Welcome to Scribd, the world's digital library. Read, publish, and share books and documents. See more
Download
Standard view
Full view
of .
Save to My Library
Look up keyword
Like this
38Activity
0 of .
Results for:
No results containing your search query
P. 1
pcr

pcr

Ratings:

5.0

(1)
|Views: 1,431 |Likes:
Published by gkrett

More info:

Published by: gkrett on Mar 30, 2010
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as DOC, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

07/15/2013

pdf

text

original

 
METODE
 POLYMERASE CHAIN REACTION 
(PCR)
Oleh :Hary KrettiawanC15109201
I.1Latar Belakang
Penyakit merupakan faktor pembatas dalam kegiatan budidaya perikanan.Kerugian yang ditimbulkan kerapkali sangat besar. Penyakit dapat menyebabkankematian, kekerdilan, periode pemeliharaan lebih lama, tingginya konversi pakan, padat penebaran rendah dan turunnya tingkat produksi. Penyakit dapat disebabkanoleh organisme patogen seperti protozoa, bakteri, jamur dan virus.Adanya hama di dalam tambak sangat merugikan bagi para pembudi dayadan spesies itu sendiri. Untuk itu para pembudi daya juga perlu memahami lebihdalam jenis – jenis hama yang dapat mengganggu, merusak bahkan memangsaspesies yang di budi dayakan. Dengan di ketahuinya jenis – jenis hama tersebutmaka pembudi daya dapat mencegahnya atau memberantasnya dengan memberiobat sesuai dengan jenis hama yang di ketahui. Begitu pula dengan penyakit, yangsangat merugikan sekali bagi pembudi daya karena adanya suatu penyakit dapatmenyebabkan ikan / udang mati secara mendadak dalam jangka waktu yangsingkat. penyebab penyakit bakterial di dalam industri udang, didominasi oleh bakterigolongan
Vibrio.
Penyakit udang berpendar atau lebih dikenal
vibriosis
merupakan penyakit yang umumnya
 
menyerang hewan laut seperti ikan, udang,dan kerang-kerangan. Pada udang bakteri
Vibrio
menyerang secara sekunder yaitu pada saat dalam keadaan stress dan lemah, oleh karena itu seringdikatakan bahwa bakteri ini termasuk jenis
opportunistic
patogen.Pengujian keberadaan bakteri patogen sangat diperlukan sebelum mewabahdan menyebabkan kerugian yang makin besar. Metoda pendeteksian bakteri patogen biasanya menggunakan metode penumbuhan mikroba yang kemudian
 
diamati keberadaan bakteri penyebab penyakitnya. Namun lamanya waktu pengerjaan menjadi masalah tersendiri, sehingga perlu penggunaan metodedeteksi yang lebih cepat dan akurat.Metode pendektesian cepat dengan menggunakan teknik PCR mampumenghasilkan analisa keberadaan bakteri patogen lebih cepat dibandingkandengan metode cawan . Hasil yang diperoleh pun lebih akurat karena leveldeteksinya adalah DNA spesifik dari bakteri patogen tersebut.PCR merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNAsecara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapatmenghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehinggamemudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintisoleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun1994 berkat temuannya tersebut.II.
METODOLOGIII.1Alat dan Bahan
Peralatan yang digunakan adalah sentrifuse, mesin thermo cycle,elektroforesis set, mikro pipet ukuran 100, 20dan 10µ beserta tipnya,effendrof, . Sedangkan bahan uji yang digunakan adalah udang stadia PL3,uropoda, insang, hepatopankreas, kaki renang dan genom bakteri vibrio asalSulawesi.Bahan-bahan yang digunakan adalah regent-reagent yang digunakan untuk  proses ekstraksi DNA antara lain EDTA, SDS, Proteinase-K, NaCl 5 M, CTAB, phenol-chlorofom-isoamilalkohol, chloroform-isosmilslkohol dan isopropanol.Sedangkan bahan yang digunakan pada proses PCR adalah master mix, primer,kontrol positif, kontrol negatif dan mix kontrol.
II.2Prosedur Kerja
Tahapan yang dilakukan untuk mendeteksi penyakit vibriosis dengan metodePCR terdiri dari tiga tahapan. Tahapan pertama yaitu ekstraksi DNA, perbanyakan
 
genom yang telah diekstraksi dengan mesin
thermo cycle
. Selanjutnya tahapanterakhir yaitu pembacaan hasil dari ekspresi genom yang telah teramplifikasidengan metode elektroforesis dan difoto secara digital. Tahapan tersebutdijelaskan sebagai berikut.
II.2.1Ekstraksi DNA
Ekstraksi DNA diambil dari sampel dengan berat 50-150 mg yang direndamdengan 250µl Buffer TE. Selnjutnya sampel diinkubasi selama 1-3 jam dengansuhu 55˚C pada larutan yang terdiri dari 500µl Buffer lysis, 20µl proteinase-K dan40µl SDS 10%. Setelah inkubasi ditambahkan 12.5µl RNAase dan selanjutnyadiinkubasi pada suhu ruang selama 15-30 menit. Setelah diinkubasi ditambahkanPCIA dengan perbandingan larutan 25:24:1 kemudian divorteks secara manualsampai homogen dan dinkubasikan kembali pada suhu ruang selama 10 menit.Selanjutnya disentrifuse pada kecepatan13.000 rpm selama 8 menit. Supernatantyang terbentuk kemudian diambil dan dipindahkan ke tabung effendrof yang barukemudian dicampur dengan 30l larutan CIA dengan perbandingan 24:1kemudian disentrifuse lagi pada kecepatan 13.000 rpm selama 4 menit.Supernatant teratas diambil dan dipindahkan ke effendrof baru sebanyak 200µlkemudian dicampur dengan 400µl ethanol absolute dingin dan dihomogenkan.Selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 6000 rpm selama 30 menit.Supernatant yang terbentuk dibuang dan pellet dibilas dengan 1ml etanol 70%kemudian disentrifuse kembali pada kecepatan 6000 rpm selama 15 menit. Pelletyang terbentuk dikeringanginkan selanjutnya disimpan pada suhu -20˚C setelahdilarutkan dengan 100µl Buffer TE.
II.2.2Amplifikasi Genom
Persiapan awal sebelum mengamplifikasi genom adalah pembuatan master mix (MM). Volume MM yang dibuat disesuaikan dengan jumlah sampelditambah dengan kontrol. Karena jumlah sampel dan kontrol ada 9 maka tiap-tiap bahan penyusun MM dikalikan 9. Akan tetapi pada praktikum ini jumlah totalMM merupakan hasil kali dari 9 sampel + 1 cadangan sehingga faktor pengkaliMM adalah 10. Hal ini bertujuan untuk menghindari kekurangan MM pada saat

You're Reading a Free Preview

Download
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->