UNIVERSIDAD AUTONOMA DE CHIAPAS

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

CAMPUS IV

LAB.GENETICA

PRACTICAS N.5 Y 6

“EXTRACCION Y PURIFICACION DE ADN DE CELULAS EUCARIOTES”

“CORRIMIENTO ELECTROFORETICO DE DNA”

CATEDRATICO:

DRA. KARINA TRUJILLO MURILLO

INTEGRANTES DEL EQUIPO:

• AREVALO MONTERRUBIO RENE DE JESUS

• BARTOLO COELLO TRINIDAD

• VILLATORO ALVAREZ SANDY CAROLONA

5to. “A”

Tapachula, Chiapas a 08 de Octubre del 2009

INTRODUCCION

El ADN es un polímero de nucleótidos, es decir, un polinucleótido. Un

polímero es un compuesto formado por muchas unidades simples
conectadas entre sí, como si fuera un largo tren formado por vagones.
En el ADN, cada vagón es un nucleótido, y cada nucleótido, a su vez,
está formado por un azúcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada
(que puede ser adenina→A, timina→T, citosina→C o guanina→G) y un
grupo fosfato que actúa como enganche de cada vagón con el siguiente.
Lo que distingue a un vagón (nucleótido) de otro es, entonces, la base
nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando
sólo la secuencia de sus bases. La disposición secuencial de estas cuatro
bases a lo largo de la cadena (el ordenamiento de los cuatro tipos de
vagones a lo largo de todo el tren) es la que codifica la información
genética: por ejemplo, una secuencia de ADN puede ser
ATGCTAGATCGC... En los organismos vivos, el ADN se presenta como
una doble cadena de nucleótidos, en la que las dos hebras están unidas
entre sí por unas conexiones denominadas puentes de hidrógeno.

Electroforesis

La electroforesis es una técnica para la separación de moléculas según

la movilidad de estas en un campo eléctrico. La separación puede
realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte sólido (p. ej.,
electroforesis en papel o en acetato de celulosa), o bien a través de una
matriz porosa (electroforesis en gel), o bien en disolución (electroforesis
libre). Dependiendo de la técnica que se use, la separación obedece en
distinta medida a la carga eléctrica de las moléculas y a su masa.

La variante de uso más común para el análisis de mezclas de proteínas o

de ácidos nucleícos utiliza como soporte un gel, habitualmente de
agarosa o de poliacrilamida. Los ácidos nucleícos ya disponen de una
carga eléctrica negativa, que los dirigirá al polo positivo, mientras que
las proteínas se cargan al unirse con sustancias como el SDS
(detergente) que incorpora cargas negativas de una manera
dependiente de la masa molecular de la proteína. Al poner la mezcla de
moléculas y aplicar un campo eléctrico, éstas se moverán y deberán ir
pasando por la malla del gel (una red tridimensional de fibras cruzadas),
por lo que las pequeñas se moverán mejor, más rápidamente. Así, las
más pequeñas avanzarán más y las más grandes quedarán cerca del
lugar de partida.

La gran mayoría de macromoléculas están cargadas eléctricamente y, al

igual que los electrolitos, se pueden clasificar en fuertes y débiles
dependiendo de la constante de ionización de grupos ácidos y básicos.
Por ejemplo los ácidos nucleicos son poliácidos fuertes.

Por lo general para caracterizar la molécula se determina la velocidad a

la que esta se mueve en un campo eléctrico y se utiliza para determinar,
en el caso de proteínas, la masa molecular o para detectar cambios de
aminoácidos y separar cuantitativamente distintas especies
moleculares; en el caso de ácidos nucleicos se determina su tamaño,
medido en pares de bases.

Espectrofotometría

La espectrofotometría es el método de análisis óptico más usado en las

investigaciones químicas y biológicas. El espectrofotómetro es un
instrumento que permite comparar la radiación absorbida o transmitida
por una solución que contiene una cantidad desconocida de soluto, y
una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia.

El ADN extracelular es una novedad biológica, de la cual se desconoce

su significado clínico y fisiopatológico. Se reportan aquí, los primeros
resultados cuantitativos de los niveles de ADN presentes en muestras de
patronamiento, detectados a través de la técnica de espectrofotometría
UV-Visible, condicionando particularmente la respuesta espectral a 260
nm de una fuente de radiación ultravioleta, y utilizando fotomultiplicador
como detector. Estos primeros resultados espectrales, permiten la
cuantificación de los niveles de ADN libre en suero y orina humanos de
personas sanas y enfermas, los cuales contribuirán a realizar las
comparaciones para entender la biología del ADN libre en la salud y la
enfermedad con miras a obtener ayudas diagnósticas pronosticas y
terapéuticas en enfermedades tan complejas como el cáncer,
infecciones crónicas, enfermedades autoinmunes etc.
 OBJETIVOS

• El alumno realizara la extracción y purificación de ADN de células

eucariotas

• El alumno realizara el corrimiento electroforético de ácidos

nucleícos extraídos y purificados de diferentes tipos de muestras

CUESTIONARIO

1.- Explica que es la paradoja del valor C

El valor C se defina como la cantidad de ADN por genoma haploide
(un solo juego cromosómico) en estado de un cromatidio (en fase
G1). En el caso de la especie humana con 2n=46 cromosomas,
especie diploide (2n), con dos juegos de cromosomas, uno recibido
del padre y otro de la madre, cada uno formado por 23 cromosomas,
el valor C sería la cantidad de ADN correspondiente a un juego de 23
cromosomas en estado de un solo cromatidio (en fase G1 antes del
periodo S de síntesis). Una forma mucho más sencilla de definir el
valor C, en el caso de las especies diploides, con dos juegos
cromosómicos, sería el contenido de ADN de un gameto de la
especie. Un espermatozoide humano y un óvulo humano (gametos)
contienen 23 cromosomas en estado de un cromatidio, el valor C
sería la cantidad de ADN de los 23 cromatidios de un gameto
humano.

2.- Describe el procedimiento químico y enzimático, para la

determinación de la secuencia de nucleótidos en un gen

3.- ¿Qué es un vector?

Un vector génico es un agente que transfiere información genética,

por algún medio, de un organismo a otro. Son utilizados en
biotecnología para portar el ADN recombinante desde una célula
donadora hasta la célula receptora en los que se inserta el gen que
se quiere transferir. A continuación se infecta la célula hospedadora
con ese vector recombinante, obteniéndose la célula transgénica

Un vector con el que los científicos experimentan son los plásmidos,

con los que es posible insertar genes foráneos al núcleo de una
célula. Otros vectores génicos son los bacteriófagos y cósmidos.
También se puede considerar vectores genéticos a los virus, puesto
que en el curso de su ciclo insertan información genética en las
células que invaden.

Los vectores deben llevar, además del gen protagonista, otros genes
llamados marcadores, que puedan identificar a las células que sean
resistentes al antibiótico marcado o que emitan luz, según los casos,
serán las portadoras del ADN recombinante. La probabilidad de
fracaso en la formanción del transgénico es muy alta, debido al
descontrol en la inserción de ADN foráneo, de manera que la célula
puede desorganizarse y morir.

4.- Esquematiza el proceso de clonación

5.- ¿Cómo realizaría la extracción y purificación de ADN en

una muestra de tejido animal?

Utilizando el kit S de QuickGene para extracción de ADN en tejidos

junto con la serie de Sistemas Automáticos de Aislamiento de Ácido
Nucleico QuickGene se podrá aislar y también purificar ADN
genómico de muestras en tejidos con muy alta calidad y
rendimiento. Adicionalmente, se pueden extraer 8 muestras lisadas
de tejidos simultáneamente, en sólo 13 minutos. El ADN genómico,
de alta calidad, purificado se puede utilizar para aplicaciones con
PCR , digestión con enzimas de restricción, Southern Blotting, y otras
aplicaciones. QuickGene utiliza la técnica de filtración a presión,
utilizando la técnica de filtración a presión se puede usar con gran
éxito una nueva instrumentación, compacta y automatizada para la
purificación rápida de ácido nucleico.

6.- ¿Cuál es la función del glicerol utilizado en el buffer de

carga?

Darle densidad a la muestra de ADN para que se vaya al fondo del

pósito de la agarosa

7.- Investigar las características y propiedades químicas del

bromuro de etidio

El bromuro de etidio (BrEt) es un agente intercalante usado

comúnmente como marcador de ácidos nucleicos en laboratorios de
biología molecular para procesos como la electroforesis en gel de
agarosa. Cuando se expone esta sustancia a luz ultravioleta, emite
una luz roja-anaranjada, que se intensifica unas 20 veces después de
haberse unido a una cadena de ADN. Este efecto es debido al
aumento de la hidrofobia del medio, y no a la rigidificación del anillo
bencénico, no estando éste entre pares de bases del ADN. Como el
bromuro de etidio se intercala en el ADN, esta sustancia tiene un
poderoso efecto mutágeno y, posiblemente puede ser cancerígeno o
teratógeno.

El bromuro de etidio tiene una referencia CAS 1239-45-8, y una

fórmula C21H20BrN3. Como la mayoría de los compuestos
fluorescentes, es una sustancia aromática. La mayor parte de la
molécula es una estructura tricíclica con grupos amino-benceno en
cada lado de una molécula piridínica(seis átomos, conteniendo
nitrógeno y un anillo aromático). Esta estructura dibenzopiridínica es
conocida con el nombre de fenantridina.

8.- Explica porque se utiliza la luz UV para observar el

corrimiento electroforético de ADN

Porque la luz UV hace visibles las bandas de ADN en el corrimiento

electroforético.
9.- ¿Por qué se prefiere usar el gel de agarosa para la
separación de ADN en vez de acrilamida?

Como los ácidos nucleicos son moléculas grandes (más de unos

centenares de bases), la matriz empleada es agarosa purificada y la
acrilamida es utilizada para el corrimiento de proteínas ya que son
moléculas más pequeñas.

10.-En base a los resultados obtenidos, ¿Qué cambios

realizarías en el procedimiento de la practica?

Dejar reposar al ADN con alcohol al 100% por 30min. A -20°C, para
precipitar mas ADN, esto se ocuparía en casos donde la muestra
fuera muy pequeña.

RESULTADOS

Mediante la utilización de este método de extracción y purificación

se, obtendrá ADN de gran pureza. La cuantificación en el
espectrofotómetro fue de 1.84280 lo que significa que si aceptable
la pureza de nuestro ADN.

Mediante la visualización en el gel de agarosa, podemos observar

ADN en el carril 6 que fue nuestra muestra (C2) demostrando la
presencia de ADN.

ELECTROFORESIS DE DNA GENÓMICO EXTRAÍDO A PARTIR DE

MUESTRAS DE SANGRE PERIFÉRICA
Carril 1: Marcador de PM

Carril 2: 3µ L muestra MAVB

Carril 3: 3µ L muestra 4

Carril 4: 3µ L muestra F.A

Carril 5: 3µ L muestra SIN NOMBRE

Carril 6: 3µ L muestra C2

Carril 7: 3µ L muestra FRNX

Carril 8: 3µ L muestra C-A

Carril 9: ----------------------

Carril 10: 3µ L
muestra NOE

Carril 11: 3µ L
muestra FG

Carril 12: 3µ L
Marcador PM

DISCUSION

Para obtener
ADN puro hay
que tomar en
cuenta la separación de las proteínas, lípidos, carbohidratos (SEVAG).
Y detener la acción de las ADN asas que son las proteínas que
degradan o parten al ADN si queremos conservar la muestra por
mucho tiempo.
 CONCLUSIÓN

Se logro la extracción y purificación de ADN de células eucariotas

obteniendo la muestra de sangre periférica. La extracción y
purificación se llevo a cabo mediante la técnica TSNT.

Realizamos el corrimiento electroforético de ácidos nucleicos

(muestra).

BIBLIOGRAFÍA.

 Gerald karp. Biología celular y molecular. ED McGrawHill 1998.

Pág. 727-730.

 Biología Molecular y Herencia. Robert A. Wallace, Jack L. King,

Gerald P. Sanders., 1a edición. Editorial Trillas. México 1991: página

97, 98.

WEDGRAFIA.

 http://www.xtec.es/~lvallmaj/palau/clonater.jpg

 http://es.wikipedia.org/wiki/Bromuro_de_etidio