBb (C3
convertase), esta por sua vez dá um feedback positivo aumentando a amplificação
da resposta ao produzir novas moléculas de C3b. No entanto todo este processo é
regulado por mecanismos que bloqueiam a ação da C3 convertase, a quebrando em no
vas moléculas menores e sem ação sobre a C3. Na presença de certas moléculas com
o carbohidratos presentes na superfície de bactérias o C3b gerado pela C3 conver
tase, pode aderir e se tornar estável à uma nova quebra, não perdendo assim sua
ação. É nessa situação que ela atua ativando a via alternativa do complemento. N
esta ativação uma grande quantidade de C3b, e logo se adere a membrana do micror
ganismo de forma covalente, isto termina por conferir a propriedade opsonizante
desta fração do complemento. Esta opsonização faz com que as células fagocitária
s reconheçam o organismo estranho com maior facilidade e assim o fagocitem com m
aior rapidez. O C3b junto com a C3 convertase consegue atuar sobre o fator C5 do
complemento o quebrando em C5a e C5b. O C5a junto com C3a atuam sobre os mastóc
itos os fazendo degranular, conseqüentemente há a liberação de fatores quimiotát
icos e de mediadores da permeabilidade vascular. Estes mediadores da permeabilid
ade vascular aumentam a permeabilidade através da modificação das forças interce
lulares entre as células endoteliais da parede dos vasos. Isto não só permite a
exudação do plasma como permite que elementos constituintes deste como o complem
ento chegue ao sítio da infecção. Estes mediadores também promovem a ativação de
moléculas como a ICAM-1 (molécula 1 intracelular de adesão) e ELAM-1 (molécula
1 endotelial de adesão leucocitária) as quais se ligam moléculas específicas dos
polimorfonucleares e permitem que estas passem entre as paredes dos capilares.
Por outro lado os fatores quimiotáticos, atraem os leucócitos polimorfonucleares
marginais de sua localização intravascular, através da parede dos vasos e event
ualmente os conduzem até os microrganismos opsonizados. Os polimorfonucleares po
ssuem um receptor específico para C3b em sua membrana e por isso aderem rapidame
nte e firmemente ao microrganismo opsonizado.
5
O processo de dilatação dos capilares (eritema), exudação das proteínas plasmáti
cas e do fluído plasmático (edema), devido a alteração hidrostática e osmótica,
e ao acúmulo de neutrófilos é que dão origem a resposta inflamatória aguda. Além
da atuação da fração C5a do complemento temos a continuação da cascata do compl
emento com o C5b que também adere a membrana do microrganismo, ao lado de C3b. A
pós a adesão de C5b temos a adesão de C6, C7 e C8 que forma um complexo capaz de
já dar início a lesão da membrana celular, com a adição de alguns componentes C
9 temos então a formação do complexo de ataque a membrana (MAC) que leva a lise
do microrganismo por perfurar a membrana. Fazendo parte desta resposta imune ina
ta, temos ainda as proteínas de fase aguda, como a Proteína C Reativa, que tem s
ua concentração aumentada em decorrência da liberação de mediadores de sua sínte
se tais como a interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6) e do Fator de Necros
e Tumoral (TNF). Estes mediadores são liberados como consequência da injúria cel
ular. Existem ainda outros fatores antimicrobianos extracelulares presentes no p
lasma como a lactoferrina, que forma um complexo com o ferro e o torna indisponí
vel à bactéria que costuma utiliza-lo como fator de crescimento. Temos também os
interferons (IFN), mais conhecidos por ter ação antiviral, por interferirem com
o processo de adesão viral à uma célula e, por vezes não permitindo que mais de
um vírus infecte uma célula já parasitada por um vírus. Os leucócitos produzem
vários tipos diferentes de α-IFN, enqu nto os fibrobl stos e pr tic mente todos
os tipos celul res sintetiz m o β-IFN. Um terceiro tipo de interferon, o γ-IFN n
ão é um componente da resposta imune inata. Quando as células são infectadas por
um vírus, elas produzem e secretam interferon o qual se li
a a receptores espec
íficos nas células adjacentes. O interferon, uma vez li
ado a uma célula não inf
ectada exerce atividade antiviral ao facilitar a síntese de enzimas que interfer
em com o mecanismo de replicação viral. Ainda fazendo parte da resposta imune in
ata encontramos um
rupo de células chamadas de Células Natural Killer ou NK (ma
tadoras naturais), estas células possuem atividade citotóxica. Na verdade as NK
são
randes linfócitos
ranulares que se li
am, provavelmente a
licoproteínas,
que aparecem na superfície de células infectadas
 por vírus e al
umas células tum
orais. Uma vez li ada a célula alvo as NK li eram o conteúdo de seus
rânulos. P


arece que o elemento citotóxico mais importante li erado são as perforinas, que
possuem uma ação parecida
 com o elemento C9 do complemento uma vez que é capaz d
e fazer furos na mem rana da célula alvo e assim a leva a citólise. Ainda com me
nor participação temos os eosinófilos, que parecem ser os fa
ócitos com especifi
cidade para a
entes parasitários como os helmintos. Os eosinófilos possuem
rânu
los em seu citoplasma
 que tem a propriedade de se corarcom corantes ácidos. Est
as células tam ém possuem receptores para o elemento C3 do complemento, uma vez
feita a adesão do eosinófilo com o parasito ocorre a li eração de proteínas cap
azes
 de lesar a mem rana do mesmo e ainda promover
 uma destruição maior devido a
li eração de meta ólitos do oxi
énio que contri uem nesta destruição.
6
 
TIPOS DE IMUNIDADE Sempre que ultrapassadas as arreiras inespecíficas pelos a
e
ntes infecciosos, estes vão induzir novos mecanismos de defesa, na maioria das v
ezes muito mais eficientes do que as diferentes modalidades que vimos anteriorme
nte. Este conjunto
 denomina-se estado de imunidade. A imunidade pode ser ativa e
passiva, su dividindo-se cada uma destas modalidades
 em natural e artificial. I
MUNIDADE ATIVA: É aquela em que o indivíduo rece e o antí
eno e o or
anismo tem

que tra alhar para formar a sua defesa, isto é, a imunidade humoral mediada por
anticorpos e a celular mediada por células. IMUNIDADE  ATIVA NATURAL: É aquela ad
quirida pela infecção natural. Ex.: sarampo, caxum a, mononucleose. IMUNIDADE AT
IVA ARTIFICIAL: É aquela induzida pela vacina,
 a qual pode ser constituída por m
icror
anismos
 atenuados como a vacina da tu erculose, anti-pólio,
 anti-sarampo e
anti-fe re amarela; vacinas inativadas como a vacina anti-rá ica, anti-coquelux
e, anti-salmonelose; e vacinas constituídas por toxoídes ou frações de micror
an
ismos como a para difteria e tétano (toxóides), adenovirose, (hexon isolado do A
denovírus). Atualmente, há outra modalidade de vacinas que são proteínas clonada
s muito específicas. Como este exemplo, temos a vacina contra a Hepatite B, prod
uzida numa levedura pelo processo do DNA recom inante. IMUNIDADE PASSIVA: É aque
la resultante dos anticorpos pré-formados.
 Neste caso a imunidade é por pouco te
mpo. IMUNIDADE PASSIVA NATURAL: É o tida através de anticorpos da mãe (I
G) que
atravessam a placenta para o feto ou através do colostro, nos primeiros dias de
amamentação. IMUNIDADE PASSIVA ARTIFICIAL: É adquirida pela inoculação de antico
rpos pré-formados em outro animal. Como exemplo, temos a soroterapia contra raiv
a, anti-ofídica, anti-tetânica e antidiftérica. Estes antissoros são o tidos em
cavalos e após purificação são usados para imunização. É um processo efémero de
proteção, durando de um a 4 meses, no máximo. IMUNIDADE ADOTIVA: É uma imunidade 
especial adquirida pela transferência de células (suspensão de linfonodos, aço
, medula óssea), provenientes de doadores imunizados que são aceitos como histoc
ompatíveis.
MECANISMOS DA IMUNIDADE Os mecanismos da defesa or
ânica contra as infecções pod
em ser discriminados da se
uinte forma: a) Imunidade humoral (anticorpos) a.1) A
ntitóxica
7
  
a.2) Antimicro iana ) Imunidade celular
IMUNIDADE ANTITÓXICA: Este tipo de imunidade é típico das toxi-infecções tais co
mo tétano e difteria, nos quais os micror
anismos causadores atuam por seu poder
toxi
ênico afetando as células do or
anismo
 hospedeiro. IMUNIDADE ANTIMICROBIAN
A: A imunidade
 humoral antimicro iana é em exemplificada
 pela defesa específica
que se esta elece no decurso da pneumonia lo ar pelo Streptococcus pneumoniae e
na menin



ite causada pela Neisseria menin itidis. Quaisquer destes ermes trans
pondo as arreiras defensivas do trato respiratório, invadem os alvéolos de dete
rminado se
mento rônquico onde se implantam e se multiplicam. Daí por diante se

ue uma sequência de eventos semelhantes aos que se desenvolvem no processo infl
amatório, em que os capilares se distendem e o plasma filtra através de suas par
edes, derramando para o interior dos alvéolos pulmonares. Fa
ócitos, inicialment
e, polimorfonucleares e depois macrófa
os afluem em
rande quantidade
 formando u
m exudato espesso tornando maciço o conteúdo alveolar, impossi ilitando a respir
ação. IMUNIDADE CELULAR: O a
ente etioló
ico de infecções pode multiplicar-se
 de
ntro dos macrófa
os. Nestas condições o anticorpo não pode atin
i-lo, esta elece
ndo a imunidade através de linfócitos efetuadores, que determinam uma “ativação”
dos macrófa
os, causando
 uma destruiçãodo a
ente infeccioso intracelular. Em i
nfecções como a tu erculose,
 a lepra, a rucelose e as viroses, em
eral é esta


elecido um quadro de equilí rio entre o hospedeiro e o a ente infeccioso, persis
tindo este no or
anismo em focos de infecção latente ou crônica. Bem diferente d
a imunidade humoral, a imunidade celular não pode ser transferida, passivamente, 
com soro imune, mas sim com células linfóides (imunidade adotiva) de animal so
revivente à infecção com micror
anismo virulento ou vacinado com a
ente atenuado
. Exemplo
 típico encontramos na vacina BCG ou nas vacinas virais atenuadas, como
a da fe re amarela, da poliomielite, etc. A
rande importância da imunidade cel
ular é evidenciada nas viroses, nas quais o vírus que é um a
ente intracelular,
é destruído onde o anticorpo não é capaz de penetrar. Este fato mostra que os an
ticorpos sistêmicos ou locais não tem papel relevante nas infecções virais. Este
s anticorpos são incapazes de impedir a propa
ação do vírus por conti
uidade cel
ular. Estes anticorpos tem a função mais de neutralizar os vírus, impedindo sua
disseminação hemato
ênica, como é o caso do vírus da pólio.
8
RESPOSTAS
 IMUNES ADAPTATIVAS O sistema imune adaptativo existe como uma forma de
loqueio aos micror
anismos que tenham conse
uido escapar do ataque promovido p
elo sistema inato. Sa emos que isto ocorre porque temos micror
anismos mutantes

que não ativam a via alternativa do complemento, al
uns micror
anismos tam ém ao
serem capturados

pelosmacrófa os desenvolvem reações que são capazes de neutra

lizar as su stâncias li eradas no vacúolo, vírus que são insensíveis a ação das
células NK (natural killer) e vírus que quase não estimulam a produção celular d
e interferon, deste modo não havendo a comunicação célula a célula capaz de evit
ar a propa
ação viral. Uma das principais proteínas sintetizadas nesta defesa im
une adaptativa são os anticorpos os quais são sintetizados pelos linfócitos B, m
ais especificamente pelos Plasmócitos. A síntese destes anticorpos só ocorre se
houver um estímulo feito pelo antí
eno ao linfócito B ou se este for estimulado
pelos linfócitos T. Cada anticorpo possui um sítio de reconhecimento, que se enc
aixa e amolda no antí
eno, e isto faz com que a li
ação do anticorpo ao antí
eno
seja mais forte ou mais fraca dependendo da especificidade da molécula de antic
orpo. Os anticorpos possuem ainda outros sítios, necessários para diversas funçõ
es como a ativação da via clássica do complemento, li
ação a células fa
ocitária
se células apresentadoras de antí
enos. Deste modo, quando um antí
eno está rec
o erto por moléculas de anticorpo, estes são capazes de induzir a fixação do com
plemento e a fa
ocitose.
AS BASES CELULARES RESPOSTA IMUNE
 HUMORAL O papel primário do sistema imune humo
ral é de eliminar or
anismos e iomoléculas estranhas, com o auxílio de proteína
s próprias
 e células. Isto érealizado pela li
ação de alo e autoantí
enos às im


uno lo ulinas. A resposta su sequente inclui a ativação do complemento e ou os s
istemas celulares da resposta imune o que eventualmente leva a fa
ocitose e dest
ruição da célula alvo, vírus ou proteína. Para que este mecanismo funcione é nec
essário que o sistema imune reconheça uma
rande

 variedade de antí enos “não sel


f” (estranhos ou aloantí enos), normalmente em aixas concentrações. Quando isto
não ocorre denominamos de inunodeficiência. Além disso o sistema imune deve res
ponder de forma eficiente aos aloantí
enos sem que isso leve a uma super reativi
dade aos antí
enos próprios (perda da tolerância levando a doença autoimune), ou
a resposta indevida levando a estimulação imune (produção de I
E levando a aler

ia). Além disso deve ocorrer a supressão da resposta imune quando a “limpa” do

or
anismo já tiver sido efetuada. A re
ulação do sistema imune é tam ém realizad
a pelo contato celular e mecanismos que dependem das citocinas para serem estimu
lados ou suprimidos. Os caminhos que a resposta
 toma depende dos tipos de leucóc
itosenvolvidos, tipos de antí
enos de mem rana que entram em contato e citocina
s li eradas.
9
A apresentação de antí
enos A fim de tornar simples o modo
eral de apresentação
de antí
enos ao sistema imune, podemos dizer que existem dois
rupos celulares,
um expressando o Antí
eno de

Histocompati ilidade (MHC) de Classe I, que está presente em todas as células do
or anismo, e outro
rupo apresentando o MHC de Classe II, que é encontrado nas


células apresentadoras de antí
eno. Podemos dizer que as células com o MHC de cl
asse I são responsáveis pela apresentação de antí
enos endó
enos, como vírus e a
l
uns marcadores tumorais produzidos dentro da célula afetada, e que ascélulas
com o MHC de classe II fazem a apresentação de antí
enos exó
enos como actérias
e toxinas. As células expressando o MHC de classe I, em
eral fazem o processam
ento da se
uinte forma: primeiro elas pe
am as proteínas produzidas por elas no
citossol ou endó
enamente, as que ram em peptídeos (8 a 12 aminoácidos) pelos sp
liceossomas e então são enviadas ao Retículo Endoplasmático (RE), através de mol
éculas de transporte associadas a proteína. No RE, os peptídeos são li
ados as m
oléculas do MHC de classe I ativas e são transportadas via Complexo de Gol
i, a
superfície celular. Uma vez na superfície celular, o complexo MHC classe I + ant
í
eno, se li
am a células T CD8+, o que leva a uma resposta mediada por células
do tipo citotóxica. Quanto as células que expressam o MHC de classe II, elas faz
em a captura do antí
eno exó
eno por endocitose. O antí
eno é em se
uida transpo
rtado para o lisossomo, onde então é de
radado em peptídeos, os quais serão li
a
dos a moléculas de classe II específicas. O complexo MHC de classe II + antí
eno
é então exposto na superfície celular, onde então irá se li
ar a linfócitos T C
D4+ que darão início a resposta imune humoral (produção de anticorpos). (McDonne
l,W.M., 1997) Células Apresentadoras de Antí
enos (APC) Os plasmócitos, são célu
las oriundas da diferenciação dos linfócitos B e tomam parte na resposta
 humoral
a partir do momento que estão envolvidas na monta
em de imuno
lo ulinas, no ent
anto, as Células Apresentadoras de Antí
enos (APC) e os linfócitos T são necessá
rios para o estímulo e controle da produção de anticorpos. Os leucócitos fa
ocit
ários podem ser divididos em duas classes funcionais: os macrófa
os/monócitos e
as APC, elas são responsáveis pela eliminação de produtos estranhos ao or


 anismo
assim como de moléculas próprias. Aparentemente, os macrófa os não são ons em
reprocessar os antí
enos para a apresentação ao sistema imune, eles apresentam
 e
m sua superfície um
rande número de receptores para re
ião Fc das imuno
lo ulin
as (FcR)
 e para o fator C3 do complemento (auxiliando no reconhecimento de célul
as reco ertas com anticorpo ou complemento), possui tam émem menor quantidade m
as em concentrações variáveis os antí
enos de histocompati ilidade (HLA ou MHC)
e outras moléculas de adesão celular como a CD54 e CD58. As APCs são muito menor
es em número do que os macrófa
os e não fa
ocitam células e antí
enos, ao invés
disso elas capturam e processam o antí
eno, apresentando os fra

 mentos em sua su


perfície celular em conjunto com os antí enos de histocompati ilidade celular de
Classe I e II (MHC), principalmente os de Classe II. As APCs mi
ram para as zon
as do tecido linfóide de células T
10
e B, e apresentam os antí
enos as células efetoras e moduladoras do sistema imun
e (células T, B e NK). Tam ém temos as células dendríticas que formam uma espéci
e de pseudopodo os quais podem se estender e aumentar a área de contato com os l
infócitos T e B. Isto tudo em conjunto com as moléculas de mem rana e citocinas
são os responsáveis pela ativação específica da resposta imune. No lifonodo temo
s a divisão das APC em células dendríticas, que apresentam antí
eno, via MHC de
Classe II ao linfócito T CD4+, e células foliculares dendríticas, as quais apres
entam o antí
eno no centro
erminativo dos linfócitos B. As células B tam ém pod
em funcionar como APCs. As células dendríticas são leucócitos, derivados de perc
ursores próximos do CD34. As citocinas são importantes em sua maturação, como o
Fator de Necrose Tumoral α (TNFα) e F tor Estimul dor de Colôni s de Gr nulócito
s e M cróf gos, no desenvolvimento d s célul s dendrític s, enqu nto bloquei m o
crescimento de m cróf gos. As célul s dendrític s e su s v ri ntes, como s cél
ul s de L ngerh ns, são encontr d s n pele, v sos linfáticos ferentes, s ngue
e outros tecidos não linfóides. Nos tecidos linfoídes, s célul s dendrític s sã
o norm lmente encontr d s n região interfolicul r. As célul s dendrític s, norm
lmente não possuem um número signific tivo de receptores p r C3 ou p r regi
ão Fc d IgG (Fcγ), mas são ricas em moléculas de MHC da classe I eII assim com
o em moléculas de adesão do tipo CD2, CD11c, CD29, CD54 e CD58. Tam ém, para fac
ilitar o contato
 com os linfócitos T e seu estímulo, expressa as moléculas CD40
e B7 na mem rana. As células dendríticas foliculares são APCs localizadas no fol
ículo primário (não estimuladas) e folículo secundário (estimuladas). Apesar des
tas áreas serem ditas zonas de células B, elas apresentam uma minoria de células
T, macrófa
os e APCs. As APCs ricas em receptores de Fcγ as quais li
am e apres
entam o antí
eno as células B inativas e ativas. As células dendríticas folicula
res podem se
urar este antí
eno por semanas, provavelmente desempenhando um pape
l importante na manutenção da resposta imune, por estimular células B novas e de
memória. O papel de ativação das APCs nos linfócitos T pode ser dividido em dua
s fases: o estímulo das células T inativas (reposta
 primária) e a ativação de cé
lulas T de memória (resposta secundária). Am as as células dendríticas, e em peq
ueno número as células

 B, podem apresentar antí enos aos linfócitos T. A apresen
tação efetiva por am as, não apenas requer o complexo
 de MHC, mas outro fator es
timulatório como ocontato célula a célula e a li eração de citocinas. Finalment
e as células B tam ém servem como células apresentadoras de antí
enos, isto foi
provado in vitro. As células B expressam
 o MHC de Classe II, e tem um receptor e
specífico para antí
enos (imuno
lo ulinas). Estas células B capazes de estimular
linfócitos
 T de uma maneira antí
eno específica, são células B7+, isto é import
ante sa er pois as células B em repouso (não ativadas), não possuem as proteínas
co-estimulatórias de li
ação, necessárias para ativar as células TH. Quando tem
os muitas células B7-, as células TH se tornam incapazes de responder ao estímul
o imune,
11
e isto leva a suspeita de que tais células B7- sejam a s responsáveis no papel d
e indução a tolerância ou aner
ia a antí
enos próprios. As células dendríticas a
presentam o complexo HLA+A
(MHC II + A
) ao receptor de célula T (TCR), de form
a que há o reconhecimento simultâneo, da célula T reconhecendo  o HLA e a célula
dendrítica o TCR, ocorrendo assim a li
ação entre elas e a su sequente resposta
intracelular com a li
ação posterior do CD4 ao MHC de classe II ou do CD8 ao MHC
de classe I. No entanto, se apenas a li
ação TCR/CD4(8) e o antí
eno/MHC II(I)
ocorre, parece que a célula T se torna incapaz de responder ou se tornar anér
ic
a. Na verdade esta é uma forma de induzir a tolerância a antí
enos próprios, esp
ecialmente para as células TH Th1. A ativação efetiva das células T pelas APC re
querem a co-estimulação pelo antí
eno B7 das células dendríticas ou dos linfócit
os B li
ando seus antí
enos CD28 ou CTLA-4 à célula T. Quando as células T são e
stimuladas deste modo, elas passam a coexpressar um li
ante (CD40L ou T-BAM) par
a o antí
eno de células B CD40. Apenas quando estes contatos co-estimulatórios o
correm é que a ativação da célula T ao antí
eno ocorre. As células T O antí


eno


TCR (Recptor de Células T) é um dosmem ros da superfamília das imuno lo ulinas
só que,

 diferentemente das imuno lo ulinas, o TCR é composto de uma su unidade a
lfa e eta (α e β). Uma pequena fração das células T expressam uma outra coleção
de produtos
ênicos do TCR, que são a delta e a
ama (δ e γ). Assim como as  imu
no
lobulinas, são necessárias moléculas acessórias para transferir o sinal e li

ação o antí
eno ao TCR para entro a célula. As moléculas acessórias mais imp

ortantes para esta ativação as células T são os complexos B7-CD28 ou B7-CTLA-4.
O complexo TCR-CD3, junto com a li
ação ao MHC-CD4
 e B7-CD28,


eralmente conse


uem ativar a célula T, no entanto, foi emonstra o que a a esão e CD2-CD58, CD1
1a-CD54 e CD4-MHC II ou CD8-MHC I são capazes e aumentar si
nificativamente o e
 
stímulo provi o pelo TCR e por B7-CD28 ouB7-CTLA-4. Parece que este aumento o
sinal
  estimulatório se eve a ocorrência e uma estabilização celular maior, qua
n o o contato entre estas moléculas.
12
  
Citocinas e sub-populações e Linfócitos   T Dentre as sub-populações e linfócito
s T, as Th1 e Th2 parecem ser oriun as a mesma célula pro
enitora, a Th0. As cé
lulas Th1 secretam interleucina 2 (IL-2), γ-Interferon(γ-IFN), Fator e Necrose
Tumoral (TNF) e IL-12, já as células Th2 são capazes e secretar as citocinas I
L-4, IL-5, IL-6e IL-10. As células Th1 lançam um sinal estimulatório  às células
B para que pro uzam e secretem I
G2a, que inibe a função a população Th2. A IL
-12 é uma citocina importante neste processo já que, sem ela, a
eração e novas
  
células Th1 é bloquea
 a. Isto acaba se refletin o também no papel a IL12 em es
timular a pro ução e IL-1, TNF  eγ-IFN, o qual é necessário
para a maturação e
Th1. IL-12 normalmente  é pro uzi a pelos
  monócitos, macrófa os e células acessó
rias como ecorrência e um estímulo   a o pelas infecções porparasitas  e bactér

ias. O γ-IFN exerce um sinal e “fee back”  positivo

estimulan o a pro ução e ma
is IL-12. A sub-população Th2 inibe a pro ução e I G2a, mas estimula a síntese
e I
E e I
G1; a IL-4 também tem participação neste processo. Em resumo IL-4 e I
L-10 são capazes e inibir monócitos e macrófa
os a prouzir IL-12, que este mo
  
o acabam por bloquear a maturação e Th1 e o correr a resposta imune feita por
Th1.
 
O estímuloa pro ução e imuno
lobulinas Ativação O primeiroestímulo para que a
célula B e início a pro ução e imuno
lobulinas, em
eral ecorre a li
ação 

o antí
eno ao anticorpo preso na membrana a célula B. Caso os

 antí enos sejam m
ultivalentes, como os polissacarí eos, ocorre a li ação
cruza a a imuno
lobulina
   
presente na membrana a célula B e ela se  torna ativa a, in epen ente a ativaç 
ão pelas células T (estimulação
   T in epen ente). No entanto, para a maioria os
antí

enos,há a necessi a e o estímulo pelas células T para que seja inicia a a
pro ução e imuno
lobulinas (estímulo T epenente). Para que isto ocorra, há a
    
necessi a e e que o antí
eno seja apresenta  o junto com uma molécula e MHC nu
ma APC e que a célula B seja co-estímula

 a pelo contato celular e por al umas ci
tocinas. Isto é importante como forma e evitar  reações autoimunes ou aloimunes.
Existemvárias formas em que este processo po e ocorrer, a mais comum é a apres
entação o MHC II por uma APC para uma célula B na presença o contato a célula
B com a Tpor B7-CD28. Em
eral a li
ação  cruzaa a imuno
lobulina  presente na
membrana a célula B, leva ao aumento  o nível e moléculas e a esão em sua me
mbrana (CD25, HLA Dr, CD40, B7) e e um aumento na  resposta a citocinas. Parece
que o contato mais importante neste  processo é o a molécula CD40 com a CD40L a
célula T é claro que, o contato e CD4/HLA Dr, CD11c/CD54 e CD2/CD58 são import 
antes, já que aumentam o estímulo a célula B. Também  é importante o contato as



APC que ocorre via Antí eno-MHC-Imuno lobulina e Superfície

 e/ou B-antí eno e
supefície-Receptotes
 Fc presentes nas células  foliculares en ríticas. Este aum
ento e contato também ocorre se o sinal for a o pelas células Th1 ou Th2.
13
   
Proliferação e maturação A ativação e proliferação  T epen ente as células B, i
nicialmente

 ocorre nos  centros erminativos os linfono os, baçoe tonsilas. A s

uinte moo
equência e ativação  as células B nos folículos
 parece ocorrer o se
,após
o complexo MHC II-A
-I
e superfície e CD40CD40L, na presença
 a li ação 
e etermina as citocinas (IL-2, IL-4), as células B começam  a proliferar rapi


amente. Nesta etapa elas crescem e morfolo icamente são enomina as blastos, pos
teriormente, elas proliferam  e se tornam centroblastos, os quais sofrem hipermut
ação somática nos
enes as imuno
lobulinas. Os centroblastos então ão ori
em a
   
células menores,
 que não se  ivi  em  e se enominam
 centrócitos. A manutenção
 a
maturação os centrócitos epen e a li
ação a sua imuno
lobulina e superfíci
   
e com os complexos e MHC II às células foliculares en ríticas. Quan o os centr


ócitos se li am via CD40-CD40L  e/ou CD23 as IL-4, isso evita queeles entrem em
apoptose (morte celular),
 evi o a ativação a síntese proteíca o bcl-2 que a m
antém. A presença e IL-4/IL-6 se li
ano a CD23 também faz com que a célula B a
 
ma ureça e se transforme no plasmócito  queé a célula especializa a na  síntese e
liberação e imuno
lobulinas. Depen en o a IL libera a no processo e ativação
   
a célula B, é que vamoster a pro ução e I
G (estimula a por  Th1: IL-1, γ-IFN
, IL-12) ou I
E (estimula a por Th2: IL-4,IL-6).  A população e células Th1 e su
as citocinas estimulam as células B a ama urecer e secretar anticorpos I
G2a. Já
o γ-IFN
a I
G1, enquanto a IL-4 é responsável pela
 inibe a transcrição

 enica



troca
  a transcrição enica e I G1 eI E. É importante ressaltar que há necessi 
a e e IL-4 e IL-5 paraa maturação os plasmócitos.  Os mecanismosapresenta os
até o momento a troca e isotipo na síntese e anticorpos  sãoain a um tantoc
omplica os e controversos
 e por isso não serão  iscuti
 os a funo aqui.Resumi a
mente po emos izer que a troca a ca eia pesa a se eve a uma eleção e um


 se
mento e DNA  entre re  iões constantes e exons e, o novo exon  o DNA que co ific
a anova ca eia pesaa. Issoparece se ar por uma excisão o “loop” o DNA inte
rme iário, acompanha o pela eleção e reanelamento (li
ação). Sabe-se que eve e
   
xistir uma enzima na con ução este processo só que, esta ain a não foi escober
ta.

VIA CLÁSSICA
 DO COMPLEMENTO Esta via só acontece se tivermos  moléculas e antico
rpo li
a as ao antí
eno,e no mínimo são necessárias  uas moléculas e anticorpo

. O primeiro
 componente o complemento ativa  o é o C1, que   ao se li
ar à uas mo
léculas
 e anticorpo I
G ou uma

 molécula e I M pela uni a e 7S através a porçã
o Fc a imuno

  lobulina,passan o então a expor suas  frações C1q, C1re C1s e tor
nar a uni a e C1r ativa  a, passan o
 a ter ativi a e e esterase.Um etalhe impo
rtante nesse processo e ativação eC1 é que há a participação e ions cálcio (
Ca++), sem ele, não há a manutenção o complexo
14
 
trimolecular
 C1q-C1r-C1s.
 É bom ressaltar
 que a via clássica também po e ser ati
va a pela presença a proteína  A os Estafilococos,   pela Proteína C Reativa (PCR
) e também pela molécula  e DNA. Com
 esta ativi a e e esterase C1 cliva os ois
 próximos componentes a cascata o complemento que são C4 e C2, estes são cliva
os em C4a e C4b eC2a e C2b respectivamente.
 C4b e C2 a erem a superfície
 o an
tí
eno, e próximo e C1, forman o assim ocomplexo C14b2. A fixação e C2 só oco
rrerá em C4b se contarmos com a presença os ions Ma
nésio (M
++), só então é qu
e C2 será quebra o em C2a e C2b, este último fica em solução. O complexo C4b2a a

e como uma C3 convertase que cliva C3 em C3a e C3b, este moo a opsonização e
  
quimiotaxia
  os leucócitos é ativa a, assim   como também ocorre o aumento  a perm
eabili a e vascular.
 C4b2a tem a capaci a e e clivar várias moléculas e C3 em
C3a e C3b,sen o que C3b irá se li
ar a superfície o antí
eno. O complexo C4b2a
 
3b é chama  o e C5 convertase, este quebra asmoléculas e C5 em C5ae C5b. As m
oléculas e C5b se li amtambém a superfície o antí eno e, em se
ui a a início



a formação o complexo e ataque a membrana (MAC), assim temos a li


  ação sucess
iva e C6, C7, C8. Finalmente  ocorre a li ação e 8 a 18 moléculas e C9 junto   a
este complexo, forman o assim um canal transmembrana que atua como uma uni a e
lítica. Os fra
mentos 
C3a e C5a atuam como potentes anafilotoxinas  que estimulam
os mastócitos  a e ranularem histamina, a qual é um potente ilata  or vascular
e contrator a musculatura lisa. Os neutrófilos liberam enzimas hi rolíticas e a
s plaquetas se a
re
am, levano a microtrombose, estase san
uínea, formação e e
  
ema e estruição teci ual local. C5a também atua como fator quimiotático para p
olimorfonucleares e macrófa
os.  Vemos então que a reação que ocorre é uma reação
em cascata, uma vezque em ca a fase enzimática ocorrem inúmeras reações na fas
e se
uinte, avoluman o a reação, como se fosse um processo ener
ético e uma cas
 
cata. O processo reacional vai se avoluman o a ca a passo que ocorre a reação se

uinte. ATIVIDADES DO COMPLEMENTO Muitas células próprias ou estranhas ao or
ani
 
smo po em sofrer lesões  pelaação o complemento. Plaquetas, hemácias, leucócito
s, bactérias, quan o revesti as por anticorpos específicos   ativamo complemento.
Oscomponentes C3 e C9 são os responsáveis pelo esenca eamento a lesão. No ca
so os micror
anismos pato
ênicos, o complemento é e capital importância na es
     
truição
 as mesmase na efesa o in iví uo. Lo
icamente, há uma série e reaçõe
s in esejáveis, on e o complemento éo responsável. É o caso as reações pós tra
nsfusionais em que, a a ministração e san

 ue ABO incompatível leva a reações se
verascomo calafrios, tremores, elevação a temperatura e, conseqüentemente, fix
ação o complemento com lise e liberação a hemo
lobina. Nas anemias  auto imunes
ocorre, também,
 hemólise. O anticorpo
 sensibiliza
 as hemácias e esenca eia ah
emólise. A oença hemolítica o recém-nasci o (DHRN) é, frequentemente provoca a
15
 
por anticorpos
 para o fator  Rh. Há uma série e outros processos em que a partic
ipação o complemento é in esejável. Complemento e Fa
ocitose: hemácias revesti
   
as por anticorpos
 e complemento têm sio utiliza as para a emonstração a parti
cipação
 o complemento na facilitação a fa
ocitose. O C3b é o elemento mais env
olvi o nesse processo. Os polimorfonucleares e macrófa
os possuem receptores par
a C3b em suas membranas, o que promove intimo


  contato entre fa  ócitos e as célul
as a serem
 in eri as. Bactérias em presença o complemento e e seu anticorpo co
rrespon ente, são fa
ocitaas mais facilmente e sofrem lise. Complemento e Liber
   
ação e Histaminas: na sequência a reação e fixação o complemento, são  libera
as C3a e C5a, em ambas as vias, clássica e alternativa. São proteínas  e baixo
peso molecular
 e que promovem
  a contração a musculatura
 lisa e po em provocar o
aumento a capilari a e celular. Os C3a e C5a são istintos química e biolo
ica
   
mente, e mo o que, quan o o músculo não respon e mais ao C3a, mostra resposta a


tiva ao C5a, su erin o receptoresnos mastócitos. Nesse processo há a liberação
e histamina que exerce a função e anafilotoxina. Complemento e Ação Quimiotáti  
ca: os fra
mentos  C3b e C5a  e o C5b67 (Complemento macromolecular) forma os ura
nte o processo e fixação o complemento, atraem

polimorfonucleares, exercen o ação quimiotáticapositiva. Se for feito um corte 
histoló
ico no local em que ocorreu o Fenômeno e Arthus, isto é, no ponto on e
 
se eu a reação e anti
eno-anticorpo, envolven  o o complemento, observa-se um a
cúmulo
   e polimorfonucleares. O tratamento e C3a
 por Tripsina inativa a sua cap
aci a e e contrair o músculo liso, permanecen o a sua ação quimiotática. Nesse
caso su
erem-se que
rupamentos químicos istintos sejam responsáveis por estas
   
ativi aes. Complemento e Pro ução e Quininas: As quininassão polipeptí eos co
m ativi a e hipotensora e estimulante a musculatura lisa, urante a ativação o
complemento. Há su
estões que a quinina prouzia pelo complemento seja ori
ina
   
a o componente C1 ouC4. O tratamento estes com a C1 esterase á ori
em a uma
substância e ativi a e semelhante   às quininas.
 Complemento e Doenças Humanas: 
o complemento está relaciona o à iversas oenças como, a
lomerulonefrite  a
u a
e crônica, lupus eritematoso sistêmico,  na pan encefalite sub a
u a e mesmo na
hepatite viral. Já se sabe que há eposição e complexos antí
eno-anticorpo-anti

-AU, em lesões renais.  BIOSSÍNTESE
 DO COMPLEMENTO: Os locais
 e síntese os seus
componentes são  iversos e etermina  os para quase to os os  componentes, bem co
mo para o inibi orC1. Componentes o Complemento e locais e síntese: Component
e C1 C2 C3 Locais e Síntese epitélio intestinal macrófa
os macrófa
os
16
 
C4 C5 C6 C7 C8 C9 Inibi or C1
     
fí
a o (células e Kupfer) baço fí
a o baço fí
a o fí
a o fí
a o
EFEITOS BIOLÓGICOS DOS PRODUTOS DE ATIVAÇÃO DO COMPLEMENTO
COMPONENTES E COMPLEXOS ENVOLVIDOS
ATIVIDADES
C1,4 C1,4,2
  
Em associação com I
M, neutralização
  o vírus Herpes simples Possível pro ução
e quininas, aumento a permeabili a e vascular
C3b
 
Facilitação a fa
ocitose pelos leucócitos.
 Imunoa erência - C3b sobre hemácias,
leucócitos ou plaquetas, terminan o por eliminação com a fa
ocitose.
C3a
 
Quimiotaxia para leucócitos.
 Anafilataxia
 (liberação e histamina, contração a
musculatura lisa e aumento e permeabili a e capilar).
C5a C5,6,7 C8,9
Quimiotaxia para leucócitos. Anafilatoxina. Quimiotaxia para leucócitos. Efeito
citotóxico.
17
     
AS IMUNOGLOBULINAS
  Também
 chama as e anticorpos, são o pro uto a célula B ma u
ra,
As imuno
lobulinas
 sintetiza
 os evi o a um estímuloanti ênico.
  são constit
uí as e, no mínimo uas ca eias pesa as (H e Heavy Chain) e uas ca eias leves
(L e Low Chain),estas   ca eias estão presas entre si por
 pontes issulfeto. As
moléculas são  sub ivi
 i as em
 classes e
 subclasses basea o em sua
 especifici a
e anti ênica as ca eias pesa as. As ca eias pesa as são esi na as por letras




re
as minúsculas, μ,γ,α,δ,ε,  as imunoglobulinas são chamadas d IgM, IgG, IgA,
IgD  IgE rspctivamnt. As três principais classs são a IgG, IgM  IgA  as
prsnts m mnor quantidad são a IgD  IgE (mnos d 1% do total d imunoglo
bulinas). Existm dois tipos d cadias lvs, chamadas d κ  λ, presentes em t
odos os tipos de imunog obu inas, mas apenas um tipo está presente em cada mo éc
u a de imunog obu ina. IgG, IgD e IgE apresentam duas cadeias pesadas e duas cad
eias eves, enquanto que a IgM e a IgA são mu tímeros desta estrutura básica. Po
ntes dissu feto e forças não cova entes conferem estabi idade a estrutura da imu
nog obu ina. A estrutura monomérica básica tem a forma de Y, com uma região cham
ada de região de dobradiça. A região da dobradiça, é uma região rica em pro ina
e suscetíve  a c ivagem por enzimas proteo íticas. Tanto a cadeia pesada e eve,
possuem uma região constante na porção carboxi termina  e apresentam uma região
variáve  na porção amino termina . Aproximadamente 60% das mo écu as de imunog 
obu inas tem a cadeia eve κ, e 40% tem a cadeia eve λ. A cadeia eve λ, aprese
nta 6 subtipos, estes indo de λ1 a λ6. As cinco c asses de imunog obu ina são ch
amadas de isotipos, baseado na especificidade da cadeia pesada de cada c asse de
imunog obu ina. Duas c asses de imunog obu ina, IgA e IgG foram posteriormente
subdivididas em subc asses baseado nas diferenças apresentadas na cadeia pesada.
Temos conhecimento de 4 subc asses de imunog obu inas IgG, designadas como IgG1
, IgG2(e recentemente descoberto a IgG2a e IgG2b), IgG3 e IgG4; e 2 subc asses d
e IgA, também designadas como IgA1 e IgA2. A digestão da IgG com papaína fornece
dois fragmentos chamados de Fab e um chamado de Fc. Cada fragmento Fab possui u
m sítio para igação ao antígeno, o fragmento Fc não se iga a antígeno mas é ca
paz de fixar o comp emento e se igar a receptores de Fc presente nas cé u as. J
á ao tratarmos a IgG com pepsina, teremos a imunog obu ina c ivada em sua porção
carboxi termina , dando como produto um fragmento com as duas porções Fab igad
as, F(ab’)2, e um fragmento parcia mente digerido de Fc (pFc’). Os fragmentos F(
ab’)2 possuem dois sítios de igação ao antígeno. As cadeias eves possuem um do
mínio variáve  e um constante enquanto que a cadeia pesada possui um domínio var
iáve  e de três a quatro  domínios constantes. A cadeia eve das imunog obu inas
tem aproximadamente 24 D ea cadeia  pesada das imunog obu inas tem um peso mo e
cu ar compreendido entre 51 D e 71 D, baseado em suas características dividimos
as imunog obu inas em c asses. Encontramos aproximadamente 30% de
18
homo ogia na sequência de aminoácidos presente na cadeia
 pesada das cinco c asse
s de imunog obu inas. A cadeia pesada da IgM é a μ, a I
G é a γ, a I
A é a α,

d IgD δ e a I
E a ε. A cadia psada é o principal constituint da molécula
d imunoglobulina. Cada imunoglobulina é constituída d uma cadia d quatro pol
ipptídos monoméricos, o qual consist d dois polipptídos lvs  dois psad
os. Os dois polipptídos psados são idênticos m qualqur molécula assim como
as duas cadias lvs. As imunoglobulinas possum ainda rgiõs dnominadas domí
nios, o qual consist d um polipptído prsnt tanto na cadia lv como na p
sada  cuja unidad strutural contém aproximadamnt 110 aminoácidos. Os domín
ios são alças qu são ligadas por ponts dissulfto nas rgiõs constant  vari
ávl das cadias psada  lv. As funçõs das imunoglobulinas stão ligadas a a
lguns domínios. A rgião VH corrspond a porção variávl da cadia psada da im
unoglobulina  a VL, corrspond a rgião variávl da cadia lv. Tmos ainda d
ntro dstas rgiõs variávis, parts hiprvariávis, chamadas d Rgiõs Hipr
variávis, stas são rsponsávis plo sítio d ligação ao antígno  pla sua c
onformação  spcificidad.
ALGUMAS CARACTERÍSTICAS DAS DIFERENTES CLASSES DE IMUNOGLOBULINAS
IgG Corrspond a aproximadam  
 nt 85% das imunoglobulinas prsnt nos adultos.
T m um p so mol cular d 154 D com duas cad ias l v s d 22.000D  duas psadas
       
d 55.000D cada. É também a imunoglobulina qu dura mais tmpo m circulação, m
média 23 dias. Tm a capacidad d atravssar a placnta  é o anticorpo nvolv
ido na rsposta imun scundária (rsposta anamnstica). Esta imunoglobulina pos
sui alta afinidad para ligação a um antígno spcífico, assim como d fixar co
mplmnto, stimular a quimiotaxia  atuar como opsonina para facilitar a fagoci
tos. Conform dito antriormnt, tmos 4 subclasss dIgG, todas basadas nas
dif    
 r nças d suascad ias p sadas γ, temos então as ca eias γ1,γ2,γ3 e γ4. Est
as iferenças a ca eia pesa a se baseiam na iferença que apresentam no número
e na posição as pontes issulfeto que li
am uma ca eia a outra.
    
I
M Correspon



 ea 5% as imuno lobulinas presentes no in iví uo a ulto e possui
uma vi a mé ia e 5 ias.É uma molécula com estrutura pentamérica, ou seja, pos
sui 5 estruturas básicas as imuno
lobulinas, só que estas estão li
aas entre s
 
i por pontes issulfeto e pela Ca eia J, com isso o seu peso molecular
 é em torn
o e 900kD. A I
M é a imuno
lobulina mais eficiente
 na fixação
 o complemento.
 S
ó encontramos a I
M em sua forma monomérica quan o está li
a a na membrana os
19
    
linfócitos B ma uros, nesse caso ela apresenta  ois componentes a icionais, o o
mínio transmembrana, composto por aminoáci os hi rofóbicos que ancoram a molécul
a à membrana
 citoplasmática, e um omínio citoplasmático.  Por ser uma imuno
lobu


lina ran e, basicamente a encontramos  no interior  os vasos. Tem importância na
imuni a e para antí
enos polissacarí ecos oriun os os micror
anismos.
  
I
A Assim como aI
M,correspon



 e a 5% as imuno lobulinas presentes emum a ult
o, possui
 uma vi a mé ia e 6 ias, e seu peso  molecular está em torno e 160 kD
. Po e ser encontra a na  forma monomérica, imérica, trimérica
 ou multimérica.
 E
xistem uas subclasses e I
A que são a I
A1 e I
A2. Ela po e ser encontra a na
circulação
 e nas secreções
 corporais, neste
 último caso ela se  apresentana form
a imérica, com as uasca eias básica a imuno
lobulina li
a as pela ca eia J e
um componente chama o e peça secretória.
   
I
D Encontra a li
a a a membrana e linfócitos  B ma uros, somente sob a forma mo
nomérica. Seu peso molecular aproxima o é e 185kD.
 
I
E Encontra
 a sob a forma monomérica
 na circulação, seu peso molecular é e apr
oxima

 amente 200kD.  Está implica a nas reações aléricas, principalmente   quan o
li
a a a membrana e mastócitos e basófilos. Resumi amente po emos izer que a I

A secretória poe ser encontraa em secreções corporais como saliva, leite, sec

reções brônquicas e intestinais.
 I
D e I
M estão
eralmente presas a membrana o
s linfócitos B a fim e intera
ir com os antí
enos e ativar os linfócitos B. A I

E está implicaa com os mecanismos e anafilaxia e a I
G, que é a única imuno
l

obulina capaz e atravessar
  a placenta, é a que está presente na circulação san

uínea em maior quanti a e.
   
A LIGAÇÃO ANTÍGENO-ANTICORPO O mo elo tra icional  usa o há al
uns anos, antes  e
se conhecer
 melhor a composição estrutural os anticorpos não é mais váli o. Es
te mo elo anti
o izia que o antí
eno se li
ava ao anticorpo por um moelo tipo
  
chave-fecha ura, hojeem ia já é sabi o que a interação que ocorre envolve síti
os combinatórios,



 sen o estabiliza a por li ações não covalentes, on e os rupos
que intera em evem estar   próximos para que estas forças atuem ou seja, evemos 
ter uma complementarie a e entre o epítopo anti
ênico e o sítio combinatório  o
anticorpo. Asvariações que ocorrem nesta complementarie a e é que
era iferen
   
ças na afini a e, avi ez e especifici a e o anticorpo.
20
      
Po emos izer que o anticorpo possui alta  afini a e quan o a interação as força
s moleculares e atração é maior que o as forças e repulsão. A força e intera
ção total entre antí
eno e anticorpo é que confere o
rau e aviez e isto també
    
m está li
a o a especifici
 a e, pois quanto maior a complementarie a e entre   os


sítios combinatórios o anticorpo com o antí eno, maior a sua especifici a e.
 
A PARTICIPAÇÃO
 DOS ANTICORPOS
 NA REAÇÃO DE FASE AGUDA A reação e fase a
u a tam


bém po e ter início quan o os anticorpos se li am a superfície e mastócitos, só
que a imuno
lobulina
 que mais participa nessa reação é a I
E, isto porque ela  p


ossui um sítio e li ação específico para receptores presentes na superfície e

mastócitos. Quan o um micror
anismo se li
a a estes anticorposli
a os a mastóci
tos, há uma alteração conformacional nos receptores   celulares
 os mastócitos,
 qu
e se tra uzem um sinal que leva a liberação
 e me ia ores capazes e aumentar a
permeabili a e vascular e a quimiotaxia e polimorfonucleares. Al
uns tipos e

  
anticorpos também po em  se li ar a membrana e células fa
ocitárias,  e mo
 o que
se houver

 a formação e um complexo antí eno-anticorpo,  envolven
 o mais e uma
molécula e anticorpo,
 há uma alteração a nível e receptores as células fa
oci



tárias que in uzem um sinal ao fa ócito, fazen o que ele fa ocite o antí eno. Is

to ocorre mais rápi o o que se o fa

 ócito apenas tivesse  um contato íntimo  com
o antí eno. Os anticorpos também po em atuar bloquean oal
umas

reações os antí

enos a li
ação com células, por exemplo, um anticorpo iri
io para a hema
luti
  
nina o vírus Influenza,
 po e bloquear sua li
ação a uma célula hospe eira. Outr
o exemplo, quan o os anticorpos se li
am a moléculas  e transporte presentes na
membrana bacteriana, faz com que esta eixe e captar al
uns nutrientes para o s
eu crescimento. Os anticorpos, também

 ao se li arem a toxinas bacterianas, bloqu
eiam sua ação e evitam que ocorra o ano celular.
 
ANTICORPOS MONOCLONAIS
 Os anticorpos  monoclonais, em mea os os anos 70 represen
taram um
ran e avanço na linha e ia
nóstico

   imunoló ico os laboratórios, com 
eles foi possível aumentar a especifici a e os "kits" e assim, obter resulta o
s mais
  confiáveis. Os anticorpos
 monoclonais,  são
anticorpos que possuem
 especif
ici a e para apenas
 um etermina o epítopo o antí eno,
  iferente
 os anticorpos
policlonais,
 on e temos varias imuno
lobulinas respon en o a iferentes epítopo
s e uma mesma molécula anti
ênica. Nossa resposta imunoló
ica normal  a um antí


eno é uma resposta
 policlonal, ou seja, há uma estimulação múltipla evários
cl
ones forma ores e anticorpos,
 cujos pro utos representam uma mistura e imuno l
obulinas.A síntese e anticorpos
 monoclonais só é possível em um laboratório es
pecializa o, isto apesar e teoricamente  ser fácil e ser monta o. Osanticorpos
monoclonaissão sintetiza
 os a partir e um clone e linfócito
 B ou e plasmóci
tos capazes e pro uzir anticorpos para o antí
eno eseja o.
21
  
Só que estes clones  evem ser  imortais,  já que ascélulas B não urammuito,  mes
mo que sejam manti os em con ições  i eais.
 A fim e conferir  imortali a e aos
 li
nfócitos B, se montam os  chama os hibri omas, que é a hibri  ização (fusão) e cé
lulas
 B com uma célula e mieloma linfocitário. As células
 e mieloma são escolh

i as por terem uas características principais, uma


 é e não conse uir pro uzir
imuno lobulinas, outra é que não possuem a ativi   ae e Hipoxantina Fosforibosil
Transferase (HPRT) ou seja, não tem a capaci a e e sintetizar  purinaspela via
exó
ena. Os linfócitosB são fusiona  os com as células
 e mieloma usan o-se Pol
ietileno Glicol (PEG),  este mo o em uma cultura  e células passamos a ter linfó
citos, células mielói es e hibri omas. Os híbri os sofrem a combinação os seu

      
enoma com o o linfócito
 B e a quireum esta o iplói e. A seleção  os hibri oma
s é feita colocan o as células trata as comPEG em um meio conten o Hipoxantina,
Aminopterina eTimi ina, por isso chama o e meio HAT. O que se faz é esperar a
morte natural  os linfócitos, que ocorre entre 1 a 2 semanas, enquanto que as c
élulas mielói es morrem porque elas não conse
uem usar a Hipoxantina exó
ena par

a pro uzir purinas, e a
   
Aminopterina bloqueia a síntese en ó
ena e purinas  e pirimi inas. Os hibri omas
conse
uem sobreviver porque conse uem
fazer uso a hipoxantina e timi ina para

ena, evio a informação
enética oriuna os li
pro uzir as purinas  por via  exó 

nfócitos
 B. Passa as então uas semanas, o meio HAT vai sen o ra
ativamente sub
stituí o por  um meio para manutenção celular  comum, como o MEM-Ea le. Posteriorm
ente, quan o estascélulas jáestão crescen o emum meio  e manutenção
 comum, é
feita a separação estas por  iluição. É realiza a uma iluição  e forma que se
obtenha 0,5 células para  ca a 100 ou 200μL,
 e esta suspensão é istribuí a em um
a microplaca,
 colocan o-se justamente
 e 100 a
 200μL por  orifício. Futuramente,

quan o já ocorreu  o crescimento e mais hibri omas  em ca a orifício a microplac 

a, a suspensão e ca a um estes eve  ser testa a. Normalmente  pela
 meto
 olo ia
e ELISA, para verificação o tipo e anticorpo pro uzi o ser o eseja o.

A SÍNTESEDAS IMUNOGLOBULINAS Durante amaturação os linfócitos B, o primeiro r
earranjo o DNA celular para a síntese os anticorpos ocorre com a monta
em a c
 
   
a eia pesa a e posteriormente a monta  em a ca eia leve, mas para fins i áticos 
, apresentaremos primeiro a síntese as ca eias  leves
e posteriormente as pesa
as. Os cromossomas  responsáveis pela pro ução  e imuno lobulinas nos humanos são
o 14 para as ca eias pesa as, 2 para as ca eias leves κ e 22 para as cadeias e
ves λ.
Síntese das cadeias eves Na década de 70, com o emprego das técnicas de DNA rec
ombinante é que se tornou possíve  estudar os genes responsáveis pe a codificaçã
o dos anticorpos. Conforme dito anteriormente, a cadeia
22
eve pode ser constituída pe a cadeia λ ou κ, os genes que as codificam estão pr
esentes em cromossomas diferentes. Iremos descrever brevemente como ocorre a sín
tese de cada uma destas cadeias baseado no mode o experimenta  descoberto em rat
os. Síntese da cadeia Lambda: O segmento genético que codifica a cadeia λ está p
resente no cromossoma 22 e está arranjado da seguinte forma a partir da posição
5’ para 3’: • • • Apresenta aproximadamente 100 segmentos Vλ (que codificam a po
rção variáve ), 6 segmentos Jλ (codificando a Junção) sendo que o segmento Jλ4 é
um pseudogene, ou seja, é um gene que não é expressado, 6 segmentos Cλ (que cod
ificam a região constante).
Antes de cada segmento Vλ temos também um segmento L chamado de segmento Líder,
é e e que codifica o inicio da fita a ser transcrita, este segmento, codifica pe
ptídeos que, tão ogo a mo écu a de imunog obu ina esteja montada, são c ivadas
para dar origem a mo écu a funciona . Todos estes segmentos estão separados por
introns (sequências não codificantes de DNA). Inicia mente o que ocorre é a reco
mbinação do segmento Lλ-Vλ com Jλ formando o comp exo Lλ-Vλ-Jλ o qua  fica separ
ado do segmento Cλ por um intron, e assim dará origem a um transcrito primário d
e RNA. Posteriormente temos processo de “sp icing” do intron entre a sequência L
λ-Vλ-Jλ e Cλ onde parte da sequência entre Lλ-Vλ-Jλ e Cλ é cortada e posteriorme
nte é feita a adeni ação do termina  3’, formando assim a cauda po i-A. Este tra
nscrito primário dá ao RNAm capacidade de codificar LλVλ-Jλ-Cλ quando for traduz
ido. Após a tradução temos o peptídeo nascente que é processado e g icosi ado, s
ofrendo então o corte do pedaço po ipeptídico codificado pe a sequência íder.
Síntese da cadeia Kappa: Nesse caso, o cromossoma que a codifica é o cromossoma
2, e este dispõe de maior número de regiões V (aproximadamente 350) cada uma pre
cedida de uma sequência Lκ, posteriormente 5 genes para Jκ, e ao fina  do cromos
soma há apenas um gene que codifica Cκ. Justamente pe o cromossoma que codifica
a cadeia κ possuir maior número de genes codificando V é que o número de regiões
variáveis possíve  é maior pois o número de combinações entre Vκ-Jκ passa a ser
de aproximadamente 1400. A sequência de montagem da cadeia Kappa ocorre da mesm
a forma que o da cadeia Lambda.
Síntese das Cadeias Pesadas As cadeias pesadas são codificadas pe o cromossoma 1
4, só que a ém dos genes codificadores para V e J também há um grupo de genes ch
amados D (Diversidade), estes segmentos D apresentam variações tanto no número d
e codons como no número de pares de bases e ainda, mais de um
23
segmento D pode se unir para dar origem a uma região D. A região D pode ser ida
de três formas diferentes sem gerar um “stop codon”, o que he atribui a divers
idade. O cromossomo da cadeia pesada descrito até o momento, parece apresentar d
e 100 a 200 genes para V com seus respectivos genes L na porção 5’, 30 genes par
a D, seis genes funcionais para J, três pseudogenes J e 11 genes para as porções
constantes da cadeia pesada (Cμ, Cδ, Cγ3, Cγ1, Cε2, Cα1, Cγ2b, Cγ2a, Cγ4, Cε1 
Cα2). São estes genes const ntes que irão determin r cl sse d imunoglobulin
ser form d . No processo de mont gem d c dei pes d , primeiro ocorre o re r
r njo do DNA de form que um dos segmentos D e J são lig dos, com o corte d seq
uênci de DNA que está entre eles. Em seguid um dos vários segmentos V, junto c
om o respectivo gene L, é lig do o complexo DJ form do. Este re rr njo VDJ con
tece pen s n s célul s que d rão origem os linfócitos B, e é o ponto crítico d
e controle n expressão d imunoglobulin um vez que pen s o gene V re rr nj d
o é tr nscrito. As regiões C ind se m ntém sep r d s do complexo VDJ por um in
tron, prov velmente contendo ind segmentos J não re rr nj dos. O tr nscrito pr
imário de RNA v i ter mesm org niz ção deste DNA. Não se s be ind se tod s
s regiões const ntes são express s no tr nscrito primário. Posteriormente o RNA
primário tr nscrito sofre o processo de “splicing”, onde o intron  situ
 do entre
o complexo VDJ é excluído té o primeiro gene C, o qu l é o Cμ, an o ori


    ema
um
 RNAm funcional  para
 a monta em a caeia pesa a μ. Múltiplos  nucleotí
 eos
 e
a enina são a iciona os, forman  o a cau a poli-A, a um os
 sítios e polia enila
ção localiza os na porção 3’ o RNA Cμ. Os
enes co ifica ores  para as outras cl
asses também possuem sítios e polia enilação,  e são utiliza os quan
 o estas
 re

iões são expressas. Então após

a monta em o RNAm, este é tra uzi o, an o ori
e
  
m a um polipeptíeo que ain a contém os peptí eos co ifica os pelo
ene L, estes 
então
são corta  os urante
 o processamento
 e
licolização
 aproteína, assim a
n o ori em a ca eia pesa a μ. To o este rearranjo


 o DNA que ará ori em as ca e
ias pesa as e leves a imuno lobulina, sãocoman a os porrecombinases, são enzi 
masque reconhecem sequências  especificas o DNA localiza  as na re
ião 3’ e 5’ e
ca aexon que será  uni o eassim,
se forma um “loop” o intron e DNA  que será
corta o.  A troca e classe e imuno lobulina, importante
 no
  processo e ama urec
imento a resposta imune, parece ser acompanha a ou prece i a pela mutação somát
ica. Inicialmente um se
mento completo e DNA, o qual inclui a re
ião VH recombi
    
na a, é li ocom as re
iões μ e γ, sen o transcrito em  uas moléculas e RNAm, u
ma expressan o a re
ião constante μ e outra expressan o a re
ião constante γ. Su
põe-se também
 que se
mentos maiores e DNA sejam transcritos juntos, e que o “sp
licin
” iferencial aria ori
em à outras classes e imuno
lobulinas, compartilh
   
an o as re
iões VH. Isto foi observa o em células pro uzin o simultaneamente I
M


e I E.
24
    
Parece também que a troca e classe e imuno
lobulina é me ia a pela recombinaçã
o entre cromossomas, nesse caso a semelhança entre as sequências que efinirão a
classe e imuno
lobulina,  permitem que ocorra umarecombinação somática entre  
ois cromossomas. Deste mo  o, se por exemplo temos os cromossomas, um  chama o e
A e outro B, uma parte o cromossomaA rearranja o, que seria  corta o em Cμ, re
combina com parte o cromossoma  B ain a não rearranja o on  e está o
ene para Cγ


. Assim teríamos a troca a I M pela I G. Como

 vemos, evi o a esta recombinação
somática que ocorre é que  permite
 a iversi a e que aparece
 nas imuno
lobulinas
, a associação
 ao acaso
 e ca eias leves e pesa as ain a contribui mais para aum
entar esta iversi a e. Devemos ter em mente também que oDNA presente  em uma cé
lula Bque sofreu o rearranjo   (recombinação
 somática),
 é iferente as emais cé
lulas o or
anismo, pois evio as eleções sofri as no DNA, este émenor,  noen
tanto a célula B continua sen o uma célula somática, ou seja capaz e se ivi ir
. As células tronco hematopoiéticas,
 assim como qualquer célula não B, tem o DNA
correspon ente aos
enes as imuno
lobulinas não rearranjao. A partir o momen


to que a
célulatronco
á ori em a uma célula pró-B, já começa  a ocorrer  o rearr
anjo os enes e imunolobulinas. O controle alélico Como ca a célula e nosso
or


anismo tem 23 pares e cromossomas homólo os, isto si nifica que


 temos 2 pare
s e cromossomos 2, 14 e 22. Como o linfócitoB sópro uz um  tipo e anticorpo,
ou seja com um tipo e ca eia leve e um tipo e ca eia pesa a isto si
nifica que
      
a expressão
  os outros tipos e ca eia pesa a é suprimi  a assim como o se
un o
tipo e ca eia leve. Por exemplo, o linfócito  B pro uzanticorpos
 com a ca eia
leve λ e com  a cadeia pesada γ, suprimin
 o a expressão os emais. O que eve es
tar ocorren o então é o que chamamos  e exclusão alélica, ou
 seja enquanto um o
s

 enes é expresso  o outro
 é excluí o. Isto parece ocorrer
  a se
uinte forma, qu

an
 o o rearranjo  e um os
enes,  como por exemplo, o e ca eia pesa a é bem suc


e i o, ori inan o ca
eias pesa as funcionais,   estas ca eiasimpe em o rearranjo
o

cromossomo
 homólo
 o e, assim não po e co ificar
 outra ca eia  pesa
 a. No caso
os enes as  ca eias
 leves, parece que as ca eias pesa as pro uzi as irão  estim

ular o
ene as ca eias leves a sofrer rearranjo, inicialmente os
enes a ca ei
a κ, se então o rearranjo dos cromossomas 2 é bem sucedido, há o impedimento do
cromossoma homó ogo e do par de cromossomos 22. Caso este rearranjo não seja bem
sucedido, outro cromossomo 2 é rearranjado e, em sequência, o par 22, até que u
ma cadeia eve funciona  seja produzida. Esta então inibirá o rearranjo nos gene
s ainda não modificados. Caso não haja rearranjo produtivo de cadeias eves ou p
esadas a cé u a entra em apoptose. Produção de imunog obu inas de membrana Os i
nfócitos B maduros tem de apresentar IgM em sua superfície ce u ar, esta IgM est
á na forma monomérica e apresenta dois domínios adicionais na porção carboxi ter
mina , um é o domínio
25
transmembrana e o outro o citop asmático. A IgM secretada tem estes dois domínio
s substituídos por uma peça. Estes dois tipos de IgM se originam devido a um pro
cesso a ternativo do mesmo transcrito primário de RNA onde um transcrito dará or
igem a IgM secretória com a cauda na porção carboxi termina  e o outro transcrit
o dará origem a IgM com os domínios transmembrana e citop asmático. Troca de c a
sse das imunog obu inas Os infócitos B assim que estão maduros expressam IgM e
IgD em sua membrana, isto se deve ao transcrito primário conter tanto o segmento
que expressa a IgM e a IgD, tendo este então dois processamentos para montar um
a ou outra imunog obu ina. No entanto quando a resposta imune exige a troca de c
asse, o rearranjo VDJ pode permanecer e ocorre apenas um novo rearranjo com o s
egmento C. Outra possibi idade, é do rearranjo VDJ permanecer e ser montado um t
ranscrito primário que expresse os segmentos constantes necessários. Este rearra
njo é dependente das citocinas iberadas durante o estímu o imune. Na resposta s
ecundária, dependendo do estímu o imune, pode ainda vir a ocorrer o rearranjo so
mático dos segmentos V, desta forma aprimorando a especificidade do anticorpo. O
s infócitos B maduros, assim que saem da medu a óssea permanecem na circu ação
periférica por a guns dias, morrendo então a menos que sejam recrutados por cont
ato com o antígeno que reconhecem. A partir do estímu o sofrido pe a igação com
o antígeno mais aque es oriundos das cé u as TH estes passam a secretar imunog 
obu inas.
REAÇÕES MEDIADAS POR CÉLULAS Estas reações envo vem a resposta imune quando, os
anticorpos não são suficientes ou não conseguem ter participação efetiva na ativ
ação imuno ógica. Esta resposta mediada por cé u as pode ocorrer na presença de
maior ou menor quantidade de anticorpos, não existe uma resposta sem a participa
ção de anticorpos. Como exemp o, citamos a formação dos comp exos antígeno antic
orpo durante uma resposta, em que estes comp exos estimu am a iberação de fator
es quimiotáticos os quais evam ao aumento do numero de cé u as e inf amação oc
a . Os anticorpos também podem estar envo vidos na igação dos antígenos às cé u
as via os receptores Fc, deste modo modu ando a resposta ce u ar. No caso de cé
u as fagocitárias e Natura  Ki er (NK), os anticorpos podem iga- as à seus a 
vos. Do mesmo modo não podemos dizer que toda resposta mediada por cé u as é dep
endente da coordenação dos infócitos T, muitas das vezes a resposta depende do
reconhecimento de partes comuns do microrganismo por receptores que não estão re
acionados com receptores antígenoespecífico de cé u as T e B. Respostas T indep
endentes
26
Vários componentes de microrganismos podem servir de estímu o para que ocorra a
quimiotaxia de fagócitos até o ponto de infecção. A gumas endotoxinas bacteriana
s podem ativar a via a ternativa do comp emento, promovendo então a formação de
C3a e C5a, que tem atividade quimiotática. Outro exemp o, são os Formi  peptídeo
s que a gumas bactérias possuem e que agem como quimiotáticos e são agentes esti
mu antes para fagócitos, uma vez que possuem receptores para estas substâncias.
A fagocitose só ocorre se o microrganismo estiver igado a superfície da cé u a
fagocitária, é c aro que esta igação é faci itada quando o microrganismo está r
ecoberto pe a fração C3b do comp emento pois, C3b se iga a receptores CR3 exist
entes nos fagócitos. Do mesmo modo, se o antígeno está recoberto por mo écu as d
e anticorpo, então o fagócito se iga ao antígeno via receptor de Fc para a imun
og obu ina. Outro mecanismo de ativação da resposta ce u ar independente da ativ
ação das cé u as T, é o da iberação de citocinas pe os macrófagos e outras cé u
as. O microrganismo invasor parece ter ou iberar mo écu as que fazem este efei
to. Dentre as citocinas iberadas pe os macrófagos, as de maior importância pare
cem ser o TNFα, o MIF (F tor de Inibição de M cróf gos) e IL-12. O TNFα ge u
ment ndo c p cid de microbiocid de m cróf gos e neutrófilos, junto com  IL-12
ele f zcom  que s célul s NK liberem γIFN, que leva ao aumento a ativi a e mic
robioci a os macrófa
os. O TNFα t mbém c us mud nç s n s célul s endoteli is e
f gócitos o que lev um umento d c p cid de de desão dos f gócitos s p re
des dos v sos endoteli is, f zendo que deste modo s célul s cheguem o sítio de
infl m ção. Qunto o MIF, ele possui c p cid de de tr ir m is célul s o loc
l onde está o ntígeno e desenc de r o processo infl m tório, ele t mbém é c p
z de ument r c p ci d de de f gocitose de outros m cróf gos e neutrófilos, s
sim como sin liz r célul s B e T p r que entrem em est do de “prontidão”.
Respost s medi d s por célul s T As célul s T enc rreg d s do princip l controle
imunológico neste tipo de re ção são s CD4+ ou Thelper (TH). Diferentes sub po
pul ções de célul s TH modul m os vários tipos de cooper ção celul r e produzem
diferentes tipos de citocin s. Efeitos secundários deste tipo de tiv ção lev m
Re ção de Hipersensibilid de T rdi com form ção do gr nulom de hipersensib
ilid de ou d no tecidu l. As célul s T enc rreg d s d supressão do sistem imun
e são ch m d s de célul s T supressor s, lgum s del s liber m citocin s modul t
óri s como TGFβ, que parece ser um supressor de células T. A partir do momento
que uma célula TH é ativada (pela apresentação de um antí
eno a ela), ela pode
determinar qual ou quais mecanismos que serão ativados, dentre estes, temos: a a
tivação de células CD8+ citotóxicas (TC), ativação de mastócitos e eosinófilos,
ativação de macrófa
os levando a
27
  
hipersensi ilidade tardia. A via de ativação vai depender de que su população d
e linfócitos T (TH1 ou TH2) vai ser ativada, e isto depende das citocinas e da c
oncentração local de vários esteroídes e meta ólitos da vitaminaD3 presentes no
tecido linfóide. Por exemplo, quando um micror
anismo leva a li eração de IL-12
e γ-IFN de macrófa
os e célulasNK, a su população de linfócitos T que será at
ivada é a TH1, enquanto que a li eração de IL-4 e IL-10 leva a ativação de TH2.
No

 processo a udo ocorre a estimulação das células TH0 que  tem a capacidade de l
i erar uma série de citocinas. No estímulo  crônico as su populações TH1 e TH2 s
e tornam ativas. Al
umas citocinas são li eradas tanto por TH1 quanto TH2 (IL-3,
GM-CSF, TNFα) enqu nto lgum s só por TH1 (IL-2, γIFN) e TH2 (IL-4, IL-5, IL-6
e IL-10). A população TH1 respon e a macrófa
os, especialmente quano estes apre
  
sentam o antí
eno. A população  TH2 ten e a aumentar  a pro ução e eosinófilos e
mastócitos e aumentar

a pro ução e anticorpos a classe I E principalmente; ess

a população respon e melhor quan o o antí
eno  é apresenta o por células B. Sabe-
se também que uma  população e TH1 é capaz e inibir a ação e TH2  e vice versa.
O γ-IFN secreta  o por TH1 inibe
 TH2, enquanto que a Il-10 libera a por TH2 inib
e a liberação as citocinas e TH1 e talvez  as células T citotóxicas e NK. As c
élulas que expressam  CD8 na membrana po em apresentar variações na liberação e
citocinas, muitas elas  liberam as mesmas citocinas que TH1 liberam e outras tem
o mesmo
 repertório e citocinas  que TH2,  talvez estas últimas exerçam  um papel
re
ula or ousupressor. A iferenciação   as células  CD8 é influencia a pelas sub
populações e células CD4. A ativi a e citotóxica   as células
  CD8 está presente
enquanto
  as células
  TH1 estão ativas.
 Citotoxici a e Me ia a por Células A cito
toxici a e me iaa por células poe ser feita por células T citotóxicas, al
umas
 
sub populações
 e células linfói es, e em eterminaas circunstâncias por célul 
as mielói es. As células citotóxicas só são capazes e lisar  células alvo, es e
que estejam suficientemente
 próximas. No entanto nem to  as  as células citotóxic
as operam o mesmo moo, pois existe o comprometimento e iferentes receptores 
na forma e ativação o mecanismo citotóxico. Existem três principais  tipos e i
nteração receptor-li
ante: • Antí
enos específicos (como peptí eos virais em cél
   
ulas infecta as), são reconheci  os por receptores e MHC as células T citotóxic
as. Nesse caso a maioria as células é CD8+, mas também envolve al
umasCD4+. •
Determinantes presentes em células tumorais, por exemplo, são reconheci os por r
eceptores em células NK. • Um anticorpo já li
ao a um eterminao antí
eno (ant
 
í
eno viral em uma célula infecta  a), é reconheci o pelos  receptores Fcpresente
s em células
 K; a esta forma e reconhecimento chamamos e Citotoxici a e Celula
r Depen ente e Anticorpo (ADCC). Estes são os principais mecanismos, mas existe
m outros
 em que há outras interações li
antereceptor que contribuem na estabiliz
ação a li
ação entre a célula citotóxica e a célula alvo.
28
    
Há um
rupo ecélulas citotóxicas capazes e reconhecer peptí eos apresenta   os
por moléculas e MHC presente nas células alvo e que por isso, não epen e o re
conhecimento e um antí
enoli
ao a anticorpo. São chamaas e células T citotó
 
xicas MHC  restritas, na ver a e são uma sub-população e pequenos linfócitos. A
maioria estas células é CD8+ e é capaz e reconhecer antí
enos associaos com M
  
HC e classe I, mas aproximaamente 10% as células T citotóxicas MHC restritas
tem CD4+ e reconhecem o MHC e classe II. O papel maisimportante as células T
citotóxicas, talvez
 seja o e eliminar células infecta as por vírus ao fazer o r
econhecimento o antí
eno apresentao junto com o MHC e classe I. Temos também

um
rupo e células citotóxicas que não precisam reconhecer o MHC, entre elas in
cluem-se as células NK e LAK (Limphokine Activate Killer),
eralmente estão pre
   
sentes no baço e san ue periférico.As células NK são eriva as os
ran


 es linf


ócitos ranulosos (LGL), a maioria as NK são CD3-,CD16+, CD56+ e MHC e classe

I+, este último como forma a célula ser reconheci a como própria enão ser lis
a a.Quanto
 as células LAK,  sabe-se  que em cultura  elas são capazes e ter  sua  a
tivi a e citotóxica aumenta  a quan o na presença e IL-2. Elas são eriva
 as e
células percursoras  pareci as com as células NK. Tem-se o conhecimento e que ex
istem células mata oras, mas que   não possuem uma função
 específica,
 elas possuem

CD3+
 e CD8+ e apresentam ativi a e citotóxica epen ente o reconhecimento  o M
HC e classe I, há também uma população  que expressa CD3+ e o receptor e célula
s Tmas que possui pouca ativi a e citotóxica e não precisa fazer o reconhecimen
to o MHC.
    
Citotoxici a e Celular Depen ente e Anticorpo (ADCC)  As células que esempenham
este papel, possuem receptores para a porção Fc as imuno
lobulinas, principalm
ente I
G, e costumam
 a seli
ar à células alvo recobertas por  anticorpos. Os pri
ncipais alvos este tipo e células, são as células infecta  as por vírus que apr
esentam antí
enos virais em sua superfície,  moléculas e MHC

e al uns epítopos p
resentes em tumores. Embora  alvo e controvérsias, também é ito que monócitos e
polimorfonuclearespo em atacar células tumorais recobertas por anticorpos. Al

umas células mieloí  es como os monócitos e eosinófilos, tomam parte nesse estímu
lo celular me ia o por anticorpo. Nesse último  caso a reação celular ocorre cont
ra parasitos e a classe a anticorpos envolvi os parece ser a I
E. Diante isso
 
levantou-se a possibili a e e que a I
E promove inicialmente os mastócitos a e

ranularem fatores quimiotáticos para eosinófilos e estes ataquem o parasito em
 
questão. Este tipo e mecanismo parece ser controla o pelas  célulasTH2, uma vez
 que elas liberam IL-4 e IL-5 que tem papel na
 promoção o aumento a população
e eosinófilos, mastócitos e linfócitos B pro utores e I
E.
29
 
O mecanismo básico pelo qual as células ADCC, T citotóxicas,  NK e Linfói es K ex 
ercem sua função é bem pareci o, este envolve  três fases istintas:  1. Li
ação
a célula com a célula
 alvo 2. Liberação o conteú o citotóxico as vesículas,  es
ta etapa é Ca2+ epen ente. Nesta etapa a célula  alvo sofre alteração  e sua est
rutura ejá se prepara para  a morte. 3.  Morte a célula alvo Este mo elo simples
é basea o na observação e vesículas os Gran es Linfócitos Granulosos (LGL), c
élulas NKe al
umas células T citotóxicas,  que contém perforina (uma proteína co
m ativi a e semelhante
 a fração C9 o complemento),
 e serina esterase,  envolvi a
na monta
em o processo  lítico. Na presença e Ca2+, os monômeros
 e perforina
se li
am a membrana a célula alvo e se polimerizam forman o o canal transmembra   
na. É bom ressaltar que  as células citotóxicas são resistentes a ativi a e a pe
rforina e por isso po em continuar ativas, esta resistência parece ser conferi a
pela proteo
licana presente nas vesículas, que se li
a e inativa as perforinas. 
As perforinas
 terminam por levar a célula alvo a apoptose coma fra
mentação o
DNA

 e esinte
 ração celular em pequenos pe aços, que são rapi amente captura os

rane processo inflamató
e estruí os por outras células, isto   sem provocar um  
rio. Nem to as as células com  ativi a e citotóxica são capazes e pro  uzir perfo
rina e, por isso, sua ativi a e citotóxica émenor, uma vez que ela eve ter out
ros mecanismos menos eficazes e estruição a célula alvo. As vesículas as cél
ulas T citotóxicas parecem conter  TNFα, TNFβ (Linfotoxina) e fator citotóxico de
NK (NKCF), no entanto não se sa e direito o papel destas citocinas uma vez que
elas levam de 3 a 4 horas para exercer seu efeito citotóxico. As células  mielóid
es tem suaatividade citotóxica ainda não totalmente  conhecida, sa e-se que junt
o com a li eração de
   TNFα e γIFN(este último libera o por células T e NK), há um
aumento e ativi a e a ciclo-oxi
enase e lipo-oxi
enase a célula alvo, com a

consequente
  liberação e raicais  livres intracelulares,
 também
 ocorre a liberaç 
ão e ra icais livres a ca eia e transporte  e elétrons a mitocôn
 ria e mu an
ças
 na síntese proteíca. As células mielói es também são capazes e liberar me i
a ores tóxicos como oxi
ênio reativo e interme iários nitro
enaos. O papel os
Macrófa
os Sabe-se que os macrófa
os estão envolvios em praticamente toos os e
   
stá
ios a respostaimune, a
in o antes mesmo a resposta me ia a pelos linfócit 
osT. Também é sabi o que eles atuam na ativação  e células T ao liberar  etermi
na as citocinas e atuam na resposta  coor enaa pelos linfócitos
 T,
 me ian o
a re
sposta inflamatória,
 tumorici
 a e microbioci a.  Muitas  as ações os macrófa os
são
 conheci as a partir e
   estu os
 in vitro,
 on
 e se escobriu que o γIFN é capa
z e ativar sua capaci a e e pro ução e óxi o nítrico enquanto que o TNFα é c
p z de ument r su liber ção. T mbém foi possível s ber que os m cróf gos são
30
 des tiv dos qu ndo n presenç de Prost gl ndin E e glicocorticóides. Há lguns
nos trás foi descoberto o F tor Des tiv dor de M cróf gos, encontr do como pr
oduto de célul s tumor is, este f tor é c p z de bloque r tivid de do γIFN.

   
Formação e
ranuloma Quan o a resposta me ia a por células falha na estruição
e um
 micror anismo por ele ser resistente
 ao ataque, as células  T continuam lib
eran o lifocinas que levam a formação o
ranuloma. A formação o
ranuloma é ob
serva a, por exemplo, em infecções por Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Le
ishmania spp e Lysteria monocyto
enes e or
anismos
ranes como o ovo e shistos
   
oma. A característica
 os
ranulomas
 é conter células eriva
 as e macrófa
os, c
uja
 função ain a não está esclareci a, células epitelioí es e células  multinucle
a as
i
antes. Estas células parecem termais  a função secretória  o que fa
ocit
ária e, ao que parece elas são

 o
resulta o a estimulação crônica os macrófa os
pelas linfocinas. A análise o ranuloma mostra que existem células T CD4+ no c
entro e, células CD8+ na periferia, su
erino que as CD4+ tem importância na in
 
ução ao acúmulo e ativação e outros linfócitos e macrófa
os. Estu os in vitro m
ostram que as lifocinas libera as por TH1 e TNFα são essenci is nesse p pel. No
modelo nim l de infecção pelo schistosom em r tos há necessid de de célul s
TH2.
REGULAÇÃO DA RESPOSTA IMUNE A respost imune pode ser regul d de vári s m neir
s, veremos brevemente s princip is del s, pen s o suficiente p r que poss mos
entender como que isso influenci nos ex mes l bor tori is.
Regul ção feit por ntígenos Célul s T e B podem ser tiv d s por ntígenos ss
im que eles se lig rem receptores específicos, no c so dos linfócitos T lig
ção não se dá com o ntígeno m s sim com p rte desse que p ssou por um process m
ento e foi lig do o MHC de cl sse I ou II. A form com que o ntígeno é dminis
tr d e n turez do ntígeno t mbém tem profund rel ção com form d respos
t imune. Como exemplo temos cápsul poliss c rídic de b ctéri s que ger lmen
te induzem produção de IgM, enqu nto que s proteín s induzem respost celul
r e humor l. Gr ndes qu ntid des de ntígeno o invés de produzir tiv ção, p
odem lev r o fenômeno de Tolerânci , que pode ser T especific e/ou B específic
. Como exemplo, se for dministr d um lt dose de poliss c rídeo em um nim
l, este pode ter induzid su tolerânci este ntígeno.
31
Regul ção por nticorpos Os mec nismos pelos qu is os nticorpos regul m respo
st imune ind não estão tot lmente definidos, s be-se que os nticorpos são c
p zes de induzir um controle neg tivo n respost imune isso é observ do qu ndo
se dministr um ntígeno junto com IgM específic , neste c so ocorre um estímul
o d respost imune p r este ntígeno, o p sso que, se for dministr d IgG no
lug r d IgM ocorre um supressão n respost . A plic ção prátic deste conhec
imento é feit , por exemplo, n plic ção de v cin s p r c xumb e s r mpo, el
s não são dministr d s em cri nç s com menos de 7 meses. Isso porque os níveis
de IgG oriund s d mãe, perm necem em circul ção por té 6 meses pós n scimento
e, com dministr ção d v cin nesse período ger ri um respost in dequ d , p
or não h ver o estímulo produção de m is nticorpos. Outro exemplo está nos c
sos em que há incomp tibilid de de Rh. A dministr ção de nticorpos p r Rh n
mãe Rh-, evit que el sej sensibiliz d pel s hemáci s Rh+ d cri nç no mom
ento do p rto, removendo s pouc s hemáci s que por ventur cheguem mãe tr vé
s d tiv ção d c sc t do complemento. Os imunocomplexos t mbém podem ument r
ou diminuir respost imune, s imunoglobulin s G e M podem modul r respost
vi receptores de Fc e form ção de um imunocomplexo com o imunógeno. Um exemp
lo disso está em p cientes com tumores m lignos, onde foi postul do que os imuno
complexos circul ntes de nticorpos e célul s tumor is são c p zes de suprimir
respost imune. Já form ção de imunocomplexos como o que ocorre com proteín
A de est filococos e nticorpo, estimul m respost imune por desenc de r v
i clássic e ltern d do complemento. Regul ção por linfócitos Conforme dito
nteriormente, dependendo d sub-popul ção de linfócitos T tiv d (TH1 ou TH2),
respost ocorre de form diferente. Há t mbém evidênci de que s célul s T
podem f zer supressão d respost imune. As célul s CD4+ podem evit r que ocor
r utoimunid de, embor não se conheç o mec nismo pelo qu l el s f zem isso.
S be-se t mbém que liber ção de citocin s como TGFβ, IL-4 e IL-10 podem supri
mir a resposta
 imune parcial ou totalmente. A produção de citocinas pelas difere
ntes su -populações
 de linfócitos TH CD4+, mostra
 porque ocorre a indução na pro
dução de I
E, tam ém a re
ulação cruzada das su -populações de linfócitos T most
ra que citocinascomo o γIFN secretado por células TH1 pode ini ir a resposta de
TH2. A IL-10 li erada por TH2 faz a supressão
 daexpressãode B7 e produção de
IL-12 por parte das células APC, o que tam ém aca a por ini ir a ativação de TH1
. No entanto parece que a função fisioló
ica

 de TH2 é mesmo de re ular a respost
a, conforme modelo realizado em ratos de la oratório,
 em que ao se remover a pop
ulação TH2, o rato tinha a resposta imune exacer ada. Já as células CD8+ parecem
desempenhar o papel de transferir a resistência e a tolerância, este efeito par
ece ser mediado pela TGFβ.
32
Re
ulação neuroendócrina Em condições de estresse pode ocorrer a supressão da re
sposta imune, como por exemplo a maior dificuldade de uma pessoa se recuperar de
umainfecção. A re
ulação feita pelo sistema nervoso central (SNC), pode ocorre
r so dois aspectos, numa devido amaioria dos tecidos linfóides e vasos san
uín
eosterem enervação simpática, aca a influenciando na re
ulação dos  linfócitos.
Tam ém o sistema nervoso controla de forma direta ou indireta a li eração de vár
ios hormônios, envolvendo peptídeos pituitários e hormônios esteroídais adrenais
em particular, corticosteróides, hormônio do crescimento, tiroxina e adrenalina
. As células nervosas costumam apresentar receptores para produtos do sistema im
une, assim como os linfócitos apresentam receptores para vários hormônios, neuro
transmissores e neuropeptídeos, incluindo-se al
uns para as catecolaminas (adren
alina e nor adrenalina), encefalinas, endorfinas, su stância P e peptídeo intest
inal vasoativo (VIP), a resposta varia entre os diferentes linfócitos e monócito
s. Como exemplo temos

 a prolactina re ulando a função linfocitária, em condições
de estresse há a li eração de corticosteróides, endorfinas
 e encefalinas as qua
is tem efeito imunosupressivo.
 Foi evidenciado tam ém que os linfócitos podem re
sponder a corticotrofina, li erando um fator que as faz
erar seu próprio ACTH,
o qual é capaz de ativar a li eração  de corticosteróides. A su stância P parece 
ter papel nas reações de hipersensi ilidade como a artrite e a asma, ao ser li e
rada pelo sistema nervoso, parece atuar em cima das juntas e do trato respiratór
io perpetuando o processo inflamatório e, pelo menos in vitro ela parece atuar n
a quimiotaxia de macrófa
os e fazer com que mastócitos de
ranulem. Outro exemplo
, encontramos nas células como os macrófa
os, que quando ativados lieram IL-1,

esta a
e no hipotálamo produzindo a fe re. Controle
enético Estudos realizados
com diferentes
rupos populacionais tem demonstrado que a resposta imunoló
ica p
ode variar entre eles por um

 fator enético. Um dos exemplos está em famílias qu
e são suscetíveis ao Coryne acterium diphtheriae, isto devido a uma característi
ca intrínseca deles. Outro exemplo está na suscepti ilidade

 de al umas famílias
de Japoneses descendentes da ilha
 de Okinawa
 ao HTLV; tam ém tem-se conhecimento
de
rupos suscetíveis ao Myco acterium tu erculosis, assim como outros suscetív
eis ao vírus da hepatite B e por isso incapazes de montar uma resposta contra es
tes a
entes. Parte dessa resposta parece ser determinada pelos
enes que control
am a monta
em do MHC de classe II pois, de acordo com sua estrutura  ele poderá t
er maior ou menor afinidade por determinados peptídeos. Mas há tam ém a influênc
ia de outros
enes não li
ados ao MHC que parecem influenciar, como exemplo temo
s a Imunodeficiência
 Severa Com inada (SCID) que ocorre devido a falta do
ene d
a recom inase, outro exemplo está na Deficiência da Adesão Leucocitária, promovi
da por mutações na su unidade da β2 inte
rina, o que leva a falha na expressão d
e LFA-1, CR-3 e CR-4. O FENÔMENO DA TOLERÂNCIA
33
A tolerância imunoló
ica é um fenômeno que o or
anismo se torna incapaz de respo
nder para determinado antí
eno. A auto-tolerância é a mais importante de todas p
ois é aquela em que o or
anismo aprende a não produzir uma resposta imune contra
si. Não é a estrutura de uma molécula que irá induzir o fenômeno da tolerância
e sim fatores como o tempo que os linfócitos entraram em contato com os epítopos
, o local de encontro, a natureza das células que apresentaram os epítopos e a p
rodução de fatores co-estimulatórios
 por estas células. A tolerância pode ser di
vidida em dois
rupos, a sa er, a tolerância central e a tolerância periférica.
Entende-se por tolerância central aquela que ocorre durante a maturação das célu
las T no timo e, das células B na medula óssea, já a tolerância periférica, é aq
uela que ocorre nos tecidos periféricos. Após as células pró-T saírem da medula,
elas che
am ao timo e, é aí que as células T se desenvolvem a partir de percurs
ores em que não foi feito o rearranjo dos
enes do Receptor de Célula T (TCR). E
stes
enes são rearranjados durante o desenvolvimento dos linfócitos tímicos, de
forma que os linfócitos T possam expressar TCRs que os permita reconhecer produ
tos de de
radação anti
ênica ou peptídeos quando estes são apresentados junto co
m a molécula de MHC.
 Da mesma forma como ocorre uma alta proliferação de linfóci
tos T no timo, tam ém ocorre uma alta taxa de mortalidade destes, a maioria CD4+
e CD8+, tudo isso faz parte
 do processo de seleção dos timócitos. As células qu
e não são destruídas, so revivem porque possuem al
um
rau de afinidade com re
i
ões polimórficas do MHC. Os timócitos se encontram com células corticais epiteli
ais que lhe apresentam moléculas de MHC, se estas forem capazes de se li
ar, pre
sume-se que seja dado um sinal para que estejam prote
idas da morte celular. Ess
a seleção positiva
arante que as células T amadureçam e sejam capazes de reconh
ecer os peptídeos de li
ação das moléculas de MHC assim se tornando tolerantes a
o próprio MHC. A seleção positiva no entanto, não conse
ue evitar a diferenciaçã
o de células T expressando TCR de alta afinidade por peptídeos próprios e por mo
léculas de MHC. Deve haver al
um processo de seleção ne
ativa para estas molécul
as. Um dos processos prováveis, envolve a li
ação das moléculas Fas do linfócito
T com a FasL expressa por al
umas células presentes no timo, no entanto, este p
rocesso da interação Fas-FasL parece ocorrer com maior frequência na tolerância
periférica. Como tanto o processo de seleção positiva e ne
ativa envolvem o reco
nhecimento de peptídeos próprios associados com MHC, parece que os sinais dados
através do mesmo TCR leva a seleção celular de acordo com a afinidade de li
ação
do TCR com seu epítopo e a concentração do mesmo. Quanto mais forte for a li
aç
ão com o epítopo, será dado o sinal para a seleção ne
ativa. A existência de vár
ios sinais diferentes para cada processo seletivo é provavelmente a razão pela q
ual os co-receptores de CD8 são essenciais para a seleção positiva, mas não nece
ssária
 para a seleção ne
ativa a menos que a afinidade do TCR pelo peptídeo este
ja aixa. A seleção ne
ativa depende de uma série de fatores,os quais incluem o
desenvolvimento da célula T a acessar o antí
eno self, a com inação do TCR e mo
léculas acessórias como a CD8 ou CD4
34
para o complexo peptídico que compõe o MHC próprio e a identificação e deleção d
as células. A seleção ne
ativa não requer células APC, é
eralmente realizada po
r células dendríticas do timo ou por macrófa
os presentes na junção córtico medu
lar e são ricas em MHC da classe I e II deste modo, elas podem se li
ar a célula
s T que tem alta afinidade por peptídeos próprios. Há suspeita de que outras cél
ulas tam ém possam estar envolvidas nesse processo, inclusive
 se acredita que os
próprios timócitos tomem parte neste processo. Existe tam ém um
rupo de célula
s especializadas, em in
lês chamadas de “veto cells”, que expressam seus próprio
s epítopos e emitem um sinal ne
ativo que mata o clone auto-reativo. Em condiçõe
s fisioló
icas, o sinal dado por estas células veto, ocorre quando uma célula T
que expressa o TCR para o epítopo próprio se li
a a célula veto que expressa os
epítopos próprios. Para que o efeito da célula veto ocorra o TCR deve se li
ar a
o epítopo próprio que está associado com o MHC de classe I presente na célula ve
to, enquanto o CD8 da célula veto se li
a ao MHC de classe I presente na célula
T deste modo, assim que essa li
ação ocorre a célula T é morta. As células T que
escapam do processo de tolerância central, ainda podem sofrer o processo de sel
eção periférica, neste caso, existem pelo menos três tipos de processos conhecid
os, são eles: 1. Deleção clonal pela indução a morte celular 2. Aner
ia clonal 3
. Supressão periférica por células T No processo de deleção clonal pela ativação
da morte celular, um dosprováveis fatores para este, parece ser o da li
ação d
as moléculas Fas-FasL. Sa e-se que várias células além dos linfócitos expressam
o Fas (CD95), que é um mem ros da família de receptores do TCR, o li
ante do Fas
, é a molécula FasL, que homólo
a ao TNF, este é expresso por células T ativadas
. A partir do momento em que uma célula T expressando o Fas se li
a a célula T c
om o FasL, é dado um sinal para que a célula T com o Fas entre em apoptose, elim
inando-se assim a célula T autoreativa. Ao que parece devem ocorrer outras inter
ações entre outros receptores para que haja a indução da apoptose da célula auto
reativa, al
uns autores falam que o estímulo repetitivo das células T auto reat
ivas com o antí
eno próprio, levaria estas células T a ficarem no estado ativo e
assim expressarem mais Fas, oque as levaria mais facilmente a rea
irem com a c
élula T expressando o FasL. Sa e-se até o momento, que ratos que não expressam c
élulas com o FasL, sofrem de uma doença auto imune semelhante ao Lupus Eritemato
so Sistêmico (SLE), só que com uma intensa linfoploriferação. O processo de Aner

ia Clonal, envolve a inativação prolon
ada ou irreversível dos linfócitos T, es
 
ta indução ocorre so certas circunstâncias. Como sa emos, as células T se torna
m ativas a um determinado antí
eno quando estas são apresentadas a ela via MHC e
há a presença do sinal coestimulatório como a li
ação do CD28 da célula T ao B7
da célula apresentadora de antí
eno. Se a célula apresentadora de antí
eno não
é capaz ou, se ela não expressa B7, a célula T então se tornará anér
ica a este
antí
eno. Posteriormente, mesmo que a célula anér
ica a determinado antí
eno, ve
nha
35
a sofrer a apresentação de um antí
eno para o qual ela é anér
ica por uma APC pr
ofissional, expressando B7, ela continuará anér
ica. Na supressão
 periférica por
células T, esta parece ocorrer por ação de células TH2 li erando al
umas citoci
nas em cima de uma determinada célula TH1 auto reativa, pois ao que parece os au
to antí
enos, são capazes de fazer as células TH2 expressarem um resposta seleti
va de supressão a favor do próprio. Tolerância das células B aos antí
enos própr
ios Quando se fala de tolerância das células B a nível de medula óssea, parece q
ue o processo de seleção é parecido com aquele que ocorre com as células T no ti
mo, ou seja,

 quando as
células B que estão em desenvolvimento encontram um antí
eno de mem rana e se li am a este ainda na medula, elas entram em apoptose, mas
isso não evita que saiam células B auto reativas da medula
 pois é possível encon
trar células B com receptorespara colá
eno, tireo
lo ulina e DNA no san
ue peri
férico de al
umas pessoas. Em ora a tolerância das células B possa ser comandada
pelas células T, em determinadas ocasiões as células B podem se tornar tolerant
es sem esta interferência. Um exemplo são al
uns micror
anismos que apresentam r
eação cruzada com epítopos reativos das células T e apresentam epítopos que são
capazes de estimular células B. Tais antí
enos são capazes de provocar um forte
estímulo na produção
 de anticorpos a antí
enos próprios. Além disso os receptore


s de imuno lo ulinas em células B maduras estimuladas podem sofrer hipermutação
e por isso podem se tornar anti-self reativas num está
io tardio. A tolerância d
eve ser imposta as células B durante o seu desenvolvimento e após o estímulo ant
i
ênico nos tecidos linfóides secundários, e ao que parece, é aí que  as células
B que rea
em com antí
enos próprios são excluídas. As células B tam ém podem sof
rer o processo de aner
ia clonal, neste caso, parece que se elas encontram um de
terminado antí
eno e não encontram a célula T específica para fazer a apresentaç
ão do mesmo, o complexo antí
eno-receptor
 é suprimido e a partir daí esta célula
B nunca mais irá expressar a imuno
lo ulina de superfície para este antí
eno as
sim como nunca mais será estimulada pela célula T para que produza imuno
loulin
 
as para este antí
eno que ela foi ini ida. As células B tam ém podem se tornar a
nér
icas quando expostas a
randes quantidades de antí
enos monoméricos solúveis 
. Parece que a supressão ocorre quando o antí
eno se li
a a I
M presente na mem
rana do linfócito B. Esse mecanismo provavelmente não tem a participação das cél
ulas T supressoras ou de células B anti idiotípicas. As células B anér
icas pode
m voltar a responder desde que sofram o estímulo pelas células TH, este estímulo
é realizado via
 CD40 (presente nas células B) com os receptores presentes nas c
élulas T e tam ém por receptores de I
D. Por outro lado a expressão das molécula
s B7 na célula B é prejudicada, este defeito pode ser superado se as células B s
ofrerem o estímulo por citocinas como a IL-4 e/ou ativadores policlonais como os
lipopolissacarídeos.
36
  
Baixas concentrações de antí
eno tam ém pode levar a tolerância, astaque estes
entrem em contato com células B imaturas, o que leva ao processo de a orto clon
al. Outro processo que pode levar as células B a se tornarem tolerantes é o que
se chama de exaustão clonal, neste caso o imunó
eno é capaz de ativar todos os c
lones de linfócitos B existentes para ele. Isto leva a maturação dos  linfócitos
B e a produção de anticorpos para o antí
eno em questão, o que aca a levando, de
pois de um determinado tempo, a exaustão das células B, o que enfraquece a respo
sta imune para este antí
eno.

REAÇÕES DE HIPERSENSIBILIDADE Chamamos de reações de hipersensi ilidade aquelas


que ocorrem de forma exa erada ou de forma inapropriada. São reações oriundas de
uma resposta normal, mas que em al
um momento se processam de forma indevida e
al
umas vezes promove um processo inflamatório ou causa lesão tecidual. Estas re
ações não aparecem no primeiro contato
 do indivíduo com o antí
eno, mas sempre n
um contato
 posterior. Gell e Coom s descreveram quatro tipos de reações de hiper
sensi ilidade, assim classificadas como I, II, III e IV, mas na verdade al

 umas
das vezes temos a manifestação de mais de um tipo de reação de hipersensi ilidad
e em conjunto. As três primeiras reações são reações dependentes de anticorpos e
a última é mediada pelas células T e macrófa
os. A reação do tipo I ocorre quan
do a I
E é produzida e normalmente
 se diri
e a antí
enos inócuos como pólen, áca
ros e pelo deanimais. A li eração de mediadores farmacoló
icos por parte de mas
tócitos sensi ilizados produz uma reação inflamatória a
uda com sintomas como as
ma e rinite. A reação do Tipo II, ou reação citotóxica dependente de anticorpo o
corre quando o anticorpo se li
a a um antí
eno próprio ou estranho presente nas
células e leva a fa
ocitose deste, via atividade matadora das células ou via lis
e mediada pelo complemento. A reação do Tipo III ocorre quando há a formação de
imunocomplexos em
rande quantidade e que não conse
uem ser eliminados pelas cél
ulas do sistema retículo endotelial,
 levando a reações como
 a doença do soro. Po
r fim, a reação do tipo IV,
 tam ém chamada
 de hipersensi ilidade tardia, ocorre
quando antí
enos, como o acilo da tu erculose, são capturados por macrófa
os e
não conse

 uem ser destruídos. Neste processo há o estímulo de células T que pass 
am a li erar citocinas as quais mediam as respostas inflamatórias. Hipersensi il
idade do Tipo I É caracterizada como uma reação alér
ica que ocorre imediatament
e após o contato com o antí
eno ou aler
eno. Seus sintomas clínicos  foram descri
tos em 1923 por Coca e Cooke, os quais incluíam asma, eczema, fe re, urticária e
aler
ia a comida. Geralmente
 ela ocorre em pessoas que apresentam al
um históri


co familiar de aler ia tam ém.
37
 
As reações do Tipo I, são dependentes de I
E li
adas a mastócitos ou asófilos,
pois a partir do momento em que a I
E se li
a ao antí
eno, ela sensi iliza os ma
stócitos a de
ranularem, desta forma levando aoprocesso inflamatório. Ao que pa
rece, quando os mastócitos são ativados há a li eração de citocinas como a IL-3,
IL-4, que atuam nos mastócitos, outras capazes de ativar os linfócitos B a prod
uzirem e secretarem I
E; IL-5, IL-8 e IL-9, que parecem ativar a quimiotaxia e a
tivação de células inflamatórias ao sítio de inflamação. A produção da I
E depen
de da apresentação do antí
eno por uma APC e da cooperação entre células B e TH2
. Assim que a I
E é produzida ela cai na circulação e se li
a a receptores espec
íficos para ela, presentes em asófilos emastócitos. Aliás está é uma caracterí
stica da I
E, ela se li
a a mastócitos e asófilos via o receptor deFc presente
nestas células.


 Apesar de a I E
durar al uns dias, os mastócitos e asófilos pe
rmanecem sensi ilizados para a I E por meses, isto devido a alta afinidade que a
I
E apresenta para o receptor FcεRI, o qual vita qu a IgE sja dstruída por
protass séricas. Só como curiosidad, as células também aprsntam um rcptor
d Fc, dnominado d FcεRII, só qu st tm baixa afinidad pla IgE. Em manif
staçõs alérgicas  infcçõs parasitárias, os nívis d IgE stão smpr lva
dos, mas as raçõs alérgicas não s manifstam apnas pla lvação sérica da I
gE. Sab-s qu a produção d IgE dpnd da coordnação das células TH2, pois 
la libra citocinas como a IL-3, Il-4, IL-5, IL-9  IL-13, qu ativam a célula B
a fazr a troca d class d imunoglobulina  assim passar a produzir IgE. A IL
-5 librada também é capaz d promovr o aumnto do númro d osinófilos, lvan
do a osinofilia tão caractrística nos procssos alérgicos. Os mastócitos qu s
ão as células nvolvidas nst procsso, são classificados m dois tipos, os mas
tócitos do tcido conctivo (CTMC)  os mastócitos das mucosas (MMC), cada uma d
las aprsnta caractrísticas morfológicas próprias assim como protass caract
rísticas, qu não srão dscritas aqui por não sr d nosso intrss. Existm
outras células qu podm s ligar a IgE  com isso tr sua ação citotóxica aumn
tada no combat a parasitos como os schistosomas. Estas células podm sr snsib
ilizadas por complxos imuns circulants  com isso contribuir no procsso alér
gico já qu las contém uma varidad d mdiadors inflamatórios capazs d pro
movr a ração alérgica. Estas células podm sr o próprio linfócito B, células
T, macrófagos, células d Langrhan é células foliculars dndríticas as quais,
s ligam a IgE via o rcptor FcεRIIb. A dgranulação dos mastócitos  basófilos
ocorr a partir do momnto m qu as moléculas d IgE s ligam ao antígno  pr
omovm a agrgação dos rcptors d Fcε, isto promov o aumnto da ntrada d í
ons Ca++ dntro da célula, rsultando na dgranulação. Esta dgranulação também
pod ocorrr s houvr a ligação cruzada d lctinas (como a concavalina A), com
a rgião Fc da IgE, dsta forma agrgando os rcptors Fcε. Isto xplica porqu
 algumas pssoas tm urticária quando ntram m contato com algumas plantas, po
is pod sr qu stas tnham grand quantidad d lctinas.
38
Dvmos rssaltar qu xistm outras substâncias capazs d fazr os mastócitos
 basófilos dgranularm como os fators C3a  C5a do complmnto, drogas como o
ACTH sintético, codína, morfina  ionóforos d cálcio (por facilitarm a ntra
da d Ca++ na célula). O influxo d cálcio nos mastócitos induzido plo antígno
tm dois fitos principais, um é qu ocorr a xocitos do contúdo dos grânul
os com a libração d mdiadors pré formados, sndo qu a histamina é o mais co
nhcido, outro é qu ocorr a indução da sínts d novos mdiadors formados a
partir do ácido araquidônico, lvando a produção d prostaglandinas  lucotrin
os, os quais tm fito dirto nos tcidos locais. Nos pulmõs ls lvam a bron
coconstrição, dma d mucosas  hiprscrção, lvando a asma. Atualmnt é dit
o qu xistm difrnts populaçõs d mastócitos produzindo difrnts tipos d
mdiadors. Como prova disto, citamos os anti-histamínicos, qu são ficazs na
s rinits  urticárias, mas não são ficints na asma, ond os lucócitos tm u
m papl mais important. Algumas drogas podm bloquar a libração d mdiadors
, sja plo aumnto dos nívis intraclulars d AMPc, como 
 a isopr nalina qu
 
  

stimula os r c ptor s β adrenér icos, ou por evitar a que ra do AMPc pela fosfod
iesterase como a
e a teofilina. O modo de ação do cromo
licato de sódio prevenin
do os mastócitos de de
ranularem ainda não está esclarecido
 mas parece envolver
o mecanismo de entrada de cálcio na célula, e tam ém parece afetar a li eração d
e mediadores por outras células.

Dia
nóstico in vitro Os métodos de dia
nóstico para a hipersensi ilidade do Tipo
I empre
ados nas análises clínicas não são muitos, em
eral eles são  analisados
em conjunto
 com testes in vivo realizados no
 paciente. Como nosso o jetivo é o
estudo la oratorial, descreveremos de forma reve, os testes in vitro. Dosa
em d




a I E sérica total Em eral na hipersensi ilidade do tipo I, a I E sérica está a
umentada em pacientes que apresentam aler
ia a inalantes no entanto a quantidade
de I
E sérica depende de fatores como idade, sexo, fumo, histórico familiar e p
resença de processos infecciosos como parasitoses. A I
E sérica é expressa em Un
idades Internacionais (UI), cada UI equivale
 a 2,4 nano
ramas de I
E, sendo que
os valores de referência se aseiam  na o servação populacional, portanto não há
uma normatização dos mesmos. A ta ela a aixo, mostra os níveis séricos de I
E o
servados em pessoas normais de acordo com a idade. IDADE VARIAÇÃO (UI/ml) MÉDIA
GEOMÉTRICA (+/2DP/UI/ml) Desvio Padrão 0 dia <0,1 - 0,5 0,22 (0,04 – 1,28)
39
6 semanas 3 meses 6 meses 9 meses 1 ano 2 anos 3 anos 4 anos 7 anos 10 anos 14 a
nos 18 – 83 anos
<0,1 – 2,8 0,3 – 3,1 0,9 – 28,0 0,7 – 8,1 1,1 – 10,2 1,1 – 49,0 0,5 – 7,7 2,4 –
34,8 1,6 – 60,0 0,3 – 215,0 1,9 – 159,0 1,0 – 178,0
0,69 (0,08 – 6,12) 0,82 (0,18 – 3,76) 2,68 (0,44 – 16,26) 2,36 (0,76 – 7,31) 3,4
9 (0,80 – 15,22) 3,03 (0,31 – 29,48) 1,80 (0,19 – 16,86) 8,58 (1,07 – 68,86) 12,
89 (1,03 – 161,32) 23,66 (0,98 – 570,61) 20,07 (2,06 – 195,18) 21,20 (valores no
rmais 10 –20 UI/ml)

Em
eral os testes para
 a dosa
em total de I
E no soro são aseados na metodolo



ia de ELISA, mas tam ém dispomos da metodolo ia de quimioluminescência só que a
sua popularização
 só será possível quando estiver a preços mais acessíveis. O pr
incipio ásico da maioria dos testes compreende o uso de um anticorpo específico


para I E fixado em um suporte onde é
colocado o soro do paciente e feita a incu
ação. Posteriormente, é feita a lava em do suporte para que os anticorpos não l
i
ados sejam removidos, e em se
uida é adicionado um outro anticorpo específico
para I
E marcado que se li
ará a outra porção da I
E . De acordo com a reação qu
e é feita a leitura é realizada em um aparelho apropriado que lançara os resulta
dos em UI/ml. Testes soroló
icos específicos para dosa
em de I
E Ultimamente dis
pomos de vários testes para dosa
em de I
Es específicas no soro, todos tem quase
o mesmo princípio que é de fixar uma porção do antí
eno purificado a um suporte
. Posteriormente o soro do paciente é colocado em contato com este antí
eno para
que ocorra a li
ação antí
eno anticorpo. Toda I
E que não for específica para o
antí
eno não se li
ara, e lo
o na etapa se
uinte, que é a de lava
em, será desp
rezada. Posteriormente, é acrescentado
 o conju
ado, que é um anticorpo específic




o para I E li ado a al uma su stância reveladora ou passível de revelação como a
peroxidase, Iodo 125 ou su stâncias derivadas do luminol. O conju
ado então se
li
a ao complexo antí
eno anticorpo formado, se li
ando apenas às I
Es, todo o e
xcesso que não se li
ar é removido com uma lava
em posterior. Dos testes disponí
veis temos os de Radioimunoensaio, que já estão caindo em desuso devido aos pro
lemas que os materiais radioativos apresentam, o teste de ELISA e suas variações
e os testes de Quimioluminescência.
40
  
Todos estes
 testes apresentam oa sensi ilidade, no entanto o que apresenta maio
r sensi ilidade e permite quantificar a I
E com maior exatidão é o teste que emp
re
a a quimioluminescência.
REAÇÃO DE HIPERSENSIBILIDADE TIPO II As reações do tipo II são mediadas por anti
corpos da classe I
G e I
M que se li
am a células ou tecidos específicos com iss
o, o dano causado se restrin
e as células adjacentes ao antí
eno. As reações do
tipo II diferem do tipo III porque, nesta última a reação ocorre
 com antí
enos s
olúveis presentes no plasma, formando imunocomplexos que aca am por se depositar
de modo não específico em determinados tecidos e ór
ãos. Os mecanismos pelos qu
ais a reação do tipo II ocorre, se dá inicialmente pela li
ação do anticorpo a c
élula alvo, desencadeando a ativação da via clássica do complemento, com isso, o
s fra
mentos C3a e C5a do complemento atraem
 macrófa
os
 e polimorfonucleares
 ao
local, assim como estimula mastócitos e asófilos a li erar su stâncias que  irão
atrair mais células aosítio
 de reação. A via clássica do complemento tam ém pr
omove a deposição de C3 , C3 i e C3d na mem rana da célula alvo, facilitando ass
im sua fa
ocitose ou destruição por
 células matadoras. Ainda com relação a via c
lássica do complemento, pode se o servar a formação do complexo de ataque a mem
rana (MAC) que leva a lise da célula alvo. As células que participam deste proce
sso são macrófa
os, neutrófilos, eosinófilos e células K (Killer), que se li
am
ao anticorpo
  complexado com a célula alvo, via o receptor
 de Fc ou via os fatore
s C3 , C3 i e C3d do complemento depositados na mem rana da célula alvo. A li
aç
ão do anticorpo via receptor de Fc, estimula as células fa
ocitárias a produzire
m mais leucotrienos e prosta
landinas, que terminam por aumentar a resposta infl
amatória. Quininas
 e moléculas
 quimiotáticas
 como o C5a, leucotrieno B4 (LTB4) e
peptídeos da fi rina tam ém contri uem nesse processo de quimiotaxia. Diferente
s classes de anticorpos produzem
raus variáveis na capacidade de induzir esta r
eação, dependendo da afinidade com que se li
a a C1q ou com a capacidade de se l
i
ar ao receptor de Fc das células participantes da reação. Componentes do compl
emento ou I
G a
em como opsoninas ao se li
arem ao antí
eno, com isso as células
fa
ocitárias fa
ocitam com maior facilidade. As opsoninas, além de aumentar a a
tividade fa
ocitária, potencializar

 a capacidade dos fa ócitos de produzir inter


mediários do oxi ênio reativo, tam ém promovem o aumento da capacidade dedestru
ição do pató
eno assim aumentando o dano imunopatoló
ico. Isso pode ser o servad
o nos neutrófilos do liquido sinovial de pacientes com artrite reumatóide, onde
a capacidade deles produzirem superóxido é maior do que a dos neutrófilos encont
rados na circulação. É suposto que isso ocorra devido a ativação dos neutrófilos
presentes na junta por mediadores como os complexos imunes e fra
mentos do comp
lemento.
41
Os mecanismos pelos quais as células efetoras destroem a célula alvo na reação d
o tipo II é idêntico ao que acontece na destruição de micror
anismos só que, com
o a célula não conse
ue fa
ocitar al
o maior que ela, os neutrófilos fazem a exo
citose de seu conteúdo lisosomal, deste modo lesando a célula alvo e as células
adjacentes. Em al
umas reações como a que acontece com os eosinófilos
 ao rea
ir
com os Schistosomas, a exocitose do conteúdo dos

 rânulos é enéfica, mas quando
os alvo é o tecido do hospedeiro quefoi sensi ilizado com anticorposo dano te
cidual é inevitável. As células K tam ém podem se li
ar a células reco ertas com
anticorpo via receptor de Fc, a partir daí elas de
ranulam citotoxinas capazes
de destruir vários tipos de células, o mecanismo pelo qual elas atuam parece ser
idêntico ao das células T citotóxicas. No entanto a maior ou menor atividade da
célula K parece depender da quantidade de antí
eno expresso na superfície da cé
lula alvo. Al
umas formas de expressão da reação de Hipersens ilidade do Tipo II 
Reação contra hemácias e plaquetas Estas reações são as mais comuns de serem o


servadas, elas podem ocorrer em circunstâncias como, atransfusão san uínea inco
mpatível, onde a pessoa que rece e as hemácias é sensi ilizada pelos antí
enos p
resentes na superfície desta; na Doença Hemolítica
 do Recém Nascido, é outra das
formas
 de expressão deste tipo de hipersensi
 ilidade, onde a mulher
rávida é s
ensi ilizada pelas hemácias
 fetais; e tam ém nas Anemias Hemolíticas Autoimunes
onde o indivíduo é sensi ilizado pelos próprios eritrócitos. Com relação as plaq
uetas, ela aparece no Lupus Eritematoso Sistêmico, onde elas promovem a trom oci
topenia e reações com neutrófilos e linfócitos. Reações Transfusionais Estas rea
ções ocorrem quando o receptor possui anticorpos para as hemácias do doador. São
conhecidos mais de 20
rupos san
uíneos, o que
era mais de 200 variantes
enét
icas. Cada
rupo san


 uíneo consiste de um
locus no ene que é
capaz de expressar


um antí eno na mem rana da hemácias a al umas células do san ue. Em cada sistem
a existem dois ou mais fenótipos. No sistema ABO encontramos 4 fenótipos, A, AB,
B e O o que corresponde aos 4
rupos san
uíneos. Uma pessoa com determinado
ru
po san
uíneo é capaz de reconhecer eritrócitos não próprios e por isso é capaz d
e montar anticorpos para estas hemácias com antí
enos alo
ênicos. Os
rupos A, B
, AB, O e Rh são fortes imunó
enos, seus epítopos
 aparecem em vários tipos celul
ares e estão localizados em unidades de car ohidrato de
licoproteínas. A maiori
a das pessoas desenvolve anticorpos para os
rupos alo
ênicos sem que tenham tid
o contato com hemácias não próprias, isto porque umas série de micror
anismos ex
pressa antí
enos parecidos com os do
rupo ABO. Já o sistema Rhesus é de extrema
importância pois ele é a principal causa da Doença Hemolítica  do Recém Nascido.
Os antí
enos Rhesus são proteínas lipídio dependentes distri uídas na superfíci
e celular.
42
Existem outros
rupos san
uíneos mais raros como os epítopos do sistema MN, que
são expressos na porçãoN-terminal
licosilada da
licoforina A que é uma
licop
roteína presente na mem rana da hemácia. A anti
enicidade
 é determinada pelos am
inoácidos 1 e 5. Associado ao sistema MN temos tam ém os antí
enos Ss, que são e
xpressos pela
licoforina B. De modo
eral pode-se dizer que as reações transfus
ionais causadas
 por estes
rupos menores são mais raras, a menos que, o receptor
seja su metido a transfusões repetidas com estes
rupos. A forma mais simples d


e se sa er se o san ue de uma pessoa é compatível ou não com outro, é a reação d
e prova cruzada, nesta reação misturamos o san
ue do doador com o do receptor,s
e houver a presença de anticorpos para o sistema ABO alo
ênico será possível o s
ervar a a
lutinação de hemácias. Deve-se tomar cuidado com os


rupos san uíneos


menos comuns e mais fracos pois estes causam a lutinação mais randa, só percept
ível
 com o auxílio de um microscópio ou por vezes só detectável com o Teste de C
oom s. Se uma pessoa é transfusionada com o san
ue total, faz-se necessário veri
ficar se o soro do paciente não apresenta anticorpos para o san
ue do receptor.
A transfusão com san
ue incompatível leva a uma reação
 imediata com sintomas clí
nicos como fe re, hipotensão, náusea, vômito e dor a dominal. A
ravidade da rea
ção quantidade de hemácias administrada.
 Os anticorpos para o sistema ABO são
e
ralmente
 da classe I M, mas tam ém temos a participação da I
G onde, as células


sensiilizadas com esta classe são destruídas
 pelas células fa
ocitárias do fí
a
do e aço, não podemos esquecer que tam ém há a participação do sistema compleme 
nto. A destruição das hemácias pode levar ao choque circulatório e a necrose tu
ular a
uda do fí
ado. A reação hipera
uda de ór
ãos transplantados,
 é outra que
se deve a formação de anticorpos para o ór
ão doado, ela é o servada em tecidos
que são revascularizados lo
o após o transplante, como no caso de transplante de
fí
ado. As reações mais severas que ocorrem na rejeição de transplante se devem
aos antí
enos do
rupo ABO e/ou das moléculas do MHC expressos nas células, ond
e o dano tecidual é feito pelo sistema complemento nas veias san
uíneas e tam ém
devido ao recrutamento e ativação de neutrófilos e plaquetas. Doença Hemolítica
do Recém Nascido Esta doença ocorre devido a formação de anticorpos maternos, d
a classe I
G, que rea
em com as hemácias do feto. Estes anticorpos, são produzid
os na primeira vez no momento do parto que uma mãe Rh-, tem um filho Rh+. Por es
se motivo o primeiro filho não apresenta a Doença Hemolítica, pois a mãe só é se
nsi ilizada no momento do parto. Na Se
unda vez que esta mãe tiver uma criança R
h+, os anticorpos I
G para as hemácias Rh+, atravessarão a placenta e rea
irão c
om as hemácias fetais assim, as levando a destruição. O antí
eno mais comumente
envolvido nesta doença é o Rhesus D (RhD), mas ele tam ém pode envolver o sistem
a Kell (antí
eno K) aliás, as

 reações mais comuns hoje em dia se devem ao antí e
no K pois este é o menos lem rado, pois ao se falar em Rh sempre se pensa no ant
í
eno D que é o mais comum.
43
depende da
Anemias Hemolíticas Autoimunes Este tipo de doença parece ocorrer espontaneament
e com a pessoa produzindo anticorpos
 contra si mesma. Pode-se suspeitar de uma a
nemia hemolítica
 autoimune se o tivermos resultado positivo para o teste indiret
o para anti
lo ulinas., este teste identifica anticorpos presentes para as hemác
ias do paciente. O teste indireto para anti
lo ulinas pode ser usado paradetecç
ão de anticorpos para as hemácias em transfusões san
uíneas erradas e tam ém no
dia
nóstico da Doença Hemolítica do Recém Nascido. As doenças Hemolíticas Autoim
unes podem se divididas em três tipos, dependendo da forma como elas se apresent
am. Elas podem ser devido a presença de anticorpos autoreativos que rea
em com a
s hemácias acima de 37oC, pode ser devido a reação de anticorpos capazes de rea

ir com as hemácias a aixo dos 37oC ou ainda, pode ser devido a reação de anticor
pos para dro
as fixadas na mem rana das hemácias.
Reações com autoanticorpos reativos a quente (37oC ou mais) Esse tipo de reação
normalmente ocorre com anticorpos formados para o sistema Rh. Eles são diferente
s dos anticorpos formados para as transfusões incompatíveis pois são formados pa
ra epítopos diferentes. É claro que existem anticorpos reativos a quente para ou
tro
rupo de hemácias, mas eles são muito raros. A maioria das anemias hemolític
as tem causa desconhecida, mas al
umas são associadas com outras doenças autoimu
nes. Este tipo
 de anemia parece ocorrer como
 o resultado de uma limpeza dos erit
rócitos sensi ilizados por macrófa
os do aço. Reações com anticorpos reativos a
frio (37oC ou menos) Os anticorpos responsáveis por este tipo de reação normalm
ente estão presentes em maior quantidade que os anticorpos reativos à quente. El
es
eralmente são anticorpos da classe I
M, e por isso capazes de ativar forteme
nte o complemento. Em
eral são anticorpos reativos para o
rupo san
uíneo Ii. E
stes epítopos I e i, são expressos como resultado de uma
licosilação incompleta
do core polissacarídico, na verdade eles são os percursores polissacarídicos qu
e darão ori
em aos epítopos do sistema ABO. A reação dos anticorpos com as hemác
ias se dá na circulação periférica, principalmente
 no inverno, pois a temperatur
a das extremidades corporais
eralmente fica a aixo dos 37oC.

 Em al uns casos po
de levar a necroseperiférica devido a formação de microtrom os nos capilares. A
anemia severa tam ém está relacionada com a capacidade
 do anticorpo fixar o com
plemento.
 A maioria das reações
 deste tipo são o servadas em pessoas idosas, não
se sa e o motivo disto, sa e-se apenas que o número de clones de autoanticorpos
é limitado. Al
umas vezes ela ocorre após uma infecção por Mycoplasma pneumonia
e, talvez porque este tipo de micror
anismo induza a
44
formação de uma
rande variedade de anticorpos.
 Supõe-se inclusive que devido a
reação cruzada com epítopos de al
umas actérias é que essa reação possa ser des
encadeada. Reações à dro
as li
adas às hemácias Este tipo de reaçãoocorre devid
o a anticorpos li
ado à dro
as que por sua vez estão aderidas à mem rana das hem

ácias, ou devido a que ra do mecanismo deauto tolerância. Dro
as ou seus meta ó
litos podem levar a reações de hipersensi ilidade contra hemácias ou plaquetas e
isto parece ocorrer de diversos modos, dentre estes, destacamos a li
ação da dr
o a as células san
uíneas com



 a formação de anticorpos para esta dro a. Isto foi
o servado nos casos de Trom ocitopenia Purpúrica onde após a administração de S
erdormida ocorria a destruição das plaquetas. A administração de dro
as como Pen
icilinas, Quininas
 e Sulfonamidas pode levar ao desenvolvimento das anemias hemo
líticas.
 Tam ém pode ocorrer devido a formação de imunocomplexos adsorvidos na m
em rana de hemácias, e consequente dano devido ao complemento. Outra das formas
de ativação da anemia hemolítica se deve a dro
a induzir a reação alér
icae por
isso são formados anticorpos para os antí
enos eritrocitários. Isso foi o serva
do em pacientes em que se administrou α-metildop , só que est re ção cess p
rtir do momento que dministr ção do medic mento é suspens . Re ções envolvend
o neutrófilos e linfócitos Neste c so os nticorpos form dos são lt mente espec
íficos, isso é observ do nos c sos de Lupus Eritem toso Sistêmico, no ent nto el
es pouco contribuem no qu dro do Lupus. Anticorpos p r pl quet s A m iori dos
c sos em que se observ form ção de nticorpos p r pl quet s é n trombocitos
e purpúric idiopátic . A trombocitose purpúric idiopátic é um doenç em que
remoção d s pl quet s d circul ção é celer d pelos m cróf gos do b ço, e
remoção se d pel derênci os receptores dest s célul s. T mbém costum ocorr
er form ção de nticorpos p r pl quet s pós s infecções por b ctéri s ou ví
rus, m s t mbém pode est r ssoci do com doenç s utoimunes como o Lupus Eritem
toso. No c so do Lupus Eritem toso, pode-se detect r nticorpos p r c rdiolip
in deridos s pl quet s. Os uto nticorpos p r c rdiolipin e outros fosfol
ipídios podem inibir co gul ção, e por isso est r em lguns c sos ssoci do co
m trombose de vei s e bortos recorrentes. Re ções contr tecidos Em ger l est
re ção ocorre em processos utoimunes, molécul reconhecid como ntígeno é
lgum proteín d membr n celul r. Exemplos deste tipo de re ção ocorrem n Sí
ndrome de Goodp sture, Pênfigo e n Mi steni Gr vis. N Síndrome de Goodp sture
observ mos presenç de nticorpos c p zes de re gir com um glicoproteín d
membr n de célul s b s is do glomérulo. Norm lmente cl sse de nticorpo envol
vid é IgG e em pelo menos 50% dos p cientes com est síndrome, há p rticip
ção de
45
 nticorpos fix dores do complemento. O result do dest re ção lev necrose sev
er e deposição de fibrin nos glomérulos. M s est síndrome pode t mbém envol
ver os pulmões, isto porque há presenç de ntígenos n s célul s pulmon res qu
e re gem cruz d mente com os nticorpos p r s célul s dos glomérulos. No Pênfi
go temos produção de nticorpos p r molécul intr celul r de desão o que c
us um sério comprometimento d pele e mucos s com form ção de bolh s. Os p c
ientes present m uto nticorpos p r um d s proteín s do desmossom , o que lev
form ção de junções entre s célul epidérmic s. Os nticorpos c b m por se
p r r s célul s um d s outr s lev ndo form ção d epidermite. N Mi steni G
r vis encontr mos fr quez muscul r ocorre devido presenç de nticorpos p r
os receptores d cetil colin presentes n superfície d membr n celul r. A
m iori dos nticorpos envolvidos nest doenç t mbém são d cl sse IgG. Nem sem
pre s doenç s utoimunes envolvem re ção de hipersensibilid de do tipo II, po
r exemplo, no c so em que di bete é c us d por um doenç utoimune, embor s
e detectem nticorpos d cl sse IgG p r s célul s p ncreátic s, m ior p rte
dos d nos imunop tológicos são c us dos por célul s T utore tiv s. T mbém nos c
sos em que detect mos nticorpos p r molécul s intercelul res, se supõe que pr
imeiro dev ter h vido um ruptur d célul p r então d r origem estes ntic
orpos. TESTE DE COOMBS O Teste de Coombs é um prov bem sensível que revel p
resenç de qu ntid des pequen s de nticorpo, sendo execut d de du s mod lid de
s: Diret e Indiret . A primeir destin -se pesquis de nticorpos fix dos às
hemáci s fet is dur nte gr videz e segund pesquis os nticorpos que mãe
desenvolveu p r o s ngue d cri nç . COOMBS DIRETO Ess é melhor re ção que s
e dispõe té o momento p r que l bor tórios de pequeno e médio porte poss m di
gnostic r eritrobl stose fet l e, é t mbém, v lios embor m is difícil no di
gnóstico de nemi s hemolític s dquirid s. P r se re liz r este teste necessit
-se do soro de Coombs. No comércio podem-se encontr r soros de Coombs tivos p
r componentes nti g m e nti não g m . M teri l necessário: Tubos de ens  io 7
5x70mm Solução de N Cl 0,85% Soro de Coombs Micropipet de 50μl San
ue o paci
ente Centrífu
a clínica e até 3000 rpm
46
      
Pipetas e 1,0 ml
ra ua a em écimos Méto o 1. Colher o san
ue o paciente com
anticoa
ulante,  lava-lo 3 vezes comsalina e fazer uma suspensão a 5%com a sali
na. 2. Tomar ois tubos,os numeran o como  1 e 2,colocar neles 50μl e suspensã
o e hemácias a 5%. 3. A icionar 2
otas o soro e Coombs no tubo 1 e homo

 enei
zar os tubos. 4.

 Centrifu ar a 1000rpm por 2 minutos.  5. Ler a reação  ro an o o
tubo

entre os e os para ressuspen er
 o botão e hemácias. Resulta o: Presença
e a lutinação no tubo 1 e ausência e a
lutinação no tubo 2 – Prova positiva  Ca
so a hema lutinação nãosejamacroscópicamente visível, coloca-se uma



 ota aam
ostra sobre uma lâmina   
e vi ro e examina-se ao microscópio. O resulta o é a o
conforme a intensi a e a a lutinação em: A
lutinação forte Granes
rupos a
lut
   
ina os Pequenos
ruposa
lutina os Raros
rupos a
lutina os Traços –
rupos e 4


a 5 hemácias a lutina as Observação: O tubo 2 é o controle, ele não
  eve aprese

ntar a
lutinação nunca.  COOMBS INDIRETO Esta reação
 é usa a para a etecção
 e a
nticorpos nosoro o paciente. Material:  Tubos e ensaio
 75x70mm Soro e Coombs
Micropipeta e 50μl Solução  salina e 0,85% Suspensão e
lóbulos vermelhos norm
ais O Rh positivo lava os e suspensos  a 5% em salina. Albumina bovina a 20% em s
alina. Técnica: 1. Separar o soro o san
ue antes e completar 24 horas e colhi
     
o e colocar 50μl em  ca a um e ois tubos e ensaio,  numeran o-os como 1 e 2. 2
. Acrescentar 50μl e suspensão e hemácias em ca a tubo e homo
eneizar. 3. Aic

ionar 50μl e albumina bovina 20% no tubo 2 e incubar a 37oC por 15a 20 minutos.
47
   
4. Lavar 3 vezes com salina, esprezan o o sobrena  ante completamente após a últ 
ima centrifu
ação. 5. Acrescentar  50μl o soro e Coombs sobre os
lóbulos lava
os e misturar. 6.Esperar
 cerca
 e 10 minutos e centrifu
ar a 1000 rpm por 1 min
uto. 7. Ressuspen
 er, elica amente,
 os
lóbulos  vermelhos observan o a hema
lut
inação.


Resulta o: A ausência e a lutinação in ica a prova ne ativa ou ausência



e anticorpos
 circulantes parao antí eno (hemácias). Se houver a lutinação em
qualquer
 um os tubos, a prova e Coombs é positiva. Deve-se usar o maior número
e hemácias com anti
eniciae iferente para se ientificar a especificiae 
     
o anticorpo. Po e-se também eterminar o título e anticorpos, proce en o-se   il
uições sucessivas
 tais como 1:2, 1:4, ...1:128. Repete-se  o teste com ca a ilu
ição. Consi era-se o título como a maior iluição  o soro,  e se verifica a he
on
ma
lutinação. As reações falso positivas po em ser encontra as quan o: O soro es
tiver contamina o com bactérias. A centrifu
ação for excessiva. Os reticulócitos
 
ultrapassam a 15%. A si erofilina
 que acompanha
 os reticulócitos
 po e rea
ir co

m a anti-si erofilina, que po e ser encontra a no soro e Coombs. As reações  po



em ser falso ne ativas quan o: Usamos tubos sujos. Lava em insuficiente as hemá
cias. Usamos antissoros inativos. Usamos antisoro contamina o com soro humano. I
ncubamos em temperatura iferente e 37OC por  tempo
inferior a 15  minutos. Obser
vação: Po emos encontrar
   a prova e Coombs ireta ne ativa ou in ireta positiva
naincompatibili a e e
rupo san
uíneo (por
estação  ou transfusão). Na ausênci

a e transfusão anterior a 2 ou 3 meses, a prova ireta  positiva
 (com a in ireta
positivaou ne
ativa) in ica a presença e anticorpo iri
i o para as próprias
hemácias o paciente. Suspeita-se, nesse caso, a presença e crioa
lutinininas.

PESQUISA
 DE ANTICORPOS IRREGULARES

Material: Tubos e ensaio 75X70mm Micropipeta 
e 50μl e 100μl Suspensão e lóbulos vermelhos normais O Rh positivo lava os e
suspensos a 5% em salina
48
  
Solução salina 0,85% Solução  e Poli Etileno Glicol (PEG) Soro e Coombs  Técnica
: 1. Separar um tubo  e i entifica-lo.

2. Colocar no tubo 50μl o soro o pacient
e. 3. Colocar 50μl a suspensão e lóbulos vermelhos 4. Centrifu
ar por 1 minut
    
o a 1000 rpm. 5. Ressuspen er elica amente as hemácias  observan o a presença e


a lutinação e/ou hemólise. 6. Acrescentar 100μl e PEG no tubo e homo eneizar.


7. Incubar em banho maria a 37oC por 15 minutos. 8.  Observar
 a presença e hemól
ise
 no sobrena ante. 9. Lavar 4 vezes  com salina,  ecantan ototalmente o sobren
a ante e forma a
arantir a retira a completa o PEG. 10. A icionar 50μl o sor
o e Coombsno tubo.  11. Centrifu
ar por 1 minuto a
1000 rpm. 12. Ressuspen er a
s hemácias
 elica amente
 observan o a presença e a lutinação e/ou hemólise. Res
ulta o: A presença e a
lutinação e/ou hemólise no tubo em qualquer uma as fase
  
s é in icativa
 e reação positiva.A ausência e hemólise e/ou a
lutinação notu
bo em to asas fases é in icativa ereação  ne
ativa. Observação: O PEG é usa o
como forma e aumentar a sensibili a e a reação antí
eno anticorpo quan o se a
iciona o soro e Coombs. Esta técnica auxilia no ia
nóstico a oença hemolític
 
a autoimune,
  nas iscrepâncias   o sistema ABO, em provas cruza as incompatíveis,
no estu o a incompatibili a e entre a mãe e o feto, e nas investi
ações transf
usionais hemolíticas.
   
REAÇÃO DE HIPERSENSIBILIDADE
 DO TIPO III A Reação e Hipersensibili a e o Tipo
III é também conheci a como a Doença os Imunocomplexos. Ela ocorre quan o o com
plexo antí
eno-anticorpo forma o não é removio pelas células fa
ocitárias, est
    
e mo o o complexo
 acaba se epositan  o em al
umas re
iões o or
anismo, on e sof
rerá ação o sistema complemento e e al
umas  células efetoras. O local
e epos
ição os imunocomplexos é em parte etermina  o pela localização o antí eno nos
teci os e em parte pela forma como eles se epositam.
49
        


As oenças os imunocomplexos
  po e ser ivi i a e mo o enérico em três rupos:  
Imunocomplexos
 forma os evi o a uma infecção  persistente, imunocomplexos
evi
o a uma oença autoimune e imunocomplexos evi o a inalação  ematerial anti êni
co. No caso e uma infecção persistente os efeitos combina os e uma infecção pe
rsistente com baixa replicação anti
ênica e também, evio a fraca resposta os
   
anticorpos,
 leva a formação
 e imunocomplexos e a eposição estes nos teci 
os.
As oenças as quais po emos incluirneste  processo são: lepra, malária,
 en ue h
emorrá
ica, hepatites virais
  e a en ocar ite estafilocócica.
    Nas oenças
 autoimu
nes
 o processo é na ver
a e uma complicação a oença evio a pro ução contínua
e anticorpos para  antí enos próprios. Conforme o número eimunocomplexos no s
an
ue vai aumentan  o, os sistemas responsáveis pela remoção estes (monócitos, e
ritrócitos e via o complemento), ficam sobrecarre
aos e os complexos vão se e
  
positan o nos teci os. As oenças  em que observamos isto ocorrer com maior frequ
ência são na artritereumatói e, lupus eritematoso sistêmico e poliomiosite.  Com
relação a inalação e material anti
ênico, os imunocomplexos são forma os na
superfície
 corporal lo
o após a exposição ao antí
eno. Tais reações são mais obs
erva as nos pulmões após exposições repeti as ao




 antí eno. Em eral os antí enos
são fun os, polém e outros materiais oriun os eplantas emateriais animais. O
s exemplos
 típicos
 escritos na literatura
 são o a Doença o Feno ou Doença
 Pul
monar o Fazen eiro e aDoença Pulmonar os Cria ores e Pombos. Nestas oenças
encontramos a presença
 e anticorpos circulantes
 para actinomicetos
 ou anticorpo
s para antí
enos o pombo. Em ambas as oençasencontramos o qua ro e alveolite
alér
ica e ela,
eralmente ocorre
 após repeti asexposições ao antí
eno. Nesse 
caso o anticorpo envolvio é a classe I
G e não a I
E como ocorre na reação o
tipo I.Neste caso quan o o antí
eno entra no or
anismo  por inalação ocorre a f
ormação e imunocomplexoslocais nos alvéolos levan o ao processo inflamatório e
fibrose. A precipitação os anticorpos para actinomicetos é encontra a em 90%
os pacientes com a Doença Pulmonar
 os Fazen eiros. No entanto ela também é obse
rva a em al
umas pessoas sem a oença eque não apresentam a sintomatolo
ia típi 
ca, o que su
ere  quehá o envolvimento e outros fatores tais como as Reações e
Hipersensibili a e o Tipo IV.
   
Mecanismos a Reação o Tipo III Os imunocomplexos são capazes e ar início a u
ma série e processos inflamatórios, entre eles a interação com o sistemacomple
mento,
eran o fra
mentos C3a e C5a, estas frações estimulam a liberação e amin
as vasoativas como a histamina e 5-hi roxitriptamina,
 e também fatores quimiotát
icos para mastócitos e basófilos, não esquecen o que C5a também apresenta esta f
unção quimiotática. Os macrófa
os também são estimula os a liberar citocinas com
o o TNFα e IL-1. Além disso, os complexos inter gem diret mente com b sófilos e
pl quet s, vi receptor de Fc, induzindo liber ção de min s v so tiv s. As m
in s v so tiv s liber d s pel s pl quet s, b sófilos e m stócitos
50
promovem retr ção d s célul s endoteli is deste modo ument ndo perme bilid
de v scul r e permitindo que ocorr deposição do complexo imune n p rede dos
v sos, este complexo por su vez continu estimul r form ção de m is C3 e C
5 . As pl quet s t mbém se greg m no colágeno d membr n b s l jud do pel in
ter ção d região Fc do complexo imune deposit do, form ndo ssim microtrombos.
As pl quet s greg d s continu m produzir min s e estimul r produção de C
3 e C5 , lém disso como el s liber m f tores de crescimento celul r, p rece qu
e estão envolvid s n prolifer ção celul r. Os polimorfonucle res t mbém são tr
ídos p r o sítio infl m tório por C5 , eles tem o p pel de f gocit r os imunoc
omplexos só que não conseguem, pois os imunocomplexos estão deridos p redes d
os v sos. Por esse motivo eles f zem exocitose de su s enzim s. As enzim s dos
polimorfonucle res, no soro, são r pid mente in tiv d s devido presenç de in
ibidores neste no ent nto, qu ndo nos tecidos s enzim s c b m por destruir o t
ecido dj cente o imunocomplexo pois os inibidores qu se não estão presentes.
A Doenç do Soro Ess doenç t mbém é c us d por complexos imunes circul ntes q
ue se deposit m n s p redes dos v sos e tecidos lev ndo doenç s infl m tóri s
como glomerulonefrite e rtrite. A doenç do soro é n verd de um complic ção
d soroter pi , onde doses m ciç s de nticorpos p r ntígenos como o veneno d
e ofídios e toxin do b cilo diftérico c b m por estimul r o sistem imune
mont r nticorpos, que re girão com estes que for m plic dos como p rte de um t
r t mento. Isto porque os nticorpos us dos n soroter pi são ger lmente de ori
gem nim l ssim, qu ndo se plic um soro nti-ofídico em um p ciente, como est
e é produzido em equinos, o p ciente c b por mont r nticorpos p r s proteín
s dos equinos. Est re ção ocorre por excesso de ntígeno, e como os imunocompl
exos form dos são pequenos eles lev m muito tempo circul ndo té que sej m f goc
it dos pelos monócitos. A form ção dos imunocomplexos é seguid de um qued br
upt dos componentes do sistem complemento. A sintom tologi clínic d doenç
do soro se deve deposição dos imunocomplexos e d fr ção C3 n membr n b s l
de pequenos v sos. Qu nto m ior qu ntid de de nticorpos form dos, m is cresce
o t m nho do imunocomplexo e isso f cilit su destruição. N re ção de Arthu
s foi observ do que o complemento é import nte p r que re ção se desenvolv ,
pois ele é que tr i os neutrófilos p r o sítio de infl m ção. O TNFα ge umen
t ndo re ção medi d por célul s, t nto ssim, que se for feito o tr t mento c
om nticorpos p r TNF, verific -se que sintom tologi clínic d Re ção de Ar
thus diminui. A remoção dos imunocomplexos depende deste est r recoberto por C3b
p r que monócitos, princip lmente do fíg do e b ço, f ç m f gocitose. Os eri
trócitos t mbém são import ntes neste processo pois eles possuem em su membr n
o receptor de C3b, o CR1, com isso eles c rreg m os
51
imunocomplexos opsoniz dos té o fíg do e b ço onde os complexos são removidos p
elos m cróf gos tecidu is. No ent nto, neste processo m ior p rte do CR1 é t m
bém removid e por isso, nos c sos em que há form ção contínu dos imunocomple
xos, eficiênci de su remoção é diminuíd . Os imunocomplexos deridos s hemá
ci s t mbém podem ser liber dos n circul ção devido ção enzimátic do F tor
I, o qu l cliv C3b lig do membr n d hemáci em C3dg, que é um fr gmento men
or deste modo os imunocomplexos c b m sendo removidos por célul s f gocitári s
que present m o receptor p r porção Fc dos nticorpos. Em p cientes com b ix
os níveis de complemento, princip lmente d vi clássic , lig ção dos imunocom
plexos s hemáci s é pequen . P rece que deficiênci do complemento se deve o
esgot mento c us do pel doenç dos imunocomplexos ou por um f tor hereditário
como no c so d deficiênci de C2. Com isso esses imunocomplexos circul ntes p s
s m pelo fíg do e c b m sendo liber dos, dest form c b m se deposit ndo em t
ecidos como pele, rins e músculos, onde eles promovem re ções infl m tóri s.
O t m nho dos imunocomplexos t mbém influênci n deposição destes, em ger l qu
nto m ior ele for, m is r pid mente ele é elimin do, ger lmente em minutos, enqu
nto que os menores podem persistir por di s. Isso se deve c p cid de dos imun
ocomplexos m iores fix rem melhor o complemento e por isso se lig r melhor s he
máci s. Os gr ndes complexos são t mbém liber dos m is lent mente d s hemáci s p
el ção do F tor I. A cl sse do nticorpo t mbém tem p rticip ção n remoção do
s complexos circul ntes pois nticorpos d cl sse IgG por se lig rem melhor s h
emáci s do que os d cl sse IgA, são liber dos m is lent mente ssim dificilment
e estes irão se deposit r em órgãos como rins, pulmões e cérebro. Qu ndo s célu
l s f gocitári s estão s tur d s, ocorre um umento do número de imunocomplexos
circul ntes e consequente umento d deposição destes complexos em loc is como o
s glomérulos ren is e outros órgãos. A deposição dos imunocomplexos em determin
dos tecidos p rece ocorrer devido o umento d perme bilid de v scul r, qu l
se deve ção de m stócitos, b sófilos e pl quet s liber ndo s min s v so tiv
s. T nto isto é verd de que se for dministr do um nti-hist mínico em nim is
com hipersensibilid de, o efeito infl m tório diminui. M s deposição dos imu
nocomplexos p rece ocorrer t mbém em loc is onde pressão s nguíne é elev d e
há lt turbulênci como n bifurc ção de rtéri s e em filtros v scul res como
no plexo coróide e no corpo cili r dos olhos. Algum s vezes os imunocomplexos s
e deposit m em determin dos órgãos como no c so do Lupus Eritem toso Sistêmico,
onde deposição ocorre nos rins, e no c so d Artrite Reum tóide em que depos
ição se d n s junt s. É provável que o complexo ntigênico form do promov lgu
m especificid de que órgão irá se lig r. Um evidênci deste f to é que em r
tos o se dministr r um endotoxin ocorre liber ção de DNA, o qu l se lig
membr n b s l dos glomérulos. Posteriormente é que ocorre form ção de ntico
rpos p r o DNA que irá se lig r o loc l em que o DNA se encontr e í ocorre
form ção do complexo imune. T mbém c rg do complexo form do
52
p rece ser import nte pois complexos com c rg positiv p recem se deposit r n
membr n b s l dos glomérulos que present m c rg neg tiv . Detecção dos imunoc
omplexos Os imunocomplexos deposit dos podem ser pesquis dos com o uxílio d im
unofluorescênci dos tecidos em que re ção está ocorrendo. A pesquis pode ser
feit p r pesquis de determin d cl sse de imunoglobulin ou do complemento
. De cordo com o p drão de fluorescênci observ do pode-se dizer se o órgão est
á muito ou pouco comprometido. Por exemplo, em p cientes com deposição contínu
de IgG sub-epteli l como nos p cientes com glomerulonefrite o prognóstico é ru
im, já nos p cientes em que os complexos estão loc liz dos no mesângio o prognós
tico é melhor. Nem todos os imunocomplexos dão origem um respost infl m tóri
, no Lupus Eritem toso Sistêmico por exemplo, pode-se encontr r complexos depos
it dos n pele com p rênci norm l. No c so de complexos circul ntes pode-se f
zer pesquis dos complexos lig dos hemáci s e dos complexos livres no pl sm
. Como os complexos lig dos s hemáci s são menos lesivos que os complexos livre
s circul ntes, norm lmente se procur pelos últimos. O problem de se dos r os c
omplexos livres está just mente n ção que o F tor I exerce n s hemáci s liber
ndo os complexos, por isso todo cuid do deve ser tom do no momento d colet do
s ngue, com sep r ção imedi t do pl sm d s célul s s nguíne s, tudo com fi
n lid de de torn r o result do o m is próximo do re l possível. A precipit ção d
os complexos com Polietilenoglicol (PEG) e estim tiv de qu nto de IgG foi pre
cipit do é norm lmente us do p r identific r s IgGs de lto peso molecul r. O
PEG promove greg ção dos imunocomplexos; por isso o soro do p ciente o ser c
entrifug do, tem os imunocomplexos precipit dos. O precipit do então pode ser qu
ntific do por técnic s como imunodifusão r di l ou nefelometri . Os complexos
circul ntes t mbém podem ser identific dos pel su finid de pelo complemento
C1q, onde C1q está fix do em um suporte sólido, onde se dicion o soro do p cie
nte e em seguid um conjug do p r imunoglobulin s m rc do p r que leitur se
j feit em um p relho. Outros receptores t mbém podem ser us dos p r se lig r
os imunocomplexos como o receptor C3 de célul s B tumor is (célul s RAJI), ou
receptor Fc de pl quet s. Deve-se tom r cuid do com dos gem feit com p ciente
s suspeitos de terem doenç s utoimunes pois muit s d s vezes estes present m
uto nticorpos p r os componentes do sistem de teste utiliz do. No Lupus Eritem
toso Sistêmico por exemplo, os p ciente produzem nticorpos p r linfócitos e D
NA, que se lig m s célul s RAJI, d ndo result dos f lso positivos p r form ç
ão de imunocomplexos. Do mesmo modo nticorpos p r C1q são encontr dos em p cie
ntes com Doenç s do Tecido Conectivo, pois C1q tem estrutur semelh nte o do co
lágeno, com isso ument possibilid de de se obter result dos f lso positivos.
Algum s d s metodologi s não específic s p r ntígenos p r detecção de imun
ocomplexos circul ntes são present dos n t bel const nte d págin seguinte.
53
54
Métodos não específicos p r ntígenos p r detecção de imunocomplexos circul
ntes MÉTODOS BASEADOS NAS PROPRIEDADES FÍSICAS Técnic s dependentes do t m nho e
densid de Ultr centrifug ção n lític Centrifug ção com gr diente de s c rose
Filtr ção em gel Ultr filtr ção Eletroforese e eletrofoc liz ção Técnic s depend
entes de precipit ção Precipit ção com PEG Crioprecipit ção Métodos b se dos n s
c r cterístic s biológic s Técnic s dependentes do complemento Teste de consumo
do microcomplemento Técnic s C1q dependentes Precipit ção em gel de C1q Teste d
o desvio de C1q Ens ios C1q-PEG (C1qBA) Ens ios C1qSP Técnic s C3 dependentes En
s ios de célul s RAJI Conglutinin Ens ios de f se sólid nti C3 Técnic s Fc de
pendentes Técnic s ntiglobulin s Testes RF Lig ção proteín A do est filococo
Técnic s celul res Teste de greg ção pl quetári Teste de inibição d citotoxi
cid de celul r dependente de nticorpo Liber ção de enzim s de m stócitos e eosi
nófilos Ens ios de inibição de m cróf gos Testes de inibição de roset s Color çã
o intr citopl smátic de leucócitos polimorfonucle res
55
CONGLUTINAÇÃO E IMUNOCONGLUTINAÇÃO A conglutin ção é outr re ção n qu l, lém
d form ção complexo Ag-Ac é indispensável h ver fix ção do complemento. Fund
mento: Hemáci s sensibiliz d s por hemolisin , glutin m-se fortemente em presen
ç de soro bovino, um vez que, o mesmo contém um substânci protéic design d
conglutinin (K), contid n fr ção euglobulin . Est fr ção pode ser isol d e
purific d por dsorção o Zimoz m e C ++ e posterior eluição pelo sequestro de
C ++ por EDTA (Ácido etileno di minotetr cético). Seu peso molecul r é de 75.
000 e o coeficiente de sediment ção de 7,8S. É termoestável 56°C, resistente à
ção do merc ptoet nol, d neur minid se e d p p ín , m s perde su tivid de
pel ção d tripsin e d pepsin . Os complexos Ag-Ac, pós à fix ção do comple
mento, são glutin d s por ção d conglutinin sobre o complemento fix do. A re
ção de conglutin ção se f z n presenç de soro de c v lo que fornece C1, C4, C
2 e C3, porém se este for deficiente de outros componentes, não se verific hemó
lise.
MÉTODO DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO CONGLUTINANTE (Segundo Coombs e Cols.) 1 - Prep
r r diluições sucessiv s do soro in tiv do, em que se desej pesquis r o ntico
rpo. 2 - Adicion r o ntígeno (estreptococos, s lmonel , riquétsi , ou o que se
desej r) previ mente diluído, us ndo um dose fix . Norm lmente us r diluições t
endo turv ção correspondente o 2o tubo de Esc l de M c F rl nd. Se o soro co
ntiver o nticorpo do ntígeno correspondente o ntígeno, h verá form ção do co
mplexo Ag-Ac. 3 - Adicion r o complemento de c v lo. Se s p rtícul s ntigênic
s não forem sensíveis à lise, pode-se us r complemento de cob i . Form -se, nest
e c so o Complexo Ag-C. 4 - Adicion r conglutinin (K), ou sej soro bovino qu
e contém. Se for us do o soro de boi, este deve ser in tiv do. A K é resistent
e à in tiv ção. 5 - Incub r 37°C por 30 minutos. 6 - Ler o teste e verific r s
e houve ou não conglutin ção. Se o soro contiver nticorpos v mos ter conglutin
ção té determin d diluição. Est corresponde o título d re ção. Há um compon
ente sérico denomin do de mobilid de bet , import nte p r re ção que é ch m d
o de f tor tiv dor de conglutinogênio (KAF). AcAgC1,3b,2 ,4b + KAF + K + C ++ C
onglutin ção.
Tudo indic que conglutinin desempenh um p pel n resistênci às infecções
celer ndo o processo de f gocitose.
56
Observ ção: Este teste tem pouc plic bilid de n prátic , visto que há um v r
i ção enorme de re ções p r pesquis de nticorpos m is eficientes.
IMUNOCONGLUTININAS As ch m d s conglutinin s, são predomin ntemente, d cl sse d
s IgM e são encontr d s em muit s espécies de nim is. Estes nticorpos re gem
com C3 e C4, fix dos. Form m-se por loimuniz ção e utoimuniz ção, dur nte os p
rocessos reumáticos, infecções crônic s e doenç s uto-imunes. As imunoconglutin
in s não necessit m de C ++ p r que re ção ocorr . Podem ser do tipo IgM ou I
gG, nti C3 e C4, m s quel s produzid s pelos processos utoimunes continu m so
b form IgM, mesmo pós um longo período de estimul ção. Pode-se estimul r su
produção em nim is inocul ndo-se b ctéri s combin d s com nticorpos heterólog
os, os qu is re gem com complemento do nim l inocul do que expõem ou modific m
determin ntes do C3 e C4. A titul ção d s imunoconglutinin s (IK) se f z por con
glutin ção. As imunoconglutinin s possuem propried des opsoniz ntes, isto é, est
imul dor s de f gocitose.
TITULAÇÃO DAS IMUNOCONGLUTININAS 1 - Prep r r um suspensão 2% de hemáci s de
c rneiro sensibiliz d s com hemolisin (do mesmo modo que se f z n fix ção do c
omplemento). 2 - Tom r um tubo 13 x 100 mm e coloc r dentro do mesmo 2 ml de hem
áci s sensibiliz d s, 0,2 ml de soro de c v lo sem in tiv r e 0,2 ml de soro de
c v lo in tiv do. O uso do soro fresco de c v lo é p r se ter um excesso de C4.
Temos ssim seguinte re ção: H + A → HA HA + C → HAC HAC1,4,2,3
Há, no c so, excesso de C4. 3 - Em um micropl c , f zer diluições sucessiv s do
soro in tiv do, que se quer determin r o título de conglutinin . P r isto, sep
r r um fileir d pl c , dicion r 20 µl de solução s lin c d um de 10 ori
fícios, previ mente, m rc dos. Adicion r 20 µl do soro no primeiro orifício e di
luir sucessiv mente 1:2, 1:4, ... té 1:256, desprez ndo os 20 µl últimos. Sep
r r dois orifícios p r controle do sistem do item 2. 4 - Adicion r 20 µl d m
istur (item 2), n s diluições do soro té 1:256 e nos dois orifícios controles.
Agit r levemente, esper r cerc de 10 minutos, centrifug r 500 rpm, git r le
vemente e ler observ ndo té que diluição ocorrerá glutin ção. A hem glutin ção
é c us d pelos nticorpos p r C3 e C4, isto é, IK. Re ção neg tiv : usênci
de glutin ção Re ção positiv : presenç de glutin ção.
57
O título conglutin nte é d do pel recíproc d m ior diluição do soro em que oc
orre hem glutin ção.
HIPERSENSIBILIDADE TIPO IV De cordo com cl ssific ção de Gell & Coombs, est
re ção é quel que lev m is de 12 hor s p r que se desenvolv m os sintom s cl
ínicos, e envolvem re ções medi d s por célul s em detrimento re ção medi d p
or nticorpos. Cl ro que est definição é muito br ngente, pois há c sos, como
n re ção t rdi de um respost feit por IgE, que envolve lém dos nticorpos
respost control d por célul s TH. Diferente d s outr s re ções de hipersensi
bilid de, re ção do tipo IV não pode ser tr nsferid de um nim l p r o outro
vi soro, m s pode ser tr nsferid pel s célul s T. El está ssoci d com pr
oteção conferid pel s célul s T m s nem sempre corre em p r lelo com el . Nem s
empre há correl ção entre Re ção de Hipersensibilid de do Tipo IV e imunid de
protetor . As célul s T responsáveis pel re ção do tipo IV for m especific ment
e sensibiliz d s por um encontro prévio e gem recrut ndo outr s célul s p r o
sítio d re ção. São cl ssific dos três tipos de re ção de hipersensibilid de do
Tipo IV, são el s, Hipersensibilid de de cont to, Re ção tuberculínic e
Re ção gr nulom tos . T nto hipersensibilid de de cont to qu nto Re ção tube
rculínic , ocorrem num período de 48 72 hor s o p sso que, Re ção gr nulom
tos ocorre num período de 21 28 di s em médi . N re ção gr nulom tos , os gr
nulom s form dos se devem greg ção e prolifer ção dos m cróf gos, e est p
ode dur r sem n s. Devemos lembr r que re ção do Tipo IV pode ocorrer junto co
m s outr s re ções de hipersensibilid de, ssim como pode ser oriund d compli
c ção de um del s.
HIPERSENSIBILIDADE DE CONTATO A hipersensibilid de de cont to é c r cteriz d po
r eczem s n região de cont to com o produto lergênico. Substânci s irrit ntes
p r pele gem de modo diferente do processo desenc de do n re ção do tipo IV
embor por vezes re ção clínic sej muito p recid . As porções dos lergenos
que desenc dei m re ção do tipo IV, ch m d s de H ptenos, são substânci s tão
pequen s ( present ndo o peso molecul r inferior 1kD ), que por si só não são
c p zes de desenc de r respost imune, ou sej não são substânci s imunogênic
s. Est s substânci s tem c p cid de de penetr r n pele e se conjug r, ger lm
ente de form cov lente, com s proteín s orgânic s. Existem dois tipos de célul
s princip is que p rticip m no desenc de r d respost do tipo IV, são el s s
célul s de L ngerh n e os Quer tinócitos. Como hipersensibilid de de cont to é
58
inici lmente um re ção epidérmic , s célul s de L ngerh n são s princip is cé
lul s present dor s de ntígeno envolvid s present ção. As célul s de L nger
h n present m os receptores CD1, o MHC de cl sse II e os receptores de Fc em su
membr n . Em estudos re liz dos in vitro foi demonstr do que s célul s de L n
gerh n, gem melhor como APC do que os monócitos. Os quer tinócitos express m s
molécul s de MHC de cl sse II e ICAM-1 em su membr n , el s tom m p rte d int
egrid de estrutur l d epiderme. Est s célul s podem liber r citocin  s como IL
-1, IL-3, IL-6, IL-8, GM-CSF, M-CSF, TNFα, TGFα e TGFβ. A IL-3 li erada pode ati
var as células de Lan
erhan, co-estimular a resposta proliferativa, recrutar mas
tócitos e induzir a secreção de citocinas com ação imunosupressora como a IL-10
e TGF-β, que diminuem a resposta imune e induzem a aner
ia clonal em células TH1
. Os queratinócitos
 podem ser ativados por uma série de estímulos, incluindo-se
aler
enos e su stâncias irritantes. Os queratinócitos ativados produzem citocina
s estimulatórias como TNFα e GM-CSF, os qu is tiv m s célul s de L ngerh n. O
desenc de r d Hipersensibilid de de Cont to P r re ção de cont to ocorrer é
necessári um primeir et p de sensibiliz ção, que lev de 10 14 di s, nest
et p o h pteno bsorvido combin com um proteín e í é f gocit do pel célul
de L ngerh n, qu l migr rá d epiderme té região p r cortic l dos lifonod
os region is. Nos linfonodos el s present m o h pteno em ssoci ção com o MHC d
e cl sse II os linfócitos CD4+, d ndo ssim origem um popul ção de célul s T
CD4+ de memóri . Em um segund f se, o se entr r em cont to com o lergeno de
novo, este c us um pequen diminuição do número de célul s de L ngerh n d ep
iderme, s qu is irão se desloc r e present r o ntígeno n pele e linfonodos à
s célul
 s T CD4+ de memóri
 . As célul s T CD4+
 então
 p ss m liber r γ-IFNo qu
al in uz a expressão e ICAM-1
 e moléculas
 e MHC e classe II na membrana e qu
eratinócitos
 e células en oteliais os capilares érmicos. Ocorre também a ativa
ção os queratinócitos que liberam citocinas  pró-inflamatórias como a IL-1, IL-6
e GM-CSF.Células T CD4+ sem especifici a e anti
ênica a acabam seno atraías
 
pela ação ascitocinas e po em se li
araos queratinócitos via ICAM-1 e MHC e
classe II. A e
ranulação e a liberação e citocinas por mastócitos ocorre lo
o
após contato com o aler
eno. O TNF-α e IL-1 liber dos pel s célul s, princip l
mente pelos m cróf gos, são potentes indutores d molécul endoteli l de desão.
As citocin s liber d s produzem um sin l quimiotático p r m cróf gos cheg rem
té junção dermoepiteli l e epiderme. Os m cróf gos cheg m derme e epiderme
em torno de 48 hor s pós cont to sendo que o pico de célul s presentes no loc l
de infl m ção se dá entre 48 e 72 hor s. A m iori dos linfócitos presentes nest
re ção são CD4+ com poucos CD8+. Após o pico máximo d re ção el começ ser
suprimid pel ção de eicos noídes como Prost gl ndin E (PGE), produzid po
r m cróf gos e quer tinócitos tiv dos. A PGE inibe produção de IL-1 e IL-2;
o mesmo tempo, o que p rece, célul T se lig os quer tinócitos e ssim o h
pteno lig do o MHC de cl sse II sofre
59
 degr d ção por enzim s celul res. A supressão é medi d por vários f tores, entr
e estes, dest c m-se liber ção de linfocin s inibitóri s evit ndo o esp lh men
to d re ção; liberção de TGFβ pelos mastócitos, queratinócitos ativados e li
nfócitos, ini indo e loqueando os efeitos proliferativos das IL1 e IL-2; a próp
riaIL-1 li erada pelos queratinócitos, após contato deste com o aler
eno, atua

ini indo o meta olismo oxidativo dos macrófa
os e diminuindo a produção dos medi
adores pró-inflamatórios; a IL-10 suprimindo a expressão das moléculas de classe
II, a produção de citocinas e a proliferação dos linfócitos TH1 específicos.  Em
ratos foi o servado ainda que a irradiação  por raios ultra violeta,  ini em a de
rmatite de contato, induzindo  um ini idor específico da IL-1. Foi o servado que


as reações a aler enos e su stâncias irritantes são parecidas, já que as duas  su
stâncias podem lesar as células de Lan
erhan e, ao mesmo tempo induzir a li era
ção de citocinas com isso, outras células de Lan
erhan podem ser estimuladas a s
e tornarem potentes APC as quais mi
rarão até os lifonodos e darão início a resp
osta imune. A sinalização por TNFα, γ-IFN e GM-CSF ocorre empelo menos meia hor
a após contato

 com a substânciaaler enica  ou irritante, sen oque se observa um
aumento a pro ução e RNAm co ifican  o GM-CSF nas primeiras uas horas pós con
tato. Al
uns   pro utos químicos po em ain a  uzir
in  a expressão e ELAM-1 e VCAM-
1 em torno e uas horas após contato e ain a in uzir aexpressão e ICAM-1 cerc
a e 8 horas epois. ICAM-1 é o li
ante e LFA-1 que po e ser encontrao em célu
 
las linfói es e mielói  es, etambém é importante para manter  estas células na pe
le. As células T e memória  ecorrentes o estímulo
 promovi
 o pelas APC nesta  re
ação ficam
 nos capilares érmicos, e por isso o esenca ear a reação, quan o o
se
un o contato com o aler
eno, é mais  eficiente na pro
  ução e sintomas
 clínic

os. REAÇÃO TUBERCULÍNICA Esta forma e hipersensibili a e é observa  a quan o se
inocula por
eno solúvel, como o bacilo a tuberculose (p
 via sub-cutânea um antí


roteínas a bactéria
 morta). Na reião em que foi injeta o o antí eno, se observ
a a formação e um e ema emtorno e 48 horas pós inoculação. Reações semelhante
s po em ser observa as quan o se a minstra antí
enos solúveis e micror

 anismos
como Mycobacteriumleprae e Leishmania   tropica em pessoas
 sensibiliza as. Por es
te motivo o teste e sensibili  a e cutânea
 é utiliza o para saber se uma pessoa
foi exposta previamente a um etermina o antí
eno. Esta forma e hipersensibili
     
a e também po e ser in uzi a por antí
enos que não sejam oriun os e micror
anis
mos como o berílio e o zircônio. A reação tuberculínica envolve  vários tipos cel
ulares,mas os monócitos são os principais participantes esta. Lo
o após a inoc


ulação o antí eno, ocorre a ativação e células T específicas, que passam a sec
retar citocinas como o TNFα e TNFβ que atuam nas células endoteliais e dos vasos
, as induzindo a expressar moléculas de adesão como a E-selectina, ICAM-1 e VCAM
-1. Estas moléculas se li
am a receptores presentes nos leucócitos, assimos rec
rutando para o sítio da reação. Nas primeiras 4 horas pós inoculação se o serva
o influxo de neutrófilos, que vão sendo aos poucos
60
 
su stituídos por macrófa
os e células Tnas 10 horas se
uintes. Este infiltrado
celular vai aumentando de forma que aca a rompendo o feixe de colá
eno da derme,
esta reação atin
e o seu pico máximo em 48 horas pós inoculação.
 Encontramos ta
nto
 células T CD4+ como CD8+, sendo que existe quase o do ro de células CD4+, ta
m ém são encontradas células CD1+ como as células de Lan
erhan e células tipo La
n
erhan neste infiltrado. Os macrófa
os constituem aproximadamente 80% das célul
as presentes no infiltrado, sendo que

 os macrófa os e linfócitos presentes expre
ssam o MHC de classe II o que contri ui para aumentar a eficiência de macrófa
os
e de células apresentadoras de antí
enos. Os queratinócitos presentes apresenta
m as moléculas HLA-DR no período compreendido entre 48 e 96 horas após o apareci
mento do infiltrado linfocitário. Provavelmente os macrófa
os sãoas principais
células

 apresentadoras de antí eno
 nesse tipo de reação, muito em ora células CD
1+ tam ém estejam presentes. Tam ém a forma como as células de Lan
erham e outra
s circulam entre a derme e os linfonodos
 é parecida com a que ocorre na hipersen
si ilidade de contato. A reação tu erculínica se resolve sozinha em cerca de 5 a
7 dias, no entanto se o antí
eno persistir no local,
 pode haver  o desenvolvimen
to de uma reação
ranulomatosa. A infiltração su epitelial com  asófilos não é c
aracterística deste tipo de reação no entanto, ela pode ser o servada em al
umas

reações de hipersensi ilidade e testes cutâneos em que são usadas proteínas het


erólo as.
HIPERSENSIBILIDADE GRANULOMATOSA Esta reação é resultante da persistência de mic
ror
anismos ou partículas as quais os macrófa
os não conse
uem destruir. Em dete
rminadas situações ela tam ém pode ser oriunda de imunocomplexos persistentes co
mo os que aparecem nas alveolites. Este processo resulta na formação
 de
ranulom
a de

 células epiteliais. Histolo icamente ele difere do que se o serva na
reação
tu erculínica,
 no entanto ele é o resultado da sensi ilização por micror anismo

s como o Myco acterium tu erculosis e M. leprae. A reação
ranulomatosa tam ém p
ode ocorrer como resultado a um corpo estranho presente no or
anismo, como o que
ocorre nas pessoas que tra alham na indústria de amianto, desenvolvendo a forma
ção de
ranulomasnos pulmões devido a inalação do pó do amianto, e tam ém uma s
érie de outras su stâncias que os macrófa
os são incapazes de di
erir. Nesse cas
o temos o que se chama de
ranuloma não imunoló
ico, pois não encontramos a pres
ença de linfócitos nele. As células mais importantes neste tipo de
ranuloma são
as células epitelióides e as células
i
antes. As células epitelióides
 são oriu
ndas de macrófa
os ativados num processo crônico em que há a li eração contínua
de citocinas e TNF, que potencializam a formação do processo inflamatório. Quant
o as células
i
antes, elas se ori
inam da fusão de células epitelióides,
 al
uma




s vezes são classificadas como células de Lan erhan i antes, em ora não tenham
características comuns com
61
elas. Ao que parece as células
i
antes podem ser oriundas de um está
io termina
l de diferenciação de monócitos e/ou macrófa
os. O
ranuloma oriundo de uma ativ
ação imune tem a participação de células epitelióides e macrófa
os na re
ião cen
tral, sendoque, al
umas vezes tem a participação de células
i
antes. Em doença
s como a tu erculose a área central do
ranuloma pode ser uma zona de necrose, c
om a destruição completa das estruturas celulares. A re
ião central de macrófa
o
s e células epitelióides
 é circundada por uma camada de linfócitos, onde ocorre
a deposição de fi ras de colá
eno levando a formação de uma considerável zona de
  
fi rose, ocasionada pela proliferação de fi ro lastos e aumento da síntese  de c



olá eno. Como exemplo de reação ranulomatosa temos a reação de Mitsuda o servad
a contra os antí
enos do M. leprae. As Reações Celulares Em experimentos executa
dos em ratos foi demonstrado que células Texpressando o TCRαβ são as que  desenc
adeiam a resposta imune frente a infecção acteriana. As células T sensi ilizada
s com o antí
eno apropriado e por

 células apresentadoras de antí eno, entram num
processo de transformação linfo lastóide, onde ocorre o aumento da síntese de D
NA, antes deentrar em divisão. Após as células T serem estimuladas por células
APC, elas li eram uma série de citocinas capazes de atrair e ativar macrófa
os,
dentre
 as citocinas, temos o γ-IFN,linfotoxina, IL-3 e GM-CSF. Numa infecção po
r actérias, temos
 os macrófa
os li erando IL-12 fazendo com que os linfócitos T
aumentem a li eração das citocinas que já estão sendo li eradas. Essa IL-12 é c
apaz de estimular a população de linfócitos TH1 e suprimira de linfócitos TH2.
As reações
ranulomatosas  podem ser ativadas ainda pela li eração de TNF oriundo
dos macrófa
os, que aca am sendo a fonte de auto ampliação da reação, com a tra
nsformação dos macrófa
os em células epitelióides, e nos casos em que o antí
eno
não pode ser destruído as células vão se fusionando, dando ori
em as células
i

antes que envolvem o antí
eno. As reações do tipo IV tamém podem envolver os l
infócitos T CD8+, os quais lesam as células mais pela  sua ação citotóxica. Como
exemplo temos a ação do pentadecatecol,
 que é uma su stância solúvel em lipídeos
, e pode atravessar a mem rana celular e assim modificar as proteínas intracelul
ares. Estas proteínas modificadas dão ori
em a peptídeos modificados no citossol
, os quais são translocados pelo retículo endoplasmático e che
am a superfície c
elular através do MHC de classe I. Estas moléculas são então reconhecidas pelas
células T CD8+ as quais  matam a célula modificada
 fazendo a exocitose de enzimas
como a perforina.
 Tam ém as células CD8 li eram γ-IFN que ajuda na formação da
hipersensi ilidade tardia.

Al
umassituações em que o servamos a Reação do Tipo IV Existem várias doenças e
m que o servamos isto, a maioria se deve a a
entes infecciosos como micoactéria
  
s, protozoários e fun
os, em ora isso tam ém seja o servado em doenças como a
62
 
Sarcoidose onde não há um a
ente infeccioso esta elecidopara tal. As doenças ma
is comuns em que esta reação de apresenta são: Lepra, Tu erculose, Esquistossomo
se,
 Sarcoidose, Doença de Crohn. Há uma situação que não é doença, mas incomoda
astante as pessoas que é a picada de insetos, inicialmente a reação que ocorre
pode ser do tipo I, por ser mediada
 por I
E, mas a evolução da resposta imune le
va
 a uma reação de hipersensi
 ilidade tardia com a formação de
ranuloma como o
o servado na reação tu erculínica. Uma característica comum nestas infecções é q
ue o a
ente infeccioso é persistente e promove o estímulo anti
ênico crônico. A
ativação dos macrófa
os pelos linfócitos pode limitar  a infecção só que, o estím
ulo contínuo leva a destruição tecidual devido a li eração de produtos oriundos 
dos macrófa
os como ooxi
ênio reativo e intermediários das hidrolases. Em ora a
reação de hipersensi ilidade seja induzida pelos linfócitos T ativados, nem sem
pre a reação é controlada, de forma que a imunidade protetora e a reação de hipe
rsensi ilidade tardia nem sempre acontecem
 ao mesmo tempo. Por este motivo é que
al
umas pessoas que tem hipersensi ilidade tardia não apresentam proteção ao me
smo antí
eno que as levou a desenvolver esta hipersensi ilidade.  Um dos exemplos
que podemos citar é a lepra. A lepra
 é dividida em 3 tipos, tu erculoíde, inter
mediária e lepromatosa. Na lepra tu erculoíde a pele apresenta pequenas áreas hi
popi
mentadas que tem umintenso infiltrado de leucócitos e células epitelióides
, mas sem a presença do acilo, já na lepra  lepromatosa se o servam múltiplas le
sões confluentes que apresentam numerosos acilos, macrófa
os e al
uns linfócito
s. Já a lepra intermediária,
 como o próprio nome diz, apresenta  características
tanto da lepra tu erculóide quanto da lepromatosa. Na lepra tu erculóide a imuni
dade protetora está normalmente associada com a imunidade mediada por células, s
ó que esta vai declinando a medida que a doença caminha para o quadro lepromatos
o, com a produção de anticorpos não protetores para o M. leprae.  Na lepra interm
ediária a reação se apresenta com o quadro típico de hipersensi ilidade do tipo
IV, sendo que nela as lesões hipopi
mentadas de pele contendo o acilo, se torna
m inchadas
 e inflamadas, porque o or
anismo é incapaz e montar a reação de hiper
sensi ilidade tardia. Nestas lesões o serva-se o infiltrado de linfócitos secret
ando γ-IFN. Esse processo ocorre nos nervos periféricos, onde as células de Schw
ann contém o M. leprae; o que é acausa mais importante
 da destruição
 nervosa ne
sta doença. Outro exemplo, é a tu erculose, nela o serva-se um alanço entre os
efeitos dos macrófa
os ativados controlando a infecção e/ou causando danos tecid
uais


 nos ór ãos infectados. Nos pulmões areação ranulomatosa leva aformação d
e “ uracos” (necrose caseosa), que contri uem para o espalhamento
 da actéria. A
s reações são frequentemente acompanhadas de fi rose extensa. O servase na re
iã
o central do
ranuloma a presença de uma área de necrose, circundada por células
epitelióides e células
i
antes com células mononucleares na re
ião periférica.
63
No caso da esquistossomose a reação
ranulomatosa se processa contra o ovo dos e
squistossomas, levando a formação do
ranuloma
 ao redor do mesmo. Na Sarcoidose,
a causa exata da doença é desconhecida, sa e-se que é uma doença crônica, com q
uadro clínico al
umas vezes parecido com o da lepra, onde macrófa
os se acumulam
em vários tecidos como pulmões, lifonodos, ossos, tecido nervoso, e pele, forma
ndo o
ranuloma, frequentemente acompanhado de fi rose. Essa doença acomete mais
o tecido linfóide, promovendo o edema dos linfonodos. Até o momento não se enco
ntrou
de que al
uma
 um a ente infeccioso para tal doença, mas há a desconfiança


mico actéria possa
 estar envolvida com ela pois a patolo ia é semelhante. A doen
ça de Crohn tam ém é uma doença em que não há a participação de um a
ente infecc
ioso, ela acomete o colo e o íleo, as vezes mais na porção terminal do íleo
 e po
r isso tam ém chamada inicialmente de ileíte terminal. Hoje em dia já é sa ido q
ue esta doença pode acometer qualquer porção do trato alimentar. Esta doença, no
s Estados Unidos pelo menos, tem acometido mais a adolescentes e pessoas por vol
ta dos 20 anos de idade, com maior incidência em pessoas do sexo feminino, mas i
sto não impede que ela ocorra em qualquer idade. Nela temos a presença de os lin
fócitos e macrófa
os seacumulando em várias camadas do intestino, levando a for
mação do
ranuloma e fi rose. Esta reação parece começar com a infiltração de ne
utrófilos na camada epitelial, reco rindo então o intestino com a
re
ados de lin
fócitos, o que leva a infiltração destes nas criptas e a posterior formação da f
ístula. Esta reação
ranulomatosa leva a diminuição do diâmetro interno do intes
tino e a formação de fístulas que che
am até outros ór
ãos.

REAÇÕES IMUNOLÓGICAS A VÍRUS Os vírus são parasitos intracelulares o ri
atórios,
constituídos por RNA ou DNA, e fazem uso do maquinário celular para a monta
em
de novos vírus. Temos tam ém os prions que são apenas proteínas infectantes,
er
almente associadas com doenças

 neuroló icas nos seres humanos e emanimais (como
a Doença da Vaca Louca nos ovinos ou a Doença de Creutzfeld-Jako nos humanos)
. Os vírus, dependendo do tipo, podem promover a doença
 de várias formas, como u
ma infecção a
uda que o próprio or
anismo conse
ue de elar, como no caso da
rip
e promovida
 por vírus influenza; como uma infecção latente e persistente, confor
me o o servado nas infecções pelo vírus Herpes simples e citome
alovírus ou como
uma infecção persistente, em que o or
anismo
 não conse
ue montar uma resposta e


ficaz no com ate ao a ente viral como é o servado nas infecções por vírus da Hep
atite B e C. No caso dos prions, não há o está
io a
udo, estes a
entes persistem
como uma infecção lenta, que dura por anos sem induzir uma resposta imune.
64
A resposta inicial

 que o or anismo monta contra os vírus faz parte das
defesas i
natas, como ali eração de interferon, ativação de células NK e macrófa os. O in
terferon é li erado pelas células que estão infectadas por vírus, este interfero
n pode ser o α ou β, o qual ativa mecanismos antivirais  nas células vizinhas. Al
ém disso, na resposta inflamatória a
uda, como ha a li eração de γ-interferon, i
nterlecina-1 e fator

 de necrose tumoral (TNF), estes a em induzindo a expressão
de ICAM-1, que aca a por facilitar a interação das células T e as células  aprese
ntadoras de antí
enos
 (Rueckert,
 R.R., 1996). Antes de falarmos mais so re a açã
o do interferon é om lem rar que existem três tipos de interferon, o α-IFN que
éliber
 do princip lmente pelos linfócitos,
 o β-IFN que é produzido mais pelos f
i rolastos e por fim o γ-IFN que é li erado mais por linfócitos e macrófa
os. P
ois em, os interferons ativam uma série de
enes dos quais dois exercem ativida
de antiviral direta, um
 deles promove a atividade
 de uma proteína quinase que te
m a propriedade de ini ir a fosforilação e loquear a translação proteíca; e o o
utro de produzir a 2’5’-oli
oadenilato sintetase que ativa uma endonuclease late
nte capaz de de
radar o RNA viral. Existem outros mecanismos mais específicos co
mo a ativação do
ene Mx, que ini e a transcrição primária dos
enes do vírus in
fluenza, mas não tem ação so re outros vírus. O γ-IFN tam ém aumenta a eficiênci
a da resposta imune adaptativa, estimulando o aumento na expressão das moléculas
de MHC de classe I e II e promover a ativação de macrófa
os e células NK.
O Papel das Células NK As células NK se tornam ativas em aproximadamente 2 dias
após o início da infecção viral, elas são mais eficientes nas infecções por víru
s da família
 Herpesviridae, mais especificamente para os citome
alovírus (CMV).
Não se sa e que moléculas da célula infectada por um vírus que a NK reconhece, n
o entanto há uma correlação inversa entre MHC de classe I e a ação da NK. Isto é
curioso uma vez que várias famílias de vírus ini em a expressão do MHC de class
e I, talvez como uma forma de escapar do reconhecimento efetuado pelas células T
. O γ-IFN é capaz de ativar a função das células NK assim como de
uia-la ao sít
io de infecção. Numa fase mais avançada da resposta imune, as NK atuam exercendo
sua atividade matadora pela citotoxicidade dependente de anticorpo.
Participação das células T e B Aos poucos a resposta
 imune vai se adaptando e en
volve além das células T citotóxicas, envolve tam ém células TH, células B e pla
smócitos. Os plasmócitos produzem anticorpos que são os principais responsáveis
por evitar a propa
ação do vírus. Estes anticorpos
 são montados para as proteína
s virais existentes nas células infectadas, tam ém temos anticorpos para as
lic
oproteínas virais atuando contra o envelope viral ou partes deste expressos nas
células hospedeiras. Auxiliando o papel dos anticorpos, temos a participação da
via clássica do complemento que atua tanto nas
65
partículas virais livres como nas células
 que estão replicando vírus. No entanto
para que o complemento ataque a mem rana de uma célula
 infectada, há a necessid
ade de que hajam pelo menos 5x106 partículas na mem rana celular. Por outro lado
as células NK conse
uem atuar em células
 com apenas 103 moléculas de I
G li
ada
s ao antí eno viral presente na mem rana celular, elas se li
am a I
G via o rece


ptor FcγRIII (CD16), destruindo a célula hospedeira por um mecanismo dependente
de perforina. As células T apresentam uma série de funções na infecção por vírus
, na verdade a maior parte da resposta feita pelas células B produtoras de antic
orpo é timo dependente, e por isso requer
 a participação de células CD4+ para qu
e haja a troca de isotipo das imuno
lo ulinas a serem produzidas e para a matura
ção. As células T CD4+ tam ém atuam na indução de células CD8+ citotóxicas e no
recrutamento e ativação de macrófa
os ao sítio de infecção. Durante a replicação
do vírus em uma célula, qualquer
 proteína viral pode ser processada e incorpora
da ao MHC de classe I, isto aca a levando as células T a reconhecerem a célula i
nfectada. Um exemplo disto ocorre na replicação do citome
alovírus (CMV) em que
a expressão de sua proteína imediata precoce, a pp63, aca a estimulando a respos
ta mediada por células T, ao ser montada junto como o MHC de classe I. As célula
s CD4+ são importantes na medida em que podem recrutar macrófa
os do mesmo modo
em que fazem na reação de hipersensi ilidade do Tipo IV  e assim acelerar a destr
uição das partículas virais. Citocinas como o γ-IFN
 li eradas pelas
 células T sã
o capazes de ativar monócitos que por sua vez li eram TNF que tam ém possui ação
antiviral. No sarampo ocorre a indução de células T CD4+, que são capazes de re
conhecer e matar células infectadas apresentando o MHC de classe II, isto parece
ocorrer devido a via de apresentação do antí
eno, em que há a fa
ocitose, de
ra
dação e apresentação a célula T pelas células apresentadoras de antí
eno. A resp
osta imune nem sempre é eficiente pois os vírus desenvolvem
 mecanismos de escapa
r, a mais comum delas é a variação anti
ênica como é o servado nos vírus Influen
za A, que tem alta taxa de mutação. A mutação viral ocorre justamente nas porçõe
s anti
ênicas que seriam reconhecidas por anticorpos específicos,
 nos vírus infl
uenza isto ocorre na hema
lutinina e na neuraminidase que em ora sejam imuno
êni
cas, não servem para a produção de vacinas devido a mutação que ocorre. Em outro
s casos como os anticorpos conse
uem remover os vírus da circulação, isto pode f
azer com que os vírus possam permanecer no interior das células como a se prote

er da ação dos anticorpos, assim levando a infecção intracelular persistente. Co
mo exemplo temos os herpesvírus e os citome
alovírus, que apenas saem das célula
s quando o sistema imune está deficiente. Só que os herpesvírus e citome
alovíru
s ainda apresentam
licoproteínas que atuam como receptores para a porção Fc da
I
G, com isso
 o anticorpo se li
a ao vírus como se li
aria a uma célula fa
ocitá
ria, e aca a não tendo a propriedade de desencadear o complemento ou ainda, ativ
ar a fa
ocitose.
66
 Vírus como o Epstein-Barr e Adenovírus conse
uem fazer com que a célula monte
 pe
quenas moléculas de RNA que competem com a proteína quinase e deste modo ini em
a ativação do γ-IFN. Além disso
 os Adenovírus e CMV induzem a codificação de pro
teínas
 que são capazes de ini ir o transporte das moléculas de MHC de classe I a
mem rana celular, deste modo os vírus escapam do reconhecimento feito pelas cél
ulas T. Al
uns vírus possuem
enes que codificam receptores homólo
os aos de cit
ocinas, quando não codificam
 citocinas. Formas solúveis dos receptores
 de IL-1β,
TNF e γ-IFN, são li eradas pelas células infectadas e com isso ini em a ativida
de destas citocinas. Como exemplo temos o vírus Epstein-Barr que codifica uma pr
oteína homólo
a a IL-10 e que exerce a mesma função da IL-10 in vitro. Durante i
nfecções crônicas ocorre a formação de imunocomplexos nos fluidos corporais ou n
a superfície de células como é o caso das infecções pelo vírus da hepatite B ou
CMV. Nestes casos os anticorpos são ineficazes na presença de
randes quantidade
s de vírus, com isso estes imunocomplexos são depositados no fí
ado ou vasos san

uíneos, onde ocorre a resposta inflamatória que leva a destruição tecidual. Em

casos como o vírus da Den
ue, os anticorpos aca am se li
ando aos vírus formando
um imunocomplexo que se li a via Fc ao macrófa
o e desta forma o vírus conse
ue


entrar na célula que irá replica-lo mais facilmente. Além disso estes imunocomp

lexos formados com o vírus da Den
ue promovem a ativação do complemento que aca

a lesando o tecido onde ele está, isto
 leva ao mecanismo que desencadeia a fe re
hemorrá
ica e a síndrome do choque o servada na den
ue. Outro mecanismo que al

uns vírus apresentam para resistir as defesas or
ânicas, é que eles possuem a ca
pacidade de infectar células do sistema imune como linfócitos ou macrófa
os, com
o ocorre na SIDA. Enquanto a célula está num está
io não ativado o vírus permane
ce em seu está
io latente, no momento que a célula é ativada, os vírus entram em
replicação. Temos vários exemplos disto, como os vírus Epstein Barr tem tropism
o pelos linfócitos B; HTLV, HIV, vírus do Sarampo, Vírus do Herpes Humano tipo V
I infectam linfócitos T e HIV e CMV infectando macrófa
os. No caso do HIV, a doe
nça se caracteriza por um lon
o período de latência do vírus, onde não ocorre qu
alquer resposta imunoló
ica. O HIV entra no linfócito T CD4+ se li
andovia
p12
0 (uma
licoproteína do envelope do HIV) ao CD4 do linfócito. O HIV tam ém pode
entrar em outras células ao se li
ar via
p120 ou por estar li
ado a anticorpos
em células como macrófa
os, e células apresentadoras de antí
eno. Durante o perí
odo de latência do HIV, parece existir um provírus, inte
rado ao DNA do hospedei
ro sem que ocorra qualquer transcrição do mesmo. Ao que parece o TNF e a IL-6 li
erada no estímulo da resposta imune pode servir como sinal para o início da tra
nscrição
 viral, podendo assim ocorrer a contaminação de outras células e consequ
ente li eração de mais citocinas. A eliminação do
67
HIV não ocorre por uma série de fatores, mas os mais importantes deles se deve a
alta mutação que o vírus sofre e a pro
ressiva imunodeficiência que ocorre devi
do a destruição das células T CD4+. Al
uns vírus podem ainda induzir a doenças a
utoimunes, podendo ser devido a lesão induzida por estes ou por simular determin
adas moléculas parecidas com as próprias. A lesão induzida por vírus se deve a p
rópria resposta inflamatória que ocorre, levando a lesão tecidual constante, e e
xpondo proteínas oriundas do interior das células, o que leva a produção de anti
corpos para estas. Quanto aos vírus que expressam proteínas semelhantes a proteí
nas próprias, quando estas são processadas e apresentadas as células T, ocorre a
que ra da tolerância imunoló
ica com a consequente produção de anticorpos às pr
oteínas próprias.

IMUNIDADE A BACTÉRIAS A imunidade a actérias está relacionada a estrutura do mi
cror anismo invasor e ao seu mecanismo de pato



enicidade. Baseado nisso há difer
enças entre a resposta imune que ocorre entre actérias
 Gram positivas, Gram ne

ativas, mico actérias e espiroquetas. No caso de actérias Gram ne
ativas estas
são mais suscetíveis a açãodo sistema complemento e a ação de células citotóxic
as, já nos demais tipos de actéria
 há a necessidadede que sejam fa
ocitadas pa
ra

 que sejam mortas. Quando a actéria apresenta fím rias, fla elos ou estão rec
o ertas pela cápsula, estas estruturas podem impedir ou dificultar a ação das cé
lulas
 fa
ocitárias e do complemento, mas podem ser atin
idas pelos anticorpos. A
s actérias podem ainda estimular o sistema imune

 via toxinas, sem invadir o or
anismo, neste caso a ação é feita pelas toxinas
 acterianas ou apenas invadindo

o or
anismo. Em
eral,ocorre a invasão da actéria ao or
anismo com a li eração
de endo
 e exotoxinas acterianas.
 Conforme já discutido anteriormente, as prime
iras arreiras a entrada de actérias no or
anismo, são compostas pelas defesas
inespecíficas como a pela inte
ra, o ácido

 estomacal, os ácidos raxos presentes
na pele, pH do trato urinário, a flora acteriana normal, etc. A se
unda linha

de defesa compreende o reconhecimento de al
uns componentes acterianos comuns p
elo sistema de defesa inato. Este tipo de reconhecimento é de lar
o espectro, e
ocorrem
 antes que células T específicas e anticorpos específicos sejam montados,
o servamos isso ocorrer com vários tipos de cocos.
 Estes mecanismos envolvem o
rcconhecimento de moléculas comuns a todas as actérias por células como as NK,

ranulócitos e monócitos, tamém temos a participação da proteína C reativa, que

ao se li
ar a superfície de al
umas actérias é capaz de desencadear o sistema
complemento.A ativação do sistema complemento leva a produção dos fatores C3a e
C5a que aca am por ativar a de
ranulação de mastócitos e asófilos, assim como 
chamar neutrófilos para o sítio de infecção. Com  a histamina e leucotrieno
 li er
ados pelos mastócitos temos o aumento da permea ilidade vascular, tam ém com a s
ecreção de IL-8, pelos mastócitos atuando junto com os fatores quimiotáticos do
complemento, temos mais células che
ando ao local.
68


O complemento conse ue ser eficaz na destruição
 de actérias que apresentam uma
i-camada lipídica, como é o caso das actérias Gram ne
ativas, pois esta é sens
ível ao MAC (complexo de ataque a mem rana). A ativação do MAC leva a de
ranulaç
ão de mastócitos e a contração da musculatura lisa, assim como a atração e ativa
ção
 de neutrófilos. Ascélulas NK quando estimuladas por IL-12  ou TNF, passam a
li erar γ-IFN, que aca a ativando mais macrófa
os. Quando as arreiras inespecíf
icas são vencidas pela actéria, entra em ação a resposta mediada por anticorpos
. Os anticorpos são muito importantes quando se trata da neutralização de toxina
s acterianas, pois a mesma é executada quando o anticorpo se li
a a porção da t
oxina que normalmente se li
aria na célula. Da mesma forma os anticorpos
 podem s
e li
ar a toxinas ou enzimas presentes na matriz extracelular da actéria, imped 
indo assim o espalhamento da actéria e as vezes interferindo com a motilidade




acteriana ao se li ar ao fla elo. Anticorpos da classe I A podem ter papel impor

tante em evitar a entrada de actérias nas mucosas, pois ao se li
ar a actéria,
impede que esta consi
a se aderir as células epiteliais. Por exemplo, anticorpo
s para a proteína M dos estreptococos do
rupo A são específicos
 para os estrept
ococos de
ar
anta. Al
uns anticorpos tam ém são capazes de loquear a captação 
de ferro e outros nutrientes ao se li
ar a determinados sítios da mem rana acte
riana. No entanto a função mais importante
 dos anticorpos, é a de ativar a via c
lássica do complemento pois quando a actéria não é destruída por este, ela  é ma
is facilmente fa
ocitada por estar opsonizada por C3 . No entanto al
umas actér
ias podem escapar
 do sistema complemento por serem fracos ativadores  ou porque a
estrutura acteriana que é atacada pelo complemento está lon
e da actéria, com
o é o caso


 das cadeias lon
as do antí eno O presentes no lipopolisacarídeo (LPS)
. Outras actérias já conse uem se livrar
 do complemento porque possuem
 mecanism
os de faze-lo como no caso em que C3 ao se depositar na capsula de actérias ri
cas em ácido siálico, este é inativado pelo fator H e I presentes no plasma, por
serem atraídos pela cápsula. Como exemplo temos as actérias como Neisseria men
in
itidis, E. coli e os estreptococos do
rupo B. No caso dos estreptococos  do


rupo A, a proteína M é um aceptor para o fator H, deste modo o complexo C3 B é f
acilmente dissociado, além dissoela possui um
ene que codifica uma protease pa
ra C5a. Células fa
ocitárias tam ém atuam capturando actérias, aliás, a maioria

das actérias Gram ne
ativas podem ser mortas pelo contato com as células  NK ou
T citotóxicas. Provavelmente
 isto ocorre por um mecanismo que lisa a  i camada
lipídica que compõe a mem rana. A li
ação das células fa
ocitárias as actérias
pode
 ocorrer de
várias maneiras:
 • • • Li
ação a lectinas presentes na superfíci
e acteriana Li ação da actéria  a lectinas
 presentes nos fa
ócitos Li
ação ao c
omplemento depositado na mem rana da actéria
69
•
Li
ação aos anticorpos li
ados ao micror
anismo via Fc. Assim que o micror
anism
o é fa
ocitado ele é exposto a uma série de mecanismos que
poderão destrui-lo, um deles é áprodução de intermediários do oxi
ênio reativo,
onde uma enzima presente na mem rana da célula fa
ocitária é capazde reduzir  o
oxi
ênio
 (O2) no anion superóxido (~O2-), que tem efeito tóxico so re a actéri
a. Tam ém temos a produção de produtos intermediários  nitro
enados, que resultam
na produção do óxido nítrico que é tóxico para actérias e células tumorais. Pa
ra a produção destes intermediários nitro
enados, os macrófa
os precisam ser ati
vados pelo γ-IFN e pelo TNF.  Existem ainda proteínas catiônicas com propriedades
parecidas com a dos anti ióticos como os peptídeos catiônicos da cisteína e ar

inina presentes nos
rânulos de neutrófilos.
 Estas proteínas
 são capazes de form
ar canais ions permeáveis  na camada i-lipídica das actérias, sendo mais eficie
ntes no pH 7,0. Há tam ém proteínas catiônicas que atuamem pH diferente como a
Catepsina G e a Azurocidina, que tem eficácia contra  as actérias Gram ne
ativas


. Não podemos esquecer que os fa olisossomos tam ém apresentam um pH alcalino as
sim que o micror
anismo é fa
ocitado, sendo que esse pH depois  de al
um tempo se



torna ácido. Al uns micror anismos morrem apenas devido a aixa do pH outros ai
nda
 precisam sofrer a ação de enzimas lisosomais que atuam no pH aixo. Al
umas
actérias Gram ne
ativas morrem pela ação da lisozima que atua na camada de  pept
ideo
licana. Su stâncias como lactoferrina (produzida por neutrófilos) tam ém te
m sua participação
 uma vez que estas seli
am ao ferro e o tornam indisponível p
ara as actérias. Al
uns produtos micro ianos podem  estimular os monócitos e mac
rófa
os sem  a participação dos linfócitos, mas tam ém
 podem ser ativados por cit
ocinas li eradas pelas células NK. Das linfocinas li eradas por células  T a mais
importante na ativação dos fa
ócitos talvez seja o γ-IFN. O γ-IFN tam ém tem o
papel de potencializar os mecanismos oxi
ênio dependente e oxi
ênio independente
das células fa
ocitárias. As linfocinas possuem dois efeitos principais, um de
ativare outro de atrair fa
ócitos isso pode ocorrer de forma diferente dependen
do da actéria, por exemplo, no caso da infecção por L. monocyto
enes, é a ativa
ção


 celular que ocorre primeiro para que a
célula fa ocitária consi a destruir a
actéria
 via ativação dos produtos do  oxi ênio reativo, já nas infecções  por M.
tu erculosis, é mais importante a mo ilização de células ao redor da actéria j
á que esta é resistente
 a fa
ocitose e por isso é mais importante para o or
anis
mo fazer sua imo ilização. Nem sempre as defesas celulares são eficientes, tanto
assim que al
uns micror
anismos conse
uem escapar do fa
ossomo indo para o cito


plasma do fa ócito. Outras actérias como o M. leprae


 conse uem fazer que as cél
ulas não fa ocitárias, e portanto sem atividade anti actericida, as removam da c
irculação antes que elas sejam encontradas por células fa
ocitárias profissionai 
s ou sofram a ação de outros mecanismos capazes de destruí-las. Para que as act
érias então sejam alcançadas elas tem de ser expulsas destas células, e quem con
se
ue fazer isso são as células T
70
 
citotóxicas, elas matam a célula contendo a actéria ao reconhecer qualquer alte
ração no receptores de mem rana expressos (principalmente o MHC). Um
rande núme
ro de células T apresentando  os receptores γδ  se proliferam nas infecções bacter
ianas, não se sabe ain a qual o papel exato elas  nas infecções sabe-se apenas  q
ue elas tem ação citotóxica nas células infecta as. Fibroblastos    também po em pa
rticipar
 no combate aosmicror
anismos provavelmente pro uzin  o eriva os nitro


ena
 os. No entanto quan o a resposta imune é exacerba a, po em ocorrer reações  i
n esejáveis
 como é o caso o choque provoca o por exotoxinas,
 que
 acontece evi
o a proução  maciça e citocinas em resposta a liberação e pro  utos bacterianos
libera os urante episó ios septicêmicos.  Aexotoxina
 (LPS) e bactérias  Gram-n
e
ativas
eralmente está implica a neste qua ro e choque, mas também  po e ocorr 
er com bactérias  Gram-positivas. Essa sín rome o choque tóxico po e levar o in


iví uo infecta o a ter febre, colapsocirculatório, coa ulação intravascular e n
ecrose hemorrá
ica, que leva a falha e múltiplos ór
ãos, como ocorre nas infecç
   
ões causa as por Rickettsia rickettsii,causa ora a Febre as  Montanhas Rochosa
s. Existe um  fenômeno
 que acontece quan o a bactéria é capaz
 e causar necrose h
emorrá
ica evi o a reação sistêmica que  ocorre envolven o o sistema
 circulatóri
o, promoven o coa
ulação  intravascular ifusa e trombose.
 A en otoxina (LPS) é o
componente ativo que ispara este

mecanismo,  promoven o mu anças en oteliais,

eposição   e fibrina,
 acúmulo e e ranulação e neutrófilos e plaquetas, sen o qu
e os me
 ia ores esta reação são o TNFα, γ-IFN,  IL-12 e IL-1. Este fenômeno  é ch
ama o e Reação e Shwartzman, e é observa o na menin
ite menin
ocócica on e num
primeiro episó io e septicemia temos o espalhamento os sítios inflamatórios  q
ue são pequenos e subclinícos mas que permanecem sensíveis a ação as citocinas.
Num
   
 se un o momento em que ocorre um novo episó io e
septicemia  ocorre  o esen
ca eamento e umaresposta inflamatória  mais forte com ran e pro  ução e citoci 
nas que levam ao esenvolvimento e necrose nestes sítios. Além o fenômeno  e S
hwartzman, temos em al
uns casos como na infecção por micobactérias o esenvolvi
      
mento a reação e hipersensibili  a e tar ia, me  ia a por células T, a qual acab
a levan o a necrose teci ual na re
ião central o processo celular, conforme já
  
escrito
 na reação o tipo IV. As bactérias   também po emapresentar o que se cha

ma e Superantí
enos, eles tem a capaci a e e se li
ar iretamente as re
iões v
  
ariáveis as ca eias β dos receptores de antí
eno de certos su sets de células T
, e além disso fazer a li
ação cruzada destes com o MHC de células apresentadora
s de antí
enos. Como resultado disso as células T são ativadas sem que haja o pr
ocessamento e a apresentação do antí
eno como peptídeos li
ados ao MHC. Estes su
perantí
enos  podem ser encontrados nos estafilococos, estreptococos, micoplasmas
e outras actérias. Eles são os
71
  
responsáveis pela li eração maciça
 de citocinas e linfocinas oque aca a estimul

ando uma
rande quantidade de su populações de células T. As actérias tam ém p
odem apresentar o que se chama de Proteínas do Choque Térmico, elas tem papel na
captura, empacotamento e transporte de al
umas moléculas. As sequências de amin
oácidos destas proteínas são extremamente conservadas e existe a especulação de
que tais proteínas, por serem semelhantes as proteínas humanas possam estar envo
lvidas com o desencadeamento da autoimunidade. Elas tam ém parecem ser o alvo da
imunidade protetora de vários micror
anismos, e ainda parece que as células T p
odem reconhecer quais proteínas são do pató
eno.


IMUNIDADE
 A FUNGOSSão classificados quatro tipos de infecção por fun os, em ora


se sai a pouco so re os mecanismos precisos de como o sistema imune rea e neste
tipo deinfecção, parece que as reações são parecidas com aquelas que acontecem
com as actérias. As principais cate
orias das infecções por fun
o são: • • Mic
oses superficiais: são produzidas por fun
os chamados de dermatófitos, e estão  n
ormalmente restritas aos componentes não celulares queratinizados da pele, ca el
o e unhas. Micoses su cutâneas: é causada por fun
os saprofíticos
 que podem caus
ar a formação de nódulos crônicos e ulceras em tecidos su cutâneos se
uido de tr
auma, como exemplo temos a cromomicose, esporotricose e micetoma. • Micoses resp
iratórias: fun
os saprófitas do solo podem provocar infecções su clínicas ou a
u
das dos pulmões, ou ainda lesões
ranulomatosas. Como exemplo temos a histoplasm
ose e coccideomicose. • Candidiases: Produzido pela Candida al icans, que normal
mente é um comensal e
eralmente causa infecções superfíciais na pele e mucosas.
Ao que parece as infecções fún
icas são controladas por reações mediadas por cé
lulas, isto é oservado nas infecções cutâneasem que elas são auto limitadas. A
resistência é aseada na reação de hipersensi ilidade do tipo IV uma vez que al

uns pacientes a apresentam frente a antí
enos fún
icos. As doenças crônicas par
ecem ser o resultado da falta ou da falha na monta
em da Reação do tipo IV. A im
unidade por células T parece estar envolvida em outras infecções fún
icas já que 
a resistência pode ser transferida via células T. Supõe-se que as células T li
erem citocinas que sejam capazes de ativar macrófa
os a destruir fun
os. Nas mic
oses respiratórias, o quadro da resposta imune é parecido com o o servado na lep
ra, onde há um infiltrado



 de linfócitos, células epitelióides e i antes ao redo
r do fun o, tentando imo iliza-lo. A candidiase costuma aparecer como resultado
de um distúr io fisioló
ico do or
anismo, seja
 por stress, uso de dro
as imunoss
upressivas ou no caso de doenças que pertur am o sistema imune
72
como a AIDS, deficiências
 imunes e doenças autoimunes. Isso prova que o sistema
imune está em com ate permanente, evitando que o fun
o se espalhe. Há evidências
de que neutrófilos e polimorfonucleares estejam envolvidos na imunidade em al
u
ns processos respiratórios como na mucormicose. É possível que proteínas catiôni
cas sejam importantes no processo de proteção contrao fun
o, uma vez que pacien
tes com fa
ócitos apresentando a deficiência no meta olismo da redução
 do oxi
ên


io conse uem matar o levedos e hifas normalmente. No entanto o meta olismo do óx

ido nítrico é importante na defesa contra o Cryptococcus, e este meta olismo par
ece ser importante no com ate a vários fun
os.
RESPOSTA IMUNE A PARASITOS As infecções parasitárias podem estimular várias form
as de resposta
 imune, ela pode ser mediada por anticorpos, mediada por células o
u envolver am os os tipos de resposta, tudo depende do parasita
 envolvido. Paras
itas como os protozoários, por serem maiores que vírus e actérias, apresentam u
ma
rande quantidade e variedade de antí
enos. Al
uns protozoários ainda podem a
presentar alterações em seus antí
enos de superfície dependendo do está
io de de
senvolvimento destes, deste modo, temos respostas imunes está
io específicas. Co
mo exemplo temos a Malária, onde o esporozoíta (forma infectante oriunda do mosq
uito), que induz a monta
em de anticorpos que não são capazes de rea
ir com os m
erozoítas (forma infectante das hemácias). Os protozoários ainda apresentam dife
rentes formas de entrada nas células do hospedeiro, na Malária, os merozoítas te
m a capacidade de se li
ar a receptores presentes nas hemácias e usar uma or
ane
la própria, contendo enzimas,para fazer a entrada (as roptrias). Outro exemplo
são as Leishmania spp. que ha itam os macrófa
os, usando os receptores do comple
mento para fazer com que as células as fa
ocitem, além disso elas podem entrar n
as células usando o receptor manose-fucose presente na superfície do macrófa
o.
A resistência que al
umas pessoas apresentam as infecções por determinados paras
itas parece ser determinada por um fator
enético, pois, foi o servado que al
um
as pessoas carre
ando al
uns
enes de MHC tinham menor capacidade de montar anti
corpos paraal
uns peptídeos
 do esporozoíta
 da malária porque suas células T não
eram sensi ilizadas. Tam ém foi o servado que a população ne
róide do oeste da
África é mais resistente a malária do que a população de ori
em caucasianapois
a primeira possui al
uns antí
enos de HLA que a última não possui. Outra o serva
ção feita na população africana, é que al
umas pessoas não apresentam o antí
eno
Duffy nos seus eritrócitos, com isso elas são resistentes a infecção pelo Plasm
odium vivax, já que este usa este antí
eno como receptor para fazer sua entrada
na célula. O desenvolvimento da imunidade depende da interação que ocorre entre
várias células e dos vários tipos de células que atuam secretando os vários medi
adores presentes na resposta imune. Podese dizer que os anticorpos são mais efic
ientes contra os parasitas presentes no san
ue e tecidos e que a resposta mediad
a por células atua nos parasitas intracelulares. No entanto o tipo de resposta c
apaz de
73
conferir proteção varia conforme o parasita. Por exemplo, o anticorpo juntamente
com a ação do complemento pode lesar al
uns parasitas extracelulares, mas tem u
ma ação mais eficaz quando tem a participação de células efetoras. Na Malária, p
or exemplo, anticorpos conse
uem evitar que as formas extracelulares consi
am en
trar nas células, e a resposta mediada por células conse
ue evitar o desenvolvim
ento da doença nos hepatócitos. Os mecanismos de ação do sistema imune O sistema

complemento é de novo importante no processo de defesa inespecífica, mas tam ém


há a participação de macrófa os, neutrófilos, eosinófilos e plaquetas na primei
ra linha de defesa. Nainfecção pelo S. mansoni por exemplo, este entra através
da pele, e o primeiro loqueio é realizado por macrófa
os, neutrófilos e eosinóf
ilos. Outro exemplo está na malária e na infecção produzida por tripanossomídeos 
, os mesmos são removidos da



 circulação pelas células fa ocitárias do fí ado e
aço. Os macrófa os ainda li eram citocinas como a IL-1, IL-12 e TNFα e f tores e
stimul dores de colôni que ument m tivid de do sistem imunológico tiv ndo
e promovendo prolifer ção de célul s. A liber ção de citocin s como IL-10,
IL-12, prost gl ndin s e TGFβ podem ter ação anti-inflamatória e imunossupresora
. Os macrófa
os são importantes na defesa contra pequenos parasitos, no entanto

elas li eram vários fatores citotóxicos capazes de destruir os parasitas sem os
fa
ocitar. Quando ativados por citocinas, os macrófa
os podem matar pequenos par
asitas como os presentes nos está
ios eritrocitários da malária, assim como os

randes, como os esquistossomas. Os macrófa
os ainda podem atuar da mesma forma q
ue as células matadorasatravés da citotoxicidade dependente de anticorpo, ao en
contrar o parasito reco erto com I
E ou I
G aumentando
 ainda mais a eficiência c
ontra parasitas como os esquistossomas. Eles tam ém li eram citocinas como TNFα
e IL-1que inter ge com outr s célul s, como por exemplo com os hep tócitos, os f
zendo se torn r resistentes os p r sitos d m lári . Os intermediários do oxig
ênio re tivo são ger dos pelos m cróf gos e gr nulócitos pós f gocitose de p
r sitos d m lári e outros como os T. cruzi, T. gondii , Leishm ni spp. como f
orm de destruir estes p r sit s. T mbém qu ndo tiv dos por citocin s os m cróf
gos liber m m is superóxido e peróxido de hidrogênio que os m cróf gos não tiv
dos, ssim como seu mec nismo de produção de oxigênio re tivo é ument do. A sí
ntese de óxido nítrico pelos m cróf gos é estimul d por citocin s como γIFN e T
NFα, e é b st nte ument d qu ndo o estímulo é feito pelos dois. O óxido nítric
o t mbém pode ser produzido por célul s epiteli is e contribui p r resistênci
do hospedeiro que em doenç s como leishm niose, esquistossomose e m lári e
ind , é um d s form s de controle. Tod s s funções dos m cróf gos efetores sã
o mpli d s logo que infecção tem início sem que h j tu ção d s célul s T
pois célul s como s NK podem
 liber r γIFN quan o estimula o pela IL-12 libera a
pelo macrófa
o. Mais ain a, os macrófa
os secretam TNFα, em respost lguns
74
produtos p r sitários como fosfolipídios contendo ntígenos dos p r sit s d m l
ári , e isto tiv m is m cróf gos. Embor o TNFα t mbém pos ser secret do por
outr s célul s, os m cróf gos ind são os princip is responsáveis por su produ
ção. O TNFα ind tiv outr s célul s como  eosinófilos
 e pl quet s m t r s l
rv s do S. m nsoni, sendo que o γ-IFN
  ain a po e aumentar mais esta ativi a e.
Os neutrófilos também tem a capaci a e e matar pequenos parasitascom mecanismo
s que os macrófa
oxi
ênio epen ente e o

  os também apresentam
 como os mecanismos

xi ênio in epen ente, incluin
  o a pro ução e óxi o nítrico.
 No entanto os neutr
ófilos possuem uma ativi a e respiratória mais intensa o que os macrófa
os e se
us

 rânulos secretórios
 contém proteínas altamente citotóxicas. Os neutrófilos p
o em ser ativa os por citocinas como γIFN, TNFα, e GM-CSF. A destruição extr cel
ul r por neutrófilos é medi d por peróxido de hidrogênio enqu nto que os compon
entes liber dos pelos grânulos estão envolvidos n destruição intr celul r. Os n
eutrófilos t mbém possuem receptores p r Fc e complemento e por isso p rticip m
d respost citotóxic medi d por
nticorpos, como ocorre n infecção pelo S. m nsoni. Deste modo eles são m is de
strutivos que os eosinófilos contr vári s espécies de nem tódeos . Os eosinófil
os p rticip m m is n s infecções por vermes, p rece que eles estão envolvidos n
defes contr os estágios tecidu is dos p r sit s que são muito gr ndes p r se
r f gocit dos. A re ção re liz d pel IgE que forç degr nul ção dos m stócit
os promove tr ção dos eosinófilos o sítio onde está o p r sit e ind mpli
fic su tivid de ntip r sitári . No ent nto nem sempre os eosinófilos consegu
em evit r que o p r sit promov infecção, m s podem limit r mesm . Os eosin
ófilos podem m t r os helmintos por mec nismos oxigênio dependente ou oxigênio i
ndependentes e mesmo não tendo mesm c p cid de de f zer f gocitose que os n
eutrófilos, eles podem degr nul r em respost lter ção de su membr n . Além
disso eles podem ser tiv dos por citocin s como o TNFα e GM-CSF. No ent nto m
iori d s tivid des dos eosinófilos são control d s por mec nismos ntígeno es
pecíficos como no reconhecimento que eles f zem d s IgE lig d s ntígenos, pro
cedendo ssim degr nul ção sobre este. Os eosinófilos possuem ind um proteí
n ch m d de Proteín Básic Princip l (MBP) que jud destruir os esquistoss
om s. Aind em lguns processos p r sitários, como n infecção pelo esquistossom
, pode h ver p rticip ção em conjunto de eosinófilos e m stócitos, onde os pr
odutos liber dos pelos m stócitos promovem o umento d tivid de dos eosinófilo
s. Os ntígenos é que c us ri m degr nul ção dos m stócitos, sem que houvesse
p rticip ção d IgE, e os produtos liber dos promoveri m tr ção e o umento
d tivid de dos eosinófilos no sítio de infecção. A p rticip ção d s pl quet s
pode se d r contr vários tipos p r sitários, dentre estes se dest c ção co
ntr form l rvári do T. gondii e T. cruzi. Assim como outr s célul s do sist
em imune, su tivid de citotóxic é ument d pel ção d s citocin s como γIF
N e TNFα. Assim como os m cróf gos e outr s célul s do sistem imune, s pl quet
s present m o receptor Fcε m sua
75
mmbrana, com isso las também podm xrcr a atividad citotóxica dpndnt d
 anticorpo quando s liga a IgE. Na rsposta parasitária as células T controlam
o dsnvolvimnto da imunidad, isso pod sr obsrvado na malária ond a monoc
itos  o aumnto do baço é acompanhado do aumnto do númro d células T dpnd
nts. Outro xmplo inclui o acúmulo d macrófagos nos granulomas qu s formam
m torno do ovo no fígado infctado plo squistossoma, também s obsrva a os
inofilia m infcçõs por hlmintos,  o rcrutamnto d osinófilos  mastócito
s para a mucosa intstinal nas infstaçõs por vrms. Os mastócitos  os osinó
filos são importants nst control das infstaçõs por vrms  hlmintos, só
qu ls costumam prolifrar mlhor quando sofrm ação d citocinas libradas p
las células T, como as IL-3, GM-CSF  IL-5. No ntanto o aumnto da libração d
IL-3 pod sr prjudicial ao hospdiro, na mdida qu st pod causar a xac
rbação da rsposta imun  assim aumntar a dissminação dos parasitas. O tipo d
 célula T rsponsávl para o control da infcção varia d acordo com o parasit
a  com o stágio da infcção  ainda, dpnd do tipo d citocina qu stá snd
o librada. Por xmplo, células T CD8+  CD4+, protgm o hospdiro contra dif
rnts fass da infcção por Plasmodium, as células CD4+ atuam no stágio m qu
 o parasita s ncontra no intrior das hmácias, nquanto as células CD8+ atua
m no stágio m qu o parasita s ncontra no fígado. As células CD8+ atuam m d
ois stágios difrnts, m um d   
l s la lib ra γIFN que inibe a multiplicação
os parasitas nos hepatócitos,
 e estroem os hepatócitos
 infecta os. Os hepatócit
os expressam o MHC   e classe I, mas não o
 MHC e classe
 II, lo
o as células CD4+
não tem a capaci
 a e e as reconhecer, o mesmo mo o, como oseritrócitos  não e
xpressam o MHC e classe I, as células CD8+ não tem a capaci a e e fazer o reco
nhecimento estas. A resposta imune contra o T. cruzi e T.
on ii, não epene ap
    
enas as células T CD4+ e CD8+, mas também e células NK e a pro ução e antico
rpos. As células NK são estimula as pela IL-12 secreta a pelos macrófa

  os, e uma
vez
 ativa os eles liberam γIFN. As infecções crônicas estão associa as a baixa
pro
 ução e γIFN e isso mostra porque os pacientes com SIDA são facilmente infec
ta os esucumbem na infecção por T.
onii, já que a população e células CD4+ e
    
stá
 sen o estruí a. Conforme já ito anteriormente,
 as células TH po em ser iv
i i as em TH1 e TH2, no está
io inicial a infecção temos quase que  o equilíbrio

entre as uas populações, e a população que irá prevalecer, 
será etermina a pe
lo tempo e pelo curso que a infecção tomará e também o a ente  parasitário em qu
estão. Na malária,
 por exemplo, as células
 TH1 atuam iminuin o a parasitemia o
s esporozoítas o P. vivax. A população e linfócitos TH1 ao liberar γIFN promov
e a ativação e macrófa
os a matar protozoários como o T. cruzi e T.
onii, ass
 
im como aumenta a ativi a e contra outros parasitas.
76
 
Em pessoas com a Leishmaniose cutânea ifusa  e Leishmaniose
 visceralpro
ressiva
, as mesmas se caracterizam pelo
ran e pro ução e IL-10, que é pro uzi a pela

população e TH2 e que por isso  inibe a população TH1, e talvez por isso
 a infec
ção não seja tão bem controla    a pelo sistema imune. Estu os in vitro emonstrara
mque a IL-4 inibe  a ativi a e o
γIFN, e isto evita que os monócitos sejam ativ
a os contra a L. onovani. Isto su ere que se usarmos IL-12 como terapia na Leis
hmaniose,
 ela possa exercer ação anta
onista sobre as IL-4, IL-10 e TGFβ, ativan
do tam ém, de forma indireta, a ação da população TH1. Na infestação por vermes,
a principal
 característica da resposta imune  é a produção de I
E e a eosinofili
a, am as dependem da ação dascitocinas li erada pelos linfócitos TH2. No entant
o se o serva uma certa contri uição dos linfócitos TH1, que ainda não foi em es
clarecida. Na esquistossomose a resposta promovida pela população de linfócitos 
TH2 parece ser importante na resistência a reinfecção quando o paciente foi su m


etido ao tratamento com dro as. A resposta pela população TH2 parece ser estimul
ada pelos ovos do esquistossoma. Em al
umas infecções parasitárias o sistema imu
ne não conse
ue destruir o parasita, neste caso o ocorrea formação do
ranuloma
, com células se a
lomerando ao redor do mesmo. Isto é o servado na esquistossom
ose, onde ocorre a formação do
ranuloma ao redor do ovo, esta reação é dependen
te de linfócitos TH1, e é uma resposta local crônica mediada por células, onde h
á a participação de citocinas como o TNFα e o γIFN. Osmacrófa

  os acumulam e lib
eram fatores o fibrino ênio que estimulam a formação oteci o
ranulomatoso e


acabam levan o a fibrose.
 Na esquistossomose a formação o
ranuloma
 ocorre em r
esposta a liberação e um antí
eno solúvel secreta o ao re or o ovo que ficou p
reso no fí
ao. Embora essa reação puesse beneficiar o hospeeiro, isolano o f
    
í
a o a ação as toxinas secreta as pelo ovo, ela acaba  sen o a causa
 patoló
ic
a a oença, promoven o reações

 irreversíveis no fí a o e a per a e sua função.
Tanto essa reação

é controla a por células T, que na sua ausência não se observ
a a formação
 o ranuloma. As células TH2 também são importantes paraexpulsar o
s vermes o intestino, pois elas ativam os mastócitos a liberarem pro utos que i
ntera
em com os eosinófilos, os quais contribuem no
   
processo e expulsão  o verme. As células
 TH2 po em in uzir os linfócitosB (via
IL-4 e IL-5) a pro uzir anticorpos a classe

 I E e ain a a proliferação e mast
ócitos
 (via IL-3, IL-4, IL-9 e IL-10)
 eain a a hiperplasia
 as células secretor
as

e muco. Os
 vermes acabam sen o lesa os pela ação os anticorpos junto com a
e ranulação os mastócitos sensibiliza os pela I
E. Os mastócitos e
ranulam hi
  
stamina que aumenta a permeabili a e o epitélio intestinal e com isto permite q
ue ocomplemento e os anticorpos presentes

 no plasma che uem à luz intestinal, a
lém isso eles po em promover o aumento o peristaltismo intestinal, como forma

ama
lobulinemi
e expulsar o parasito. Vários
 parasitos
  po em promover
 uma hiper 
a não específica, a qual po e ser evi o a liberação e substâncias os parasito
s, que atuam como mitó enos as células B. Como exemplo, os níveis e imuno
lobu


linas I
M se mostra aumenta o na tripanosomiase e na malária e
77
   
I
G na malária e na leishmaniose  visceral.
  Quan o temos a pro ução e anticorpos
específicos, temos estes atuan o e iferentes  maneiras contra o antí
eno, como 
exemplos,  temos os anticorpos atuan o iretamente sobre o parasita o promoven o
a ação o complemento
 sobre
 este, como ocorre na malária contra os esporozoítas
ouna oença e cha
as, iretamente sobre os tripanosomas; os anticorpos também 
po em neutralizar a ação o parasita bloquean o sua li
ação à célula hospe eira
, como acontece  com os merozoítas, que  só entram nos eritrócitos via roptria, à
qual é bloquea a pelos anticorpos; po eocorrer também o aumento a fa
ocitose f
 
eita pelos macrófa
os, a qual  é aumenta a quan o há também a participação ocom
plemento, via a interação os anticorpos com o receptor Fc os macrófa ose o c

omplemento  com o receptor para C3; também temos o mecanismo e citotoxici  a e ce
lular me ia a por anticorpos, muito eficaz nas infecções promovi as por T. cruzi
, S.mansoni e al
uns vermes filariói es, nesse caso células como macrófa
os, neu
trófilos
 e eosinófilos
 se li
am aos parasitos recobertos
 por anticorpos via rece 
ptor eFcou e C3  e fazem a exocitose
 em cima o parasita.
 Foi observa o que
epen en o o tipo e anticorpo  envolvi o a resposta é iferente, como exemplo  ci
tamos a esquistossomose, on e a resistência  é conferi a por anticorpos
 a classe
I
E, e a I
G4 parece bloquear a ação a I
E. Isto é muito observa o em crianças
, pois elas apresentam alta pro ução e I G4

 e com isso ficam susceptíveis a rei
nfecções
  pelo esquistossoma Por vezes fica ifícil
 iferenciar entre uma respost
a me ia a por células  e por uma resposta
 me ia a por anticorpos, como ocorre na
esquistossomose,
 on e temos a atuação e ambas as respostas. Nela o anticorpo
  é
capaz e se li
ar ao ovo e ativar o complemento, bem como a resposta me ia a por
células como macrófa
os, neutrófilos, plaquetas  e eosinófilos. Os macrófa
os e
neutrófilos

atuam provavelmente pela liberação eoxi ênio reativo e metabólitos
 
o
 óxi o nítrico,
 e os eosinófilos atuam liberan o a MBP. Esta ação celular é a
in a potencializa a pelas citocinas como a TGFα. Aind os nticorpos podem sensi
biliz r o m stócitos f zerem degr nul ção de medi dores infl m tórios, incl
uindo os que tiv m eosinófilos. Mec nismos de Esc pe dos p r sit s P r sit s co
mo Leishm ni podem esc p r do sistem imune us ndo os receptores do complemen
to p r entr r nos m cróf gos e ssim esc p r do met bolismo oxid tivo dos mesmo
s. Outro exemplo em que o sistem imune s vezes é benéfico o p r sit , está em
que o TNFα estimul o S. m nsoni produzir m is ovos. Alguns p r sit s t mbém
podem resistir ção do sistem complemento, como é o c so d s Leishm ni , onde
L. donov ni por ser resistente o complemento se esp lh com f cilid de n s v
íscer s. No c so do T. cruzi, ele consegue esc p r d ção do complemento porque
em su membr n existe um glicoproteín que possui tivid de semelh nte o F t
or Aceler dor de Dec imento (DAF), p rece que os esquistossom s t mbém possuem u
m molécul simil r o DAF. Os p r sit s intr celul res conseguem esc p r d des
truição de vários modos, por exemplo, os que vivem no interior de m cróf gos con
seguem esc p r d ção dos met bólitos de oxigênio e
78
enzim s lisosom is, isso é observ do no T. gondii, que consegue evit r degr d
ção pelos met bólitos do oxigênio e com Leishm ni , que entr n célul o se
lig r os receptores do complemento e ssim esc p r d ção do f gossom . Além d
isso Leishm ni possui enzim s que inibem produção dos met bólitos do oxigên
io, como superóxido desmut se que protege dos r dic is do oxigênio, e ind
present um c m d de Lipofosfoglic n (LPG) que tu como um escudo contr os
met bólitos do oxigênio e o t que enzimático. Aind , um glicoproteín , Gp6
3 tu inibindo ção d s enzim s lisosom is do m cróf go. A Leishm ni spp. t
mbém consegue inibir ou diminuir expressão d s molécul s de MHC d cl sse II d
os m cróf gos de onde el s estão, com isso c p cid de dest s célul s estimul r
em s célul s TH, é diminuíd . Alguns p r sit s podem ind se “esconder” do sis
tem imune tr vés de v ri ções ntigênic s, como se observ nos p r sit s c us
dores d m lári . Outros p r sit s, como é o c so dos esquistossom s, podem dqu
irir um c m d de ntígenos do hospedeiro, de form que o sistem imune não con
segue os reconhecer. Os esquistossom s poderi m se cobrir com molécul s do grupo
s nguíneo A e B ssim como molécul s de MHC de cl sse II. Outros p r sit s como
lgum s espécies de protozoários, como Ent moeb histolytic , e lguns helmin
tos podem esc p r do t que do sistem imune form ndo cistos protetores. Os p r
sit s t mbém podem present r c r cterístic s físic s que lhe conferem proteção,
como é o c so dos esquistossomose, que tem um fin c m d que os protege de su
bstânci s tóxic s l nç d s pel s célul s efetor s do hospedeiro, nos nem tódeos,
su membr n froux pode ser desc rt d qu ndo está sob o t que do sistem i
mune, cestódeos podem esc p r do t que de neutrófilos secret ndo um inibidor d
el st se, o que f z p r r tr ção dest s célul s. Vários p r sit s podem resi
stir o t que do met bolismo oxid tivo, como s flilári presentes nos linfonod
os, onde el s secret m um glut tion peróxid se, os esquistossomose tem em su
membr n um glut tion S tr nsfer se. Alguns nem tódeos e trem tódeos podem evi
t r ção de imunoglobulin s secret ndo prote ses que cliv m imunoglobulin ,
removendo porção Fc. Os p r sit s t mbém podem present r tivid de imunosupre
ssor , pois lguns podem destruir célul s linfóides ou o próprio tecido linfóide
devido liber ção de um f tor linfocitotóxico, ou por interferir com função
dos m cróf gos. Os m cróf gos podem ser recobertos com poliss c rídeos e glicoco
njug dos que os vermes liber m e ssim s tur m o m cróf go, interferindo com seu
process mento. N m lári , por exemplo, os m cróf gos cumul m hemozoín , que
é um produto de degr d ção d hemoglobin , qu l interfere com su s funções. M
uitos produtos p r sitários são c p zes de estimul r os m cróf gos liber r s
prost gl ndin s e outr s molécul s imunosupressor s s qu is interferem com re
spost infl m tóri . Outr s vezes os próprios vermes liber m prost gl ndin s, co
mo é o c so de lgum s filári s e cestódeos. Antígenos solúveis liber dos em gr
ndes qu ntid des pelos p r sit s podem tr p lh r respost imune um vez que e
l s gem como um mec nismo de “distr ção” p r este. Um exemplo
79
 disso está no ntígeno solúvel S ou nos ntígenos termo resistentes do P. f lcip
rum, que se lig m os nticorpos e ssim permitem que p r sit esc pe. T mbém m
uitos dos ntígenos de membr n são liber dos sob form solúvel, como é o c so
do LPG liber do pel Leishm ni e vários ntígenos de superfície liber dos pelo
s esquistossom s. A supressão ntigênic t mbém ocorre por supressão d respost
d Hipersensibilid de do tipo IV, fet ndo os linfócitos T CD4+ ssim como o b
l nço entre s popul ções TH1 e TH2. N Leishm niose, foi observ do que s cultu
r s de célul sT de p cientes  com L. donov ni não er m c p zes desecretr IL-
2 ou γIFN quan o cultiva as com

 o antí eno específico.  A expressão o MHC e cla
sse II assim como a secreção  e IL-1 se apresenta iminuí a, e a secreção e pro
sta
lan inas está aumenta a. Na filariose as células  TH1 não proliferam em respo
sta a antí
enos  específicos e a resposta realiza a por anticorpos  permanece inta
cta. Na ver a e o que se observa nos pacientes altamente infecta os com filarias
e esquistossomas é que há
ranes quantiaes e I
G4, a qual tem efeito bloque
   
a or sobre a ação a I
E. Ain a na esquistossomose, anticorpos a classe I
M e I

G2 prouzios para al
uns carbohiratos os esquistossoma, são capazes e inibi
 
r asfunções
 citotóxicas os
ranulócitos  e estão correlaciona  os com a suscepti

bili a e a reinfecção. A IL-2 pro uzi a por linfócitos TH1 po e mostrar-se  efic


iente
em al umas infecçõespor protozoários como ocorre na malária,  e na oença
e cha as, isto  parece se ever a interferência que o parasita po e executar nos
receptores a IL-2.

Consequências imunopatoló
icas  as infecções parasitárias
 As respostasimunoló i




cas al umas vezes ao invés e serem benéficas
   po em preju icar o hospe eiro. Na

os e linfócitos no fí
a
Leishmaniose visceral o aumento a ativi a e os macrófa
o e baço leva
alia. Na esquistossomose, a resposta imunopa

 a hepato e esplenome

   
toló ica se eve a formação  os ranulomas ao re or osovos, coman a os pelas c
élulas


  T. A I E pro uzia
nas infestações por vermes  po em levar uma ran e quan
ti a e e mastócitos
 a e ranularem,
 levan
 o a pro ução o choque anafilático, c
omo observa o no rompimento
 o cisto hi ático na infecção
 pelo E.
ranulosus. Po
e ocorrer a formação e autoanticorpos
 como observa o nas tripanosomiases  e na
malária,
 provavelmente evi o a ativação policlonal, com
 isso  acabam sen o pro
 u
zi os anticorpos para as hemácias, linfócitos e DNA. Po e ain a ocorrer a pro uç
ão e anticorpos para os parasitas, mas que rea
em cruza amente com os tecios 
  
o hospe eiro,  como exemplo,  temos a car iomiopatia,
 aumento
 o esôfa
o e o me
ac
olon observa



 os na Doença e Cha
as, que se eve a ação e anticorpos no ân lio
nervoso e as células T que rea em cruza amente com o T. cruzi.
80
   
A pro uçãoem excesso e al
umas citocinas
 po e contribuir para as manifestações
clínicas e al
umas oenças um exemplo isto está na malária a
ua, one temos
   
febre, anemia, iarreia e alterações pulmonares provavelmente evi o a ação o T
NFα. Algum s vezes o poder imunosupressivo de lguns p r sit s é tão intenso que
torn o hospedeiro susceptível infecções por vírus e b ctéri s.
PRINCÍPIO DOS IMUNOENSAIOS As técnic s imunológic s se b sei m n re ção entre o
ntígeno e o nticorpo, e b se do neste princípio, qu lquer molécul que se com
porte como um ntígeno pode ser identific d por est s técnic s. N s re ções de
precipit ção um d s c r cterístic s d re ção entre o ntígeno e o nticorpo, é
que o complexo form do entre o ntígeno e o nticorpo se precipit em proporçõe
s combin d s ou próximo zon de equiv lênci . Isso é melhor observ do n re çã
o de preciptin , onde um ntígeno e um nticorpo são mistur dos em solução, tend
o concentr ção de nticorpo fix , v i se ument ndo os poucos qu ntid de de
ntígeno. Aos poucos o número tot l de imunocomplexos v i ument ndo e depois c
omeç diminuir. Se for feito um gráfico d re ção de preciptin , teremos este
dividido em três zon s diferentes, num primeir et p , temos o excesso de ntic
orpo, nesse c so qu ntid de de ntígeno é insuficiente p r se complex r com t
odos os nticorpos, logo não observ mos precipit ção. Em um segund et p , te
mos qu ntid des equiv lentes de ntígeno e nticorpo, logo ocorre precipit ção
de todo ntígeno e nticorpo presente. Por fim, num terceir et p , temos m is
ntígeno do que nticorpo, e isto lev redução do volume precipit do, pois oc
orre solubiliz ção do complexo ntígeno nticorpo form do devido o excesso de
ntígeno presente. Este fenômeno ocorre in vitro com tod s s re ções que envol
v m form ção do complexo ntígeno- nticorpo, e por isso, s vezes obtemos resu
lt dos f lso neg tivos, qu ndo não diluímos um soro o suficiente, pois ocorre um
fenômeno ch m do de pró zon , onde há t nto nticorpo, que re ção frente um
ntígeno não ocorre de m neir dequ d , que permit ser visu liz d . A m iori
dos imunoens ios pode ser dividid em dois gr ndes grupos, são eles os métodos
competitivos e os métodos não competitivos. Nos métodos competitivos, substânc
i ser n lis d ( n lito) e um substânci igu l que será n lis d só que
m rc d (m rc dor), são mistur d s junto com um nti- n lito ( nticorpo p r s
ubstânci ser n lis d ). Após incub ção por um determin do tempo, se mede
qu ntid de de m rc dor lig do ou concentr ção de n lito presente n mostr .
Nos métodos não competitivos, um excesso de imunore gente (pode ser nticorpo o
u ntígeno), é dicion do, de form que o n lito forme um imunocomplexo com o i
munore gente. O imunocomplexo é então qu ntific do e rel cion do com qu ntid d
e de n lito presente n mostr .
81
Os métodos não competitivos são m is sensíveis que os métodos competitivos. A se
nsibilid de d detecção feit pelos ens ios competitivos é limit d pel concent
r ção de nticorpo us do, por outro l do sensibilid de dos métodos não competi
tivos é determin d pel lig ção não específic dos imunore gentes m rc dos. Os
métodos não competitivos podem ser us dos p r detecção de um molécul simple
s desde que sej m us dos m rc dores f cilmente detectáveis e com b ix lig ção n
ão específic . T nto os métodos competitivos qu nto os não competitivos requerem
medição dos imunocomplexos n presenç de nticorpos e/ou ntígenos livres. N
os imunoens ios “heterogêneos” (competitivos ou não competitivos), isto é feito
se sep r ndo os imunocomplexos dos imunore gentes livres. Nos imunoens ios “homo
gêneos”, modul ção do sin l ocorre como result do d imunore ção, lém do m is
form ção dos imunocomplexos pode ser detect d sem sep r ção do imunore gen
te lig do ou livre.
82
Ens ios Competitivos ) Com imobiliz ção do nticorpo Neste tipo de imunoens i
o o nticorpo p r o n lito em questão é fix do em um suporte sólido (pl c de
poliestireno, micropérol s, tubos, etc), por dsorção ou por lig ção cov lente.
Os sítios livres do suporte sólido, que poderi m lig r substânci s inespecífic s
, são bloque dos com um proteín como lbumin , fim de evit r interferênci
n re ção. A mostr com o n lito é então coloc d no suporte sólido junto com
o m rc dor (um substânci igu l o n lito só que m rc d ). O n lito então co
mpete com o m rc dor pelos nticorpos fix dos no suporte sólido. Após um período
de incub ção, o suporte sólido é l v do p r f zer remoção dos re gentes que
não se lig r m e em seguid se procede leitur do sin l que o m rc dor emite.
Este sin l é invers mente proporcion l qu ntid de de n lito presente, ou sej
, qu nto m is n lito presente, menor o sin l e vice vers . O nticorpo p r o
n lito us do deve ser o m is específico possível senão teremos lig ção de subs
tânci s não específic s ele, o que lev re ção com result do f lso positivo.
Se o nticorpo puder ser m rc do com biotin ou um h pteno (como substânci s co
m os grupos nitrofenil), sem que h j um redução signific tiv de su finid de
, então f se sólid recobert com estrept vidin ou um nticorpo p r h pteno
pode ser utiliz do. A v nt gem de se f zer isso é que est configur ção pode ser
plic d p r diferentes tipos de ens io. A f se sólid t mbém pode ser recober
t com nticorpos com finid de p r porção Fc dos nticorpos p r o n lito (
nti n lito). Por exemplo, pode-se us r nticorpos de c br específicos p r
porção Fc de nticorpos de coelho específicos p r o n lito fim de revestir o
suporte. Est configur ção ssegur que o nticorpo p r o n lito será fix do
o suporte sólido pel porção Fc e deste modo fic rá disposto de form propri d
p r se lig r o n lito com m ior eficiênci . Consequentemente menos nticorp
os p r o n lito são necessários p r c d ens io qu ndo comp r mos com o métod
o direto ( nticorpo p r o n lito fix do no suporte). Qu nto m is t rde se dic
ion o m rc dor pós dição do n lito, melhor será o result do obtido com r
e ção, ument ndo-se ssim sensibilid de. Neste c so o melhor procedimento é s
e incub r f se sólid com o n lito, té que o equilíbrio sej lc nç do, e po
steriormente se dicion r o m rc dor e proceder nov incub ção p r que se lc n
ce um novo equilíbrio. b) Com imobiliz ção do ntígeno Antígenos proteícos pod
em ser imobiliz dos diret mente nos suportes de poliestireno por dsorção físic
desde que estej m purific dos. No c so dos h ptenos, estes são inici lmente lig
dos proteín c rre dor e então incub dos com f se sólid . Após o bloqueio,
se dicion mostr e o nticorpo m rc do específico p r o n lito. O n lit
o presente n mostr compete com o n lito imobiliz do por um determin do númer
o de nticorpos m rc dos. Est re ção termin com l v gem do suporte sólido
fim de remover os nticorpos não lig dos o n lito fix do no suporte
83
sólido. Qu nto m ior qu ntid de de n lito n mostr menor será qu ntid de
de nticorpos m rc dos lig dos f se sólid . Se m rc ção diret dos nticorpo
s p r o n lito não for possível, então pode-se us r um nti-soro bruto. Assim
que imunore ção é complet d , detecção do nticorpo lig do f se sólid é f
eit se us ndo um nti globulin m rc d .
Ens ios Não Competitivos ) Ens ios tipo s nduíche (dois sítios) Estes ens ios s
ão us dos p r detecção de ntígenos m cromolecul res, onde lig ção simultân
e de dois nticorpos o ntígeno é possível sem interferênci estéric . A mo
str é coloc d no suporte sólido o qu l está recoberto com nticorpos específic
os p r o n lito ( nticorpos de c ptur ) e posteriormente bloque d . Posteriorm
ente se procede incub ção p r que o nticorpo se ligue o n lito e em seguid
se procede l v gem p r remover tudo que não se ligou. Agor em um segund
et p se dicion um excesso de nticorpos m rc dos p r o n lito ( nticorpos d
e detecção) e procede-se nov incub ção. Feito isso se l v o suporte sólido p r
remoção dos nticorpos que não se lig r m e se procede leitur dos nticor
pos lig dos. A esse processo se dá o nome de ens io s nduíche de du s f ses. A q
u ntid de de n lito presente n mostr corresponde qu ntid de de nticorpos
detect d n f se fin l. Neste ens io t mbém pode se dicion r mostr junto c
om o nticorpo m rc do fim de se reduzir um et p no processo e por isso ch m
do de processo de s nduíche de um et p . A leitur e interpret ção desse pro
cesso se dá d mesm form que o processo de du s f ses. Este processo de um f
se, embor rápido, pode present r problem s, como qu ndo concentr ção de n l
ito super qu ntid de de nticorpos de c ptur e de detecção, d ndo v lores in
feriores o que poderi se observ r. Pois neste c so o nticorpo de c ptur ( qu
ele presente n f se sólid ), fic s tur do e um gr nde qu ntid de do n lito f
ic em solução. A detecção do nticorpo é distribuíd entre s du s f ses do n
lito. Os imunocomplexos form dos em solução são l v dos n et p seguinte incu
b ção e ssim, um pequen qu ntid de dos nticorpos de detecção fic lig d o
n lito que se ligou o nticorpo d f se sólid , logo o sin l detect do será me
nor. C sos como estes em que há gr nde qu ntid de de n litos, lev ndo um resu
lt do b ixo é observ do o se dos r m rc dores tumor is em p cientes com câncer,
onde os ltos níveis de m rc dores presentes n s mostr s dão origem um sin l
b ixo nos ens ios não competitivos de um p sso. Este efeito d gr nde qu ntid d
e de n lito, pode ser detect do, se repetindo dos gem d nálise com mostr
diluíd . A mostr diluíd dá um sin l m ior se houver o excesso de n lito. A
ltern tiv mente, mostr é n lis d pós dição de um solução p drão conce
ntr d do n lito. Qu ndo o efeito do excesso de n lito está presente, este pod
e ser elimin do se
84
 ument ndo concentr ção do nticorpo de detecção té o ponto em que h j um ex
cesso deste em rel ção o n lito. No ent nto diminuição d sensibilid de pode
ser observ d devido lig ção não específic ssoci d lt detecção de nti
corpos m rc dos. Pode-se minimiz r isto diluindose s mostr s vári s vezes nte
s de proceder o ens io, desde que sensibilid de do teste permit isto. Os ens
ios de du s et p s f zem uso de dois nticorpos monoclon is epecificos p r dife
rentes epítopos dos ntígenos. Contudo combin ção de nticorpos monoclon is co
m policlon is pode ser us d . Algum s vezes os mesmos nticorpos policlon is pod
em ser us dos como nticorpos de c ptur e detecção. Como os ens ios de du s et
p s us m dois nticorpos, eles present m melhor especificid de que os métodos d
e competição. N verd de substânci s que re gem cruz d mente interferindo com os
ens ios competitivos, não cheg m interferir nos ens ios de du s et p s porque
norm lmente est s substânci s não se lig m os dois nticorpos de c ptur e de
detecção. b) Imunoens ios p r nticorpos específicos e ens ios de c ptur de cl
sses de imunoglobulin s Ens ios não competitivos us dos n determin ção de nti
corpos específicos são incluídos neste grupo. A f se sólid é recobert com o n
tígeno. Antígenos proteícos t mbém podem ser us dos p r recobrir o suporte sóli
do, onde os h ptenos são primeir mente conjug dos com proteín s c rre dor s. A
mostr diluíd é incub d junto com f se sólid . O nticorpo lig do f se sól
id é então qu ntific do us ndo-se um nti globulin m rc d . Este tipo de ens
io é especi lmente útil n pesquis de hibridom s p r produção de nticorpos
monoclon is. Nos ens ios de c ptur de cl sse de imunoglobulin , f se sólid é
recobert com nticorpos p r cl sse que se desej qu ntific r presentes n
mostr . Após incub ção d mostr com f se sólid se procede-se l v gem qu
e irá remover tudo que não se ligou por não ser específico. Posteriormente o nt
ígeno de interesse é dicion do e c ptur do pelos nticorpos específicos lig dos
n f se sólid . A lig ção do ntígeno é determin d pel dição de um nticorpo
m rc do p r o ntígeno. Como exemplos deste tipo de ens io temos determin çã
o de IgM no di gnóstico d infecção gud e determin ção de IgE p r lguns l
ergenos específicos. Os ens ios de c ptur de cl sse de imunoglobulin s são m is
específicos se comp r dos com queles que empreg m o ntígeno fix do no suporte
sólido, especi lmente p r nticorpos de cl sses que se present m em pequen q
u ntid de, já que todos os outros nticorpos são removidos ntes d dição do n
tígeno. c) M pe mento de epítopos Nos c sos em que temos vários nticorpos monoc
lon is p r o mesmo ntígeno, pode ser necessário se determin r se eles se lig m
diferentes epítopos que se sobrepõe. Um f se sólid recobert com o ntígeno
purific do é incub do com nticorpos monoclon is m rc dos junto com diferentes
concentr ções de outro nticorpo monoclon l, só que este não está m rc do. Se os
dois nticorpos se lig rem o mesmo epítopo sobreposto, então, devido competi
ção que ocorre entre
85
eles o sin l diminui conforme concentr ção do nticorpo não m rc do ument . O
sin l perm necerá o mesmo se os dois nticorpos se lig rem diferentes epítopo
s. Um configur ção levemente modific d pode ser us d se um prep r ção ntigê
nic purific d não estiver disponível p r recobrir o suporte sólido. Nesse c s
o, o nticorpo monoclon l p r o ntígeno desej do, é coloc do p r recobrir o s
uporte sólido. Posteriormente se dicion solução ntígenic não purific d , p
rocede-se incub ção e l v gem p r remoção de tudo que não se ligou, inclu
indo-se í s proteín s inespecífic s. Posteriormente se dicion o nticorpo mo
noclon l m rc do junto com o nticorpo monoclon l não m rc do e incub -se mos
tr . A interpret ção d leitur se d do mesmo modo que no procedimento descrito
cim . Imunoens ios P r Antígenos Imobiliz dos n F se Sólid Este grupo envol
ve detecção de proteín s ntigênic s em Western Blots. As proteín s são primei
r mente sep r d s por um gel de poli cril mid e tr nsferidos por eletroeluição
p r um membr n de nitrocelulose. A membr n é então incub d com um solução
proteíc como lbumin ou leite desn t do, fim de bloque r os esp ços v zios d
nitrocelulose. A seguir se dicion o nticorpo de interesse p r proteín ,
incub -se por um determin do tempo e posteriormente se procede l v gem do exce
sso de nticorpo, e o imunocomplexo form do é detect do pel dição de um imuno
globulin p r o nticorpo que se ligou o ntígeno. Este procedimento oferece
lt sensibilid de, m ior té do que se us sse um nticorpo m rc do específico p
r o ntígeno. Existem outr s técnic s p r detecção de imunocomplexos só que es
t s serão descrit s os poucos, conforme necessid de. N s re ções de imunoblot
podemos l nç r mão de nticorpos monoclon is ou policlon is. Cl ro que os ntic
orpos monoclon is são m is específicos m s eles podem f lh r qu ndo se tr t de
f zer lig ção com proteín s que tenh m se desn tur do dur nte eletroforese.
Por outro l do, o soro policlon l contém nticorpos que inter gem com epítopos q
ue perm necer m int ctos pós eletroforese e/ou tr nsferênci . Além do m is, m
is de um nticorpo pode se lig r mesm molécul ntígenic . Deste modo os nt
icorpos policlon is oferecem m ior sensibilid de e por isso são m is us dos no i
munoblot. A m iori dos m rc dores us dos são enzim s como fosf t se lc lin
e peroxid se. As enzim s se convertem de um substr to solúvel em um produto colo
rido, fluorescente ou quimioluminescente. Como exemplo cit mos di minobenzidin
, que é um do dor de hidrogênio p r peroxid se, e por isso dquire um cor m
rrom , t mbém mistur de fosf to de bromocloroindol com o zul de nitrotetr z
ol, dá um precipt do de cor púrpur , pode ser us do como substr to p r fosf t
se lc lin .
Imunoens ios Não Competitivos P r Molécul s Pequen s ) Ens ios de dois sítios
p r H ptenos com Grupos Amino
86
Neste tipo de ens io, substânci s contendo o grupo mino n mostr são inici lm
ente biotinil d s se us ndo o ester de biotin N-hidroxisuccinimid em excesso.
Feito isso mostr é incub d com um nticorpo p r o H pteno que está recobri
ndo f se sólid . Nest et p o H pteno biotinil do é c ptur do pel f se sólid
, sendo que biotin livre com lgum s molécul s biotinil d s são l v d s pós
um tempo de incub ção. Posteriormente os imunocomplexos são dissoci dos no pH 1
,0 e solução é post p r re gir frente nticorpos p r o H pteno m rc dos c
om um enzim que é c ptur d por um f se sólid recobert com etrept vidin . A
tivid de d enzim lig d f se sólid é rel cion d diret mente concentr ç
ão de h pteno presente n mostr . Est configur ção só será bem sucedid se o s
ítio de biotinil ção estiver longe o suficiente do sítio onde está o epítopo,
fim de permitir lig ção simultâne d estrept vidin e do nticorpo p r o H p
teno. Oligopeptideos constituídos de 9 minoácidos for m determin dos por este m
étodo em concentr ções inferiores 50 mol. H ptenos pequenos, como Tiroxin ,
podem ser determin dos por este método pen s se for introduzido um “esp ç dor”
entre porção biotinil d e o sítio do epítopo. Este tipo de ens io cheg se
r té 50 vezes m is sensível que os ensáios de competição us ndo os mesmos ntic
orpos m rc dos. b) Ens io idiométrico Neste tipo de ens io mostr é pipet d
em um f se sólid recobert com um nticorpo p r o H pteno ( nticorpo primário
). Após re ção imune ter se complet do, se dicion um nticorpo p r idiotipo
do tipo β, o qual irá se li
ar aos sítios de li
ação primários livres do antico
rpo. Após a lava
em se adiciona um anticorpo para idiotipo do tipo α, que se lig
rá os complexos primários do nticorpo/H pteno. Este nticorpo só não se lig r
á o nticorpo primário d f se sólid se o nticorpo do tipo β já estiver li
ad
o ao anticorpo da fase sólida. O sinal medido é proporcional a concentração de H
apteno presente na amostra. c) Imunoensaios com o epítopo fixado à fase sólida (
SPIE-IA) Esta é uma confi
uração de imunoensaio proposta nos últimos anos para p
equenos Haptenos contendo
rupos amino livres, os quais não fazem parte da estru

tura do epítopo. O hapteno é primeiramente capturado por uma fase sólida reco et
a com anticorpos para o Hapteno. O Hapteno é então covalentemente
 li
ado as prot
eínas da fase sólida, isto é ao anticorpo
 e as proteínas de loqueio. Isto é aco
mpanhado se usando um rea
ente homo ifuncional de li
ação
 cruzada para
rupos am


ino primários, como o lutaraldeído ou disuccimidil su erato. A reação acontece
em condições amenas as quais não rompem o complexo hapteno-anticorpo. A etapa de
desnaturação se
ue com a adição de metanol ou ácido clorídrico, que serve para
dissociar o imunocomplexo e expor o Hapteno imo ilizado a detecção do anticorpo.
O mesmo anticorpo monoclonal, marcado com acetilcolinesterase, é usado da mesma
forma que na detecção do anticorpo. Ensaios deste tipo parecem ser de 70 a 200
vezes mais sensíveis que os ensaios de competição que empre
am os mesmos anticor
pos fixados a fase sólida e um hapteno conju
ado a acetilcolinesterase como marc
ador.
87
d) Ensaios de li
ação de fase líquida (LBA) Neste tipo de ensaio a reação ocorre
em solução. O analito rea
e com excesso de anticorpo marcado com peroxidase. Ap
ós a reação ter se completado, as formas li
adas e livres do anticorpo são separ
adas por cromato
rafia liquida de alto desempenho em uma coluna de
 troca catiôni
ca. A reação enzimática pós coluna é realizada
  se misturando o su strato com o l
íquido que sai da coluna passando em uma o ina, se
uido por uma detecção fluori
métrica. No caso de antí
enos macromoleculares, a separação dos imunocomplexos d
os anticorpos livres pode ser feita com a filtração em
el de uma cromato
rafia
liquida de alta performance, já que a massa molecular do imunocomplexo é muito m
aior que a do anticorpo livre.
DETECÇÃO INDIRETA DE IMUNOCOMPLEXOS Neste caso a molécula carreadora do sinal ou

eradora do sinal, como os radioisótopos, enzima ou marcadores fluorescentes ou
quimioluminescentes, não estão li
ados diretamente a um dos imunorea
entes, mas
estão li
ados de forma não covalente e especificamente ao imunocomplexo assim q
ue a reação se completa. A maior vanta
em dos sistemas empre
ando a detecção ind
ireta é que a mesma molécula reveladora carre
ando o imunorea
ente pode ser usad
a em uma variedade de imunoensaios. Além disso, o uso de sistemas
 de detecção in
direta
eralmente são responsáveis por ensaios de alta sensi ilidade, uma vez qu
e mais moléculas carreadoras de sinal, se li
am ao imunocomplexos do que em ensa
ios onde a detecção do anticorpo está diretamente conju
ado a molécula sinalizad


ora. a) Detecção de imunocomplexos com uma imuno lo ulina marcada Neste tipo de
ensaio o anticorpo de detecção não está
 marcado. Após a formação do imunocomplex
o, um anticorpo marcado para anti
lo ulina é adicionado, este se li
ará as re
iõ
es constantes não variáveis do anticorpo. Esta técnica é especialmente útil quan
do a marcação direta do anticorpo de detecção
 é difícil e resulta na perda de im
unoreatividade. Anticorpos para imuno
lo ulinas de várias espécies, marcados com
moléculas fluorescentes ou enzimas estão disponíveis no comércio a um custo rel
ativamente aixo. Além do mais


 esta confi uração promove
a amplificação do sinal
mais do que se uma imuno lo ulina marcada
 para cada antí eno fosse usada. Em su
ma, uma simples molécula de imuno
lo ulina marcada pode ser usada para detecção
de vários anticorpos da mesma espécie. O pré requisito para a confi
uração acima
é que os anticorpos de captura e de detecção sejam de espécies diferentes, de f
orma que a imuno
lo ulina marcada não reaja com o anticorpo
 de captura fixado no
suporte sólido. Alternativamente, fra
mentos de Fa ou F(a )2, são empre
ados c
omo anticorpos de captura
 junto com anticorpos marcados para a re
ião Fc do anti
corpo de detecção. ) Proteína A
88
A proteína A é uma proteína de 42kDa encontrada na parede celular do  Staphylococ
cus aureus. Ela se li
a com alta afinidade a re
ião Fc das imuno
lo ulinas de vá
rias espécies. Existem 4 sítios de li
ação para os anticorpos, mas apenas dois d
eles podem ser usados simultaneamente.
 A proteína A marcada é útil na detecção i
ndireta de antí
enos imo ilizados em um suporte sólido. Nestes ensaios, um antic
orpo de detecção não marcado é adicionado a fase sólida e então oimunocomplexo
formado é quantificado com a proteína A marcada. A proteína A tam ém pode ser us
ada para a detecção
 de imunocomplexos em ensaios tipo sanduíche,asse
urando que


fra mentos Fa são usados ao invésdo anticorpo total para reco rir o suporte s
ólido. A proteína A não marcada tam ém pode ser usada como ponte entre duas molé
culas de anticorpo, isto é, para a detecção de anticorpo do imunocomplexo e do a
nticorpo marcado.
 A afinidade da proteína A para imuno
lo ulinas depende da clas
se

 da imuno lo ulina e a que espécie ela pertence. Por exemplo, a proteína A tem

loulinas I
G1 de ratos, e tem alta afinidade pelas
aixa afinidade
 para imuno
imuno
lo ulinas de humanos e de coelhos. c) O sistema Biotina-Estreptavidina Con


ju ados de estreptavidina com enzimas como a Fosfatase alcalina, peroxidase ou m
oléculas fluorescêntes
 estão comercialmente disponíveis. Anticorpos podem ser ma
rcados com várias iotinas sem que haja uma perda si
nificativa de sua capacidad
e de se li
ar ao antí
eno. Consequentemente, mais de uma molécula de estreptavid
ina marcada pode se li
ar a cada anticorpo.  Além do mais uma amplificação é intr
oduzida a qual resulta no aumento de sensi ilidade. Como a estreptavidina possui
4 sítios de li
ação para a iotina, ela pode atuar como uma ponte entre duas mo
 
léculas iotiniladas. Os imunorea
entes iotinilados  e a estreptavidina marcada
são estáveis por lon
o período de tempo. O sistema iotina-estreptavidina pode s
er usado para a detecção de imunocomplexos dos se


uintes modos: a) Os antí enos
ou anticorpos de detecção podem ser marcados com iotina. Após a imunoreação ter
se completado, o excesso de rea
ente é removido com uma lava
em e o imunocomple
xo é quantificado pela adição da estreptavidina
 marcada. ) Os antí
enos ou anti
corpos de detecção são marcados com iotina. Após a imunoreação ter se completad
o, o imunocomplexo é colocado para rea
ir com um excesso de estreptavidina não m
arcada. A estreptavidina não


 li ada é removida com uma lava em, e posteriormente

se adiciona umamolécula iotinilada marcada. Ex: Fosfatase alcalina iotinilad
a ou peroxidase iotinilada.  Neste caso a estreptavidina
 é usada como ponte entr
e o anticorpo de detecção iotinilado e a molécula iotinilada marcada. c) A est
reptavidina é posta para rea
ir primeiro com uma enzima iotinilada e forma comp
lexos macromoleculares, os quais envolvem várias moléculas
 fazendo ponte com a e
streptavidina. A proporção de streptavidina e enzima iotinilada pode ser optimi
zada de forma que a estreptavidina não fique saturada e so re pelo menos um síti
o de li
ação para os imunorea
entes iotinilados.
89
d)
Ensaios usando complexos enzima-anti-enzima Neste tipo de ensaio, a molécula
er
adora de sinal são complexos solúveis pré formados de uma enzima com anticorpos
para a enzima (anticorpos policlonais ou monoclonais). Estes anticorpos para enz
ima são da mesma espécie assim como o anticorpo de detecção usado no imunoensaio
. Após a imunoreação ser completada os complexos enzima-anticorpo fazem
 uma pont
e com o anticorpo de detecção ao se usar um anticorpo para imuno
lo ulina. Compl
exos de PeroxidaseAnti preoxidase (PAP) e Fosfatase alcalina-anticorpo são lar
a
mente usados na
imunohistoquímica.
90
CONTROLE DE QUALIDADE NOS IMUNOENSAIOS A finalidade de um imunoensaio é que este
consi
a determinar com precisão a quantidade ou a concentração de analito. Para
os imunoensaios, o termo potência estimada é usado  para estimar a concentração
do analito, por exemplo, M, n
/ml, mUI/ml. A sensi ilidade é definida como a qua
ntidade mínima
 do analito que pode ser detectada
 com precisão.
 Al
umas definiçõe
s de sensi ilidade se referem a posição a soluta ou a su ida da curva de dose-ef
eito do que ao limite mínimo de detecção. A especificidade se refere a capacidad
e do imunoensaio medir unicamente o analito de interesse. O
rau que outros anal
itos rea
em cruzadamente no imunoensaio é que afetam esta especificidade. A exat
idão se refere ao ajuste que ocorre entre a resposta verdadeira e a resposta dad
a pelo imunoensaio. A precisão se refere aos resultados em acordo que aparecem e
m medições repetidas. Nos imunoensaios, a precisão é normalmente expressa como v
ariação intra e inter-ensaio, calculados como coeficiente de variação. Erros esq
uemáticos e erros randômicos Os erros esquemáticos são detectados nos valores re
ais ou exatos em ensaios repetidos. Consequentemente, a inexatidão no imunoensai
o se refere a erros esquemáticos. A validação dos imunoensáios, muitas das vezes
se refere a investi
ação destes erros esquemáticos que podem ocorrer, que devem
ser corri
idos ou eliminados. Com relação aos erros randômicos, estes são os qu
e mais afetam a precisão. Os erros randômicos não podem ser eliminados mas podem
ser minimizados. Os erros randômicos que se acumulam durante o processamento do
imunoensaio, podem ser quantificados estatísticamente e usados para
arantir li
mites de confiança para expressão dos resultados. A avaliação da qualidade envol
ve a determinação de que um imunoensaio está livre de erros sistemáticos assim c
omo a estimativa dos erros randômicos. VALIDAÇÃO DE UM ENSAIO Para se validar um
imunoensaio é necessário se determinar se os valores o tidos com o mesmo estão
precisos e corretos. A validação de umensaio normalmente ocorre em fases. A pri
meira fase é para a avaliação da sensi ilidade e especificidade, a se
unda fase
é para se investi
ar a exatidão do imunoensaio comparando-o com métodos de refer
 
ência. Um o jetivo frequente é o ter resultados do desconhecido com o mínimo de
manipulação
 da amostra. Deste modo a validação do imunoensaio tam ém envolve se
sa er se a determinação dos constituintes da amostra possuem efeito si
nificativ
o no ensaio e/ou a identificação de que tipos de preparação de amostra são neces
sários para se alcançar com exatidão a estimativa de potência. A fase final da v
alidação é limitada a aplicação clínica do imunoensaio, afim de sa er se ele fo
rnece osdados desejados nas condições desejadas. A sensi ilidade do imunoensaio
A sensi ilidade pode ser definida como a quantidade de analito necessária para
produzir
 uma mudança na resposta a qual é si
nificantemente diferente da respost
a o tida na ausência do analito
91
  
(dose zero de analito). Se a sensi ilidade não for aixa o suficiente
 para ser ú
til na aplicação desejada,
 deve-se considerar a produção ou o tenção de outros r
ea
entes. Para se sa er o quão específico é o imunoensaio, inicialmente se monta
um painel com um lar
o espectro de compostos, em uma alta dosa
em, normalmente
de 1.000 a 10.000 vezesmais concentrado do que se costuma
 usar para a monta
em
de uma curva padrão. Su stâncias que apresentam uma ini ição mínima para a li
aç
ão do analito ao anticorpo ouanticorpos, não rea
em cruzadamente de modo si
nif
icativo. Os compostos que ini em a li
ação do analito ao anticorpo em altas dose
s devem ser examinados em detalhes. A estraté
ia típica, é de se construir curva
s de doseefeito para aquele do analito usando
 um teste de similaridade (paraleli
smo). Este procedimento determina se a su stância rea
e de modo semelhante ao do
analito deinteresse e a sua relativa potência. Por comodidade, a reação cruzad
a de uma su stância em particular em um imunoensaio é frequentemente expressa em
percenta
em. Deste modo uma potencia relativa de 0,01 corresponde a 1% de reaçã 
o cruzada. Um outro meio de se expressar a mesma coisa é dizer que a dose da su
stância teste é 100 vezes maior do que a dose de referência do analito, levando
a mesma resposta no imunoensaio. Outra estraté
ia de se determinar a reação cruz
ada envolve a determinação de uma série de reações as quais contém uma quantidad
e fixa do analito de interesse (como uma dose que corresponda a aproximadamente
metade da curva de dose-efeito). Procede-se uma série de reações, aumentando-se

radativamente as quantidades da sustância de teste. A dose da sustância de te

ste que não causa
 alteração si
nificativa na resposta é o tida como a quantidade
máxima da su stância de teste que pode estar presente em uma amostra e não inte
rferir com esta na interação analito-anticorpo. Quando caracterizamos a especifi
cidade de um imunoensaio, é importante que desenvolvamos uma estraté
ia racional
para monitorar a reação cruzada. A fim de ilustrar este ponto, suponha que temo
s um imunoensaio para a dosa
em da Testosterona. Quando construímos ou utilizamo
s um ensaio para a Testosterona, é essencial sa ermos se este ensaio rea
e cruza
damente com outros hormônios andro
ênicos como o 5α-dihidrotestosteron , ndrost
enedion , dehidroepi ndrosteron e
ndrostenediol; met bólitos do ndrogênio como 5α- ndrostenediol, ndrosteron e
etiocol nolon ; percursores esteroid is como colesterol, pregnenolon , progeste
ron , 17-hidroxipregnenolon e 17hidroxiprogesteron ; e esteróides em outr s cl
sses que costum m est r presentes nos fluídos corpor is como estrogeneos, glicor
ticoídes e miner locorticoídes. Se o ens io for us do p r medir Testosteron em
p cientes que poss m est r recebendo esteróides sintéticos, como nticoncepcion
is e glicorticoídes sintéticos, re ção cruz d com est s substânci s t mbém d
eve ser pesquis d . Se o ens io for utiliz do p r o uso em um situ ção específ
ic onde certos compostos estão presentes em lt s concentr ções, é desejável qu
e se demonstre que estes não são c p zes de interferir. Um exemplo disso está qu
ndo se us v o R dio Imuno Ens io (RIA) p r Testosteron p r di gnostic r o e
feito
92
d s prost gl ndin s n produção de ndrógenos, er necessário se demonstr r que
Testosteron podi ser medid com ex tidão n presenç de lt s concentr ções
de Prost gl ndin s. Se um imunoens io p r pequenos peptídeos está sendo desenvo
lvido, re ção cruz d de outros peptídeos com estrutur s semelh ntes deve ser
ex min d . A especificid de dos imunoens ios p r pequenos peptídeos pode norm l
mente ser determin d se ger ndo pequenos fr gmentos peptídicos de um peptídeo s
intético e se ex min ndo re ção cruz d . O mesmo conceito se plic construç
ão de um imunoens io p r hormônios proteícos. Como exemplo temos os ens ios p r
gon dotrofin corionic hum n (hCG). O hCG é composto de du s subunid des d
iferentes, ch m d s de lf e bet . A subunid de lf é comum os hormônios pitu
itários, hLH, hFSH e hTSH. A subunid de bet possui um sequênci de minoácidos
que é muito semelh nte do hLH, únic diferenç é que do hCG possui um se
qüênci dicion l de 24 minoácidos n porção c rboxi termin l. Um investig ção
minucios de um ens io p r o hCG deve lev r em cont re ção cruz d que pode
ocorrer com um série de proteín s hormon is produzidos pel glândul pituitári
nterior e pel pl cent ssim como outros hormônios presentes nos fluídos cor
por is. Um questão post sempre em dúvid , é que porcent gem devemos consider
r um re ção cruz d signific nte? Re ções cruz d s menores que 0,001% (1 em 10
0.000) não são nenhum problem . Altos percentu is devem ser preci dos de cordo
com o c so. Por exemplo, no c so d Testosteron , 5% de re ção cruz d p r out
ro ndrógeno com um estrutur semelh nte, como o 5αdihidrotestosteron , não é m
otivo de preocup ção; n verd de um imunoens io que discrimin estes dois ndróg
enos este nível é muito útil. No ent nto qu ndo o mesmo imunoens io será us do
p r medição só d Testosteron sem sep r ção d o 5α-dihidrotestosteron d
o m teri l. Outro exemplo está se queremos dos r Progesteron dur nte gr vid
ez, sem que tenh mos que sep r r os outros esteróides, nesse c so 1% de re ção c
ruz d é lgo se pens r. T mbém 10% de re ção cruz d do hLH com um kit p r d
etermin ção de hCG em mulheres grávid s é lgo b st nte sério, m s se este kit n
ão for us do p r mulheres grávid s, ele pode ser us do. Como se vê, determin
ção de que percentu l de re ção cruz d é signific tivo, depende d plic ção do
kit e p r que fim di gnóstico se destin . Outro ponto se consider r nos inun
oens ios é qu l epítopo o nticorpo fix do n f se sólid reconhece, pois de co
rdo com isso s beremos se o kit é m is ou menos específico. A ex tidão Outr et
p critic dos imunoens ois se refere su ex tidão, p r est belecer este conc
eito, devemos comp r r os result dos obtidos do novo imunoens io com os result d
os de um método bem conhecido e p droniz do. A escolh de imunoens io p r deter
min r um n lito em p rticul r é norm lmente com o intuito de, p r f cilit r
coloc ção d mostr e m teri is p r re gir. Muitos métodos de referênci são c
omplexos e consomem muito tempo n execução pois c b m envolvendo
93
vári s et p s de m nipul ção. Como medição destes ens ios é feit por métodos qu
ímicos ou biológicos, não há um regr específic p r todos os ens ios. No ent
nto, lgum s consider ções podem ser feit s, m iori dos ens ios p r esteríod
es er v lid d frente ens ios de crom togr fi gás-líquido; imunoens ios p r
proteín s podem ser v lid dos com bioens ios. Qu ndo se comp r os v lores obti
dos no imunoens io e do método de referênci , deve-se ter conhecimento d s limit
ções, ex tidão e precisão do método de referênci . Como substânci s constituint
es d mostr podem influenci r n estim tiv de potênci Em um imunoens io, tud
o que estej presente n mostr diferente do n lito constitui o que se ch m d
e m triz d mostr . M trizes comuns de mostr incluem soro, pl sm , urin , s l
iv , e extr tos de tecidos. Os fluídos corpor is são mistur s complex s de subst
ânci s que podem interromper o imunoens io de vári s m neir s como: interferindo
com lig ção do n lito o nticorpo primário, por competir com o composto ou
de um m neir não específic , por promover um lig nte competidor como um esteró
ide ou proteín s lig ntes de tiroíde, por interferir com os re gentes us dos p r
sep r r form s lig d s e livres e/ou por interferir com o sistem de detecção
(r diométrico, fluorescente ou enzimático). As m trizes que possuem m ior influê
nci nos imunoens ios, norm lmente são observ dos como result dos imprecisos. Po
r exemplo, o uso de imunoens ios p r dos r esteróides no soro ou pl sm lev
result dos imprecisos porque m tirz d mostr contém proteín s de lt finid
de p r estes hormônios. Outros tipos de efeitos promovidos pel m triz são m i
s sutis. Se presentes, estes podem ser evidentes de um modo diferente n nálise
do comport mento d s curv s dose-efeito p r o n lito estud do com um mistur
p drão versus mostr m triz. No ent nto obtenção de curv s dose-efeito sem
elh ntes ou p r lel s não prov que interferênci n mostr se deve o efeito
d m triz presente n mostr . Os testes de simil rid de ou p r lelismo devem s
er interpret dos em conjunto com testes de ex tidão. As estr tégi s p r determi
n r se os efeitos m triz são signific ntes são: i) Comp r r s curv s prep r d s
no t mpão diluente com quel s prep r d s com mostr m triz destituíd do n
lito; ii) Determin r se o umento de mostr do n lito dicion d mostr m
triz pode ser qu ntit tiv mente recuper d (teste de videz); iii) Test r os efe
itos d dição de qu ntid des c d vez m iores de m triz, neste c so m triz re
present um mostr que possui um qu ntid de desconhecid de n lito. No prime
iro e no terceiro c sos, dificuld de em se mont r um curv dose-efeito com o
mesmo tipo de ond (curv s semelh ntes ou p r lel s), é c us de preocup ção. Co
mo form de torn r os testes de simil rid de signific tivos, eles devem ser pli
c dos em vári s mostr s que representem s diferentes cl sses de mostr s que v
enh m ser n liz d s. Existe um teste que permite um mostr desconhecid pod
e ser test d em um nível com um dose simples onde liquot s d mostr são mis
tur d s com qu ntid des crescentes do n lito. A
94
qu ntid de de n lito n s mostr s serem mistur d s deve equiv ler qu ntid d
e de n lito presente n mostr origin l m is qu ntid de ser dicion d . Es
te teste é rel tiv mente fr co p r determin ção dos efeitos de m triz, pois
m triz é dicion d em um nível e mostr é norm lmente mistur d com o n li
to puro. A demonstr ção de que qu ntid des dicion is de mostr m triz re gem d
e modo semelh nte o n lito p drão são m is convincentes. Se for encontr do o e
feito de m triz, o imunoens io deve ter seu protocolo lter do fim de evit r e
st interferênci . Est revisão pode incluir o prep ro de um nov curv de c li
br ção com um m triz semelh nte desconhecid m s destituíd do n lito, ou po
de envolver et p s dicion is no prep ro d mostr . Como s ber se o imunoens io
fornece um respost confiável A f se fin l d v lid ção de um imunoens io, é p
roceder um teste com o mesmo se l nç ndo mão de mostr s selecion d s p r t l.
Por exemplo, supondo que o teste sej p r determin ção do hCG como confirm ção
de gr videz, m s se desej utiliz -lo p r determin ção do hCG produzido em l
guns tumores. P r isso mostr s do soro de homens e mulheres não grávid s devem
d r result dos neg tivos. Já s mostr s de mulheres em diferentes et p s d gr
videz devem ser positiv s e s concentr ções obtid s devem ser equiv lentes o
do método de referênci . Amostr s de p cientes que present m tumores produtores
de hCG devem ser positiv s e mostr s de p cientes com tumores, m s não produto
res de hCG devem ser neg tiv s. Nest f se de v lid ção do imunoens io, escolh
de mostr s de referênci deve é muito import nte, já que os result dos oriund
os de t is mostr s serão us dos p r est belecer os v lores norm is do ens io e
os limites de detecção do mesmo. OUTRAS MEDIDAS PARA GARANTIR QUALIDADE Com rel
ção mostr A colet d mostr t mbém ssegur o bom controle de qu lid de,
el pode fet r ex tidão e interpret ção dos result dos. As mostr s ssim q
ue entr m no l bor tório devem ter identific ção com d dos precisos, est r co
ndicion do de form propri d , sem v z mentos e nem est r com m teri l em f lt
p r s nálises que se desej f zer. Em ger l s interferênci s rel tiv s o m
teri l envolvem o m teri l com hemólise, lipêmico ou com excesso de bilirrubin
. No c so do soro ictérico é dificil se rejeit r o mesmo pois ger lmente se orig
in de lgum est do p tológico do p ciente. Já o m teri l hemolis do, n m iori
d s vezes envolve colet m l re liz d ou sep r ção do soro ntes d retr ç
ão complet do coágulo e por isso se recomend inspeção do colet dor. Qu nto
o soro lipêmico, já foi descrito que se for feit centrifug ção lt velocid
de do soro, bo p rte dest pode ser removid .
Com rel ção o condicion mento do kit O kit deve ser condicion do n s condiçõe
s dequ d s p r preserv ção do mesmo, sempre seguindo s recomend ções do f bri
c nte. Um medid que muitos não tem em mente, por não
95
conhecer o funcion mento dos refriger dores, é o condicion mento de kits em gel
deir s do tipo frost-free, este tipo de equip mento não é o ide l devido gr n
de v ri ção de temper tur p r os degelos const ntes, que ocorre neste. Est c
r cterístic dos equip mentos frost-free, f z com que vid útil do kit diminu
. T mbém medid s como condicion r o kit com d t de cheg d deste no l bor tó
rio g r nte o controle do mesmo. Antes de se us r um kit novo deve-se coloc r
d t de bertur do mesmo e test -lo com lgum s mostr s de v lores conhecidos
e se est belecer um curv dose-efeito fim de se observ r se não há diferenç s
signific tiv s entre o kit ntes us do e o novo. Deve-se t mbém observ r qu l
id de d águ re gente, o Comite Intern cion l de P drões p r L bor tórios Clín
icos cl ssific águ em três tipos, s ber I, II e III. A águ tipo III é us
d p r l v gem de vidr ri e rins gem primári , do tipo II é us d p r pre
p rções de cor ntes e re gentes serem estereliz dos e, por fim, águ do tipo
I que deve ser us d p r os procedimentos l bor tori is, prep ro de soluções p
drão, eletroforese e imunoens ios. A t bel b ixo present s c r cterístic s
que c d tipo de águ deve ter. Especific ção Nível máximo Tipo I de 10 Tipo II
1000 Tipo III Não signific tivo
b ctéri s (CFU/ml) pH Resistivid de (MΩ cm 25 C) Máximo de silic tos 0,05 0,1
1.0
o
Não signific tivo mínim 10 (em linh )
Não signific tivo 1,0
5,0 8,0 0,1
(mg de SiO2 /L) Cont min ntes orgânicos M teri l p rticul do P ss r por filtro d
e Não signific tivo Não signific tivo
c rvão tiv do Não deve ser superior Não signific tivo 0,22μm Não si
nificativ
o
   
Com relação aos parões Existem três tipos  e pa rão que costumam ser usa os no
laboratório,
 os pa rões primários, secun ários e os materiais
   e referência. Os 
pa rões primários são
 aqueles em que há um certa
 quanti a e e um analitoe po e
ser
 usa
 o para se  eterminar a concentração ireta e tem  um coeficiente e ativ

ua ou em soluçõ
i a e e 1. Os pa rões primários normalmente  são prepara
 os em á  
es proteícas com solventes

 or ânicos. Os pa rões
 secun ários são etermina
  os em
comparação com um pa rão e valor já conheci o realiza o em  um méto o e referê

ncia conheci o.Os materiais e referência, são aqueles usa os na calibração e
aparelhos, vali ar um ensaio ou estabelecer valores
 aos materiais. Os materiais
e referência po em ser vacinas com a quanti a e
96
    
e antí
eno expressa em uni a es ou esferas elátex, muito usa
 as para a quanti
ficação e partículas.
 Outro tipo e material ereferência
 po em ser os materia
is certifica
  os, são materiais váli
 os para uma etermina a técnica e são acompa
nha os a ocumentação apropria a quanto a seu uso.
97
   
INTERFERÊNCIAS NOS  IMUNOENSAIOS
 A exati ão e um imunoensaio po e ser comprometi 
a por uma varie a e e substâncias interferentes.   Esta
  interferência
 po eser p
ositiva ou ne
ativa e po e variar em ma
nitu e epen eno a concentração a sub
stância
  interferente presente  na amostra. 
Estas fontes e interferência po em se
r evi o a reação cruza a, anticorpos en ó enos, antí
enos mascaraos, interferê
  
ncia com os mecanismos in ica ores (como inibi ores enzimáticos nos imunoensaios
que usam enzimas) e ao efeito matriz.
    
Detectan o as interferências
 A etecção e uma  interferência
 po e ser muito ifí
cil, pois esta po e promover a os  sem a evi a exati ão. No  entanto,nem sempre 
nos sabemos a real concentração o analito
  em uma amostra  esconheci a, e este 


mo o não  temos base para jul ar a exati ão e umresulta o. A melhoroportuni a
e para etectar e caracterizar interferências é urante a avaliação e um ensai
o.
   
Detectan o interferências
  urante a avaliação
 e um ensaio Várias  análises
 e ro
tinas executa as urante a avaliação e um ensaio permitem a etecção e interfe
rências, a estraté
ia é i entificar amostras  com prováveis interferências
 presen
tes e então caracteriza-las ou no mínimo   eterminar em que con ições se
   suspeita
que
 ainterferência aparece. Em estu os e comparação  (se utilizan
 o e ois mé
to os e análise), amostras apresentan  o resulta os inespera os,
  são aquelas pos
síveis e ter um interferente. A fim e aumentar as  chances  e etectar
 estasam
ostras, eve-se incluir amostras e pacientes com oenças efí
a o e baço e e
pacientes com anticorpos interferentes como  o Fator Reumatói  e, Anticorpos
 Anti
Nuclearese Anticorpos para Ratos. Após i entificar  resulta os fora os limites
para estu
 os futuros e remover  estes  pontos as análises estatísticas, um coefic
iente  e baixa correlação  po e in icar a interferência que está contribuin o par
a a ispersão.
 A fim ei entificar
 as possíveis interferências presentes, as am
ostras po em ser coloca as em ois
rupos, aqueles com o sinal mais positivo e a
queles com

 o sinal mais ne ativo. É importante ter em mente que a interferência 
está sen  o feita em um méto o por comparação;  se a interferência
 afeta os ois m
éto os e forma equivalente
 
ela não po e ser  etecta a pelo  estu o comparativo.
Em estu  os e lineari a e, eralmente cita
  os como  testes e paralelismo como no
caso osimunoensaios,a não lineari a e sobre a iluição  normalmente
 in ica a
presença e al
um tipo e interferência, este efeito é iminuí  o pela iluição.

Geralmente uma ou mais   amostras com uma alta concentração e analito
 é iluí a c
om o solvente recomen  a o ou uma amostra com  baixa concentração o analito. Em s
uma
 estas amostras  i entifica as pelo
 méto o a comparação como possivelmente te
n o interferentes  evem ser retesta as após a iluição. É bom ressaltar quese  a
não lineari a e reflete  a presença e substâncias interferentes, a lineari a e
não exclui a presença estes.
98
        
Em estu os e recuperação,   uma etermina a quanti a e o analito  puro é aplica a
em uma pequena quanti a e a amostra com alta concentração o analito,  e esta a
mostra
  é analisa
 a a fim e saber
 se é possível
 recuperar em resulta  o, a quanti
a e a mais o analito a iciona a (aumento e concentração).   Resulta os iferent
es aqueles que apresentam100% e recuperação  po em in icar a atribuição incorr
eta os valores o calibra orou  a presença   e uma substância  interferente. Assi

m como nos estu os e lineari  a e, os
 estu os e recuperação evem ser realiza
 o
s com amostras i entifica as no méto o e comparação e, se possível conten o al

uma substância interferente. É claro  que os interferentes
 mais
 comuns como lipem
ia, ictericia e hemólise, também evem ser incluí os no estu o. Al
umas vezes os
   
efeitos estes possíveis interferentes po em ser observa osquan o se faz o est
u opor comparação e méto os. Se estas amostras forem fora os limites é possív 
el e que não haja interferência ou que ambos ensaios apresentem o mesmo
rau e
interferência.
 Sempre
 que espécimes com substâncias interferentes  são i entific
a os, evemosobter a os  laboratoriais e informações
 clínicas  o paciente,
  espe
cialmente em oenças a
u as e crônicas  e quan o se está fazen  o uso e me icamen
tos.
 Esta informação oferece in ícios para a provável causa e interferência  alé
m o queamostras e outros pacientes  com os
 mesmos in ícios po em ser obti as p
araestu os comparativos e assim aju ar a i entificar
 a substância
 interferente. 
Mu anças no
rau e interferência numa  série e amostras o
mesmo  paciente
 po e
m ser compara as com o curso clínico o paciente e com a osa em o me icamento, 
o que fornece in ícios  para a causa a interferência.  Finalmente, a tentativa
eseparar o analito a substância interferente ou
êneas
   eseparar formas hetero

o analito po em ser realiza as por vários méto os e extração, cromato rafia o
u eletroforese.
   
Detectan o inteferências urante  a rotina  Durante
 uma rotina não se tem i éia e
que substância está causan o a inexati  ão os resulta  os. Normalmente   a única i
n icação que se tem é que os resulta os não estão e acor o com os a os clínico
s o paciente.
 É importante lembrar que a substânciainterferente  po e provocar
resulta os falsamente normais enquanto  que o resulta o real
  po e ser mais alto o
umais baixo. A avaliação inicial as interferências 
po e i entificar al
umas co
n ições clínicas ou certas
  terapias com ro as nas quaisainterferência é comum
. Este tipo e resulta o eve ser examina o com mais cui a o. Al
umas vezes méto
   
os automatiza
  os fornecemresulta os e leitura zero, a qual, se for atípica, p
o e ser evi  o a presença
 e um interferente. Em ensaios que fornecemuma alta f
reqüência e resulta os anômalos, se faz necessário testar ascausas e interfer
ência prováveis, como testar a li
ação não específica e proce er uas iluições

as amostras.
99
   
REAÇÕES
  CRUZADAS E ANALITOS
   HETEROGÊNEOS Um bom imunoensaio epen e e sua sensi
bili a e e especifici a e a li
ação antí
enoanticorpo. Emal
uns casos esta esp
ecifici a e é comprometi a porquemoléculas com epítopos i ênticos ou semelhante
s conse
uem se li
ar ao rea
ente e captura, promoveno o que chamamos e reação
 
cruza a. Os  problemas e as soluções para as interferências 
associa
  as as múltip
las formas o analito  (formas isoméricas e
 parcialmente e ra a as), são semelha
ntes à aquelas causa as pela reação cruza a.
   
Fontes e Reação Cruza  a As fontes e reação  cruza a são
tantas  que não nos é po
ssível escrever
 to as, por isso
 serão cita  as apenas al umas as principais. Re
ação cruza a com analitos
ran es Para
ran  es analitos como proteínas a reação
cruza a se eve principalmente a presença e múltiplas  proteínas com estrutura s
emelhante ou a proteínas hetero
êneas,  um exemplo isso
  está nos hormônios
lico
protéicos como o hCG, LH e FSH, evi o a sua subuni a e α comum em todos. Atu lm
ente est s re ções cruz d s pr tic mente for m elimind s devido o desenvolvime
nto de ntissoros p r subunid de β. Atualmente tam ém já se conhecem  múltiplo
s variantes destes hormônios  protéicos como no caso do hCG, onde se sa e que exi
stem formas livres das su unidades β, variantes do car ohidrato e varias formas
parcialmente de
radadas, tam ém já se conhecem os precursores destes hormônios q
ue estão presentes no soro e as variantes
enéticas que podem vir a estar presen
tes. Por causa disto, al
uns epítopos podem não estar presentes e isto pode alte
rar o resultado do exame. Exemplo disto esta no LH, que se tiver formas
enética
s diferentes no soro, em al
uns ensaios ele não é detectado.  A hetero
eneidade d
e uma proteína e as variações de sua relativa distri uição em diferentes formas
em amostras diferentes do mesmo paciente e em diferentes pacientes em datas dife
rentes,
 podem causar diferenças si
nificativas na exatidão  dos resultados. Este
pro lema pode ser ainda maior se o analito usado nos cali radores não for o mesm
o presente no soro dos pacientes.  Quando isto acontece, a amostra não pode ser d
iluída em paralelo com os cali radores, pois isto leva ao erro através do limite
analítico. Um exemplo disto está ao se dosar as cadeias leves de imuno
lo ulina
s monoclonais (proteína de Bence Jones) em uma urina, como existem diferentes ca


li radores, com diferentes afinidades para um tipo

de cadeia leve,  se a imuno lo
ulina da urina não for a mesma, podemos ter dosa ens acima ou a aixo do esperad
o. Reação cruzada com analitos pequenos Os analitos pequenos podem ser hormônios
não protéicos, vitaminas e dro
as como exemplo citamos al
uns hormônios esteroí 
dais que apresentam uma estrutura muito  semelhante e possuem múltiplos meta ólit
os com estrutura semelhante. Isto aca a se refletindo nos ensaio de dosa em de

100
 
esteroídes na urina, devido a presença destesmeta ólitos. Por exemplo, a Ciclos
porina A possui uma quantidade enorme de meta ólitos, que mesmo que se use um en


saio com anticorpos monoclonais para capturar a Ciclosporina, al
uns destes meta

ólitos podem interferir com o ensaio. Outro
  exemplo está na dosa em do Feno ar
ital, se na amostra tiver tam ém o Pento ar ital, este pode interferir com a exa
tidão do resultado dando valores mais altos. Outro exemplo, está quando dosamos
anfetaminas, se o paciente estiver
 tomando medicamento como clopromazina, ou ado
çantes com ciclamato, os meta ólitos destes podem interferir com o resultado, da
ndo um valor maior do que o existente. Reações cruzadas com moléculas em estádos
patoló
icos Em casos como doenças renais ou hepáticas, a concentração de molécu
las que podem rea
ir cruzadamente
 em um ensaio pode estar aumentada, isto porque
estas
eralmente são meta ólitos do analito e tam ém porqueo fí
ado e o rim te
m participação na produção e excreção destes analitos. Nós o servamos maior inte
rferência na dosa
em de dro
as quando temos doenças que afetam o fí
ado e o rim.
Interferências positivas nos ensaios para Teofilina e Fenitoina ocorrem em paci
entes com falha renal. Nos ensaios para di
oxina se o serva a interferência do F
ator Imunorreativo Parecido com di
oxina que aparece em pacientes com doença ren
al, hepática, mulheres
rávidas ou neonatos. No caso de antí
enos
licoprotéicos

as mudanças na doença se devem
eralmente a pequenas

divisões no car ohidrato.


Por exemplo a concentração do Antí eno Carcioem rio ênico (CEA) pode aumentar de
vido ao câncer coloretal ou doença do fí
ado e as diferenças na divisão do car o
hidrato são diferentes nos dois casos. Al
umas vezes mudanças relacionadas a div
isão dos car ohidratos de
licoproteínas podem ser usadas para o dia
nóstico dif
erencial como acontece quando se usa a transferrina deficiente de car ohidrato p
ara o dia
nóstico de alcoolismo ou, como no caso em que a Concavalina A específi
ca prostática é utilizada para o dia
nóstico diferencial entre o câncer prostáti
co e o da hiperplasia prostática eni
na. Reação cruzada com anticorpos monoclon
ais Nem sempre os anticorpos monoclonais conse
uem ser totalmente específicos, p
ois moléculas que apresentam epítopos com alto
rau de homolo
ia ao epítopo do a
nalito, conse
uem competir com o analito e assim falsear os resultados esperados
. Exemplo disso ocorre nos “kits”
 que utilizam anticorpos monoclonais para a cap
tura da ciclosporina onde meta ólitos desta podem rea
ir com os anticorpos de ca
ptura.
REDUZINDO AS REAÇÕES CRUZADAS A exatidão de um imunoensaio depende da eliminação
ou da redução da reação cruzada de compostos presentesna amostra a ser analisa
da. O uso de anticorpos monoclonais já ajuda a reduzir astante esta reação cruz
ada, no entanto, em al
uns casos isto não elimina de vez o pro lema. Al
umas vez
es temos de lançar mão de imunoensaios com dois sítios de captura, pois como est
es ensaios capturam dois epítopos diferentes, isto ajuda a reduzir a reação cruz
ada. Infelizmente os
101
ensaios com dois sítios de captura existem apenas para moléculas que sejam
rand
es o suficiente para que se possa haver o reconhecimento de dois epítopos difere
ntes. Separação de li
antes antes de efetuar o imunoensaio Outra forma de se evi
tar as reações cruzadas é se efetuando a separação de li
antes inespecíficos ant
es de se proceder a reação. Para tal devemos conhecer as propriedades fisicoquím
icas da molécula
 que possa causar a reação cruzada, tam ém diferenças de tamanho
, car
a, solu ilidade e li
ação protéica é que irão determinar a forma de se pro
ceder a separação. Esta separação pode ser al
o simples de ser feito como a extr
ação or
ânica feita para o cortizol presente na urina ou al
o mais sofisticado c
omo o uso da cromato
rafia
 liquidade alta performance (HPLC) para separar a di

oxi enina de seus meta ólitos. Tam ém pode-se fazer uso da filtração em
el ou u


ltrafiltração, como pode

 ser feito na separação de hormônios licoprotéicos como
o hCG, LH e FSH das su unidades α livres dos mesmos. Outro exemplo está n modi
fic ção químic que se pode f zer com s substânci s que poderi m interferir com
re ção. Exemplo disto está n destruição do pentob rbit l com N OH p r que e
ste não interfir com dos gem do fenob rbit l. As vezes o problem de um re ç
ão está t mbém no controle d temper tur , se um re ção for incub d por pouco
tempo, isto pode f zer com que prob bilid de de contecer re ções cruz d s sej
m ior, exemplo disto ocorre nos ens ios p r esteroídes. Além do tempo de incu
b ção é t mbém import nte ter cuid do com temper tur fim de reduzir possi
bilid de de ocorrer re ções cruz d s. Além disso, const nte de equilíbrio d r
e ção v ri de cordo com temper tur e s vezes substânci que re ge cruz d
mente tinge o equilíbrio num temper tur diferente d quel em que o n lito
tinge.
Bloque ndo re ção cruz d A re ção cruz d t mbém pode ser bloque d nos ens i
os onde se desej dos r nticorpos específicos p r determin do ntígeno de pelo
menos du s form s. Num como form de sep r r os nticorpos pouco específicos,
se dicion o soro substânci s c p zes de re gir cruz d mente. Isto se b sei n
propried de de que nticorpos pouco específicos se lig m melhor s substânci s
que re gem cruz d mente do que o ntígeno específico. Exemplo disto está n re
ção de FTA-ABS onde nós f zemos dsorção do soro se dos r nticorpos p r o
T. p llidum, neste c so se dicion o soro treponem s s prófit s como form de
bloque r os nticorpos inespecíficos. T mbém podemos bloque r um re ção cruz d
se dicion ndo nticorpos específicos p r o gente que re ge cruz d mente e
ssim f zer com que este gente não interfir n re ção. Exemplo disto está n d
ição de nticorpos p r cortizon no soro do p ciente onde se v i f zer dos
gem do cortizol.
102
ANTICORPOS HETERÓFILOS E ANTICORPOS PARA ANIMAIS Anticorpos heterófilos são nti
corpos c p zes de re gir com um gr nde qu ntid de de ntígenos. Historic mente
eles for m definidos como nticorpos d cl sse IgM que p recem n mononucleose
infeccios e que se lig m hemáci s de c rneiro. Estes nticorpos podem ser rem
ovidos pel dsorção com hemáci s de boi m s não com célul s do rim de porco d
Índi . Aproxim d mente 90% dos dolescentes e dultos jovens present m nticorp
os heterófilos. Atu lmente todos nticorpos c p zes de interferir com os imunoen
s ios são ch m dos de nticorpos heterófilos, ou nticorpos heterofílicos ou in
d de hetero nticorpos. Os hetero nticorpos englob m nticorpos idiotípicos, F t
or Reum tóide e nticorpos multiespecíficos. O mec nismo de interferênci dos he
tero nticorpos é o mesmo mec nismo de interferênci que ocorre com nticorpos p
r nim is. Estes nticorpos p r proteín nim is podem surgir como respost o
tr t mento feito com soroter pi prévi , como plic ção de soro nti-ofídico,
pois este soro é produzido em c v los, ou em pesso s que lid m muito com nim i
s como os tr t dores. Deve-se de preferênci ter idéi de que nticorpo interfer
ente está presente n mostr fim de se proceder dsorção do mesmo. É bem ve
rd de que os nticorpos produzidos em lgum doenç s são difíceis de serem ident
ific dos e removidos e por isso podem interferir com os ens ios de dois sítios d
e c ptur , ens ios de nefelometri e turbidimetri .
A N turez dos Hetero nticorpos É import nte se conhecer os tipos de hetero ntic
orpos como form de tent r evit r interferênci que eles podem produzir.
Anticorpos Poliespecíficos Estes são nticorpos c p zes de re gir com um v ried
de de ntígenos que presentem estrutur químic , form ou c rg semelh nte. Ge
r lmente é difícil de est belecer qu ndo estes nticorpos estão interferindo n
re ção. Em ger l os nticorpos poliespecíficos são nticorpos que present m fi
nid de p r se lig r componentes celul res semelh ntes como membr n celul r o
u estrutur s nucle res. Este tipo de nticorpo é muito observ do no lupus eritem
toso sistêmico, onde temos produção de nticorpos poliespecíficos p r DNA. T
mbém temos presenç de nticorpos poliespecíficos n tuberculose onde estes p
odem se lig r o DNA de fit simples ou dupl , polinucleotídeos e c rdiolipin .
No c so dos nticorpos do F tor Reum toíde que ger lmente são d cl sse IgM este
s podem se combin r com DNA dupl fit , tireoglobulin , insulin , toxoíde tetâni
co e lipopoliss c rídeo. N s infecções por M. lepr e observ -se produção de n
ticorpos polire tivos p r mitocondri , DNA dupl fit , proteín s do citoesquele
to e cetilcolin .
103
Est poliespecificid de dos nticorpos p rece ser porque os nticorpos são produ
zidos p r reconhecer um sítio de lig ção m ior do que o necessário p r se lig
r um simples epítopo e, por isso c b m se lig ndo outros lig ntes. A produç
ão destes nticorpos heterófilos t mbém pode ser explic d pel form como reg
ião v riável dos nticorpos é mont d , se record rmos mont gem d molécul de
nticorpo, veremos que et p fin l dest envolve o re r njo cromossom l e tr
nsloc ção de genes, onde os introns são excluídos com isso, temos produção de
diferentes tipos de nticorpos.
O F tor Reum tóide O F tor Reum toíde é n verd de um grupo de uto nticorpos qu
e se lig m múltiplos determin ntes ntigênicos n porção Fc d IgG. Se supõe q
ue os F tores Reum toídes poss m ser ger dos como nticorpos nti idiotipos. Ass
im como outros nticorpos os nticorpos p r f tor reum toíde present m diferen
tes subcl sses que podem ser poliespecíficos, se lig r DNA dupl fit , tireogl
obulin , insulin , toxoíde tetânico, lipopolis c rideo e DNA em form de histon
Mec nismo de Interferênci dos hetero nticorpos e nticorpos p r proteín nim
is Os hetero nticorpos podem c us r interferênci pelos três mec nismos descrito
s b ixo e os nticorpos p r proteín s nim is podem promover interferênci p
elos dois primeiros: i. Agreg ção de imunoglobulin s. Nos ens ios de dois sítios
de c ptur o nticorpo interferente f z um lig ção cruz d (um ponte) entre o
nticorpo de c ptur e o de detecção n usênci do n lito. Nos ens ios que us
m dispersão de luz, o nticorpo interferente c b ument ndo o t m nho do im
unocomplexo precipit nte. Este tipo de interferênci c b por elev r o result d
o d concentr ção de n lito. ii. Bloque ndo o sítio de lig ção. Este ger lmente
ocorre com os ens ios do tipo competitivo, lev ndo result dos f ls mente elev d
os do n lito. Os ens ios de dois sítios de c ptur podem t mbém ser bloque dos.
Se não houver um excesso do nticorpo de c ptur , isto pode lev r result dos
f ls mente b ixos ou neg tivos. iii. Lig ção poliespecífic o ntígeno de c ptu
r . Neste c so isto pode ocorrer em ens ios us dos p r se dos r os níveis de n
ticorpos endógenos, e pode lev r result dos com v lores inferiores ou superior
es o esper do.
Ens ios de dois sítios de c ptur A interferênci m is comum que ocorre neste ti
po de ens io é que o nticorpo heterófilo ou p r proteín nim l se lig o nt
icorpo de detecção, e o se f zer dição do nticorpo de detecção este c b s
endo lig do pelo nticorpo interferente t mbém. Isto é que c b lev ndo resul
t dos f ls mente elev dos. Est lig ção do nticorpo interferente pode ocorrer p
el inter ção d porção F b
104
do nticorpo interferente com F b do nticorpo de c ptur e/ou detecção, ou po
de ocorrer pel inter ção d porção F b-Fc. Por exemplo, o F tor Reum tóide c us
inter ção F b-Fc, e nticorpos p r idiotipo c us m inter ção F b-F b. É b
om lembr r que est inter ção pode ocorrer mesmo sem presenç do n lito.
Ens ios competitivos Os ens ios competitivos de f se sólid podem sofrer interfe
rênci dos nticorpos heterófilos ou p r proteín s nim is devido o bloqueio q
ue ocorre o sítio de c ptur do nticorpo. Já foi observ do que ens ios deste t
ipo são menos fet dos que os ens ios de dois sítios de c ptur devido lt f
inid de que os ntígenos m rc dos e não m rc dos possuem p r lig ção o sítio d
e lig ção. Norm lmente gr ndes qu ntid des de nticorpos interferentes são os qu
e c us m problem s, isto pode ocorrer se, por exemplo, for us d um gr nde qu n
tid de de mostr . Exemplo disto ocorre nos r dioimunoens ios p r α-fetoproteín
que us m gr nde qu ntid de de soro e possuem longo período de incub ção, ocorr
endo result dos f lso positivos qu ndo o soro possui gr nde qu ntid de de ntico
rpos heterófilos. Dependendo do tipo de nticorpo p r proteín nim l presente
interferênci pode ser ind m ior do que que ocorre com nticorpos heterófi
los. T mbém já foi descrit interferênci neg tiv nos ens ios de c ptur de f
se líquid . Nos ens ios competitivos em que se us dois nticorpos t mbém pode
ocorrer interferênci neg tiv , já que há form ção de imunocomplexos do nti
corpo interferente com os dois nticorpos do imunoens io.
Ens ios de dispersão de luz Qu se não há rel tos de interferênci neste tipo por
dois princip is motivos, primeiro neste tipo de ens io form s poliméric s do n
tígeno ger lmente promovem v ri ções mínim s, segundo, s técnic s de dispersão
de luz tem sido us d s p r nálise de substânci s presentes em gr ndes qu nti
d des (medid s em miligr m s), o que difere dos ens ios competitivos que medem q
u ntid des pequen s. No ent nto em soros com ltos níveis do F tor Reum tóide (F
R) pode ocorrer interferênci , em ger l est se deve form ção do complexo Ig
M-FR com o nticorpo de detecção do ens io. T mbém o soro contendo lt s concent
r ções de IgG e IgM-FR, o suficiente p r form r imunocomplexos circul ntes, e c
rioglobulin s, podem interferir nos ens ios de dispersão de luz. Os imunocomplex
os circul ntes podem ser precipit dos com dição de Polietilenoglicol (PEG) e
ssim f cilit inter ção ntígeno nticorpo.
Ens ios us ndo o ntigeno fix do f se sólid p r detecção de nticorpos Mui
tos ens ios como queles us dos p r detecção de nticorpos nti-nucle res (AN
A), e nticorpos nti tiroide nos, us m ntígenos p r f zer c ptur de ntico
rpos específicos em conjunto
105
com nticorpos p r imunoglobulin hum n p r detecção do nticorpo específic
o. Anticorpos poliespecíficos podem interferir nestes ens ios por competir com
nticorpos específicos p r lig ção o ntígeno fix do, ou se lig r proteín s
vizinh s o ntígeno. Est lig ção proteín s vizinh s o ntígeno ocorre qu n
do o “kit” us célul s ou fr ções celul res n f se sólid p r c ptur do nt
ígeno, isto porque os nticorpos poliespecíficos possuem finid de p r componen
tes semelh ntes estrutur de membr n e constituintes celul res. Estes nticor
pos poliespecíficos podem p recer em qu ntid des v riáveis junto com os nticor
pos específicos que desej mos medir. Como o nticorpo de detecção m rc do não co
nsegue diferenci r entre o nticorpo específico (o que desej mos encontr r) e o
poliespecífico, isto pode lev r result dos f lso positivos.
RECONHECENDO ENDÓGENOS
E
REDUZINDO
A
INTERFERÊNCIA
DOS
ANTICORPOS
É necessário s ber o tipo de ens io que est mos us ndo p r tent r reduzir est
interferênci , se é um ens io onde se desej detect r o ntígeno, ch m do de ens
ios p r ntígenos, ou se é um ens io p r detecção de nticorpos, ch m do de e
ns io p r nticorpos.
Interferênci Provoc d Por Anticorpos Endógenos Técnic s p r identific ção de
um soro suspeito Como os ens ios competitivos são menos sujeitos re ções cruz
d s, é interess nte se proceder comp r ção de um ens io com este princípio com
um ens io de dois sítios de c ptur . Se o ens io de dos sítios present r um v
lor elev do em rel ção o método competitivo, é porque está ocorrendo interfer
ênci . Alguns p cientes podem present r interferênci por nticorpos heterófilo
s com m ior freqüênci que outros, isto contece com p cientes com doenç s gud
s e crônic s como infecções por micob ctéri s, endoc rdite b cteri n , doenç u
toimune, infecções por Klebsiell , etc. Estes p cientes present n níveis elev d
os de FR e ANA.
Detect ndo presenç de Anticorpos Heterófilos e Anticorpos p r Proteín s Anim
is A presenç deste tipo de nticorpo em um p ciente pode reduzir eficáci de
um imunoter pi e t mbém lev r os imunoens ios express rem result dos f lso
positivos ou neg tivos. Existem ens ios p r detecção deste tipo de nticorpo
como o ELISA, em que nticorpos monoclon is ou policlon is de r tos são us dos p
r c ptur r e detect r estes no soro suspeito. Estes nticorpos t mbém podem se
r detect dos se us ndo crom togr fi líquid de lt perform nce ou outr s téc
nic s de detecção de imunocomplexos como um mistur com nticorpos de r to com
o soro suspeito de conter nticorpos heterófilos e/ou nticorpos p r proteín
nim l.
106
No ent nto isto nem sempre elimin interferênci , pois nticorpos IgM-FR, por
possuírem diferentes idiotipos podem ind continu r interferindo n re ção. Neu
tr liz ção de nticorpos em ens ios p r ntígenos Em ens ios onde o result do p
ositivo pode ser problemático p r o p ciente, como queles p r detecção do v
írus d hep tite B e C ou do HIV, f z-se necessári incluir um et p de neutr l
iz ção de nticorpos ssim como um mec nismo de redução de interferênci s. Isto
pode ser feito d seguinte form , depois que se re liz o ens io com o soro do p
ciente, e este presentou o result do positivo, se peg um pequen liquot do
soro do p ciente e procede-se o tr t mento deste com dição do nticorpo exóg
eno p r o ntígeno. Por exemplo, se o teste é p r c ptur do ntígeno s do vír
us d hep tite B (HBsAg), se dicion nticorpo p r este ntígeno no soro do p
ciente. Deste modo os ntígenos do soro do p ciente serão neutr liz dos, posteri
ormente se repete um novo teste com o soro tr t do, deste modo o ntígeno não se
lig rá n f se sólid , m s se tivermos nticorpos interferentes (como o FR) ele
s se lig rão n f se sólid e promoverão o result do f lso positivo. É import nt
e ress lt r que os nticorpos de neutr liz ção us dos devem ser de hum nos ou ch
imp nzé, pois os nticorpos heterófilos hum nos não se lig m estes nticorpos.
T mbém qu ndo se tr t d pesquis de ntígenos vir is, deve-se us r um lt c
oncentr ção de nticorpos de neutr liz ção p r os subtipos vir is. Reduzindo
Interferênci em Ens ios de Dois Sítios Neste c so temos o tr t mento imunológic
o ou não imunológico como form de reduzir interferênci . No método imunológic
o, l nç mos mão de imunoglobulin s não re gentes p r c ptur r os nticorpos int
erferentes, no ent nto nem sempre est técnic g r nte redução d interferênci
, s vezes se f z necessário o uso de um mistur de imunoglobulin s não re gen
tes de diferentes espécies como form de promover lig ção dos nticorpos inter
ferentes est s. Outr s técnic s imunológic s de reduzir interferênci inclue
m: i. Uso de fr gmentos F b p r promover c ptur do nticorpo interferente. i
i. C ptur com nticorpos produzidos em du  s espécies diferentes. iii. Uso combi
n do d β-
alactosidase conju
ada com F(a )2 e I
G policolonal ou I
G monoclonal
polimerizada das mesmas espécies usadas para produzir os anticorpos usados nos
ensaios. iv. Uso de anticorpos de
alinha, que parecem não rea
ir com o FR human
o. Quanto as técnicas não imunoló
icas, estas requerem uma etapa de pré-tratamen
to, como exemplo,temos o tratamento com PEG (130
/L de soro), o qual precipita

todas as imuno
lo ulinas endó
enas e de todos anticorpos idiotípicos. Tam ém tem
os o tratamento por aquecimento do soro a 90oC, usado como forma de eliminar a a
tividade anomala dos anticorpos por desnaturação. Ou ainda há o tratamento com a

entes sulfidrílicos como o Mercaptaetanol ou Ditiotreitol, que quera as pontes

dissulfeto e inativa os anticorpos interferentes. Há tam ém o pré tratamento co


m deter entes como
107
forma de inativar os anticorpos. Infelizmente, o tratamento químico não pode ser
aplicado para todos os ensaios, pois dependendo do analito este tam ém pode ter
sua estrutura alterada, e assim levar a resultados falso ne
ativos. Forma de re
duzir a interferência em ensaios para anticorpos específicos Neste caso a recome
ndação é que se proceda o uso de ensaios com antí
enos de captura altamente puro
s como forma de evitar a li

ação não específica. Atualmente isto é possível devi
do as técnicas de DNA recom inante, que permitem desenvolver antí
enos recom ina
ntes puros e apenas com o epítopo desejado. Reduzindo a interferência em ensaios
de Nefelometria e de Competição As técnicas para redução de interferência deste
s ensaios são semelhantes as aplicadas para os ensaios de dois sítios de captura
, ou seja qualquer uma das técnicas imunoló
icas ou não imunoló
icas pode ser ap
licada. Ressalta-se apenas que nos ensaios de nefelometria o tratamento com PEG
pode ser feito usando 40
/L deste no soro para que a concentração de I
M seja re
duzida.
INTERFERÊNCIAS DEVIDO A ANTÍGENOS QUE MASCARAM A REAÇÃO Neste caso a interferênc
ia ocorre
 como resultado de
rupos anti
ênicos que são escondidos ou alterados p
or su stâncias associadas a esta. Exemplo disto encontramos na dosa
em da Apolip
oproteína A-I (apo A-I) em lipoproteínas. Foi demonstrado que a atividade da apo
A-I pode ser aumentada em até 60% fazendo o tratamento com deter
entes, pois ao
que parece os lipídios que

 a se uravam são destruídos com este tratamento. Este
tipo de interferência tam ém é o servado quando se mede antí
enos em soro com i
munocomplexos, como no caso do está
io inicial da infecção pelo HIV onde o HIV e
stá complexado com anticorpos para ele e assim tornando-se quase impossível de s
e ter uma concentração real da quantidade de vírus presente. Isto acontece princ
ipalmente em crianças recém nascidas, filhas de mãe soropositivas. A forma de se
fazer a detecção seria
 promovendo a dissociação dos imunocomplexos. No entanto
para se resolver o pro lema dos antí
enos escondidos é extremamente difícil, em
al
uns caso como nas apolipoproteínas, os antí
enos escondidos podem ser de vári
os tipos, com isoformas múltiplas que podem estar escondidas pelos lipídios e o
tratamento com solventes pode reduzir a interferência assim como pode causar a d
esnaturação do analito. Por isso as vezes é importante fazer o mesmo tratamento
feito com o soro no cali rador do imunoensaio, como forma de verificar se não es
tá ocorrendo prejuízo ao teste.

INTERFERÊNCIAS COM O MECANISMO INDICADOR Al
umas amostras podem conter su stânci
as que interfiram com o indicador da reação aumentando ou diminuindo a leitura.
Exemplo disto está em pacientes que estão fazendo tratamento
108
com radioterápicos e tem o soro analisado com Radio Imuno Ensaio (RIE), estes se
mpre darão um resultado acima do esperado. Em ensaios imunoenzimáticos, o aument
o da atividade enzimática pode levar a resultados falsamente
 elevados. É possíve
l que na amostra haja a presença de ativadores ou ini idores da enzima e assim a
lterem o resultado. Como exemplo, temos um meta ólito da aspirina que faz com qu
e ocorra uma mudança no espectro de a sorção ultravioleta do NADH, levando a a s
or âncias relativamente aixas na análise de dro
as. Em ensaiosem que a leitura
final depende da fluorescência, compostos fluorescentes ou ini idores
 desta pod
em alterar o sinal de leitura. Na quimioluminescência, al
umas su stâncias prese
ntes nesta podem interferir com a emissão de foton.
EFEITOS MATRIZ O efeito matriz éuma interferência causada pela diferença de rea
tividade do analito devido ao am iente que amostra apresenta. As reações antí
en
o anticorpo são
eralmente sensíveis a variações na concentração de lipídios, pH
e a força iônica. As diferenças na matriz
eralmente
 alteram a eficiência da se
paração de frações li
adas e não li
adas e tam ém a extensão da li
ação não espe
cífica a su stância reveladora. O efeito matriz
eralmente aparece quando deseja
mos dosar su stâncias diferentes do soro em um imunoensaio, como por exemplo usa
mos o liquor para pesquisa de anticorpos. Como já explicado anteriormente, o efe
ito matriz é difícil de ser detectado, e por isso, as vezes requer que se faça a
diluição da amostra para proceder um novo ensaio, e que ainda qualquer
 tratamen
to feito com o material a ser analisado seja repetido com o cali rador do “kit”
como forma de verificar se este não interfere mais ainda com a precisão de nosso
s resultados.
109
 
ENSAIOS DE AGLUTINAÇÃO Um ensaio de a
lutinação é aseado na propriedade que um
antí
eno e determinado anticorpo para este, quando li
ado a uma partícula inerte
(marcador) tem de se li
ar entre si e, promover a precipitação do complexo antí

eno anticorpo. Em al
uns casos estas reações podem ser vistas a olho nu, quando
por exemplo usam partículas como hemácias ou partículas sintéticas, outras veze
s as reações podem ser vistas com auxílio de instrumentos que fazem a leitura a
transmissão de luz, como no caso da quantificação de anticorpos quando o suporte
é feito por

 micropartículas
de látex. Foi através da a lutinação com hemácias q
ue se desco riu o sistema san uíneo ABO. A presença de um antí
eno natural nas c
élulas e a alta densidade dos sítios de li
ação cruzada levam a formação de uma
a
lutinação forte, facilmente visualizada a olho  nu. Por este motivo foram desen
volvidos kits onde se utilizam  hemácias sensi ilizadas com antí
enos ou anticorp
os, estes possuem alta sensi ilidade e são fáceis de serem usados. Além das hemá
cias, pode-se utilizar como fase sólida partículas como: lipossomos, microcápsul
as, partículas sintéticas, e vários tipos  de látex.  Estas partículas devem ter u
m diâmetro entre 7 e 0,05μm. Princípios a reação e a
lutinação O princípio bás
   
ico as reações e a
lutinação é a formação e pontes e anticorpo  entre as imun





o lobulinasI G ou I M e a partícula anti ênica com múltiplos eterminantes. Os
anticorpos a classe


 I M são
aproximaamente  100 vezes mais eficientes nas reaçõ
es e a lutinação o que a I G, isto  evi o a sua característica  pentavalente. I
sto torna possível que moléculas  e anticorpo reajam com mais eum sítio ou rea
jam com sítios equivalentes em iferentes partículas e assim pro uzam uma estrut
ura com li
ações cruzaas. As reações e a
lutinação, normalmente são usaas na
    
etecção e espécimes iri
i os a antí
enos específicos li
a os a partículas (se
nsibiliza os). Na a
lutinação in ireta, se utiliza um anticorpo corresponente l
   
i
a o a uma partícula, neste tipo e reação po emos etectar um antí
eno solúvel
em um espécime. Um hapteno(um antí
eno por exemplo) com um simples eterminant
e anti
ênico (como no caso e al
uns hormônios ou ro
as), poem não levar a for

mação esta ponte que  forma o complexo antí
eno-anticorpo e, conseqüentemente  nã
o levam a formação a a
lutinação. Quan o uma partícula sensibiliza a com um hap
   
tenoé utiliza acomo rea
ente, a eterminação  este hapteno requer o uso o ens
aio einibição a a
lutinação.  A inibição
 a a
lutinação é um ensaio   ecompeti


ção on e a a lutinação a partícula e hapteno com uma certa quanti a e e antic
  
orpo, o qual po e estar livre ou li
a o a partículas, é inibi a pelo hapteno pre
sente na amostra. Como exemplo, temos al
uns testes e
raviez que fazem a ete
   
rminação in ireta o hCG, on e partículas e látex recobertas  com o hCG são post


as para rea ir coma urina que contenha o hCG, e junto se a iciona anticorpos pa

ra o hCG. Deste mo o, o hCG li
a o às partículas irá competir com aquele present
e na urina,


 se não houver a lutinação, si nifica que havia mais hCG na urina e o
teste é a o como positivo.
110
    
Os ensaios e inibição a a
lutinação po em ser mais sensíveis que os testes  e
a
lutinação passiva, embora  a preparação os rea
entes exija a estreza e um es
 
pecialista
   treina o no uso as técnicas mais sofistica  as. Em
termos e sensibil
i a e o ensaio, as partículas sintéticas ou o méto o e hema lutinação oferecem

ran es vanta
ens em relação ao ELISA (Enzyme Lynke Immunosorbent Assay), na 

etecção e anticorpos, isto porque neste ensaio apenas os anticorpos  alvo estão
envolvi os na reação imune. Enquanto no ELISA, na concentração e 10
e I
G por
   
litro presente no soro, ou al
o em torno

  e 6 or ens e ma nitu e maior que o a
nticorpo alvo, interfere na sensibili a e o ensaio pro uzin o o que na lín
ua i
         
n

lesa se chama e ruí o e fun o ou, melhor izen o,  pro uzin o o resulta  o uv
i oso. A reação e ELISA á melhores resultaos quan o se objetiva a etecção e
antí
enos. Partículas usa as como fase sóli a Vários tipos e partículas vem se
   


n o usa as como fase  sólia nas reações e a lutinação.  O primeiro tipo  e a lut
inação foi observa o quan o se misturouo soro e um paciente infecta o por  uma
bactéria e arespectiva.O sistema ABO etipa
em e eritrócitos  humanos, escob
erto por Lan steiner, po e ser classifica o como uma reação e a
lutinação iret
   
a. As provas e a
lutinação ireta ain a são utiliza as no ia
nóstico microbiol


ó ico (salmonelas e brucelas por exemplo),

e na tipa em e hemácias. Partículas
artificiais como
elatina, microcápsulas e peptíeos ou silicatos, poem ser se


nsibiliza os  com um antí eno ouanticorpo específico  para o alvo na a
lutinação 

passiva (in ireta). Em 1983 Ike a e Tomizawa esenvolveram uma  partícula
 e ela
tina
 especial com uma superfície
 altamente hi rofilíca que, evi o a isso é capa
z e evitar a li
ação e materiais não específicos presentes na amostraem estu 
o. Para a sensibilização
  estas partículas com o antí
eno ou anticorpo eseja o,
se utiliza formal eí o para a fixação. Hema
lutinação Os testes e hema
lutinçã
 
o, apesar e serem muito sensíveis não  são complica os em sua realização  e seque
rexi
em equipamentos  especiais. Devi o a isso muitos países em esenvolvimento

a otaram este tipo  e teste
 e suas
 variações.
 Atualmente os testes e hema
lutin
ação são
 utiliza  os na etecção e vírus a hepatite B (HBV), hepatite C (HCV),
vírus a imuno eficiênciahumana (HIV), tireo
lobulina,  microssomos
 tiroi eanos,
e outros. Tambémtestes e hema
lutinação reversa, po em etectar HbsA
(antí
e
no e superfície o vírus a hepatite B), α-fetoproteín , e hemoglobin hum n n
s fezes. P r detecção de ntígenos, estes testes present m o limite de dete
cção situ ndo entre 30 e 50 ng/ml. Outro exemplo de teste de hem glutin ção surg
iu nos nos 80, foi o teste p r detecção de nticorpos do Treponem p llidum, f
oi reconhecido mundi lmente por f zer uso de eritrócitos de g linh ou c rneiro,
sensibiliz dos com o T. p llidum cultiv do em coelhos. Se comp r do com outros
testes p r di gnóstico d sífilis, este oferece m ior sensibilid de e especific
id de. No ent nto este teste ind present result dos f lso positivos, em deco
rrênci d presenç de uto nticorpos p r
111
 proteín nim l presente no soro ou p r outr s proteín s presentes. Est interf
erênci pode ser nul d se tr t ndo o soro com dsorventes contendo o soro do
nim l correspondente, restos celul res ou outros componentes. Há poucos nos um
novo teste de hem glutin ção em que se f z uso de nticorpos monoclon is de r to
s específicos p r o ntígeno de superfície d s hemáci s hum n s, este ens io co
nsegue reconhecer estes ntígenos mesmo em hemáci s com estrutur lter d com
o s que p recem n nemi f lciforme. Neste ens io f z-se o uso de nticorpos
biv lentes, que se lig m o epitopo de superfície e o lvo ser detect do, des
te modo não há necessid de de se proceder sep r ção do pl sm d s célul s s ng
uíne s. Aglutin ção com p rtícul s de gel tin As p rtícul s de gel tin tem sid
o consider d s como s substitut s p r os ens ios de hem glutin ção. As p rtícu
l s de gel tin ind oferecem v nt gem de não ocorrer lig ções inespecífic s
com o m teri l presente n mostr por su superfície  ser lt mente hidrofílic  .
A p rtícul de gel  tin tem proxim d mente
 3 μm e iâmetro, e é pro uzi a atr
avés a separação

 e fase e li  ação
 cruza a emumpH ótimo a 40OC. A partícula


r
esultante é fixa a com formal eí o ou lutaral  eí o. Como as partículas
 e elat
ina não são anti
ênicas,
 os testes realiza
 os com estas são isentos os problema
s que aparecem quan o há a presença eanticorpos heterófilos nas amostras. Tamb
ém, ao se trabalhar com as partículas e
elatina, estas requerem o uso e uma 
 

iluiçãomenor o soro na análise, como forma eevitar reação não  específica e
arantin o assimum ensaio com  maior sensibili a e. Outrostipos e partículas su
r
iram no merca o, como méto o alternativo às partículas e
elatina. Uma elas
 
são partículas
 incolores, que são blocos e partículascopoliméricas compostas 
e áci o L-
lutâmico. Estas partículas po em ser colori as com a cor que se esej
a para facilitar


 a visualização.
 A a lutinação com partículas e elatina  foi in

o foi
icialmente
  usa a para a etecção
 e anticorpos para o HTLV. Este méto o lo
a ota
 o paraa etecção
  o HIV, HBV e HCV já que ele é muito simples eser rea
liza o e não epen e o controle e temperatura preciso  para ser executa
 o. A
lu


tinação pelo látex A a lutinação pelo látex é usaa para a etecção e vários
 
an
alitos,
 como exemplo, ela vem sen o usa o para a etecção o hCG em testes e r
avi ez qualitativos
 e em méto os semi automatiza os para testes quantitativos, c
omo na etecção e al
umas  proteínas plasmaticas.
 O teste qualitativo é o
  proce
imento
eralmente executa o em  lâmina, on e se mistura uma certa quanti a e a a
mostra o paciente com outra o látex, a
ita-se por  2 a 3 minutos e se executa a
leitura a olho nú, al
umas vezes, no entanto, po e ser necessário levar a lâmin
a ao microscópio
 para confirmar se houve ou não a
lutinação, pois as partículas 
e látex
 po em ser muito
 pequenas. Quanto ao teste quantitativo
 estepo e ser  re
alizao por méto os e absorção e luz, como a turbi imetria ou méto os e ispe
rsão e luz, como a nefelometria. A a
lutinação pelo látex  poe ter
ran e sensi



bili a e, al o entre 30 a 50n /ml quan o se lança mão e méto os semi automatiza
os.
112
       
Ensaios
 e Turbi
  imetria  com Látex Os ensaios e turbi imetria me em aquanti a
e e luz per i a quan  o esta se espalhaao encontrar  com a superfície e umapar
tícula. O limite e etecção  este méto o varia e acor o com o comprimento e l
uz
 utiliza o. A  maioria os espectrofotometros
   utilizam vários comprimentos e o
n a como forma e aumentar a sensibili a e, o mesmo  mo o também
 se procurou es
envolver partículas que se encaixem  na capaci a e e leitura
   o aparelho, em
er
al estas partículas tem o tamanho e 0,1μm, e epen en o a aparelha em a sensib

 
ar até 10n
/ml. Deve-se ressaltar que as partículas e látex po
ili
 a e po e che    
em sofrer
 interferência
 e fatores esconheci os presentes na amostra o pacien 
te, e este mo o, vários

 absorventes

 evem ser usa os no rea  ente e na fase e i
ncubação. Imunoensaios e conta em e partículas Este tipo e ensaio tem a vanta

em e não requerer que seja feita a separação as partículas li
aas as não li

aas com o rea
ente, no entanto, o Fator Reumatóie presente na amostra, poe v

ir a interferir com os resulta os, poiseste se li
a especificamente a I
Ge não
especificamente a outras proteínas,  tu o isso, levan  o em
eral a resulta os fa
lso positivos. O principio estes ensaios é basea o na conta
em óptica e partíc
 

ulas,
 o que permite avaliar a iminuição   em número  e partículas não  a lutina as
urante
 o ensaio. Tanto o ensaio  e ín ice (o ínice que um sinal ecai em núme
ro e partículas não a
lutina as),  ou os ensaios e ponto final, são aplicáveis
neste formato. Enquanto o ensaio e ponto final
arante a sensibiliae em nano


ramas
  por mililitro, no caso e reações imunoló
icas, é necessário
 um lon
operí
o o e incubação. Nos últimosanos, su
iram vários tipos e instrumentação e fl
uxo contínuo basea os na meto olo
ia e conta
em e partículas, servino inclusi
   
ve paraa ientificação  e al
uns marca ores tumorais.  Outros tipos e ensaios D
os méto os esenvolvi os recentemente, temos a meto olo
ia e ispersão e luz “
 
   
quasielástica”,
  que se baseia na me ição as mu anças  em resposta
 a istribuição 
o tamanho
  as partículas. Estatécnica  faz
 uso e um feixe e laser para  me ir
a re ução o coeficiente mé io e ifusão  as partículas
  como o resulta
o e um 
a reação imune.   Ensaios basea os na me ição  e mu anças a anisotropia an ular 
a luz ispersa a e acor o com o tamanho mé io a partícula  também fazem  parte 
os últimos lançamentos.
  Neste caso as partículas com iâmetros pareci os com o
ocomprimento e on a po em promover uma variação an
ular a luz ispersaa epe
 
n ente o tamanho a partícula.
 
ENSAIOS DE DISPERSÃO   DE LUZ Uma característica assuspensões coloi ais é que el
as
 tem a proprie a e e ispersar a luz em várias  ireções, este fenômeno é cham
a o e Efeito  Tyn all,
  nele não há alteração o comprimento
  e on a a luz inci
ente, e ele epen e o tipo e partícula. O efeito re e esta ispersão é que a
luz
113
      
po eser observa
 a em to osos ân
ulos relativos  a ireção a luz inci ente.  O 


rau esta ispersão é epen ente o tamanho a partícula  e o comprimento  e on
a a luz inci ente.  Como exemplo, em soluções  or inárias, as partículas o solut
o (parte issolvi a) são tão pequenas que a ispersão e luz que ocorre  é muito
pequena. No entanto,quan o as partículas crescem em tamanho,  forman o complexos
macromoleulares, a ispersão é mais si
nificativa, fazen o com que a solução te
nha um aspecto turvo. Também quanto  menor o tamanho as partículas em suspensão,
mais a luz se ispersa 
em várias ireções,
 quanto maiores
 forem as partículas,
a luz começa  a se iri ir  em uma única ireção e se ispersar menos, este efeito
é conheci o como efeito e Dispersão e Raylei
h-Debye. A maioria as técnicas
       
e ispersão e luz, fazem uso este efeito, me in o a luz ispersa emiti a em u
ma única ireção. O complexo


antí eno-anticorpo A li ação e um antí eno com o a



nticorpo é um equilíbrio inâmico em que  um anticorpo  bivalente  se
li a a um ant


í eno monovalente ou multivalente. Quan o o número e sítios e li ação o antic 
orpo é si
nificantemente maior que o número e sítios o antí
eno, os sítios o


antí eno são rapi amente satura os pelos anticorpos e assim se formam pequenos c

omplexos antí
eno-anticorpo.  No entanto,
 se tivermos um pequeno excesso e antic
orpos, teremos a li
ação e mais   e um anticorpo ao antí
eno multivalente, o que



leva a formação e um are a o os complexos

antí eno-anticorpo. Já no momento
em que há mais antí
eno o que anticorpo, toos os sítios o anticorpo se tornam
 
satura os, com uas moléculas anti
ênicas forman o um pequeno complexo não a
re

a o. A zona e equivalência, é aquela em que há o máximo e li
ações entre o an
 
  
tí
eno e o anticorpo,
 forman o o maior complexo  a
re
a o possível (em mé ia2 a
3 moléculas e anticorpo se li
an o a uma e antí
eno). As características a li

ação antí
eno anticorpo é que servem como base para os ensaios e ispersão e
   
luz. Isto que izer que, se iniciarmos  com uma quanti a e eanticorpos em exces
so constante, eformos aumentano aos poucos a concentração e antí
enos vai oco
rrer o aumento a concentração o complexo antí
eno-anticorpo em quantiae sufi
   
ciente para ar ori
em ao efeito e ispersão e Raylei
h-Debye. Como estes comp
lexos antí
eno anticorpo são relativamente
 constantes em tamanho,  arelação entr 
e a concentração e antí
enoe o complexo antí
eno-anticorpo e a ispersão e
luz, seaproximam a lineari a e. As concentrações

 anti ênicas próximas ao  coefi
ciente e equivalência,
 apresentam pouca ispersão
 e luz. Esta
   é uma conição b
em conheci a o excesso e antí
enoresultan o na possibili a e e haver uas co
ncentrações anti
enicas iferentes e antí
eno corresponeno ao mesmo valor a
     
ispersão e luz. Este efeito se eve a iminuição o tamanho o complexo  imune
pois a razão e anti
eno para o anticorpo continua a aumentar, iminuin o assim
 
a ispersão total e luz (ver
ráfico).
114
    
A cinética as reações e imunoprecipitação também eve serleva a em conta,  apó
s a mistura oantí
eno com oanticorpo, começa a formação e complexos  isperso

res e luz sen o que, o pico e formação estes ocorre em 20 se
un  os aproxima a
mente. É claro que após  este tempo continua a ocorrera formação e imunocomplex
os, e que o tamanho  estes começa
 a crescer, aparecen o complexos maiores que ac
abam influin o na ispersão a luz.

 Finalmente temos um está io estável,  em que
não há mais
  a variação  na ispersão e luz,
 é a fase
 e equilíbrio a reação. Os

ensaios e ispersão e luzfazem uso  esta fase
 e equilíbrio
 para fazer a
 me
ição. Méto
 os que fazem uso a taxa e aumento a luz ispersa, são conheci os c
omo métoos cinéticos ou proporcionais. As partículas continuam a se a
re
ar e a
umentar e tamanho até o ponto em que elas precipitam e a solução é clarifica a.
  
NEFELOMETRIA
 O principio esta reação é simples,  nele o soro iluí o (antí
eno) 
é mistura o com uma certa concentração conheci a o antisoro, em eral tampona o

. Assim a ispersão e luzvai aumentan o aos poucos até atin

   ir o seu pico máxi 
mo. O an
ulo a ispersão
 e luz
 é compara o com
 os resulta os obti os com  pa rõ
es e calibra ores o aparelho e forma a po  er  eterminar
 a concentração  e anal
ito
 presente no
 soro o paciente.  Depen en
 o o tipo e instrumento usa o, ele p
o e fazer a me  ição cinética ou o ponto e equilíbrio
 a reação.
 Os aparelhos q
ue fazema me ição oequilíbrio a reação, eterminamquan o se atin
 iu o ponto
máximo a ispersão e luz  após
 um etermina
  o tempo e reação, e a ispersão
e luz a amostra é subtraí o o sinal e fun o para se alcançar o sinal final o
complexo. É claro que o
115
     
soro por si só po e contribuir pela ispersão e luz  evi o a seus constituintes

como os quilomicrons, lipoproteínas e baixa ensi ae e a presença e imunocom
plexos circulantes.
 A prática comum e se con
elar e escon
elar o soro no labor
atório,
 a fim e se executar  o exame no outro ia, contribui no aumento a ispe 
rsão
  e luz. Quan
 o não há ispersão e luz, isto acaba por limitar a sensibili
a e o ponto e equilíbrio a reação, isto  po e ocorrer evi  o a umalimitação p
resente na amostra analisa  a.  Na maioria  os ensaios, uma as forma e evitar es
ta interferência é fazen
 o a iluição  o soro a 1:50. Este problema é menor quan
o se analisa  o liqui o céfalo raqui iano ou urina pois estes
 contém menos mater
ial capaz e ispersar a luz. Nem sempre o pré tratamento o soro como  forma e
evitar a interferência é útil, uma vez que este aumenta a complexi a e a anális 
e e a torna mais suscetível  
a erros. Existem  outra fontes e interferência  o si
nal como a presença e i itais nos tubos e análise,  presença
 e fibras
  e poeir
a na amostra. A nefelometria  cinética empre
a a me ição o aumento e ispersão
e luz após

 ter se inicia  o a reação  entre
 antí eno e anticorpo. Isto elimina a
necessi a e e correção o sinal  e fun
  o que ocorre
 na amostra. A nefelometria 
cinética monitora a taxa e mu ança a ispersão e luz, a qual aumenta
ra ativ 
amente,

 até che ar um momento em que aumenta rapi amente  até
 um pico máximo, e
epois ecairapi amente. O pico  máximo é o parametro  e me ição o aparelho,  est
e é compara
    o com uma curva pa rão, já realiza
  a anteriormente
 e armazena
 a no b
anco e a os o aparelho. Esta curva pa rão  eve ter si o elabora
  a como o maio
r número e amostraspossíveis, como forma e aumentar a exati  ão o aparelho.
 C
urvas pa rão  elabora as  com poucos pontos são sempre a fonte
 e resulta os com p
ouca exati ão. Também, eve-se estar atento a presença e bolhas na  amostra a se
r coloca a para  leitura no  aparelho, pois estas contribuem para
 a ispersão a l
uz em outras ireções. Um os principais requerimentos  e to as as técnicas e i
munoprecipitação é querer etectar o excesso e antí
eno. Para uma certa quanti
      
a e e anticorpos presentes  na mistura
  a ser osa a, a que a absoluta a ispers
ão e luz
 ou, a taxa e aumento a ispersão e luz, que aumenta conforme a quan
ti a e e antí
eno presente, até se che
ar um pico máximo. A partir este ponto,
  
   
quanto
 maior for a quanti a e e antí  eno, menor será aquanti
a e e luz ispe
rsa a. Também é possível
 que ocorram uas concentrações eantí eno, uma associa

eno, este mo
a com o excesso
 e anticorpo  e uma associa
 a com excesso e
 antí
o, ca a uma estas promove a ispersão  a luz e uma forma  iferente. É possível 
se esenvolver con ições no ensaio e forma a po erse etectar o excesso  e an
tí
eno para uma proteína ou analito que esteja além os valores encontra os em s
oros normais ou patoló
icos. No entanto nem  sempre é possível  sefazer isso, emb
ora seja importante se etectar o excesso e antí
eno quan o se eseja osar imu
no
lobulinas. Estas proteínas  po em estar presentes em altas concentrações em pa
cientes com hiperplasia ou oenças mali
nas. O antisoro usao nas reações e imu
    
noprecipitação evem  ser capazes e reconhecer uma varie a e e epítopos present
es na amostra, po e-se também usar soros monoclonais, só que eve-se
116
   
ranes quantiaes e anticorpo monoclonal já que e
tomar cui  a o quan o se usa  
stes po em levar  a erros e quantificação. Existem  várias técnicas para a etecç
ão o excesso e analito em uma amostra, uma elas consiste em se a icionar mais
antí
eno ou anticorpo na mistura em estu o como forma e promover o aumento a
   

ispersão e luz, quan o há o excesso e anticorpos  ou
 anti enosrespectivamente
. Outra
 forma  consiste em se preparar  uas iluições iferentes a amostra e se
proce er a osa
em, como forma e comparar  os resulta os e se observar sehá cor
respon ência entre eles. Este tipo e proce imento tem  maior aplicabili a e eme
nsaios que me em o ponto final (ponto e equilíbrio)  e uma reação. Quan o se e
seja osar  anticorpos  presentes
 numa amostra, a fim e se saber se há excesso  e
stes, po e-se proce  er antes a nefelometria,  a eletroforese quantitativa a amo
stra como forma e verificar a concentração a imuno
lobulina presente  no  entant

o, isto é pouco  prático e mais
 trabalhoso. Quan o comparamos
 os méto
 os e me iç
ão o ponto eequilíbrio  e uma reação  com o que me e a cinética a reação, vem
os que
 os méto os que
 me em o ponto e equilíbrio
 são mais simples e menos sofis
tica os em  termos
 e aparelhos. Os méto
  os cinéticos são menos sensíveis a inter
ferência
 e fun o que
 ocorre nos méto os e ponto final, e são mais sensíveis,
 m
as po em ser afeta os por falsas reaçõesantí
eno anticorpo   por causa e anticor
pos monoclonais.  Anticorpos policlonais e alta afini a e po em apresentar reaçõ
es mais rápi as nos ensaios cinéticos.
 

TURBIDIMETRIA Os ensaios  e turbi imetria se uem as  mesmas consi erações feitas
para
 a nefelometria, a iferença  é que neste tipo e ensaio se me e a absorbânci 
a a luz
 e não a
 luz ispersa a.
 Para a turbi imetria também temosensaios  eme
ição o ponto e equilíbrio  e  a cinética a reação.  Nos ensaios
  e me ição o
ponto e equilíbrio,  eve-se
 me ir  primeiro o sinal e fun o a amostra, para en
tão subtrai-lo o resulta o final a reação antí
eno anticorpo.   Já nos ensaios c
inético isto nãoé necessário  já que  este se baseia na me ição e vários
 pontos.
No entanto
  a meição a luz absorvi  a oferece limitações,
 o aparelho
 eve ser c
apaz e me ir mu anças a absorção e luz  a or
 em e 5 uni a es e miliabsorção
com precisão,
  sem
 que haja a presença e ruí o no sinal (interferência eletrôni
ca oriun a a re e elétrica ou e outro aparelho).
 
APLICAÇÕES DA NEFELOMETRIA  E TURBIDIMETRIA Qualquer   flui o corporal po e ser usa


o em ambas as técnicas    es e que haja quanti a e suficiente antí eno para ser 
etecta
 o. A quanti a e e amostra necessária em ambas as técnicas é pequena, a
 em e microlitros. Quan o temos
or  amostras opalescentes, estas po em ser filtra

aas a alta rotação. Amo
as em um filtro  com a porosi a e e 0,22μm ou centrifu 
strashemolisa as ou ictéricas po em tornar ifícil o ensaio, mesmo quan o estas
são iluí as.
117
    
A cinética as reações e precipitação po e ser afeta a pela força  e composição
 
iônica, pH e a presença
 e promotores poliméricos.
 A presenca e ions e só io,
ma

nésio e fosfato po em promover a reação e precipitação.  Por este motivo o us
o e soluções tampão fosfato salina   (PBS) na concentração
 e 0,01 a 0,1 mol/mlc
om pH entre 7,4 e 7,9 é recomen
 a a na iluição a amostra  ser analisa a. Po
a  e
-se também fazer a a ição a Azi a só ica na concentração e 0,1% como forma e
evitar o crescimento e bactérias e fun
os na amostra. Al
uns polímeros poem se
  
r usa os na amostra como forma  e promover a reação,  aceleran
 o a interação
  entr


e antí eno e anticorpo. Além isso os polímerospo em iminuir a turbi ez as so
luções com

 muito anticorpo eminimizar o sinal e fun o. O Polietileno licol  (PE
G) é um estes polímeros,  po e-se usar o PEG 4000 ou 8000 na concentração
 e 40
a 60
/L. Al
uns tipos e problemas mais comuns  nos ensaios  e turbi imetria
 e n
efelometria são comuns,
  assim como  a forma e resolve-los,
 entre estes estacam
os: Problema Excesso e ispersão e luz Dispersão e luz insuficiente  Solução D
iluir mais o anticorpo,
   iluir mais a  amostra.
  Aumentar a fração e anticorpo, a
umentar a quanti a e e amostra. A mu ança a ispersão e luz é pequena Ajustar
a taxa
 areação antí
eno anticorpo, usar polímeros para promover a reação. Rea
ção e fun o em excesso Filtrar rea
entes e/ou a amostra.
  
Aplicações específicas Este tipo e reação se aplica a osa
em e proteínas  que
tenham importância clinica presente no soro, urina ou liqui o cefaloraqui iano.
Estas proteínas
eralmente possuem tamanho  suficiente para promover a formação
e imunocomplexos e também conse
uir esviar aluzquan o rea
e com anticorpos  es
pecíficos. Dentre as proteínas que po em ser osa  as tanto pela turbi imetria qu
anto pela nefelometria temos as se
uintes lista as abaixo: α1-Ácido glicoproteíc
o α1-Antiquimotripsin α2-Antipl smin α1-Antitripsin α2-M croglobulin α1-Micr
oglobulin Albumin Antitrombin III Apolipoproteín A-I Apolipoproteín B
118
   
β2-Macro

 lo ulina Ini idor
 de C1 C3 C4 Ceruloplasmina
 Proteína C Reativa Fi rino

ênio Fi ronectina Gc-
lo ulina Hapto
lo ulina Hemopexina I
A I
E I
G I
M Cadeia
Leve κ Cadeia Leve λ Préa bumina Proteína de igação ao retino  Fator reumatóid
e Transferrina Anti Estrepto isina O O imite da sensibi idade ana ítica destes
métodos para a detecção de proteínas é de aproximadamente 5mg/L. E a precisão ob
tida com estes métodos pode chegar a a go entre 1 e 10% do tota  do coeficiente
de variação, dependendo da proteína que está sendo dosada. É c aro que para se o
bter a precisão é necessário que se façam curvas de ca ibração do ensaio para as
sim garantir sua precisão e exatidão.
FATORES QUE AFETAM A PERFORMANCE DOS ENSAIOS As interferências que mais dão prob
emas são aque as que dão o sina  de fundo na reação, contribuindo para aumentar
a dispersão de uz. Em gera  este tipo de interferência se deve a amostra que e
stá sendo ana isada ou aos reagentes usados. A fi tragem dos reagentes, associad
os a centrifugação a a ta ve ocidade ou a u tracentrifugação da amostra, ajudam
a reduzir este sina  de fundo. Soros muito ictéricos ou hemo isados podem afetar
a absorbância dos método turbidimétricos, esta interferência pode ser minimizad
a com a di uição da amostra antes de se processar o ensaio.
119
A qua idade do anticorpo usado no ensaio é crucia  para o desempenho destas técn
icas, pois como as proteínas presentes no soro podem apresentar várias formas, o
reagente usado deve ser capaz de reagir com estas várias formas. Isto é especia
mente úti  em proteínas como a haptog obina, cujas isoformas variam muito em te
rmos de peso mo ecu ar. Os métodos nefe ométricos e turbidimétricos, no entanto,
são menos afetados pe as variações do tamanho mo ecu ar do que são os método de
imunodifusão radia . Preparações de anticorpo que apresentam variações na igaç
ão devido a presença de componentes monoc onais, devem ser evitadas sempre que p
ossíve . A concentração de proteína monoc ona  pode ser estimada independentemen
te por métodos e etroforéticos. Qua quer variação no reconhecimento do anticorpo
de uma preparação pode ser ava iado procedendo-se um teste de para e ismo atrav
és do imite do excesso de anticorpo em concentrações antigênicas. Isto é, a di 
uição de uma série de amostras de um soro deve mostrar uma série inear de resu 
tados. Na verdade, este tipo de verificação pode ser estendido a todos os tipos
de ensaios.
TESTE DE PAUL BUNNEL & DAVIDSOHN E MONOTESTE A mononuc eose infecciosa descrita
em 1889 por Pfeiffer, também chamada Doença G andu ar, Angina Monocítica, manife
sta-se por febre contínua, angina, adenopatia cervica , astenia, suores profusos
, esp enomega ia. Hoje, sabe-se, que seu agente etio ógico é um vírus da famí ia
Herpesviridae denominado Epstein & Barr. Foi demonstrado por Epstein,Archong &
Barr, em 1967, a partir de materia  de um paciente com infoma de Bur itt.
DIAGNÓSTICO: A presença de anticorpos para o capsídio do vírus pode ser demonstr
ada por imunof uorescência indireta em presença de cé u as infob astóides, prod
utoras de vírus, na fase aguda da infecção. É, porém um teste comp icado e inace
ssíve  aos aboratórios de aná ises c ínicas. Devido a este fato, o diagnóstico
da mononuc eose infecciosa baseia-se na pesquisa de anticorpos heterófi os. Dois
testes são, comumente, usados para este diagnóstico: O MONOTESTE e a reação de
PAUL-BUNNELL & DAVIDSOHN.
MONOTESTE: No monoteste usam-se hemácias formo adas de cava o. Em uma âmina com
um de microscopia, co oca-se uma gota de soro do paciente (não necessita ser ina
tivado). Adicionam-se a este soro duas gotas de uma suspensão a 20% de hemácias
formo adas de cava o. Agita-se imprimindo um movimento de rotação à âmina. Dent
ro de dois a três minutos ocorre hemag utinação. O teste pode, também ser feito
em âmina escavada. Ausência de hemag utinação não exc ui o diagnóstico para mon
onuc eose.
120
REAÇÃO DE PAUL-BUNNELL & DAVIDSOHN: Esta prova é baseada na capacidade que tem o
soro do doente de ag utinar hemácias de carneiro a uma di uição de 1:56 ou supe
rior. Entretanto, mesmo se ocorrer a ag utinação das hemácias de carneiro, o tes
te deve ser confirmado pe a adsorção do soro do paciente com os antígenos de rim
de cobaia e g óbu os, de boi separadamente.
Técnica da reação: Materia  necessário: - Soro do paciente inativado - Micropipe
ta de 20 µ  - P aca de vidro escavada (a mesma que se usa para o VDRL) - Hemácia
s de carneiro a 2% em sa ina - G óbu os cozidos de boi (antígeno) - Extrato de r
im de cobaia (antígeno de Forssman) - So ução de NaC  a 0,85%.
Rea ização do teste: 1 - A uma âmina com pe o menos oito escavações, adicionar
20 µ  de so ução sa ina; 2 - Na primeira escavação adicionar 20 µ  do soro do pa
ciente. Homogeneizar com a mesma ponteira, passando 20 µ  para a 2a cavidade, da
í para a terceira e assim, sucessivamente, até a ú tima, quando desprezamos 20 µ
. Temos assim, o soro di uído a 1/2, 1/4 até 1/256; 3 - Adicionar a cada di uiç
ão do soro 20 µ  de uma suspensão de hemácias de carneiro a 2%, em sa ina. Homog
eneizar, imprimindo à âmina um movimento de rotação. A ag utinação das hemácias
ocorrerá dentro de 1 a 2 minutos até certa di uição ou pode não haver ag utinaç
ão se o soro não possuir hemag utininas. Uma hemag utinação produzida pe o soro
até à di uição de 1:32, é um teste que não indica a mononuc eose. Pode-se dar co
mo negativo. Se porém, houver hemag utinação até a uma di uição do soro de 1/64
ou maior, há uma forte suspeita de ser mononuc eose. Neste caso o soro dever ser
absorvido com g óbu os de boi (0,1 m  de Gb + 0,4 m  do soro) e com rim de coba
io (0,1 m  de Rc + 0,4 m  do soro). Misturam-se soro e antígeno em um tubo de he
mó ise, deixar no banho maria a 37°C por 30 minutos, centrifugar e repetir a rea
ção com o sobrenadante do mesmo modo que se procedeu para a prova direta com as
hemácias de carneiro. Para isto destacar duas fi eiras na p aca, uma para Gb e o
utra para Rc. Em cada fi eira, adicionar 20 µ  de sa ina em cada cavidade e di u
ir, como anteriormente, o soro tratado (uma fi eira para Gb e outra para Rc). Ad
icionar em cada cavidade 20 µ  de hemácias de carneiro e homogeneizar, com movim
entação de rotação.
121
4 - Após 2 a 3 minutos proceder a eitura, observando o títu o do soro, em cada
fi eira. O títu o será a maior di uição do soro onde houver hemag utinação comp 
eta. Observações: O antígeno de g óbu os de boi absorve o anticorpo do soro no c
aso de mononuc eose infecciosa e da doença sérica. O antígeno de rim de cobaio a
bsorve os anticorpos de Forssman. Em determinado soro, se o títu o da prova dire
ta for de 1:128 e após à absorção com Gb e Rc não ocorrer hemag utinação, não se
trata de mononuc eose e sim de doença do soro. Se por acaso ocorrer hemag utina
ção pe o soro tratado com Rc a uma di uição de 1:64, por exemp o, e com Gb não o
correr hemag utinação, trata-se de mononuc eose. Se se tratarem de anticorpos de
Forssman, não haverá hemag utinação no soro tratado com Rc, mas haverá hemag ut
inação no soro tratado com Gb. Resumindo teremos: DIFERENCIAÇÃO DAS AGLUTININAS
ANTI-HEMÁCIAS DE CARNEIRO DIAGNÓSTICO PROVA DIRETA HEMÁCIAS DE CARNEIRO Rc Doenç
a do soro Mononuc eose Soro norma  128 128 128 64 Gb 64 SORO ABSORVIDO COM
Deve-se esc arecer que a reação c ássica de Pau -Bunne  & Davidsohn era feita e
m tubos e com di uições de 1/7, 1/14 ... 112 ou mais. Considerava-se, neste caso
, como suspeito de mononuc eose infecciosa, um paciente cujo soro apresentasse,
na prova direta um títu o igua  ou superior a 1:56. Nestas condições absorvia-se
o soro com Rc e Gb para diferenciação das hemag utininas. Observação: O sangue
de carneiro usado deve ser conservado em so ução de A sever, outros anticoagu an
tes diminuem a sensibi idade das hemácias e prejudicam o teste.
TESTE DO LÁTEX O átex tem sido empregado como suporte para variados tipos de an
tígenos e de imunog obu inas, graças às suas propriedades de adsorção de proteín
as. Contamos com um grande número de testes tendo como suporte o átex. Nos dife
rentes diagnósticos rea izados podem ser pesquisados anticorpos (se o átex esti
ver revestido com antígeno) ou pesquisa de antígeno (se o átex estiver revestid
o com anticorpo). Atua mente existem conjuntos de átex para pesquisar os agente
s microbianos (bactérias, vírus), muito específicos, isto é, sensibi izados com
anticorpos monoc onais.
122
TESTE DO LÁTEX PARA ARTRITE REUMATÓIDE Os reagentes tendo como suporte o átex,
são fornecidos por diferentes fabricantes. No conjunto, são fornecidos o átex s
ensibi izado com gamag obu ina humana (anticorpo), soros padrões positivo e nega
tivo di uídos a 1:20, p aca de vidro quadricu ada e so ução tampão de g icina-Na
C , pH 8,2.
REALIZAÇÃO DO TESTE 1. Usar a âmina quadricu ada e separar três quadrados, o nú
mero 1 para o soro do paciente, o número 2 para o soro negativo e o número 3 par
a o soro positivo; 2. Di uir o soro do paciente a 1:20 no tampão de g icina (0,0
5 µ  de soro em 1 m  de tampão). 3. Co ocar nos quadrados números 1, 2 e 3 uma g
ota do soro do paciente (1:20), uma gota do soro negativo e uma do soro positivo
, respectivamente. 4. Sobre cada gota adiciona-se uma gota do átex sensibi izad
o misturando bem. Imprime à âmina um movimento de rotação durante 1 a 2 minutos
. Reação positiva: presença de ag utinação Reação negativa: ausência de ag utina
ção Se quiser fazer uma titu ação basta fazer di uições sucessivas do soro no ta
mpão de g icina. O títu o será a maior di uição do soro onde ocorre ag utinação.
Em cerca de 80% dos casos de artrite reumatóide essa prova é positiva, enquanto
que na febre reumática e na po iartrite reumática secundária crônica é quase se
mpre negativa. Nas infecções ou afecções como hepatite, cirrose hepática, sarcoi
dose, sífi is e upus eritematoso, esta prova é sempre positiva.
TESTE DO LÁTEX PARA ANTICORPOS ANTIROIDEANOS O conjunto é fornecido contendo os
reagentes como no caso anterior. O átex é revestido com tireog obu ina acompanh
ando soros negativo e positivo (di uídos 1:20), em tampão de g icina. A rea izaç
ão do teste obedece às mesmas normas do teste para artrite reumatóide. Neste tes
te não se faz titu ação.
TESTE DO LÁTEX PARA LUPUS ERITEMATOSO O conjunto de reagentes é fornecido pe a F
irma Hy and e se constitui de um frasco com partícu as de átex revestidos com D
NA, p aca de vidro, soros positivo e negativo (não di uídos). Nos quadrados 1, 2
e 3 co ocar uma gota do soro do paciente, do soro negativo e uma gota do soro p
ositivo, respectivamente.
123
Adicionar uma gota de átex a cada um dos três quadrados, imprimir à âmina um m
ovimento de rotação durante 1 a 2 minutos e procede-se a eitura. Reação positiv
a: presença de ag utinação Reação negativa: ausência de ag utinação. Atua mente,
encontram-se os conjuntos de reagentes com suporte de átex para diagnóstico de
uma série de afecções e infecções microbianas. Todos são fáceis de se uti izar,
bastando er, com atenção, os fo hetos que acompanham os conjuntos para diagnós
tico.
TESTE DE WAALER-ROSE Fundamenta-se este teste na ag utinação de hemácias de carn
eiro sensibi izadas com hemo isina, pe o soro do indivíduo com artrite reumatóid
e. O soro do paciente com artrite reumatóide é capaz de ag utinar hemácias de ca
rneiro sensibi izadas em 75% dos casos. Esta ag utinação ocorre por causa de um
fator chamado “Fator Reumatóide”. Este teste pode ser usado em tubos 13 x 100 mm
ou em microp acas de p ástico, as mesmas que se usam para os testes de hemag ut
inação, inibição da hemag utinação e fixação do comp emento.
MATERIAL NECESSÁRIO PARA A REAÇÃO - Microp aca de p ástico (96 orifícios) - Micr
opipeta de 20 µ  e respectivas ponteiras - So ução sa ina 0,85% - Hemo isina (so
ro de coe ho anti-hemácias de carneiro) - Hemácias de carneiro - Banho Maria a 3
7°C e a 56°C - Soro do paciente - Centrífuga c ínica comum para 3.000 rpm. TÉCNI
CA DO TESTE 1. Usar as hemácias de carneiro conservadas em so ução de A sever, 
avadas três vezes em so ução sa ina. Após à ú tima centrifugação fazer uma suspe
nsão a 2% na mesma sa ina usada para a avagem. Usar um vo ume destas hemácias e
adicionar a igua  vo ume de hemo isina contendo 2 unidades hemo íticas (3 m  de
hemácias a 2% + 3 m  de hemo isina com 2UH). Deixar no banho maria a 37°C, por
15 minutos para sensibi izar. Em outro tubo co ocar 3 m  de sa ina e 3 m  de sus
pensão de hemácias a 2%. Estas hemácias servem de contra-prova. 2. Usar uma micr
op aca e marcar duas fi eiras (cada uma com 12 escavações), uma com a etra A e
a outra com a etra B. 3. Co ocar em todas as escavações das fi eiras A e B, 20
µ  de sa ina.
124
4. Nos orifícios A1 e B1, adicionar 20 µ  de soro inativado do paciente. Com out
ra ponteira de 20 µ  homogeneizar o íquido do 1o orifício passando 20 µ  para o
2o, daí para o 3o até o 11o, desprezando 20 µ . Deixar o orifício A12 sem soro
(contro e). Do mesmo modo, proceder as di uições da fi eira B. As di uições do s
oro em ambas as fi eiras são: 1:2, 1:4 ... 1:2048. 5. Adicionar 20 µ  de hemácia
s sensibi izadas em todos os orifícios da fi eira A, isto é de A1 a A12 e a cada
um dos doze orifícios de fi eira B adicionar 20 µ  de hemácias não sensibi izad
as. Agitar suavemente e incubar a p aca a 37°C por uma hora transferindo-a, em s
eguida, para a ge adeira. 6. Leitura: Após 30 a 60 min na ge adeira proceder a 
eitura. Observar a presença ou não da hemag utinação em todos os tubos das fi ei
ras A e B, inc usive os contro es (A12 e B12). 8. Resu tado: É ca cu ado pe o qu
ociente da recíproca da maior di uição do soro que produz ag utinação com as hem
ácias sensibi izadas, pe a maior di uição do soro que ag utina as hemácias não s
ensibi izadas. Exemp o: se o títu o da fi eira A for de 1:256 (8o orifício) e se
o títu o do mesmo soro na fi eira A for de 1:32, teremos: 256: 32 = 8. É uma pr
ova negativa pois só a consideramos positiva com o resu tado fina  igua  ou maio
r que 1/32.
125
TESTE DE FIXAÇÃO DO COMPLEMENTO Considerções Gerais O teste de fixação do comp e
mento foi até a década de 1970, amp amente uti izado para diagnóstico de muitas
doenças virais, bacterianas, mico ógicas e parasito ógicas. Naque a época esta r
eação iderava entre as demais executadas nos aboratórios. Em a guns casos, com
o nos vírus Inf uenza e a é tipo específica, e no caso dos Arbovírus e a é sub-g
rupo específica e no caso dos Adenovírus e a é grupo específica. Apresentando ou
não especificidade ainda hoje é empregada para o diagnóstico aboreatoria . Com
o aparecimento dos testes de Imunof uorescência, de ELISA, da Quimio uminescênc
ia da Imunoperoxidase e Western B ot e a tem seu uso, atua mente, bastante restr
ito. A fixação do comp emento em re ação a estes ú timos testes, perde por sensi
bi idade e especificidade. Mesmo assim, este teste está onge de cair em desuso
e deve continuar sendo úti  por a gum tempo. Fundamento O fundamento do teste ba
seia-se na propriedade que tem o anticorpo de se combinar com o antígeno e consu
mir o comp emento, evitando a hemó ise do sistema reve ador. Materia : a) Microp
acas de fundo côncavo. As microp acas norma mente usadas possuem 96 orifícios.
Dependendo da preferência de cada um pode-se usar tubos ou macrop acas. Estes tê
m, porém, o incoveniente de ser anti-econômicos. b) Centrífuga c ínica com capac
idade de atingir 3000 rpm, rotor horizonta . c) Banho maria a 37oC e a 56oC. d)
Micropipetas
a

 de
 10, 20 e 25μl e as respectivasponteiras. e) Tubos e centrífu

cônico raua os e vi ro. f) Tampão Fosfato e pH 7,2 ou solução a 0,85% e Cl
oreto e só io conten o ions cálcio e ma
nésio (Ca++ e M
+ , sensibilizam a reaç

ão).
) Hemácias e carneiro a 2%em tampão  fosfato ou salina a 0,85% h) Hemolis
ina i) j) Complemento em solução e Richar son (solução conserva ora). Antí
eno
para o qual se queira pesquisar o anticorpo.
  
k) Soro opaciente inativa o (56oC por 30  minutos). Nesta operação ocorre a es
naturação o complemento, principalmente a fração C3.
126
l)
 
Solução
 salina tampona a com cálcio e ma
nésio, 10 vezes concentra a conforme fó
rmula escrita a se
uir:
NaCl.......................................................70,0
KCl............
............................................3,7

NaHPO412H2O................................................3,01
K2H2PO4........
..................................................0,24
M
Cl2H2O................
.......................................10,0
CaCl2..............................
.................................0,45


 M Cl2....................................



..........................0,34 Á ua estila

 a q.s.p. ..........................


.............1000,0ml
  Diluir os sais  separa  amente e conservar em ela eira. Na


hora e usar iluir a 1/10 em á ua estilaa e, se necessário,ajustar o pH para
7,2 com  os mesmos sais usa os no preparo a solução. Técnica a Reação – Pa ron
ização os Rea
entes Sistema Hemolítico:  Hemácias sensibiliza
 as e carneiro a 2
% (antí
eno) e hemolisina – soro ecoelho  anti hemácias e carneiro
 (anticorpo)
. Nota:a Hemolisina é também chama a e soro hemolítico,  soro  e coelho anti
l
óbulos e carneiro. a) Hemolisina: A hemolisina usa a é osoro e coelho anti-
l
óbulos e carneiro. Parase obte-lo inoculam-se
lóbulos e carneiro em coelho e
, após haver a formação e anticorpos para
lóbulos e carneiro, retira-se o san

ue, eixano-se coa
ular para separar o soro. Centrifu
a-se o soro, para se ret

iraral
uma impureza que tenha  fica oe inativa-se a 56oC por 30 minutos. Isto v
isa estruir o complemento o soro. A iciona-se, então, parte i
ual e
licerina
 
como preservativo  e conserva-se, para uso na
elaeira a 4oC.  b) Glóbulos e ca 
rneiro: Colheita  e san
ue: colhe-se
 a quanti a e e san
ue e carneiro que se
eseja,



 empre an o i ual volume e Alsever, que é uma solução anticoa ulante cons
erva ora. Solução e Alsever: Glicose...........................................
 
...................2,05
 Citrato
 e só io.......................................
..........0,8
Cloreto e só io................................................0


 
,42 Á ua estila a q.s.p. .......................................100ml
    Ajustar
o pH a 6,1 com a solução à 5% e áci o cítrico. Esterelizar urante 3 ias a 100
oC por30 minutos. O san
ue é
uarao em
elaeira a 4oC e mantio estéril. O s
  
an
ue e carneiro  coleta
 o em Alsever conserva-se bem por3 a 4 meses es e que
não


 seja a ita o a ca a vez que for usa-lo, sem variação e resistência lobular
urante, pelo menos, uma semana. A conservação é tanto
127

 
maior quanto  menos a itação sofrer  o frasco conten o as hemácias. Po e-se conser
var até60 ias em perfeitas  con
 ições a 4oC.  c) Complemento: Ocomplemento é ob
ti o me iante punção  car iaca e cobaios
 a ultos e sãos, evitan o-se as  fêmeas p
renhas. Os animais everão ser  manti os em jejum urante  12 horas, sen o conveni
ente usar a mistura esoros e, pelo menos, 4 cobaios, evi o ao  fato o comple
mento serconstituí o e, pelo menos 9 frações  (C1 a C9) e, usan o-se apenas um
cobaio po erá estar ausente uma ou mais estas frações. Desloca-se o coá
ulo ime
   
iatamente após se ter  forma o, eixa-se urante 2 horas atemperatura ambiente 


e separa-se o soro me iante centifu ação lenta (1500 rpm) urante10 minutos, e
 
maneira a evitar
 a hemólise.
 Será então mistura o com a solução
 e Richar son,
na proporção  e 8 partes o soro (complemento)   mais uma parte  e solução B, mais
uma parte e solução A. A solução e Richar son é constituí a e uma solução A
e uma solução B. NOTA: é importante juntar-se ao  complemento
 em primeiro lu
ar,


a solução B e, em se ui a a solução A. Solução e Richar son: Solução A Áci o bó
rico (H3BO3)......................................................0,93
Bórax (N
a2B4O710H2O)...................................................2,29
Sorbitol (C
6H14O61/2H2O)...............................................11,47
Solução satur
   
a a e cloreto e só io q.s.p. ......................100ml Solução B Borax......
........................................................................0,57
Az
 
i a só ica....................................................................0,
 
81
Soluçãosatura a eNaCl q.s.p. .....................................100ml
   O
bservação:
  issolver
 ca a substância separa amente em solução satura a e cloret
o e só io juntan o-as epois.
    
) Titulação o complemento e a hemolisina  O complemento po e ser titula  o aom
esmo tempo com a hemolisina. No primeiro ia,  preparam-se as várias iluições

 o
complemento.
  Para isso junta-se uma
 parte e complemento  e 7 partes
 e á ua es
tila a, fican
 o o complemento
 ilui
 o a 1/10, em vista e possuir
 uas partes e
solução eRichar son (1 parte e solução  A mais
 uma parte e solução B). Exemp
lo: 0,4 ml e complemento mais 2,8ml e á
ua estila a = 3,2ml = 1/10. De 1/10 p
roce er as iluições
 1/20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100. Para fazer as iluiç
ões em tubos e hemólise, proce er assim:
128
Complemento 1/10 0,5ml (1 mais 1) 0,5ml (1 mais 2) 0,5ml (1 mais 3) 0,5ml (1 mai
s 4) 0,2ml (1 mais 5) 0,2ml (1 mais 6) 0,2ml (1 mais 7) 0,2ml (1 mais 8) 0,2ml (
1 mais 9)
Salina 0,5ml 1,0ml 1,5ml 2,0ml 1,0ml 1,2ml 1,4ml 1,6ml 1,8ml
Diluição 1/20 1/30 1/40 1/50 1/60 1/70 1/80 1/90 1/100
    
Ain a no primeiro ia, istribui-se  na placa: a) 20μl e salina em toos os orif
ícios, inclusive nos controles e complemento (CC’),  e nos
 controles
 e hemolisi
na (ver esquema na pá
ina 123). b) Colocar 10μl e ca a iluição o complemento,
inclusive nos controles complemento,não fazen o nos controles e hemolisina. A
placa é coloca a na
ela eira até o ia se
uinte ou na estufa a 37oC por uma ho
ra. Após uma hora e incubação ou uma noite na
elaeira, preparar misturas e v
   
árias iluições e hemolisina e suspensões e
lóbulos e carneiro a 2%. Mistura 
r as iluições e hemolisina e as suspensões e lóbulos em partes i
uais, eixa


r no banho maria a 37oC,
 para sensibilizar, e istribuir
 nas
 placas, numa quanti
a
 e e 20μl para ca a orifício.
 e) Preparo
 as iluições
 eHemolisina Num  tubo
e Kahn, coloca-se
 0,1ml e hemolisina e título esconheci o mais 0,9ml
  e sal
ina, fican o a iluição a 1/10. Num se
un  o tubo, colocam-se 0,7ml  e iluição 1
/10 mais 2,8ml e salina, temos assim a iluição 1/50. Usam-se  as iluições
 1/10
0, 1/200,
 1/400, 1/800, 1/1600, 1/3200, etc. Para a obtenção estas iluições, p
roce er assim: Hemolisina 1/50 1. 1,5ml 2. 1,5ml (1/100) 3. 1,5ml (1/200) 4. 1,5
ml (1/400) 5. 1,5ml (1/800) 6. 1,5ml (1/1600) Salina Mais 1,5ml Mais 1,5ml Mais
1,5ml Mais 1,5ml Mais 1,5ml Mais 1,5ml Diluição 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1
/3200

Num 7o tubo colocamos apenas 1,5ml e salina (controle).
129
   
a) Lava
em os
lóbulos: Retirar 10ml e san
ue, conserva oem Alsever, e centri
fu
ar a 1800 rpm por 5minutos, a fim e retirar a solução e Alsever. Iniciar a
lava
em propriamente ita, retirano-se o sobrenaante (Alsever). Aicionar 10m

l e salina 0,85%, a
itar e centrifu
ar a1800rpm por 5 minutos. Repetir a lava

em por mais uas vezes, até obter sobrena ante claro. Na última
em (a terce
   lava
 
ira), antes e se aspirar o sobrena  ante, verificar a quanti a e ese  imento  ou



papa e hemácias. b) Preparo os lóbulos a 2%: Completar a quanti a e obti a


e papa, comsalina, para obter uma suspensão e lóbulos a 10%. Exemplo: Obten o

-se 0,6ml e papa, completa-se com salina  até 6 ml o que correspon e a 10%.

Uma
parte os
lóbulosa 10% mais 4 partes e salina,  o que á 2%. Ex: 2 ml e lób
ulos 10% mais 8 ml e salina = 2%. Nota: antes e se iniciar a última lava
em o
 
s
lóbulos, colocar a placa naestufa, on e everá  ficar 30 minutos antes e se
juntar as hemácias sensibiliza as.  c) Mistura as iluições   e hemolisina
 aos
l
óbulos a 2% Ajuntar

  os
lóbulos e carneiro a 2% a ca  a iluição e hemolisina,
em i

 ual quanti a
 e e a itar rapi amente. 1)  1,5 ml e hemolisina 1/100 mais1,5
ml e
lóbulos e carneiro a 2%. 2)1,5 ml e hemolisina 1/200 mais1,5 ml e

lóbulos e carneiro a 2%. 3)1,5 ml e hemolisina 1/400 mais1,5 ml e
lóbulos
e carneiro a 2%. 4)1,5 ml e hemolisina 1/800 mais 1,5 ml e lóbulos
e carne

iro a 2%. 5) 1,5 ml e hemolisina 1/1600 mais 1,5 ml e
lóbulos e carneiro a 2
%. 6) 1,5 ml e hemolisina 1/3200 mais 1,5 ml e
lóbulos e carneiro a 2%. Cons
  
tituem-se

estas misturas
 as hemácias sensibiliza as. 7) 1,5 ml e salina mais 1
,5 ml e lóbulos e carneiro a 2%. Colocar estes sete tubos no banho  maria a 37
oC por 15 minutos. ) Distribuição na placa: Apósa placa ter fica o na estufa p
or 30 minutos e a hemolisina ter si o sensibiliza  a pelos
lóbulos  e carneiro n
o banho maria por
 15 minutos, faz-se a istribuição  na placa,
  on e  foram coloca
as as iluições o complemento. Colocam-se  20  μl e ca a iluição o sistema hem
olítico,  inclusive nos
 orifícios e controle
 a hemolisina, excetuan  o-se os ori
fícios e controle  o complemento, on e

só se a iciona a suspensão e hemácias
 e
salina (1,5 ml e salina mais 1,5 ml e lóbulos a 2%), 7o tubo. Após a istrib
uição o sistema hemolítico na
130
   
placa a

itar a mesma e a ca a
10 minutos,
 no ecorrer e 30 minutos. A se
uir, r
etirar a estufa e colocar na ela eira, e 2 horas após fazer a leitura. Hemolis
ina Complemento Control e o
Comple mento 1/20 1/100 1/200 1/400 1/800 1/1600 1/3200 1/6400 0 0 0 0 0 1 2 1/3
0 0 0 0 0 0 1 2 5 1/40 0 0 0 0 0 1 2 5 1/50 0 0 0 0 0 1 3 5 1/60 0 0 0 0 1 2 3 5
1/70 1 0 0 2 2 3 4 5 1/80 2 1 1 3 3 3 5 5 1/90 4 3 3 3 4 4 4 5 1/100 5 5 5 5 5
5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5

Contro- 5 le o
comple mento
 
Leitura: 0 = não há células, hemólise
 completa 1 = 10% e células 2 = 25% e cél
ulas 3 = 50%
 e células
 4 = 75% e células 5 = 100% e células
 e) Título
 a hemo
lisina: A ose ótima e sensibili
 a e a hemolisina é a iluição
 que á hemólise

completa
 com a mais alta iluição o complemento.  No qua ro acima  o ótimo e se
nsibili ae é a iluição e 1/400,que correspon e a 1UH,  uni a e hemolítica.
 f
) Título o complemento:
 O título
 o complemento será a o pela maior
   iluição
o complemento on e houver
 50% ehemólise e representará  1 Uni a e e Complement
o. Exemplo: Se a maior iluição  o complemento   on e houver hemólise e 50% for a
1/80, esta iluição correspon erá a 1 uni a e o complemento, se
uino o mesmo
    
raciocínio, 1/40 correspon e a 2 Uni a es e Complemento.
) Titulação o antí
e
no:
131
     
1. Preparo
 as iluições o antí
eno: Preparar em tubos e hemólise  as várias i
luições o antí
eno: 1/2, 1/4, 1/8,  1/16, 1/32, 1/64.a) 0,8 ml e antí eno mais



0,8 ml e salina = 1/2 b) 0,8 ml e 1/2 mais  0,8 ml e salina = 1/4 c) 0,8 ml
e 1/4 mais0,8 ml e salina = 1/8 ) 0,8 ml e 1/8 mais 0,8  ml e salina = 1/16 
e) 0,8 ml e 1/16 mais 0,8 ml e salina = 1/32 f) 0,8 ml e 1/32 mais 0,8 ml e
salina = 1/64
   
2)
 Preparo as iluições e sor pa rão: 1/10, 1/20, 1/40,  1/80, 1/160. a) 0,2 ml
e soro pa rão mais 1,8 ml e salina  = 1/10 b) 1,0 ml a iluição
 1/10 mais 1,0
ml e salina
 = 1/20 c) 1,0 ml a iluição
 1/20 mais 1,0 ml e salina
  = 1/40 )
1,0 ml a iluição
 1/40 mais 1,0 ml e salina = 1/80 e) 1,0 ml a iluição 1/80
mais 1,0 ml e salina = 1/160
  
3) Preparo o complemento: Seo título o complemento, previamente    titula o, for
, por exemplo, 1/80  = 1 Uni a e o complemento.  Usar 2 uni a es o complemento =
1/40 Ex: 0,1 ml o Complemento mais 0,7 ml e á
ua estilaa = 1/10 0,8 ml e C
 
omplemento
 mais 2,4 ml e salina = 3,2 ml  = 1/40 4) Preparo a hemolisina: Seo
título a hemolisina, previamente
   titula o, for, por exemplo,  1/800 = 1 Uni a e
e hemolisina.
 Usar 2 uni a es e hemolisina = 1/400 1 ml e hemolisina 1/40 mai
s 9 ml e salina = 1/400.
132
    
5) Preparo as hemácias
 sensibiliza as: Juntan o-se partes i
uais e hemolisina
1/400 e
lóbulos e carneiro a 2%,  após 15 minutos no banho maria, para que a he
molisina sensibilize os
lóbulos e caneiro, fica pronta a mistura e hemácias e
hemolisina.

Distribuição
   na placa:  No primeiro ia, frontalmene na placa, colocar-se-ão  10 μ
l e ca a iluição o antí
eno, sen o que, no orifício e controle o antí
eno,
     
serão coloca os 20 μl e salina e 10  μl e ca a iluição  o antí
eno. Horizontal 
mente na placa, colocar-se-ão  10μl e ca  a iluição o soro que se quer  pa roniz

ar, seno que, no orifício  e controle o soro, serão  coloca os, 10μl e ca a i
luição
 o soro e 20μl e salina. Em to os orifícios  a placa serão coloca  os 10μ
l o complemento
 (1/40) inclusive nos orifícios
 e controles, tanto nos
 o soro
quanto nos e antí
eno. Será feito isola amente  na placa um controle  e compleme
nto, ocupan
 o 4orifícios. 1o orifício: 20 μl e salina  mais 10 μl o complement

o = 2 uni aes ecomplemento. 2o orifício: 20 μl e salina  mais 10 μl  e comple
mento iluí  o (a iluição se faz num buraco acima,juntan o-se20  μl  e salina m
ais 20 μl e complemento).  O 2o orifício correspon
 erá a 1 uni
 a e e complement
o. 3o orifício: 20 μl e salina  mais 10
 μl e complemento (a
 iluição se faz em
outro buraco acima,
 juntan o-se 30 μl e salina mais
 10 μl e complemento).
   4o o
rifício: 30 μl e salina somente, o que correspon erá a nenhuma  uni a e e compl
emento que é i
ual a 0. A placa é coloca  a na


 ela eira até o ia se uinte


 ou po
r 3 horas à temperatura ambiente a fim e se imentar as hemácias. No 2o ia, ser
á coloca oo sistema hemolítico. No preparo os
lóbulos para o sistema  hemolíti
co, antes a 3a e última  lava
em coloca-se a placa na estufa, pois everá ficar
por
 30 minutosantes e se juntar o sistema hemolítico.  Distribuição na placa: A
istribuição everá ser feita apoós  a placa ter fica
 o na estufa por 30 minutos
e os
lóbulos e carneiro terem si o sensibiliza  os pela hemolisina,  no banho  m
aria a 37oC por  15 minutos. Colocam-se 20 μl e hemácias snesibiliza as em to os
os orifícios a placa, inclusive
   nos controles.
 Deixa-se a placa
 na estufa por
30 minutos,
 ten
 o-se o cui a o e a
itar a ca a 10 minutos, fin o os quais será
leva a a
ela eira por uas horas lo
o após será feita a leitura.
Leitura:
133
    
1. A iluição
 ótima
 o antí
eno é a que  fixa maior iluição o complemento. No e
xame a ota o, é e 1/80 e será esta a iluição o antí
eno a ser usaa na eterm
    
inação
 o testecom o soro esconheci
  o. 2. O título o soro pa rão étoma o pel 
a iluição que á na leitura e 50% e hemólise, a qual, com  a ótima iluição o


antí eno foi 1/80. O título o soro será 1/80. 3. Leitura o complemento: No pr
   
imeiro
 orifício o complemento foram coloca  os 10 μl, o que correspon
 e a 2 uni

a es. Deverá haver

 hemólise
 total. No se un o orifício   foram coloca os 10 μl o
complemento que, iluí o, passou a possuir  uma uni
 a e. Deverá haverhemólise  to
tal. No terceiro orifício
  foram coloca os 10 μl o complemento
 que, ilui o, pas
sou a possuir 1/2 uni a e. Deverar haver hemólise parcial e 50%. No quarto orif


ício não foi coloca o complemento lo o não haverá hemólise.
    
Reação propriamente ita: Umavez osa os  (pa ronizaos) o complemento,
 o antí
e
no, osoro e a hemolisina, po emos proce er o teste e Fixação o complemento pa
ra pa ronizar o antí
eno ou para pa ronizar o antisoro ou aina para eterminar
   
o título e um etermina o soro. A reação se passa em  uas fases.
 Na primeira
 fa


seajuntamos o soro, oantí enoe o complemento nas iluições etermina as pela

pa ronização. Na Se
un a fase a iciona-se o sistema revela or.
   
Exemplo e um teste  completo:  Tomaremos como exemplo a eterminação o título e
anticorpos
 para
 A enovírus e um certo  paciente. Material: Microplaca
 e 96 ori
fícios e fun o concavo Micropipeta e 20 e 25 μl Salina tampona a Antí
eno e A
  
enovírus Complemento Hemolisina  Hemácias
 e carneiro Banho maria a 37oC  Gela
 ei
ra Para executarmos  o teste e Fixação  o complemento
 com a finali  a e e eterm
inarmos o título e anticorpos para A enovírus,
 everemos usar to os os rea
ente
s previamente
  pa roniza os e ca
 a um numa iluição fixa, correspon en o a: uas
uni a es anti
ênicas, uas uni a es
134
     
complementares
 e uas uni a es e hemolisina. Assim teremos:  se o título  o antí

eno for e 1/80, uas uni a es anti
ênicas correspon em ao antí
eno a iluição
       
e 1/40. O mesmo proce imento eve ser feito para a eterminação as uas uni a
es complementares  ehemolíticas, por exemplo,  tomar uas vezes a concentração o
título final e caa rea
ente. Execução o teste: 1.Tomamos  uma microplaca e
96 orifícios e fun o concavo.
 Separamos
 uma fileira e oze orifícios e colocam

os
 20 μl e salina tampona a nos
 oze orifícios. Separamos  uma outra fileira
 e
ois orifícios para controle o soro, ois para controle o antí
eno, ois para
   
controle o sistemarevela or e oispara controle o complemento. Nestes  coloca

mos, também, 20 μl e salina tampona  a 2. Feito isto,  colocamos 20 μl e soro o
paciente no primeiro
 orifício  a primeira fileira e iluímos sucessivamente
 com
a micropipeta e20 μl, passan o 20 μl para o se
un o orifício, aí para o terc
eiro
 e assim por ianteaté o último 
orifício. Desta  maneira teremos o soro ilu
í o e 1/2 até 1/4096
   ( e um mo o  eral nos  testes e fixação
 o complemento,
 nã
o há necessi a e e ultrapassar a iluição  e 1/512). Nos ois orifícios o
 cont
role o soro,  colocamos também  20 μl o soro  bruto em ca a um. 3.  Uma vez iluí
o o soro, a icionamos em ca a orifício  one foram realiza as as iluições  o mes
mo, 20 μl o antí
enoconten o uas uni a es anti
ênicas, incluin o nos ois ori
fícios os controles o mesmo antí
eno. 4. A
ita-se a placa suavemente, e aicio
      
nam-se 20 μl o complemento
 conten o uas uni aes, em to os os orifícios a rea
ção propriamente
 ita e nos controles e soro, e antí
eno  e e complemento. Não
se a iciona complemento nos  controles o sistema revela or. 5. Após esta  operaç
ão a placa com a reação po erá ser incuba a a 37oC por 1 hora ou na
ela eira po
r uma noite. 6. A revelação
 é feita como sistema hemolítico, isto é, uma mistur
a empartes i
uais  e hemolisina conten o uas uni  a es hemolíticas  e uma suspen
são e hemácias e carneiro
 a
 2% em salina tampona
 a. Para isso a icionamos
 20 μ
l o sistema revela or em to os os orifícios a reaçãopropriamente ita  e nos c
ontroles (soro, antí
eno, complemento  e sistema revela or)  7. Leitura a reação:
a) Soro ne
ativo: Não haven o anticorpos, não há consumo o complemento e este
livre vai
  
entrar na combinação hemolisina e hemácias, pro uzin o a hemólise.  Se to os osc
ontroles estiverem bem, sónão haverá hemólise nos controles  o sistema revela o
r. b)Soro positivo: Haven o anticorpos há a reação e anticorpos-antí
eno e con
sumo o
  
complemento
 até
 etermina a iluição. Vamos supor até1/128 (com o tempo ocorre 
se imentação as hemácias  e formam botões).  O título e anticorpos o soro é e
1/128. O funcionamento os controles eve  estar correto, isto é, só não ocorre h
emólise nos controles o sistema revela or.
135
   
Observações: 1 – Al
uns soros po em apresentar inibi ores o complemento (antico
mplementar) ou hema
lutininas inespecíficas. As vezes, este fenômeno poe ser no

ta o claramente, isto é, o soro contém hema
lutininas inespecíficas
  ou anti-comp
lementar.
  No primeiro caso as hemácias o Sistema Revela
 or não escem para o fu
n o oorifício e no se
un o caso há a se imentação as hemácias e notamos a for 
mação e botão. No caso e haver  hema
lutininas inespecíficas,
 tomam-se 0,5 ml
e soro e trata-se com 0,1 ml e papa e hemácias e carneiro. Incuba-se a 37oC p
or 30 minutos, centrifu
a-se para separar o soro e procee-se a reação. Se houve
   
r inibiores inespecíficos o complemento, tomam-se 0,5 ml o soro e a icion-se
0,1 ml o complemento bruto, incuba-se a 37oC por 30 minutos. Após  isto, inativa

-se o soro e proce e-se novamente a reação.
 2 – To
 os os testes e Fixação o Co
mplemento
 são realizaos o mesmo mo o. No caso e pesquisarmos anticorpos no so
ro o paciente, só mu a o antí
eno. Este eve variar e acoro com o a
ente etio
 
 

ló
ico que estamos pesquisan  o.Esta mesma
 reaçãopo eser empre a a para ia no


sticar o antí eno.  Nesta moali a e proce eremos e mo o inverso ao que fizemos
anteriormente. O esconheci o é o a
ente etioló
ico (antí
eno), como  acontece po
r exemplo, na i entificação os micror
anismosisola os. Para isso everemos Ter
complemento,
 hemolisina e anticorpo
 pa roniza os. O antí
eno entra nas reações
em iluições sucessivas e os emais componentes em iluição fixa, conforme nos r
eferimos, anteriormente.
136
 

ANTIESTREPTOLISINA
  O (ASLO) Os estreptococos beta hemolíticos o rupo  A elabora
m uas espécies e estreptolisinas: 1. Estreptolisina    O, assim
 chama a por ser s
ensível ao O2 e só se manifesta a sua ativi a e quan o o cal o tóxico é trata o
com um a
ente re utor no vácuo. Uma as substâncias químicas usaas é o sulfato
 
e só io (NaHSO3). A estreptolisina S é oxi
ênio estável, não

 é anti ênica  e par
ece ser iêntica à hemotoxina estreptococica, que se injeta a no camun on
o ou c
oelho pro uz hemo


 lobinúria, anemia  e icterícia. A estreptolisina
 O é fortemente
anti ênica e in uz a formação eanticorpos  correspon  ente,  isto é, antiestrept
olisina O (ASLO). A eterminação o título e ASLO é e
ran e valia ia
nóstica
na febre reumática
 e nas infecções pelo  estreptococo
  o
rupo A,
  beta hemolític
o. O título e antiestreptolisina é a o em uni a es  To    a es Internacio
ou Uni
nais. Na febre reumática um nível e 333 UT  já é in ica or e oença e nas infec
ções estreptoccocicas recentes,umtítulo e 125 UT si
nifica infecção por esta
bactéria. Títulos altos ou subi a e título em sorolo
ia parea a são si
nificati
vos.
  
TESTE DE ANTIESTREPTOLISINA
 O O fun amento o teste baseia-se na inibição a hem
ólise pro uzi a pela estreptolisina
 O quan o esta entra em contato com seu antic
orpo correspon ente. Como to o antí
eno, a estreptolisina O eve ser paronizaa
   
. Os laboratórios e Análises Clínicas já a quirem este antí
eno paroniza o,  pr

onto para uso. Os fabricantes fornecem a estreptolisina
 O com as in icações e
iluições a serem feitas para a realização o teste.
 
MATERIAL  NECESSÁRIO - Tampão e fosfato  pH6,5 a6,7 - Hemácias e carneiro ou h
umanas o Grupo O - Pipetas e 1 ml
ra ua a em écimos - Tubos 13 x 100 mm  - Es
tante para tubos 13 x 100 mm - Banho Maria a37°C - Soro inativao a 56°C o pac 
iente
 Existem muitossoros que possuem inibi ores inespecíficos a hemólise, po
en olevar a resulta  os errôneos.  Estes inibi ores são beta-lipoproteínas e esta
s po em ser removi as por um os se
uintes processos: a) Métoo o extran - Apó
  
s à inativação
 o soro o paciente,  tomam-se
 0,2 ml este soro,  em um tubo 13 x
100 mm e a icionam-se  1,56 ml
 e tampão  e ASLO mais
 0,4 ml e extran (p.m. 500
.000) a 10% em á
ua estila a e 0,2 ml e cloreto e cálcio 1 M. Deixar uma hora
em temperatura
137


ambiente,
 centrifu
 ar por 10min.a 1.500 rpm. Colher o sobrena ante. Este sobre
na ante
 correspon e ao soro iluí  o a 1:10, pronto  para se proce er a reação.
 b)
Méto o a heparina  - A 0,2 ml
 e soro inativa o, acrescentam-se
 0,05 ml e hepa
rina a 1%, 1,8 ml e cloreto e cálcioa 0,025 M. Deixar uas horas em temperatu 
ra ambiente

 e centrifu ar a 4.000 rpm urante  10 minutos. O soro assim absorvi o
está iluí o a 1:10, pronto para ser usa o no teste.
  
TÉCNICA
 DA REAÇÃO (Rantz & Ran  all, mo  ifica a) 1 - Após a inativação  e otratam
ento o soro para a remoção os inibi ores inespecíficos, este fica iluí  o a 1:
10. Necessita-se, para  o teste,  iluí-lo a 1:100  e a 1:500. Para estas
 iluições
basta tomar 0,5 ml o soro e a icionar 4,5 ml e tampão ASLO, fican o assima 1
:100.Do soro a 1:100, tomamos 1 ml e acrescentamos 4 ml e tampão, temos a ilu
ição e 1:500. 2 - Em uma estante  para tubos 13 x 100 mm, separamosuma fileira
para
 13 tubos
 e os enumeramos
 e 1 a 13, colocamos nestes o tampão iluior, as
iferentes iluições o soro e a estreptolisina Oconvenientemente iluí a. Incu 
ba-se a 37°C por 15 minutos e a iciona-se 0,1 ml e uma suspensão  e hemácias e


carneiro ou humana o rupo O a 2%. Incuba-se a 37°C por ez minutos e proce e
a leitura a reação. Verifica-se
 se os controles funcionaram bem. No controle  se
m estreptolisina não po e ocorrer hemólise  e nos
 controles
 com hemolisina
 eveo
correr hemólise total. Para melhor enten er a isposição os tubos e a a ição o
s rea
entes basta observar o esquema abaixo:
DOSAGEM DE ANTIESTREPTOLISINA O DILUIÇÕES DO SORO TUBOS SORO DILUÍDO TAMPÃO ASLO
SLO ATIVADA INCUBAR A 37°C DURANTE 15 MINUTOS ADICIONAR 0,1 ml DE HEMÁCIAS A 2%
EM TODOS OS TUBOS INCUBAR A 37°C POR 10 MIN. DILUIÇÕES DO SORO
138
1:10
1:100
1:500
controles
1 0,1
2 0,5
3 0,4
4 0,3
5 0,25
6 0,2
7 0,15
8 0,5
9 0,4
10 0,3
11 0,2
12 -
13 -
0,4
-
0,1
0,2
0,25
0,3
0,35
-
0,1
0,2
0,3
0,75
0,5
0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
0,25
0,25
0,25 0,25 0,25 0,25
-
0,25
1:10
1:100
1:500
controles
TUBOS UNIDADES TODD
1 50
2 100
3
4
5
6
7
8 500
9 625
10 833
11 1250
12 -
13 +
125 166 200 250 333
- = sem hemólise + = com hemólise
  
LEITURA Examinar ca a tubo,
 a fim e se verificar
 qualquer sinal e hemólise. O
tubo 12que é o controle e hemácia,
 não eve mostrar hemólise e onúmero 13, co
ntrole
 e estreptolisina
  eve evi enciar hemólise total. O título o soro corres
pon erá à maior iluição
 o mesmo em
 que não ocorrer hemólise. Recomen a-se
 semp
re usar um soro pa rão
 para termo  e comparação quan o se realiza o teste e ASL
O. O título final po e ser corri
i o pela se
uinte fórmula:
    
Título o soro
 o paciente:Tít. teórico o soro pa rão X tít. o soro paciente
Título obti o com o soro pa rão
TAMPÃO PARA ANTIESTREPTOLISINA O KH2PO4 ........................................
....................3,17
NA2HPO4 .............................................
............1,81
NaCl
 ........................................................

.........7,40
Á
ua estila a q.s.p. ...................................1000,0

ml Dissolver os sais separa amente em um pouco e á
ua. Ajuntá-la e completar o


volume para 1000 ml. Conservar em ela eira a 4°C.
139
TESTE DE NEUTRALIZAÇÃO
  
INTRODUÇÃO O Teste e Neutralização  é lar
amente  utiliza o no ia
nóstico viroló

ico. Serve para a i entificação e vírus quan o se tem o soro imune específico
 
 
ou é utiliza o para o soro  ia nóstico, isto é, pesquisa o anticorpo
 para eterm




ina o a ente etioló ico, ese que se tenha o antí eno pa roniza o. Este varia c
onforme o a
ente etioló
ico e que se suspeita. As infecções causaas por vírus

icas contra um ou mais antí
enos virais. Em
e
in uzem típicas respostas imunoló     
ral,
 esenvolvem-se respostas e natureza 
celular
 e humoral, 
e mo o que a me i
a equalquer uma po e permitir o ia nóstico e virose. O ia nóstico laborator 
ial e uma  infecção viral é realiza  o a custa e recursos soroló
icos, pela emo
nstração o aumento o título e anticorpos. Os méto os para quantificar os anti
corpos nas viroses, são basea


 os nas clássicas reações antí eno-anticorpo. Os mé
to os mais comumenteempre a os incluem as reações: fixação o complemento, neut
ralização, inibição e hema
lutinação e imunofluorescência. Aqui, será ao enfo
    
que
 ao teste e neutralização,   on e serão abor a os iferentes aspectos, como fu
n amento, técnicas e utili a es.
    
FUNDAMENTO Os anticorpos neutralizantes  e vírus são etermina os pela a ição e
soro, que os contém, a uma suspensão e vírus, inoculan o-se epois  a mistura e
m
 hospe eiros suscetíveis, como culturas e células, ovos embriona
 os e animais
e laboratório.  A presença
 e anticorpos neutralizantes é emonstra a se os hosp
e eiros utiliza os  não esenvolverem  efeitos citopáticos, “pocks”,
 paralisia
 e o
u morte, no caso o uso e culturas ecélulas, ovos embriona os e camun on
os r
espectivamente. Enquanto  isso os hospe eiros-controle,
 que receberam
 vírus
 com s
oro sem anticorpos,
 esenvolvem
 o efeito o vírus.
 A proteção o hospe eiro cont
ra os efeitos o vírus emonstra a presença e anticorpos neutralizantes.  Em out
ras palavras, o teste  e neutralização
  baseia-se na capaci a e
 que tem os antico
 
rpos específicos o soroem  estu o e neutralizarem
 etermina
 o vírus, impe in  o
, assim, a infecção num a o sistema hospe eiro conheci o, caso contrário evi en
ciaremos a ausência e anticorpos para o vírus em questão.
140
     
TESTE DE PROTEÇÃO Uma outra mo ali a e e neutralização é o teste e proteção. E
ste consiste em primeiro lu
para etermina o a
ente vir
 ar, inocular o antissoro
al ou bacteriano, no hospeeiro, como: cultura e células, ovos embriona os e an
imais, espera-se um tempo e 30 a 60 minutos e após isto inocula-se o a
ente que
se quer testar. Se o soro for eficiente não haverá efeito sobre o hospe eiro.
   
EMPREGODO TESTE - Usa o em ia
nóstico laboratorial quan o se têm soros  parea o
s e se eseja evi

 enciar a conversão soroló ica, ou seja,  o
aumento
 e pelo meno
s quatro vezes o título e anticorpos neutralizantes, o se un  o soro para
 o pr
imeiro. - Do mesmo mo o,usamos o mesmo teste para  a avaliação  o título
 e anti
corpos. Neste caso,
 usan o-se
   apenas
  uma amostra e soro,
 quan o é e interesse
conhecer

 o rau e imuni a e o in iví uo

para
 etermina o vírus, já que osanti
corpos etecta os pela neutralização
 sur em urante a infecção e persistem uran
te muitosanos. A imuni a e anti-viral é sempre estu a a nos exames,  principalme

nte, quan o se trata e saber se os pacientes já foram infecta os por  iferentes
vírusou esenvolveram anticorpos para as vacinas comumente empre a as na profi

laxia e viroses, como poliomielite, sarampo, caxumba, raiva, etc.


DIFERENTES

 TIPOS DE REAÇÃO   DE NEUTRALIZAÇÃO   1 -Neutralização  em Camun on os Cam
un on os e suscetibili
 a e uniforme e i a e-pa rão conheci as  são  inocula os po
r uma via
 pa roniza
  a com a mistura vírus e soro. São observa as iariamente a p
rocura esinais
  e oença, tais como fraqueza e paralisia, para
 estabelecer
 ae
specificia e as mortes. Os sintomas e as mortes são re
istra as iariamente u
rante 21 ias. As mortes que ocorrem nas 24 horas posteriores à inoculação  são a
tribuí as às causas traumáticas
  ou não
 virais. A
 suspensão viral usa a é titula
a pelavia e inoculação a otaa.A ose letal e 50% DL50estatisticamente,  é c
alcula a e um número etermina o e DLé empre
a o para ca  a mistura e vírus co
m soro. Por outro la o, o soro é manti o constante, e as iluições virais, variá
veis.

2 - Neutralização em Culturas e Células Baseia-se no mesmo princípio:  o anticor

po viral
 neutraliza,
 especificamente, os efeitos
 citopáticos  o vírus. Em ca a s
érie e reações e neutralização
 são realiza as titulações e controle e vírus,
e o vírus é utiliza o na reação, na iluição referente a 100 TCD (Tissue Cultur
e Dose).
141
     
A concentração mais alta e ca a soro é testa a quanto a possível toxici ae cel
ular específica. Para remover possíveis substâncias  interferentes ou inibi oras
inespecíficas, é necessário aquecer o soro a 56°C urante 30 minutos. Na reação,
são
 feitos controles
 e células,  para a avaliação o teste. As culturas  são inc 
uba as a 37°C urante 3 ias e, epois,
  examina as ao microscópio. Os etalhes
a execução esta reação variam, po  en o ser feita em tubos - macrotécnica ou em
placas - microtécnica. A técnica escrita a se
uir, etalha a execução a reação

e neutralização
 em microtécnica, já que esta não só, é mais econômica  que o te
ste realiza o por macrotécnica, em termos e rea
entes, como também e fácil man
useio e leitura.
 
3 - Neutralização
 em Ovos Embriona os É bastante usa o para  vírus respiratórios


e o proce imento é, praticamente, i ual aos testes realiza os em animais ou em c
élulas.

TITULAÇÃO DE ANTICORPOS NEUTRALIZANTES EM MICROTÉCNICA 1. Preparo as microplaca
s a) Colocar as placas no álcool a 70% por 1 hora; b) Tirar o álcool, eixar esc
orrer e secar na estufa por al
umas horas; c) Colocar as placas para esterilizar
em ultravioleta por 1 hora.
    
2. Material - Micropipetas e 0,025 ml; - Microplacas e fun o re on o com  tampa
s; - Meio Gey ABCcom antibióticos; - Salina estéril;  - Micro ilui ores e 0,025
ml; - Diluições
  o vírus - volume  maior para a iluição correspon ente a 100
 TC
D;
 - Soros iluí os 1:4; - Desseca or; - Áci o sulfúrico 1M; - Bicarbonato e só
io 1M.
3. Técnica
142
     
- A partir
 o se
un o orifício e uma fileira a placa, colocar 25 µl eGey ABC
, usan o micropipeta estéril;  - Colocar  25 µl e soro,  previamente iluí o em Ge
y ABC, no primeiro e se
un o orifício e uma fileira e placa. Lavar a micropipe
tacom salina estéril entre um soro e outro; - Fazer iluições os soros a parti
r o se
uno orifício a fileira com ajua os microiluiores; - Colocar 25 µl
  
e vírus suspensão
 conten o 100 TCD com micropipeta,  emto os os orifícios; - Fa
zer controle o vírus utiliza o no teste, colocan o em ois ou mais orifícios a
placa 25 µl e Gey ABC e 25 µl e suspensão  viral;
 - A
itar levemente, fechar c
om
 tampa e colocar em ambiente e CO2 ( esseca or: áci o sulfúrico e bicarbonato
e só io na  proporção 2:4 respectivamente);  - Incubar a 35°C por 2 horas ou man
ter em
ela eira (4°C) por uma noite; - No ia se
uinte, fazer suspensão e célu

las em meioMEM Ea
le com  5% e soro fetal bovino, e colocar  1
ota, com micropi
peta, em ca a orifício a placa; - To o o experimento    eve ser feito e maneira
asséptica;
 - Incubar a 37°C por 3 a 5 ias, epen
 en o o vírus. Obsevar os resu
lta os e interpretar.   Observações: A suspensão
 eve ter 150.000 - 200.000 céls/m 
l. Não há necessi a e e contar em câmara e Neubauer, basta observar através a
luz a concentração a suspensão celular.
   
TESTE DE DIFUSÃO EM GEL O teste e ifusão em
el vem  sen o usa o há
muito tempo
. Serve para pesquisar anticorpos no  soro ou para i entificar micror  anismos, co
mo vírus,  bactérias,
 etc. É um méto o que apresenta pouca sensibili a e, por iss
o tem si o usa o, em menor escala no laboratório e Análises Clínicas.
 
eno e e anticorpo colocaos lao a la
FUNDAMENTO: Baseia-se
na ifusão e antí  
o em um suporte e el (normalmente, a
ar ou a
arose). No ponto e encontro  os
ois teremos uma reação A
-Ac e precipitação. Neste caso temos a upla ifusão (
DD). Outra técnica consiste em a icionar ao a
ar, aina funio (+/- 45°C) o ant
    
í
eno ou o anticorpo, epen en o o que se vai pesquisar. Colocan o, por exemplo
, o antí
enonum orifício

 feito no a ar, este se espalha e se combinacom o anti
corpo forman o umhalo e precipitação. Neste caso temos a ifusão ra ial simple 
s (DRS). O teste  e DRS presta-se muito para se fazer levantamento soroló
ico e
vários
 tipos e infecções presentes ou passa  as. Um exemplo que a Or
anização M
un ial eSaú e usou muito foi a pesquisa  e anticorpos  para o vírus  Influenza A
2, a fim e se fazer um levantamento epi emioló
ico a
ripe no mun o.
143
  
TÉCNICA DA DRS: 1. Tomar  um a
ar a 0,5% em tampão e fosfato  pH 7,2, fun í-lo em
banho maria a100°C eixar esfriar a 45°C,  acrescentan  o o antí
eno em concentr



ação paroniza a. Paraum antí eno conten o 2,7 m % e proteína, basta colocar e




m 3ml e a ar, 30 µl e antí  eno,  homo eneizar e verter sobre uma lâmina  escava

ar fi
a e plástico, ten o o cui a o e nivelar  a lâmina para que a cama
  a e a
que com espessura
 homo
ênea. Após  à soli ificação perfurar  a cama


 a e a
ar com
uma


 a ulha e calibre 16 corta a em ân ulo reto. Não se  ispon o e uma a ulha p
o e-se fazer os orifícios com uma pipeta Pasteur corta a em ân
ulo reto. Desobst
ruiros orifícios  com pipeta Pasteur e vácuo. A lâmina estápronta  para o uso. E
m ca a lâmina po em-se  fazer 48 orifícios. Se não for
  usar e ime iato
 as lâmina
s evem ser embala as em saquinhos plásticos  bem ve a os e conserva
  a 4°C. Nu
as
nca con
elá-las.  2. Em ca a orifício a lâmina colocar 3 µl
  o soro e um pacien
te, não iluí o. Após  a icionar os soros (não se esquecen o e um controle posit
ivo e um ne
 ativo), eixar a lâmina a
 uma temperatura  e 4°C a 8°C, por uma
 noit
e. 3. Haven o anticorpos no soro, po
 erá ser visualiza o
 um halo em re or
 o ori
fício, on e o soro for positivo, po en o ser  muito níti o ou pouco níti o. 4. Me
r
ulhar a lâmina em salina  ou PBS pH 7,2, eixar por 6 horas ou mais. Este mer
u
lho remove o excesso  e proteínas eos halos  tornam-sebem  níti os. 5. Aleitura
é feita pela área e precipitação e ca a soro que é a a pelo tamanho o halo,
em mm2. A área será tanto maior quanto mais positivo for o soro. 6. Se preferir

uarar a lâmina eve-se corá-la, com tiazina vermelha a 1% ou com Ponceau S a
   
1% iluí o em solução e áci o tricloroacético  a 5%. Para a coloração mer
ulhar
no corante
 urante
 30 min. Retirá-la a solução corante,  lavá-la li
eiramente em


á ua

 estila
 a e mer ulhá-la 
numa solução para a escoloração (solução salina +

ulhaa na solução, a
5% e áci o acético + 3% e licerol). Deixar a lâmina mer

itan o e vez em quano, até a escoloração. Após a escoloração, retirá-la o
  

líqui o e eixar  secar
 em estufa a 37°C. 
Vamos ter uma película e aarose que s
e conserva in efini amente. A função a licerina é evitar a quebra a película
e a
ar.
TÉCNICA DA DUPLA DIFUSÃO
144
 
1. Preparar a lâmina com a
ar sem antí
eno esem anticorpo.  Fazer uma série e o
rifícios sen o um central e outros emtorno
 o central.
 A istância entre
 os ori
fícios
   externos e o central vai epen er o tamanho e ca a orifício e a quanti
a e e rea
ente que caa um levará. Também, poem ser feitos ois orifícios, um
   
ao la o o outro, obe ecen o à mesma re
ra usa a para o anterior (ver fi
. abai
xo).
2. Colocar

 osantí enos nos orifícios laterais e o anticorpo no orifício central

enos ou o antí
eno no orifício central e soros n
no caso e i entificar   os antí  
aslaterais
 no caso e i entificação os soros. Quan o se fazem   orifícios um ao


lao o outro, coloca-se soro em um e antí eno no outro, po en o, ao mesmo tempo 
i entificar
 o soro
 ou o antí
eno. Em ambosos casos, no ponto e encontro a i


fusão o soro e o antí eno teremos linhas e precipitação (ver fi ura acima e n

a pá
ina se
uinte).
 
LEITURA No caso  os orifícios
 ispostos em círculo em relação a um orifício cent
ral, teremos, e acor o com a representação  a se
uir: 1. Os antí
enosA e B são


i uais e apresentamlinhas i ênticas e precipitação como antissoro o orifício
central. Há fusão as linhas.


 Osantí enos têm o mesmo eterminante. 2. Entre o

ica ou reação e inte
s antí enos B e C não há i enti a e ou epen  ência imunoló
rsecção. Os  eterminantes
  anti
ênicos são iferentes. 3. Entre  os antí
enos C e
D há uma i enti a e parcial com formação e um esporão. Os eterminantes C e D q
ue rea
em com o soro anti C e D têm parte comum. Porções anti
ênicas menores ent
re C e D formam o esporão. 4. Entre os antí
enos D e E existe uma ientiae par
   
cial além isso  iferenças
  menores entre os ois antí
enos  mostram uplo esporão

. 5. Há uma i enti a e entre os antí
enos E e F, aparecen oa fusão e linhas e
precipitação. Entretanto o antí
eno F apresenta uma linha e precipitação que n
ão se observa com



 o antí eno E. O
antí eno F apresenta ran e cruzamento com E,

eno E. A fo
mas é constituí
 o e porções anti
  ênicas que não encontramos no antí
rmação e esporão aparece quan o ois antí
enos são comparaos frente a um siste
 
ma eanticorpos. Em um sistema   possui  eterminantes
  ausentes e em outro há, tam
bém, eterminantes comuns an o uma i enti a e parcial.
145
146
    
IMUNOELETROFORESE
 A imunoeletroforese é a combinação a eletroforese e upla i
fusão em
el e a
ar, que se realiza em uas etapas. Neste particular aplica-se 
uma
 corrente elétrica no sistema.Na primeira  etapa separam-se os componentes e
etermina o antí
eno,
raças às iferenças  e suas car
as elétricas. Numa 2a et


apa faz rea ir estas frações  já separa as com um antissoro específico. Este méto
o permite caracterização e uma substância, simultaneamente, para  três parâmetr
os:
  a) Saber suas características  eletroforética b) Difusibili a e c) Especifici
a e imunoquímica Este é um méto o que foi utiliza o em lar
a escala em toos os

ia, por seu alto poer e resolução, bastano mencionar que a el
ramos a biolo
    
etroforese o soro oin  ivíuo nos  permite
  evi enciar30 componentes. Há uma co
mbinação e sensibili
 a e e e po er e i entificação os iferentescomponentes
. Por outro la o, a quanti a e e soro  é mínima, com apenas 5 µl, po e-se fazer
uma análise ampla o material a ser i entifica o. No soro humano encontramos, pe
la eletroforese, 5 componentes:
 albumina, alfa 1, alfa 2, beta e
ama
lobulina.
Estas

frações se separam e acor o com as car as elétricas. Numa 2a fase, aplica

n o um soro imune específico paralelo a ca a uma as frações e fazen o atuar a c
orrente elétrica, vamoster uma combinação e ca a fração anti
ênica com osoro.
Ocorre uma combinação
 e ca a fração anti
ênica com o anticorpo correspon ente
e, por sua vez, á-se a separação e outros componentes  anti
ênicos e a respecti
vacombinaçãocom os anticorpos  específicos
  e ca a sub-fração. Nesta nova fase
po emos proce er a análise e
ran e quanti a e e sub-frações combina as comos
seus anticorpos
 específicos.  Em Análises Clínicas este  sistema foi substituí o
por uma série e testes mo ernos, mais eficientes e e fácil realização, como  os
testes e imunoenzimático, fluorimétricos  e outros  que permitem separação os c
omponentes como a cromato
rafia em
el e acrilami a.
147
ELISA (ENZYME-LINKED IMMUNOASSAY)
  

O ensaio e ELISA é um os tipos e teste  mais empre aonos laboratórios    hoje e
m ia, istoporque ele oferece
 simplici a e, sensibili
 a e e epen en o o kit a
especifici a e superior a e vários testes. A meto olo
ia este ensaio se mostr
  
ou tão eficaz, que ele acabou substituin o os testes e Ra io Imuno Ensaio  (RIE)
, justamente
 por ser um teste mais estável e permitir o armazenamento o kit por
um perío o bem maior sem que seus rea
entes sofram e
raação. Os testes e ELI
 
eneos e Hetero
eneos. Nos testes homo

SA po em ser classifica
  os em testes Homo 
eneos, a ativi a e enzimática é altera

   a como parte e uma reação imunoló  ica. N
este tipo e ensaio não há necessi a e e separar o imunocomplexo forma o os im
unorea
entes livres. As técnicas homo
eneas são especialmente elaboraas para a

 
  
osa em e ro as e haptenos, mas não tiveram seu uso ifun  i
o nos  laboratórios
e análises  clíncas, já que este apresenta problemas na osa em e proteínas. P
or outro lao, os ensaios hetero
êneos são amplamente empre
aos na imunolo
ia.
    
Neste tipo e ensaio,  a ativi a e enzimática o imunorea
ente marca o não está 
iretamente envolvi a na reação propriamente

ita;no entanto, os rea entes li a

 
os e os rea
entes livres evem ser separa os uns os outros.

ENSAIOSDE ELISA HETEROGENEOS O princípio básico o ELISA hetero
êneo se baseia
no uso e um antí
eno ou anticorpo conju
a o com uma enzima que, ao rea
ir com s
  
eu substrato, á ori
em  a um pro uto colori o, quimioluminescente
 ou
 fluorescent
e. Se for usao o méto o colorimétrico, a mu ança e cor é monitora a a olho nú
ou
 com
 o uso e umespectrofotometro   para eterminar a proporção entre a quanti  
a e ecor pro uzi a e a quanti a e e analito presente. Existe uma quanti  a e e
norme e materiais que po em ser usa os como suporte para a colocação o antí
en
 
o ou o anticorpo.  O mais comum é se fazer  uso emicroplacas  e poliestireno, p
ois estas além e serem  pequenas,
 evitan o
   esper ício e material, permitem que
se faça a análise e uma
ran e quanti a e e amostras. A técnica e ELISA hete
ro
enea, é feita com al
umas etapas e lava
em, como forma e separar os imunore
   
a
entes
 li
a os os que não estão li
a os. Está técnica   permite
  ain a se fazer u
so e ensaios competitivos e não competitivos, poen o ain a osar antí
enos ou
  
anticorpos,
  neste
 último caso,  toos os isotipos e anticorpos po em ser osa os
, tu o epen e a especifici a e o anticorpo usa o.
148
   
Ensaios competitivos Normalmente este  tipo e ensaio é usa o para se osar antí

enos, neste caso eles possuem fixa os ao suporte   sóli o anticorpos
 ou antí
enos
específicos. Estes méto os são também chama os e méto os e rea
ente limita os,
   
pois o antí
eno e o anticorpo são usa  os em quanti  a es limita
 as. Quan o o ens

aio usa um anticorpo
 específico fixa o na fase sóli  a, se a iciona a amostra o
paciente conten o o antí


eno mais o antí eno marca o,
  com isso eles irão competi

em a amostra o pacien
r pelo anticorpo
 fixa o na  fase sóli a. Junto
 com
 a osa 
te se proce e um controle o rea
ente, on e se a iciona apenas o antí
eno marca
o junto com

 um tampão a fase sóli a, com isso se tem o parâmetro  ne ativo para,
assim, po e comparar com  o resulta
 o obti o com a amostra o paciente. Isto é ne
cessário, pois
  o sinal etecta o na amostra o paciente é iversamente proporcion
al a quanti a e e analito presente na amostra,  ou seja, quanto mais analito na
amostra, menor o sinal. Existem variações  o ensaio competitivo
  na qual o antí
e
no é fixa o na fase sóli a eo ensaio po e ser realiza o em uas etapas. Nesse c
aso, numa primeira fase  se a iciona o soro o paciente no suporte, incuba-se, po
steriormente se proce e a lava
em para a remoção e tuo que não ficou li
ao ao
  
suporte sóli o, e então  se a iciona o conju
a o, e proce  e-se nova incubação.  N
esta etapa, o conju
a o irá se li
ar ao antí
eno livre o suporte sóli o, poster
 
iormente, se proce e uma nova lava
em e executa-se a fase e revelação e leitura
. Se compararmos os testes competitivos
  com os nãocompetitivos,
 veremos que  est 
es oferecem
 maior
  especifici  a e e menor sensibili a e; no entanto isto é epen
ente a afini ae e pureza  os rea
entes imunoló
icos. Os ensaioscompetitivos  s


ão i eais para osa em e moléculas relativamente pequenas que po em ser obti as
    
com relativa pureza em
ran es quanti a es, a fim e serem  marca  as com uma enz
ima. Como
 os ensaios competitivos requerem pequenas quanti a es e anticorpo, el
es são i eais para o uso em sistemas que há pequenas quanti a es e anticorpo.
   
Ensaios não competitivos
 in iretos Este tipo e ensaio é um os mais empre
a os
nos
 laboratórios e análises clínicas. Assim como os ensaios  competitivos,
 eles

po em usar antí
 enos ou anticorpos
 fixa os a fase sóli a. Quan o se faz uso e u
m antí
eno fixa o a fase sóli a, o anticorpo específico   presente  na amostra,
 se
li
ará a este. Posteriormente
 o anticorpo será etecta o com a a ição e uma imu

no
lobulina marcaa específica para o anticorpo em questão. Para se etectar  if
erentes isotipos e imuno
 lobulina, lançase mão  e imuno
lobulinas marca as espe
 
cíficas
 paraum etermina o isotipo. Este  tipo eensaio é muito empre
a o quan
o se eseja etectar anticorpos  para um etermina o a
ente infeccioso ou auto an
ticorpos. Para este tipo e teste, po e-se usar como suporte microplacas e poli
estireno, nitrocelulose, esferas e microesferas.
149
     
Quan o um anticorpo é li
a o a fase sóli a,
estes ensaios são classifica os e e
nsaios e captura ou san uíche, pois  o antí eno presente na amostra, que poe se
r um anticorpo também,  será captura o pelo anticorpo
 fixa o ao suporte sóli  o. P
osteriormente se a iciona um anticorpo marca o para um epítopo iferente o antí

eno em questão, que completará o sanuíche. Existem inúmeras variações este ti
  
po e ensaio. O antí
eno captura o po e ser uma imuno
lobulina  qualquer,  uma pro


teína viral ou um antí eno qualquer que tenha no mínimo ois epítopos iferentes
    
. Este tipo eensaio requer que uma
ran e quanti  a e e anticorpo
  esteja fixa
a na fase sóli

 a, no entanto, oferece uma ran e sensibili  a e. Os ELISAs não co

entes
mpetitivos po em ser mo ifica os para incorporar cama   as a icionais e rea
imunes, com isso se  obtém o aumento na sensibili  a e o ensaio, no entanto, ist
o acaba influencian o no  custo e no tempo e execução o teste. A
aplicação mais
comum é ocomplexo
  avi ina-biotina, que proporciona  um aumento sinificativo na
sensibili a e o teste.
 O anticorpo biotinila o é normalmente usa o como o se
u
n o anticorpo osan uíche. Ele então

  é posto para  rea ir com uma  mistura  previa 
mente prepara
 a e avi ina e peroxi ase biotinila a. Esta
 peroxi ase po e ser e


senvolvi a com a entes quimioluminescentes como forma e aumentar a sensibili a
e.
   
Outras variações o ELISA Uma as variantes oELISA,  é a que usa a membrana e
nitrocelulose como suporte sóli o, ela é chama a e ensaio Dot Blot. Neste tipo
e ensaio, o antí
eno ou anticorpo  é fixa o a membrana,
 e normalmente esta reaçã
o é observa a pela pro ução e um  pro uto colori o na membrana,
  este  é apenas um
ensaio qualitativo. Os ensaios   e Dot
 Blot po em ser mo ifica os e forma a apr
esentar uma
 maior sensibili a e e po em
 se tornar semi-quantitativos es e que s
e use um ensitometro para ler a cor a reação.
 
Problemas
 na reação  e ELISA São vários os problemas  que po em aparecer  num test
e e ELISA, aqui estacaremos os mais comuns, sen o que na tabela a pá
ina se
u
 
inte, estão representa
 os os que mais aparecem e a forma e tentar  resolver.
 Um
os problemas o ELISA é a li
ação não específica a fase sóli a. Quan o ocorre a
li
ação não específica nestes ensaios, nós a etectamos justamente no controle
     
o tampão, pois este acaba apresentan  o um sinal eleva o (chama  o e sinal e fu
n o, ou ruí o pela  literatura e lín
ua in
lesa), no controle o tampão e no con


trole ne ativo a amostra.Só como esclarecimento, o controle o tampão, é aquel
e que é feito se a icionan o apenas o tampão no lu
ar a amostra o paciente, e
 
toos os rea
entes coloca ospermanecem   os mesmos.
 A absorbância  estes controle
s eve ser menor que 0,1 Uni a es e Desnsi a e Ótica (UDO), epreferência eve
ser inferior
 a 0,05 UDO. Se a absorbância  for maior que isto, eve-se verificar
a etapa e lava
em, se esta foi executa a no número
150
     
correto e vezes ou ain a, se verificaro conju
a o utiliza o. Como forma  e cor
ri
ir
 o problema, a primeira tentativa e corri
ir o problema é aumentan o o núm
 
ero e lava
ens. Caso isto não resolva  o problema,  a iluição  e a pureza  o conj
u
a o enzimático evem ser testa
   os. Se o conju
a o não pu er ser iluí o, sem q
ue issoafete a sensibili a e o ensaio,  eve-se  pensar em substituí-lo.Outra m
aneira e resolver
 este problema
 é se a icionan
  o soro normal(1 a 5%), a mesma
espécie usa a no conju
a o, notampão e iluição. Também po e-se usar BSA (Alb
umina Bovina), na concentração  e 1 a 5%,ou qualquer outra proteína inespecífic 
a para bloquear os sítios o suporte sóli o que não rea

   iram como forma e minim 
izar oproblema. Problema Densi a e ótica o controle o PBS eleva o. Densi  a e
ótica o controle ne ativo
eleva o.
e
  Solução possível

Aumentar o número  e lava

ns Bloquear
 os sítios a fasesóli a que não rea iram; aumentar a iluição o co
nju
a o; substituir o conju
a o por um e maior pureza; aicionar e 1 a 5% e s
 
  
oro normal a mesma  espécie usa a no conju a o ao tampão e iluição; trocar  o t
ipo e suporteusa o. Controle positivo com valores  baixos. Tenha
 certeza e que
o suporte usa o é o correto; aumente a pureza o anticorpo ou o antí
eno e ca
  
ptura; aumente o tempo e ou a temperatura e incubação,   verifican o antes se am
bas estão corretas.Quano aamostra está pouco iluí a, apresenta  Dilua mais a
amostra. um resulta
 o mo era o, no entanto quan o está muito iluí a apresenta u
m valor fora a escala e leitura    o aparelho. O ensaio
 apresenta valores baixos
para tu o Verifique a inte
 ri a e o substrato e o tampão, (amostra e controle
s). certifique-se
   que o pH o tampão também esteja correto; verifique   o prazo e
vali a e os rea
entes e a forma como foram  estoca os. Resulta o a amostra  o
paciente não está  Procure pela presença e anticorpos heterófilos. con izente co
m o histórico o mesmo.

Outro problema que  costuma ocorrer, éa alta absorbância o controle ne
ativo (

eralmente acima e 0,2 UDO),al umas ascausas po em ser as mesmas que ori
inam


a leitura
 acima e 0,1 UDO o controle o tampão  e por isto as soluções a serem
aplica as são as mesmas. No entanto  isto po e não funcionar, neste caso o probl
ema po e estar presente no antí
eno e captura presente no
151
     
suporte sóli o. Outras vezes o problema po e seroriun o a presença e anticorp
os heterófilos no soro controle, com a presença e anticorpos para rato,  anticor
pos para coelho, anticorpos para bovinos, etc.  Neste caso se recomen a tratame
o
nto este soro com anticorpos  ou proteínas  a mesma espécie e animal e que são
compostos os anticorpos e captura ou ain a, trocar o soro controle ne
ativo. O
utro
 problemaque costuma aparecernos testes  e ELISA,principalmente  nos teste
s otipo san  uíche, é a obtenção e resulta os abaixo o espera o para uma amos
tra e soro e um paciente com sintomatolo
ia clínica efinia, neste caso, o qu
  
e eve estar ocorren o é que o paciente apresenta  altas taxas o analitono soro 
. O soro o paciente apresentará   resulta os mo era os  com a amostra
 não iluí a,
masassim que ela for iluí

 a, ela mostrará  resulta os eleva os, chean o ao po
nto e atésuperar a capaci a e e leitura o aparelho. A explicação  este fenôm
eno não pô e ser bem explica a até hoje.  Parece que ela é causa a por que há um
excesso e antí
eno, no qual a maioria os sítios e li
ação o antí
eno estão p
   
reenchi os, evitan o assim  a formação o san uíche. Há também  a teoria e que a
presença e anticorpos e baixa

  afini a e, a lava em ina equa a e as concentraçõ

uns testes one se
es abaixo o ótimo o conju
a o resultariam  
neste
efeito. Al
observa este fenomeno são os testes e osa em a
ona otrofina coriônica  (hCG),
marca ores tumorais,  ferritina e anticorpos e antí enos presentes em oenças in
fecciosas.
 O proce imento
 recomen ável
 para se evitar o efeito
 exposto acima,
 se

ria o e se processar uas amostras o mesmo soro, uma sem iluir  e outra
 iluí
a, só queisto implica nofator custo e por isso, não é aplica  o. Po e-se  então
tomar cui a o nas etapas elava
em, principalmente   após a a ição e ca a antico
rpo. Também o conhecimento o princípio o kit, e o material empre
ao neste aj

 

u a a resolver al uns os problemasque po em sur ir  com ele. Quanto a presença
e anticorpos
 heterófilos, estes po em ser encontra os com especifici a e para u
ma série e proteínas animais (carneiro, cabra, coelho, rato, etc). No entanto o
anticorpo heterófilo queparece promover maiores problemas nos ensaios são os a
nticorpos para proteínas e ratos. Isto
eralmente ocorre quano o ensaio o tip
   
o san uíche usa  como anticorpo e captura e anticorpo  e etecção, anticorpos mo
noclonais pro uzi os
   em ratos. Com isto o resulta o po e se apresentar acima ou
abaixo o espera o, an  o resulta os falso positivos  ou falso ne
ativos respecti
vamente. Aestimativa e anticorpos  para proteínas   e ratos   presente no  soro  nor
mal varia e 0,5%  até acima a casa os 40%, tu o epen e a sensibili a e o te
ste. Um exemplo istoocorre  com pacientes com câncer que são trata os com antic
orpos monoclonais
 pro uzios  em ratos,
 estes apresentam anticorpos para imuno
lo
bulinas e ratos  e quanti a es caa vez maiores se continuam  com otratamento. E
nsaios tipo san uíche em que se a iciona o anticorpo e
   captura e etecção em um
a única etapa são os que apresentam  maior possibili a e e ar resulta os falso

positivo. Por isso nem sempre evemos ter confiança  em testes cujo o resulta  o s
ai rápi o. Existem várias técnicas para se re uzir a interferência  provoca a por
estes anticorpos heterófilos, entre estas temos o aquecimento a amostra a 70oC
, precipitação com Poli Etileno Glicol
152
 (PEG) e o bolqueio com
   
 IG e rato.

Deve-se tomar cui a o com o aquecimento a a
mostra,
 pois isto, po e ar ori  em aresulta
os falso positivos. A forma mais co
mum etratamento
 tem si o a aição e imuno  lobulina não imune, no entanto  a qu
anti a e a iciona a e a fonte este soro evem  ser observa as. Vários estu os e
monstraram que o soro eve ser a mesmacepa  e ratos assim como  o anticorpo mon
oclonal
 utiliza o. No
 entanto é recomen a o que se
 use um pool e soros monoclon
ais
 e várias
 cepas e ratos. Na maioria  os estu os se usou aproxima  amente 10%
e soro e rato junto com o tampão e reação, no entanto o soro e al
uns pacie
    

ntes
 requer que seja usa  a uma
quanti a e em torno e 25% e soro eum lon o per
ío o e incubação afim  e corriir a interferência. Outro problema  os laboratór
ios quan o se proce e o ensaio e ELISA está na quantificação a I
M com um anti
corpo
 especifico
 para tal. Esta po eapresentar al
uns problemas, como  a presenç
a e resulta os falso  positivos evi o a presença o Fator Reumatói e (FR) na am
ostra, que como já ito anteriormente é também uma I
M. Resultaos falso ne
ativ
   


os também po  em ocorrer evi o a competição 
a IG pelo mesmo sítio  e li ação 


a I M. Uma as formas que simplificou a osa em a I M, foi o uso
e ensaios e
captura para a I
M, neste caso se usa um anticorpo para I
M fixao no suporte só
    
li o, então ao se a icionar o soro o paciente e se proce er a incubação, to a I

M o soro o paciente é capturaa. Posteriormente se aiciona um antí
eno que s
  
e li
ará especificamente a I
M.  Finalmente
 se a iciona um anticorpo marca o iri

i o ao antí
eno previamente a iciona o. Este ensaio torna óbvio os problemas co
    
m resulta os falso ne
ativos evi o a inibição  competitiva  a li
ação a I
M ass
im como to a aI
G presente na amostra o paciente é lava a noprimeiro passo. É
claro que ain a po em ocorrer resulta os falso positivos evi o a li
ação o FR
 
que po e rea
ir com a I
G o conju
a o ou se li
ar a I
G específica para o antí

eno presente na amostra. Uma as formas e evitar este problema a li
ação com
   
o conju
a o é sefazen o o uso e F(ab)2 como anticorpo  e captura. Alternativam
ente o ensaio po e ser mo ifica o para uma técnica ireta, se empre
ano um antí
  

eno marca o com uma enzima na se
un a fase, esta forma eliminan o qualquer imu 
   
no
lobulina que po eria se li
ar ao FR. Se fazen o uso estas mo ificações prova
velmente não teremos mais resulta os falsopositivos,muito   embora eles  ain a po
ssam ocorrer. Para  sistemas em que
 não há isponibili
 a e os ensaios e captura
para a I
M,po e-se lançar mão e um ELISA in ireto com o antí
eno imobilizao
 
na fase sóli a e o uso e um anticorpo  específico para a I
M na fase secun ária
o teste.  No entanto isto só po e ser  feito se tivermos etapas  para a ição a am
ostra e os imunorea
entes. Deste mo o evitaremos  os resulta os falso positivos
e falso ne
ativos. Existem  várias formas
 e se fazer
 isto. Também
 existem no mer
ca o colunas capazes e separar a I
G a amostra o paciente, e forma que obten
hamos a I
M pura e com a vanta
em e não termos também  o FR pois a I
G presa na


coluna a e como substrato para o mesmo. Também po e-se remover to a a I
G a amo
  
G que a
iria como a
ente precipitante.
stra com a a ição e um prepara o anti-I  
O problema esta


 técnica é que não po emos
arantir  que to a a I G seja completa
mente removi a a amostra se esta contiver ran es quanti a es e anticorpos pol
iclonais.
153
    
Além isso istonão elimina  a presença o FR na amostra, que eve ser trata a pa
ra a sua retira a. Esta po e ser removi a se a icionan o I
G para  que ela se a
r

que isto não irá eliminar o resulta o falso ne
ativo
e uee assim precipite. Só

evi o ao alto nível e I G específica presente naamostra.
 Para
 que o teste e
ELISA forneça os resulta os entro os parâmetros eseja os, eve-se sempre  ter
os se
uintes controles corren o junto com o ensaio: controle o PBS  ou o tampão
, controle

 ne ativo, controle positivo alto e baixo. No entanto, urante  o teste
poe-se a icionar outros controles como a a ição e amostras  normais epacient
es e forma aleatória.
 Nos kits em que não se tem
  o número e controles
 esejáve
is, po e-se
 a icionar controles internos compra os e laboratórios e confiança,


incluin o-se aícontroles ne ativo, e e novo  positivo
 fraco e forte. Também po
e-se fazer uso e um mesmo soro controle, o osan o pelo menos umas 20 vezes se

uias em ias iferentes, como forma e verificar se o ensaio se mantém preciso
.
154
IMUNOFLUORESCÊNCIA
 
INTRODUÇÃO A fotoluminescência  é o princípio a técnica e imunofluorescência no
entanto, existem três tipos e fotoluminescência,  os quais são: a fluorescência
, a fosforecência e a fluorescência tar ia. Destes apenas a fotoluminescência  e
fluorescência
 interessam a
 nós. A fotoluminescência
 ocorre quan o moléculas são
excita as pela interação os fotons com a ra
nética. A fluorescên

 iação eletroma
  
cia é a ra iação e ener  ia que ocorrequan o uma luz e comprimento e on a cur
to excita
 os eletrons e uma molécula e forma que elas tem o seu comportamento
altera o. Conformeasmoléculas fluorescêntes se tornamexcita as, os eletrons p
assam para um esta o e alta ener
ia por um curto perío o e tempo, normalmente
em
unos. A ener
ia liberaa é expressa na forma e luz e um comprimento
 nanose
     
e on a maior o que o a luz responsável   pelo esenca ear o processo.  Temos a
in a a luminescência
 é a emissão e luz e uma
 substância excita
 a quimicamente
que retorna a forma eletrônicamente excita
 a para o seu esta o normal. Descrito
entãoo princípio básico  as técnicas e fluorescência, passemos  então as aplic
ações a mesma. O teste e imunofluorescência é, atualmente, usa o em lar
a esca

la em uma série e enti a es patoló
icas, tais como:  oenças bacterianas, virais
 
,protozooses, parasitoses e oenças imunoló
icas iversas. Existem uas mo
      ali

a es e testes  e imunofluorescência, o méto  o ireto e o in ireto. O méto o ir
eto é aplica o nos casos em que temos e ientificar o micror
anismo nas secreçõ 
es, em biópsias ou necrópsias. Para isso, eve-se ter o soro imune conju
a o com


fluoresceína ou ro amina para o a ente que se quer pesquisar. Este soro   imune p
o e ser policlonal
  ou monoclonal. Este último confere alta especifici a e ao tes
te. O méto o in ireto presta-se muito bem ou para pesquisar o a
ente etioló
ico
 
nas secreções, nos teci os (biópsias  ou necrópsias) ou para se etectar anticorp
os no soro o paciente. No caso e se pesquisar  o micror
anismo evemos ter o ma
terial fixa
o a uma lâmina.
Este  é trata o por um antissoro  homólo
o e, em se
ui
a, com uma lobulina conju a a com fluoresceína ou ro amina específica para aqu
ele antissoro
 e ler aomicroscópio fluorescente. Exemplifican o,se tomarmos um
material
 e vesículas a pele para pesquisarmos
 Herpes simples, os tipos 1 e 2, 
everemos ter osantisoros
  para os ois
 tipos o vírusHerpes. O material  fixa
o em uma lâmina a equa a é ivi i o em ois campos e ca a campo trata o por um a
ntissoro específico. Apósisto, epositar  sobre o esfre
aço uma
lobulina especí


fica para o anticorpo usa o, conju a a com fluoresceína. Após a reação ler ao mi
croscópio fluorescente. Haverá fluorescência no esfre
aço quan o houver reação a
ntí
eno-anticorpo específico.
155
 
Para pesquisarmos o anticorpo, evemos ter a lâmina com o micror
anismo  para o q
ualse quer pesquisar o anticorpo. Depositar sobre o esfre
aço o soro o pacient
e, eixar rea
ir e, posteriormente, colocar a
lobulina anti-humana, eixar rea

ir e examinar ao microscópio fluorescente.
     
TIPOSDE MARCADORES O tipo e marca orusa  o vai
epen er as características qu
e se eseja ter tais como: 1. Estabili  a e por lon o perío o 2. Alta absortivi a
e e bom ren imento 3. Absorção a luz num espectro visível 4.Não interferir co
m a reação antí
eno-anticorpo

 A se uir apresentamos  uma lista os principais  mar
ca ores usa osnos ensaios e fluorescência,  sen o que,  o isotiocianato e fluor
esceína e a ro amina são osmais usa os. Isotiocianato e Fluoresceína: É lar
am
ente usa o para
 a marcação e anticorpos  e analitos. É um os que apresentam mel
hor relação e absorção e emissão e luz, ocorren o em nanose
unos. É uma moléc
    
ulahi rofóbica e é exitaa comprimento  eon a próximo
 ao comprimento a luzem
iti a. Fluorocromos e Ro amina: Os eriva  os e Ro amina como a tetrametilro  am
ina possuem a emissão
 num comprimento
  e on a maior  que o o isiotiocianato e f
luoresceína.
 Os eriva os e ro amina po em ser usa os
 junto com o isotiocianato
e fluoresceína
as, em
eral isto é feito
 fornecen o assim ima ens multicolori 
nos citometros e fluxo,  e no sequenciamento e DNA. Ficobiliproteínas: Estas pr
oteínas são encontra as em al
as e tomam parte no processo e fotossintese. As p

rincipais classes e ficobiliproteínas
 são as Ficoeritrinas, Ficocianinas e as A
loficocianinas.
 A emissão e luz por estes compostos
  é cerca e 30  vezes maior q
ue o a fluoresceína
 e por isto vem se tornan o ca a vez mais usa a nos imunoens
aios. Marca ores fosforecentes: Estes apresentam a vanta
em e ser muito sensíve
    
is sem, contu o, promover
 o sinal
 e fun o in eseja o, ou seja, emitir luz sem q
ue haja a presença o que se eseja observar. Al
uns os marcaores fosforecente

s são a Eritrosina  (tetrahi rofluoresceína), eosina 5’ isotiocianato  e metalopro
teínas. Quelatos
 e terras
 raras e criptatos: Os
 quelatos e terras raras como
 o
s quelatos e lantaní eos apresentam a emissão e fluorescência por um perío o b
astante lon
o e por isto são os preferi  os nas reações que se
asta  muito tempo
para fazer
 a leitura. Os criptatos  e terras raras também são usa os nas reações
que se eseja uma fluorescência ura oura. Umbeliferona: é um rea
ente que não

apresentaa mesma resolução que o isotiocianato e fluoresceína, e por isto não
é tão usa o.
156
PROBLEMAS NOS
 IMUNOENSAIOS
 Os problemas
 maiscomuns nos imunoensaios
 se referem
a sensibili a e o ensaio  que po e ser afeta a pela concentração o analito pres
ente na amostra em estu o. Al
uns os problemas se referem a ispersão e luz na
  
s soluções conteno altas  concentrações  e proteínas e partículas coloi ais, flu
orescência e fun o evi o a presença e múltiplos compostos

or ânicosna amostr
 
a ou impurezas nos rea
 entes,  ou a não fluorescência  evi o a li
ação e proteín
as não específicas,
 mu anças o pH, ou interferência ecompostos químicos.O pr
é tratamento o soro

 com substâncias
  proteolíticas, oxi antes ou rea entes esna
tura ores como peráci os, po em aju ar a eliminar a fluorescência e fun o.
TÉCNICAS DE IMUNOFLUORESCÊNCIA
 1 - Imunofluorescência Direta a) Material necessá
rio: - Lâmina limpa com elimitações circulares  para se colocar o antí
eno; - Ta
mpão e fosfato

pH 7,2; - Antí eno particula o. No caso os vírus usaremos célul

ao com fluoresceína; - Micropipeta
asinfecta as; - Soro imune específico
 conju
s e 10, 20 e 25 µl; - Pipetas e 5 ml; - Glicerina alcalina; - Microscópio epif
luorescente.
 
b) Técnica:
 Vamos supor que se queira
 pesquisar
 Herpes vírus num raspa o e vesí
cula e pele. Em uma  lâmina limpa elimita a com círculos, colocar  o material em
3 ou 4 círculos, eixar secar ao ar e fixá-lo com acetona
ela a. Após isto, co
locar sobre o esfre
aço antissoros específicos para vírus Herpes tipos 1 e 2, e
preferência monoclonais, conju
aos com fluoresceína. Incubar as lâminas em amb
 
iente úmi o a 37°C por 30 a 40 minutos. Lavar com tampão e fosfato pH 7,2. Seca
r, cobrir com
licerina alcalina e ler no microscópio epifluorescente. Se por ex
emplo, houver fluorescência no esfre
aço em que foi colocao o antissoro, o víru
  
s implica o será o Herpes o tipo 1 ou 2. Observação: Ain a não temostestes sor

oló
icos específicos para iferenciar o Herpes 1 o 2, mas temos estu os em an a
mento.

2. Imunofluorescência In ireta
157
    
a) Pesquisa o micror
anismo ou o elemento que se eseja no material o pacient 
e, taiscomo: secreções, teci os, etc. - Fazer o esfre
aço como no processo ire 
to; - Aicionar o soro imune específico para o micror

 anismo que se suspeita  e
eseja i entificar. Esperar 30 a 40 minutos,  incuban o a 37°C em câmara úmi a. Ap
ós este tempo lavar  a preparação
  a fim e remover o que não rea
e; - Secar a lâm
ina, com auxílio e um seca or e cabelo e cobrir o esfre
aço com
lobulina anti
-humana,
 conju
a a com fluoresceína. Incubar  a 37°C
 por 30 a 40 minutos em câmar 
a úmi a. Após este tempo, lavar com á
ua estila a ou com tampão  pH 7,2, bastan
 


o otejarsobre  a lâmina o líqui o por ½ minuto; - Secar, usan o o ar aqueci o
e um seca or e cabelo, cobrir o esfre
aço com
licerina alcalina e examinar ao
 
microscópio epifluorescente. Não há necessi a e e cobrir com lamínula.
 
anismo eve ser feito e
b) Pesquisa
 e anticorpo
 no soro - O esfre
aço o micror  
m lâmina elimita a com círculos.

 O antí eno é fixa o como foi explica o anterio 
rmente; - No caso e se esejar eterminar  o título e anticorpos no soro,  ilui
r este sucessivamente e colocar 5 µl e ca a iluição  nos círculos conten o o an
tí
eno. Incubar a 37°C por 30 minutos em câmara úmi a; - Lavar com tampão pH 7,2

otejan o o líqui o sobre a lâmina por 1 minuto, secá-la com ar aquecio, usan
 
aços com
lobulina anti-humana conju
aa
o seca or e cabelo;- Cobrir os esfre    
com fluoresceína na iluição fixa etermina a na pa ronização. Neste caso po emo
s empre
ar
ama
lobulina total (I
G, I
M, I
A), só I
M ou só I
G, epen en o a
  
   
finali a e o ia
nóstico. Incubar por 30 a 40 minutos. Após este tempo, lavar
como anteriormente; - Secar e cobrir a preparação
 com
licerina alcalina; - Ler
no microscópio epifluorescente.
 Não haven o fluorescência si
nifica reação

 ne at
iva.
 Se o soro examina o contiver anticorpos vai haver fluorescência  até etermi
na a iluição. Vamos  supor que houve fluorescência até 1/640, esta iluição corr
espon e ao título o soro.
158
 
Observações importantes:
 a) Em to  os os testes temos que usar sempre  um soro pos
itivo
  para
 termo e comparação, e preferência com título conheci o; b) Em caso
e úvi a a imuno
lobulina eve ser sempre retitulaa. Para isto basta proceer

a se
uinte maneira:
 - Tomamos como exemploo teste para o Toxoplasma. - Em uma
lâmina conten o o esfre
aço com o antí
eno e Toxoplasma
onii, aicionar, em c
   
erca
 e 12 círculos conteno o esfre
aço, uma iluição fixa e soro humano conte
n o anticorpospara

 T. on ii. Por exemplo,  se tivermos
 um certo soro com o títu
lo paraT.
on ii e1/4096, fazer uma  iluição este a 1/512 e a icionar o soro
assim iluí o emto os os orifícios a lâmina. Incubar  por 30 a 40 minutos a 37
°C, emcâmara úmi a. Após isto,  lavar e secar como escrito anteriormente. - Pre
parar iluições sucessivas a imuno
lobulina conju
aa que se eseja eterminar
     
o título. A icionar 10 µl a ca a iluição o soro nos círculos separa os a lâmi
na, incubar 30 a 40 minutos a 37°C em ambiente úmi o. Lavar, secar e a icionar

licerina alcalina. Ler ao microscópio
 epifluorescente.
 - Leitura:
 Se a fluorescê

ncia ocorreu até a iluição  e 1/320, esta iluição  correspon e ao título a imu


no lobulina. Para uso po e-se iluir a 1/160 a fim e obter uma boa mar em e se


urança nos testes.

PREPARO DOS REAGENTES 1 - Tampão e fosfato - PBS (Phosphate Buffer Saline), 0,0
1 M e pH 7,2 Na2HPO4 ...........................................................
..........12,0
NaH2PO4.H2O ...................................................
............2,2
NaCl .........................................................
 
....................85,0
Á
ua bi estila a q.s.p. .............................
   
................1000,0
 ml Esta solução é 10 vezes
  concentra a e eve ser
uar a

a em
lea eira a 4°C, a icionan o à mesma azi a só ica na preparação e 1/1000.
Para uso, iluir 1/10 em á
ua estilaa pH 7,0. 2 - Solução Tampão e Carbonato
 
- Bicarbonato e Só io a 0,5 M e pH 9,5 (Esta solução é para alcalinizar a
lice
rina) Solução A Na2CO3 .........................................................
 
............5,3
Á
ua bi estila a q.s.p. ......................................
.....100.0 ml Solução B NaHCO3 .................................................

..................4,2
Á
ua bi estila a q.s.p. ................................
 
.........100,0 mlPara o uso, misturar  1
volume e A e ois e B. Esta mistura é
a solução 2, usa a na alcalinização a licerina.
159
3 - Glicerina alcalina Glicerina p.a. ..........................................
...........9 volumes Solução 2 .................................................
 
.........1volume Conservar em
ela eira. Esta
licerina alcalina é usa a naspr
eparações a imunofluorescência  e a sua função é excitar afluorescência  quan o
os
 raios ultravioletas inci em na preparação. 4 - Solução e azul e Evans Azul
e Evans ........................................................10,0 m
PBS pH
7,2 q.s.p. .................................................100,0
   ml Esta soluçã
oé mistura a ao conju
a o na concentração e 0,1 ml para 1 ml e conju
ao ilu
  
í o. A função o azul e Evans é a esuprimir a fluorescência inespecífica eix
an o apenas a reação específica. Quan ose trata o teste com este corante to o o
campo fica e cor vermelha,
 sobressain o a fluorescência. Observação importante
: Ao preparar oPBS eve-se usar á
ua estilaa ou biestilaa com pH neutro. No

   
rmalmente
  o pH  a á ua estila a é e 5,0  a 5,5. Deve ser neutraliza  o com soluç
ão e hi róxi o e só io normal. O PBS iluí  o para os
 testes e imunofluorescên
 
cia eve ser sempre recente.
 Mesmo conserva o em
ela eira não po e serusa o ap
ós uma semana e prepara
 o. O tampão velho  sempre interfere
 nos testes e fluore
scência, ne
ativan o a reação ou baixan o o título e anticorpos.
 
MICROSCÓPIOExistem ois tipos e microscópio fluorescentes, o hipofluorescente,
ultrapassa
 o e o epifluorescente. No Microscópio hipofluorescente, comoo própr
io
 nome
 iz, si
nifica que a luz ultravioleta
 entra por baixo atravessan o ocon
ensa or, atravessa a lâmina  para epois sensibilizar
 o objeto a ser examina  o.

Para se usar este tipo e microscópio a lâmina a preparação  tem que ser e vi
 r
o muito bom e fina, a fim e não haver muita per a os raios  UV.  Por outro la o,
na hora a leitura eve-se colocar entre a lâmina e o con ensa oruma
ota e ó

leo e ce ro especial para fluorescência.   Este óleo tem  a finali a e e preenche 
r o espaço  queexiste entre  o con ensa or e a lâmina a preparação a fim e não
haver per a e ispersão os raios UV. Este óleo funciona mal, porque  além e suj
ar o microscópio
 não permite
 movimentar muito
 a lâmina. Por esta ificul a e o n
úmero e testes realiza osem microscópio este  tipo é muito baixo.
 Resumin o,é
um equipamento
 ultrapassa o. Por outro la o, eve-se
 sempre mu ar os filtros e
UV com iferentes cores e espessuras. De um mo o
eral, neste caso  preferem-se
o BG12. O Microscópio epifluorescente a luz  sai a objetivae inci e iretamente
sobre o objeto.
  Neste caso não há necessi  a e e óleo nem e lâminas especiais.
Não há per a os raios UV e a lâmina po e
160
    
ser movimenta a livremente. A capaci a e e trabalho  é muito alta  e proveitosa.
  
Os microscópios  este
 tipo já têm filtros embuti os, não haven  o necessi a e e
troca. Lâmpa  as usa
   as As melhores são as e mercúrio
 existin o e capaci a es
iferentes, epen  en o  o aparelho.
 As mais usa  as são: HBO200, HBO100 e HBO50.
  T
ambém são usa as lâmpa as e halo
ênio, estas  uram mais,
 mas a sensibili a e é
baixa, principalmente, quan o se usa conju
a o com ro amina.
 
QUIMIOLUMINESCÊNCIA
 As moléculas quimioluminescentes são usa as em ensaios iret
os ou in iretos  como substratos  para enzimas em ensaios imunoenzimáticos,  aliás,
o principio  os ensaios e quimioluminescência é o mesmo os ensaios e ELISA. 
A emissão e luz nos  ensaios quimioluminescentes
 se á quan o uma moléculasai
oseu esta o excita o para o seu esta o normal,  mas a quimioluminescência ifere 
a
 imunofluorescência pois a reação ocorre
 evi o a uma reação química e não e
vi oa excitação luminosa.  A maioria as reações e quimioluminescência  ocorrem
evi o a uma reação e oxi ação, que faz  com que ocorra a exitação e   molécu
uma 
la e assim que ela  retorna ao seu esta
 o normal emite uma certa quanti a e e lu
z visível. O ren imento os ensaios e quimioluminescência  éinferior  a 10% no e
ntanto isto  não
 torna a reação inviável. A emissão  e luz é etecta  a por aparel
hos chama os e Luminometros,
 estes aparelhos po
   em utilizar como etectores um
tubo fotomultiplica
 or, sensor
 fotoelétrico, io o e silicone ou filme
 foto
ráf


ico. Alumas as
  reações e quimioluminescência envolvem a reação o Luminol com

enio e peroxiase ano como prouto o isoluminol, a oxiação
peróxi
 o  e hi ro
   
  
o Ester
 e acri ina pelo peróxi o e hi ro enio ou a ecomposição o A amantil
1,2 ióxi o etano aril fosfato  pela
 Fosfatase  alcalina. Estas reações  são altam
ente sensíveis e a emissão e luz estas po e ocorrer como um rápi o flash ou te
r uma emissão prolon
aa que poe permanecer por horas. A reação com o ester e
  
acri ina, por exemplo,
  é uma reação  muito rápi a,que emite um flash e luz muit
o curto,
 varian o e 300 nanose
un os até 2 se
un os,já a reação com oluminol
po e urar até 2 minutos,assim como a reação com o A amantil 1,2 ióxi o etano
aril fosfato. Os ensaios e quimioluminescência são classifica os em ensaios Het 
ero
êneos e Homo
êneos.  Ensaios
 Hetero

 êneos O marca or maiscomum  neste tipo e
ensaio é o ester e acri ina, ele po
enos ou

 e ser usa o como marca or e antí 
anticorpos,
  es e que se use conju a ores químicos como a carbo iimi a ou a mist
ura e ani ri os.
161
 
Costuma-se usar  micropartículas
 ma
néticas como fase sóli  a nos ensaios  em que s
e usa o ester eacri ina.Neste caso se costuma proce er a incubação o soro em
um suporte sóli o, conten o ao antí
eno, posteriormente se aiciona o conju
ao
  
com o ester  e acri  ina, proce  e-se  nova incubaçãoe finalmente se revela a rea
ção coma a ição e peróxio e hi ro
enio para pro uzir a luz numa fração e na
nose
un os. Esta reação poe sofrer interferência no pH alcalino pois os anions
OH po em rea
ir com ester e acriina bloqueano o ataque o HO2 e assim evitan
    
o a ecomposição o ester.  Esta reação in esejável po e ser evita a se pré incub 


an o o soro como conju a o no pH enter 5 e 7. Como a reação com ester e acri i

na é muito rápi  a, ela  só é realiza a quan o otubo com o material em estuo est
áfrente ao etector o aparelho.O limite e etecção com  oester e acri ina é
e 0,5 amol. O Luminol também  po e ser usa  o neste tipo e etecção, noentanto 
ele
 é menos eficiente, para iminuir esta eficiência passou-se a usar erivao
s este como o Isoluminol  (aminobutil N-etil isoluminol), queoferce o limite e
etecção
 na casa os 50 amol. Ensaios
 homo
eneos Neste tipo e ensaio, a li
açã


o o anticorpo a um  antí eno marca o com um composto  quimioluminescente acaba mo

uir entre o anticorpo li
ulan o a emissão e luz, uma vez que é possível istin

ao ao conju
ao e o não li
ao, sem que seja necessário separa-los, isto acont
  
 
ece porque a emissão e luz o conju
a o li a oao anticorpo  po e ser maior ou m


enor que a o conju a o livre, epen e o marca or usa o no conju
ao. Como exem
  
plo temos um teste  em que se osa a pro
esterona com o uso e conju
a os com o i
soluminol, quan o este conju
a o se li
a especificamente a anticorpos para a pro

esterona, ocorre o aumento e intensiae e luz em até 4 vezes. Outro exemplo,

  
estáem al uns kits que osam anticorpos  para o cortisol,
 fazen o uso e conju

a os e cortizol com isoluminol, quan


  o este conju a o se li a ao anticorpo espe
cífico, ocorre uma que a na emissão  e luz pelo isoluminol. Também existem ensai
os em que se faz a transferência e ener
ia entre uma molécula marcaora oaora

e aceptora. Umexemplo isto está em ensaios   que se uso o Isoluminol como a fon
te e exitação e ener
ia para um marca or e fluoresceína. Neste caso, supon o
que

 o ensaio seja feito para a
etecção e
um antí eno, usa-se um anticorpo marc

ao, só
a o com fluoresceína para se li  ar ao antí eno específico e outro conju
que este

 será
o antí eno marca  o com o luminol.  O que vai ocorrerentão é a comp
etição o antí eno não marca o com o marca o pelo anticorpo  marca  o com a fluore
sceína. O isoluminol sozinho emite a luz num comprimento e on a e 460 nm, quan
o ele está li
ao com a fluoreceína ele emite luz no comprimento e ona e 525
       
nm. A mé ia a taxa e emissão  e luz obti a, quan o compara a com um pa rão é
que irá fornecer qual

  a quanti a e eantí enopresente na amostra. Este princip
io vem sen o aplica o em kits para a etecção e pro
esterona, AMP ciclico e imu
no
lobulinas as classes G e M.
TESTE DE WESTERN BLOT
162
INTRODUÇÃO
    
Atualmente,
  a técnica  e Western Blot (WB) tem  si o utiliza a para estu os etal
ha os e uma série e micror
anismos incluin o bactérias, vírus e protozoários.
Para ca a micror
anismo há pequenas variações no tocante ao preparo os rea
ente
 
s, mas ofun  amento a reação é o mesmo. Este teste tem muita semelhança  com o E
LISA, muan oapenas o suporte anti
ênico que  é feito em papel e nitrocelulose.



Como pa rão aremoso exemplo  a obtenção  os rea entes, monta em e utilização
o teste para Vírus a Imuno eficiência A quiri  a (HIV). Com este exemplo,
a com
preensão

o teste
 ficará  bem clara. A técnica e Western Blot teve  sua ori em na
meto olo
 ia esenvolvi  a em 1975 por E.M. Southern,
 que utilizan o eletroforese
em
el e poliacrilami
  a realizou a separação e proteínas por peso
 molecular e
m um estu o e hibri ização DNA-RNA.  Este trabalho foi acompanha
 o,
  em 1977, pel
a emonstração por Van Raams ork e uma técnica para a etecção e eterminantes 
anti
ênicos,
 em moléculas separa as por peso molecular,  em
el e poliacrilami
a, através e um teste imunoenzimático
 utilizanoa enzima peroxi ase. Finalment
e Harry
 Towbin, em 1979, emonstrou a possibili a e e transferir as moléculas s
epara as em
el e poliacrilamia para folhas e nitrocelulose, facilitano a ma
  
nipulação as proteínas em  uma matriz mais  resistente. A união estas três meto


olo ias formam a técnica e enzyme-linke  immunoelectrotransfer  blot assay ou té
cnica e Western Blot. A técnica e Western Bloté composta e quatro está
ios:
1o está
io -Eletroforese
 em
el e poliacrilami a No primeiro  está
io a prepara
ção

 purifica a e HIV-1 é submeti a a eletroforese em el e poliacrilami a, hav

ênicos virais que forma
en o a separação
 por peso molecular
 os componentes anti
m ban as e proteínas na matriz o
el. 2o está
io - Transferência as banas O
   
material
 anti
ênico viral separa o é transferi  o o
el epoliacrilami a para  f
olha e nitrocelulose
  que é então corta a em tiras, conten o os componentes  o v
írus separa os em ban as. 3o está
io - Reação antí
eno-anticorpo As tiras e nit
rocelulose, conten o os antí
enos virais, são colocaas em contato com os soros

os pacientes e soros controles. Os anticorpos séricos  específicos
 para os compo
nentes virais, irão rea
ir com as respectivas  ban as, forman
 o complexos antí
en
o-anticorpo macromoleculares, que ficam reti os nas tiras e nitrocelulose.
163
  
4o está
io - Revelação os complexos  antí
 eno-anticorpoA revelação os complexo

eno-anticorpo é realiza a através a utilização e um conju
a o constituí
s antí
 
o e anti-imuno
lobulina humana marca a com uma enzima e o substrato enzimático
.
 
METODOLOGIA
 1 - Preparação o antí
eno Normalmente 


o antí eno utiliza o na técni
ca e Western Blot é prepara  o a partir e
cultura e linfoblastoshumanos infec 
ta os  com HIV-1 e estimula
 os com fitohema lutinina. Após aproxima  amente  seis

ias ecultura,quan o o sobrena   ante a cultura apresenta pico e pro ução ev
írus, etermina o pela ativi a e e transcriptase reversa, a cultura  é submeti  a
a centrifu
ação para a remoção as células linfoblásticas.  O líqui o sobrena an
te,rico em partículas virais, éentão submeti o a ultracentrifu
ação em
raien
 
te e sacarose, para a obtenção e massa viral purifica  a.A massa obti a é entã 
o ressuspensa em tampão tris-HCl 0,1 M pH 8,0 conten  o uo ecil  sulfato e só io
e 2-mercaptoetanol, e após aquecimento é titula a para a pa ronização a técnic
a.
  
2 - Eletroforese
  em
el e poliacrilami  a A separação eletroforética e proteína 
s epen


 e a car a eletrostática, o peso molecular  e a confi uraçãotri  imensi
onal as moléculas
 protéicas. O tratamento  as proteínas virais, com uo ecil su
lfato e só io, elimina a interferência a car
a eletrostática, por tornar as pr


 

oteínas ne ativamente carre a as.  A utilização  e a entes
 re utores, como o 2-me
rcaptoetanol,
 promove a quebra as pontes  issulfeto as proteínas
lobulares, a
lteran o a estrutura tri imensional, e forma que to as as proteínas virais pass
am a ter


 amesma confi uração  espacial. O tratamento a amostra viral com o ete

ente reutor 2-mercaptoetanol, elimina a
r ente uo ecil  sulfato e só io e o a   
interferência a car
a eletrostática e a confi
uração tri  imensional as proteí
nas, permitin o a separação eletroforética apenaspelos iferentes pesos molecul
ares as proteínas que constituem o HIV-1. O
el e poliacrilamia formao pela
    
polimerização,
  evi o a reação  entre
 a acrilami
 a e abis-acrilami  a, forman o u
ma ree tri imensional, sen o a ensi a e esta re e etermina a pelas  concentra
ções e acrilami
 a e bis-acrilami a. A concentração
  a acrilami a etermina
  a po
rosi a e o
el e, por conse
uinte, a veloci  a e com
 que as proteínas e iferen
tes pesos moleculares mi
ram no
el quan o submeti as àcorrente  elétrica. A
con
centração e bis-acrilami a é responsável pela elastici  a e e resistência o el
. Ao mesmo tempo em que as proteínas virais são aplica as no
el e poliacrilami
    
a,uma solução  e proteínas
 e pesos molecularesconheci os é também aplica a,
sen o separa as em ban as que  servem como pontos e calibração, para estimular o
peso molecular as ban as e proteínas virais.
164
 

3 - Transferênciapara nitrocelulose Após a separação 
eletroforética
 os antí en
os virais,
 as ban as protéicas são  transferi as o el e poliacrilami a para a
matriz

e nitrocelulose. A folha
 e nitrocelulose écoloca a sobre a superfície 

o
 
el, e o sistema é submeti
 o a eletroforese, sen o a corrente elétrica iri i
a o el para a folha e nitrocelulose. As ban as protéicas   são então transferi

as para a folha e nitrocelulose, manten o o pa  rão e ban eamento obti o pela


eletroforese no el e poliacrilami a. A folha e nitrocelulose é corta a em fit
as, que conterão as ban as protéicas virais.
  
4 - Reação
 para evi enciação e anticorpos  para HIV-1 As fitas e nitrocelulose
conten

o os antí enos virais, separa os por peso molecular, são expostas aos sor

os ospacientes e soros controles positivo e ne
ativo. Os anticorpos  séricos pa 
ra as iferentes proteínas virais irão rea
ir com  as respectivas ban as, forman
o complexos macromoleculares
 que permanecem fixa os à fita. Posteriormente, as f
itas são lava as para retirar os anticorpos inespecíficos, que não rea
em com os
componentes virais.
  
5 - Revelação
 a reação As fitas são expostas a um conju
a o, sen o normalmente
utiliza a a anti-imuno
lobulina G humana marca a com enzima quepo e ser aperox
 
i ase. O conju
a o rea
e com

 o complexo antí eno-anticorpo fixa o na fita e nit
rocelulose. Após a lava
em a fita, para retirar o conju
ao não complexao, é a
   
crescenta  oo substrato

enzimático, que no caso a peroxi ase  é representa
 o pel
o peróxi o e hi ro ênio e uma substância cromó
ena como a iaminobenzi ina. Há
    
o aparecimento e ban as cora as na re
ião on e ocorreu a reação o anticorpo co
m o componente protéico viral.
BIBLIOGRAFIAMcDonnell, W.M., Askari, F.K., 1997. Immunization. JAMA 278(22):200
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Picornaviri ae: The viruses an their replication. em Fiel s, B.N., 1996 Virolo

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165