EXPLORAREA

HEMOSTAZEI

2009-2010
 DEFINITIE

 Proces de formare a coagulului sanguin la locul de injurie a unui vas

de sange pt a stopa pierderile de sange

 Proces rapid, localizat si foarte bine reglat

 Sangerari anormale sau tromboze pot sa apara cand elemente

specifice ale acestui proces lipsesc sau sunt disfunctionale
Elemente cheie

• Sistemul vascular – endoteliu

• Plachete
• Factori ai coagularii
• Sistemul fibrinolitic
 FAZE PROCES HEMOSTATIC

 DIDACTIC:
 HEMOSTAZA PRIMARA  dop plachetar instabil
 HEMOSTAZA SECUNDARA  coagul fibrino-plachetar stabil

 FIZIOLOGIC – 4 faze:
 Initierea si formarea dopului plachetar

 Propagarea procesului de coagulare de catre cascada coagularii

 Finalizarea coagularii prin interventia mecanismelor de control

antitrombotice

 Inlaturarea coagulului prin fibrinoliza

 Formarea dopului plachetar

 Plachetele sunt activate la locul injuriei pt a forma dopul plachetar initial

ce asigura efectul hemostatic si stopeaza sangerarile mici si moderate

 Raspuns functional plachete:

 ADEZIUNE – depunere plachete pe matrixul subendotelial
 AGREGARE – coeziune plachete-plachete
 SECRETIE – eliberare continut granule
 ACTIVITATE PROCOAGULANTA – amplificarea formarii de trombina

 Activare plachete – de catre numerosi stimuli fiziologici:

 ADP, epinefrina – activatori slabi
 trombina, colagen – activatori puternici
 Secvente normale hemostaza
(4 pasi)

1. Vasoconstrictie arteriolara
 Reflex neurogenic

 Reducere sangerare
 2. Expunere subendoteliu – formare dop plachetar

 ECM, in special colagen

 Plachetele adera si devin active

▪ Modificari forma
▪ Eliberare continut granule

 Agregare plachete pt formare dop plachetar

 Secretie – eliberare continut plachetar

 = hemostaza primara
 3. Factorul tisular eliberat la locul injureiei de catre celulele
endoteliale
 Interactioneaza cu factorii eliberati de plachete
 Activeaza cascada coagularii pornind de la nivelul
plachetelor activate
• Este activata trombina
• Sunt recrutate si activate alte plachete
 In final – depunere fibrina
 = hemostaza secundara
 4. Formarea dopului fibrinoplachetar stabil

 Previne hemoragia

 Interventie mecanisme de control (t-PA) limiteaza

formarea dopului fibrinoplachetar doar la nivelul injuriei
 Cascada coagularii

 Conversia in cascada a unor serii de

proenzime inactive in enzime active
 formare trombina

 Trombina converteste fibrinogenul

plasmatic solubil in fibrina insolubila
FACTORII COAGULARII

1. Zimogeni sintetizati hepatic, vitamina K dependenti:

 F II – protrombina
 F VII - proconvertina procoagulanti
 F IX- Christmas (hemofilia B)
 F X – Stuart Prower
 Proteina C – anticoagulant, cofactor proteina S
! Formele activate ale fact VII, IX, X, asociaza cofactori specifici
pt indeplinirea rolului in cascada coagularii: VIIa – factor tisular,
IXa – VIIIa, Xa – Va.

! Trombina actioneaza direct asupra fibrinogenului ca fact

procoagulant; in asociere cu trombomodulina  anticoagulant
prin activarea proteinei C.

13
FACTORII COAGULARII procoagulanti
2. Cofactori solubili:
 F V – proaccelerina
 F VIII – antihemofilic A
 F von Willebrand – molecula carrier pt FVIII
 Proteina S – anticoagulant, cofactor clivare si inactivare Va, VIIIa
3. Factori de contact:
 F XI – activat in vitro de F XII, in vivo nu necesita obligatoriu factorii de
contact, poate fi activat de trombina de pe supraf plachetara
 F XII - Hageman
Responsabili de activarea de
 HMWK(kininogen) - Fitzgerald contact a coagularii
 Prekalikreina- Fletcher
4. Cofactori celular asociati:
 Factorul tisular – TF (III, tromboplastina tisulara)  factor major de initiere
coagulare in asociere cu VIIa
5. Fibrinogenul (F I)
6. F XIII – stabilizator fibrina
14
FACTORI INHIBITORI / REGLATORI

 Inhibitorul caii factorului tisular- rol inhibitor pt fact Xa si VIIa/TF

 Antitrombina III – ATIII- blocheaza situsurile active ale trombinei,
fact Xa si IXa
 Proteina C – sinteza hepatica, activata de complexul trombina-
trombomodulina, actioneaza ca si cofactor pt proteina S in inactivarea
factorilor Va, VIIIa
 Proteina S – sintetizata hepatic, asociaza proteina C si Ca in
reglarea coagularii
 Trombomodulina- gp sintetizata de celula endoteliala, leaga -
trombina schimbandu-I specificitatea de substrat

15
MODEL CELULAR HEMOSTAZA
Activare Tr
Activare V
Activare X trombina Activare VIII
Activare XI
CELULA TF+
TF, receptor pt F VII
VII VIIa/TF cx
Activare IX

X
II
IXa Xa

VIIIa Va IIa

XIa
Tr activat

ADP
adrenalina

Tromboplastina intrinseca

16
 Caile coagularii
 Doua cai de formare a fibrinei
• Intrinseca
• Initiata de suprafete incarcate negativ
• Extrinseca
• Initiata de injuria tisulara

 Ambele converg catre cale finala comuna

• Protrombin a Trombina

• Fibrinogen Fibrina  coagul

 Activarea in cascada a
sistemului coagularii

18
19
Controlul coagularii
 Antitrombine (e.g., antitrombina III)

 Proteina C and S
 Sistemul fibrinoltic

• Plasminogen  plasmina  produsi de dgradare

ai fibrinei (PDF) – D-dimer reprezentant major al
PDF
Anticoagulanti naturali
Sistemul fibrinolitic
 Fibrinoliza

http://www.si.mahidol.ac.th/department/biochemistry/home/md/courseware_202/lec/hemostasis_lec.pdf
 Reglarea fibrinolizei

http://www.si.mahidol.ac.th/department/biochemistry/home/md/courseware_202/lec/hemostasis_lec.pdf
 Dezechilibru hemostaza

coagulare defect
Hemoragii
antifibrinoliza

fibrinoliza defect
Tromboze
anticoagulare
 Bleeding
disorders

Vascular Clotting factor

Platelet disorders DIC
abnormalities abnormalities
 Plasma
 Componenta non-
celulara a sangelui

 Ser
 Plasma fara fibrinogen si
 Alti factori ai coagularii
 Evaluare de laborator

Timp vasculo-plachetar
- numar trombocite
- teste functionale
agregare plachetara
activitatea ristocetinei
- timp de sangerare
- testul garoului (Rumpel-Leede)
NUMAR TROMBOCITE
 Numarare manuala – imprecisa, consumatoare de timp

 Metode automate - rapid, precis

 Metode optice  
 Flow cytometrie
 N = 150,000 - 450,000 /mcL

  - trombocitopenia – risc crescut de sangerare

 - trombocitoza- tromboze

TESTE FUNCTIONALE PLACHETARE

 Raportul numarului de plachete pt evaliuare functionala – raportul
intre numarul de plachete dintr-o proba de sange, inainte si dupa
stimularea cu un agonist (ADP, epinefrina) evalueaza capacitatea de
agregare  corelat bine cu agregometria
 EVALUARE FUNCTIONALA PLACHETARA

Agregometria plachetara implica o serie de teste efectuate pe

sange integral sau plasma imbogatita in plachete , utilizand
cativa agonisti.

 Acid arahidonic.
 Trombina
 ADP
 Epinephrine
 Collagen
 Ristocetin- necesita FWv si receptori membranari integrii
 Agregometria plachetara
 Clasica – plasma imbogatita in plachete (obtinuta prin
centrifugare) stimulata cu ADP, epinefrina, ristocetina – evaluare
agregate prin turbidimetrie
 Depinde de functia normala a plachetelor, de concentratia de
agonisti
 nu poate detecta agregate formate din mai putin de 100 Tr

 Agregometrie sange integral

 Prin impedanta electrica
 Light scattering methods 
 Analiza flow-citometrica a marimii particulelor
 Platelet function analyzer  (PFA-100®)

 Expunere plachete sange integral la un flux

rapid (5000 to 6000/sec) prin tuburi capilare
si monitorizarea scaderii fluxului pe masura
formarii dopului hemostatic in centrul unei
membrane acoperite cu ADP si colagen

 Rezultatul testului exprimat ca timp de inchidere

 Poate inlucui timpul de sangerare in vivo

 Test screening pt evaluare functionala

 Nu este speific unei anomalii

EVALUAREA ACTIVARII PLACHETARE

 MARKERI SOLUBILI AI ACTIVARII – factorul 4 plachetar, beta

tromboglobulina, TX B2

 Flow citometrie - CD62p, CD63, LAMP-1, CD40L, GpIIb/IIIa

complex
 Agregarea Ristocetin indusa

 Masoara afinitatea de legare a factorului vW la receptorul

plachetar GP Ib
 Plasare plachete pacient intr-o serie de eprubete in care se
adauga concentratii joase de risatocetina (0.4 - 1.2 mg/mL)
 Se urmareste formarea sau nu a agregatelor in fiecare tub

 Ristocetina adaugata la sangele normal determina aglutinare

 In boala von Willebrand, unde factorul von Willebrand este

defect sau absent apare aglutinatinare anormala
 VWF antigen - ELISA

 VWF activitate
 Activitatea cofactorului ristocetinic (VWF:RCo), "gold
standard" pt activitatea VWF
 Activitatea cofactorului ristocetinic
si nivelul FvW in hemostaza
primara
Boala in cauza Activitatea CoF FvW
Ristocetinic
B von W tip III  
B von W tipIIB   prin consum
B von W tip I, IIA  dg dificil, nivel
FvWn
Pseudo-B von W   prin consum
Sd. Bernard  N
Soulier

37
 TIMPUL DE SANGERARE
 Metoda Duke (lobul urechii)
 Metoda Ivy (antebrat)
 Test de sange ce urmareste cat de repede se opreste sangerarea de
vase mici
 Islab reproductibil, invaziv, consumator de timp
 Cu toate acestea - screening test de prima intentia in clinica

 Normal 2-10 minute (Ivy)

 Valori crescute - thrombocytopenia, disseminated intravascular coagulation
(DIC), Bernard-Soulier disease, Glanzmann's thrombasthenia, Aspirin
EXPLORAREA GLOBALA A
HEMOSTAZEI
1. TIMPUL DE SANGERARE  TS
 METODA DUKE
 Tehnica: dezinfectare lob ureche sau pulpa deget inelar, intepatura de
3-4 mm adancime, tamponare cu hartie de filtru din 30 in 30 de secunde
pana la oprirea sangerarii.
 Normal = 2-4 minute
 METODA IVY
 Tehnica: incizie pe fata anterioara a antebratului sub o presiune
constanta de 40 mm Hg obtinuta cu manson tensiometru, cronometrare
timp necesar hemostazei; incizie standard greu de obtinut.
 Normal = 4 – 10 minute
TS:
• Testul de toleranta a aspirinei – prelungeste •reproductibilitate dificila, standardizare
TS la cei la limita; discutabil dificila
•este inconstant modificat in anomalii
Semnificatie: TS alungit orienteaza catre o de vas
vasculopatie, trombocitopenie, alterare fct Tr •scade usor odata cu inaintarea in
(aspirina) si mai rar catre o coagulopatie. varsta
2. NUMAR SI FUNCTIE TROMBOCITARA •nu exista corelatii intre TS si pierderile
39 de sange intravisceral
•test primar de screening de ale carui
1. EXPLORAREA REZISTENTEI VASCULARE
 PROBA VENTUZEI
• Tehnica: decompresiune a unei suprafete cutanate cu ajutorul unei palnii de sticla sau
ventuze conectate la o pompa aspiratoare si manometru cu mercur - se determina
momentul de aparitie si numarul de petesii aparute ca rezultat al decompresiunii.
• Rezistenta capilara normala  nu apar petesii pana la o decompresiune de 20-25 mm
Hg la adult, 30 mm Hg copil.
 PROBA RUMPELL-LEEDE
• Tehnica: tensiometru aplicat deasupra cotului si se ridica presiunea la o valoare intre
presiunea sistolica si cea diastolica timp de 5 minute.
• Rezistenta capilara normala  nu apar petesii. Fragilitate capilara cu atat mai mare cu
cat numarul si intinderea petesiilor sunt mai mari.

Intrucat rezistenta si permeabilitatea capilara depind de integritatea morfologica si

functionala a vasului dar si de numarul si calitatea trombocitelor, proba ventuzei si
Rumpell-Leede sunt pozitive atat in vasculopatii cat si in afectiuni plachetare.

40
 Cascada coagularii

PTT, aPTT PT, INR

ACT

TT
EXPLORAREA TIMPULUI PLASMATIC
TIMPUL DE COAGULARE (TC)-Lee-White: timp coagulare sange
venos in eprubeta hemostaza, la 370; n=8 – 12 min. Evalueaza
calea intrinseca, sensibilitate scazuta.

TIMPUL HOWELL (TH) timp coagulare plasma decalcificata

(recoltare pe sodiu citrat) dupa recalcificare, la 370 
cronometrare timp formare cheag fibrina
Evalueaza calea intrinseca, punct de pornire FXII activat de
supraf electronegativa a eprubetei
(1,10-2,10 min) nu deceleaza tulburari minore coagulare
Timpul de cefalina sau de
tromboplastina partiala (PTT)
exploreaza coagularea intrinseca +
comuna
PTT
timp recalcificare plasma saraca in aPTT
trombocite cu suspensie cefalina
(tromboplastina partiala ) n=70-110 s
valori normale in diateze hemoragice de
natura plachetara (Tr este exclus din test,
plasma saraca)
prelungire in deficit factori
tromboplastinici sau al complexului
protrombinic

43
Timpul de tromboplastina partiala activata (aPTT)

cefalina (tromboplastina partiala) + plasma cercetata expusa la

suprafete incarcate negativ (activata) , aceasta fiind diferenta fata de
PTTn=40-60 s

APTT – deficit factori coagulare IX, XI, VIII, XII, PK, HMWK, sau prezenta
inhibitori
-aPTT descopera inhibitorii obisnuiti: anticoagulanti lupici, Ac anti-fosfolipid
care interfera cu reactivul fosfolipidic folosit in reactie diluarea plasmei scade
concentratia inhibitorilor si aPTT tinde sa scada
-aPTT folosit pt monitorizarea terapiei cu heparina: aPTT=1,5-2,5x timp
referinta

44
EXPLORAREA ETAPELOR COAGULARII
I. TROMBOPLASTINOFORMAREA
Timp de consum de protrombina (TCP)= ser
cercetat+tromboplastina calcica +plasma adsorbita
(VIII, XI, V) sau fibrinogen  n= 30 sec
investigheaza formarea protrombinazei pe cale
intrinseca

este singurul test care se lucreaza pe ser si singurul la care valorile scazute
sunt patologice
evidentiaza indirect deficite factori coagulare XI, IX, VIII
Mecanism: protrombina reziduala din ser se transf in trombina in prezenta
tromboplastinei calcice. Deficit al formarii protrombinazei (IX, XI, VIII) face sa
ramana cant mare de protrombina care in prezenta tromboplastinei calcice
formeaza cheagul mai rapid.
 CALE INTRINSECA T Howell=1,1- CALE EXTRINSECA
Suprafata incarcata negativ (in vitro- 2,1 min
sticla, caolin, dextransulfat)
Factorul tisular
PK,
HMWK
XII XIIa VII
VIIa- Ca2+

XI XIa

TCP (30”)
Ca2+
TENAZ PROTROMBINAZ
IX IXa A A
TQ/TP
Ca2+
X Xa Ca2+ (11-15 “)
PL membranar
PL membranar
PTT, VIIIa
VIII V Va
aPTT
(40-60 “)

II IIa

T. Trombina I Ia
T. Reptilaza
(15 -20”)
Teste de corectie
• constau in refacerea timpului Howell si aPTT cu reactivi ce contin factorul considerat
deficitar
•Reactivii folositi sunt:
•plasma normala proaspata – contine toti factorii (PN)
•plasma normala proaspata adsorbita pe sulfat de bariu – contine F VIII si XI (PAD)
•ser vechi – contine F XI si IX (SV)
•cefalina in suspensie (C) – daca se lucreaza T Howell, aici participa si Tr

eprubeta E1 E2 E3 E4
Reactiv PN PAD SV C Deficit de
factor
Corectia + + - - VIII
testului Hemofilia A

+ - + - IX
Hemofilia B

+ + + - XI
Hemofilia C

+/- - - + Fp3
Inhibitori
- - - - protrombinaza
47
II. TROMBINOFORMAREA
timpul Quick / timp protrombina = plasma
de cercetat (citratata, fara Tr post
centrifugare la 2500 g, 15 min) +
tromboplastina calcica  n= 11-15 sec.
VII
evalueaza factorii II, V, VII, X, trombino, T QUICK
fibrinoformarea cale extrinseca
 - deficit II, V, VII, X, deficit vit K,
hipo/afibrinogenemii
INR= International Normalized Ratio
protrombine time ratio (PTR)=timp X
protrombina pacient/timp martor (PTR =1
la n, =1,5-2,5 la cei cu anticoagulante II
orale)
V
INR = PTR = 0,5-1,5 (ISI – index
ISI

international de sensibilitate) FIBRINOGEN

> 1,5 - hiopcoagulabilitate
INR=2-3 la subiecti sub anticoagulant
< 2 – risc tromboza
>3 – risc hemoragie
48
Testul Koller = vitamina K parenteral la
subiecti TQ  + determinare TQ
TQ normal  deficit aport sau absorbtie
vitamina K
TQ alungit  defect de utilizare

Timp Quick si timp partial tromboplastina

in paralel = cale extrinseca + intrinseca
Vit K

F II – protrombina
Testul generarii de tromboplastina:
F VII - proconvertina
plasma normala adsorbita (V, VIII, XI, XII) F IX- Christmas (hemofilia
B)
ser normal (IX, X, XI, XII) F X – Stuart Prower
plachete (factorul III lipoproteic)
2 din reactivii de mai sus + 1 componenta
pacient  identificare defect in ser, plasma, + Ca tromboplastina
trombocit
49
Algoritm de diagnostic utilizand teste de
coagulabilitate globala
aPTT TQ (timp Deficit de factori
protrombina)
 N CALE INTRINSECA
XII, XI, IX, VIII
N  CALE
EXTRINSECA
VII (parahemofilia
Alexander)
  CALE COMUNA
X, V, II, I
DEFICIT
MULTIPLU
(coagulopatie
dobandita)

50
 III. FIBRINOFORMAREA
timpul de trombina = timp coagulare
plasma oxalatata + exces trombina= timp de
conversie fibrinogen fibrina
 - deficit sau exces (inhiba activitatea
trombinica) de fibrinogen; fibrinogen n cu
timpul de reptilaza anomalii fct.; inhibitori fmare fibrina:
reptilaza coaguleaza substante heparin-like (neoplazii), exces PDF
fibrinogenul si este insensibila la plasma normala corecteaza TT in hipo si
anticoagulanti afibrinogenemii, partial in fibrinoliza acuta
 in prezenta inhibitori
polimerizare fibrina, normal in
caz anticoagulanti antitrombinici

dozare fibrinogen plasmatic (gravimetric, colorimetric)

 - hepatopatii severe, leucoze, fibrinolize primare, secundare
 - infectii, hemopatii maligne, colagenoze, etc
activitate factor XIII- dizolvare cheag cu acid monocloracetic
51
cheag>2 ore – normal, < 5-15 min-lipsa factor XIII
 Algoritm de diagnostic in investigarea
fibrino-formarii

FIBRINOGENEMIA TIMP TIMP DIAGNOSTIC

TROMBIN REPTILAZ
A A
   HIPOFIBRINOGENEMIE
N   DISFIBRINOGENEMIE
N  N ANTICOAGULANTI
CIRCULANTI

52
 Retractia cheagului
• metoda de explorare a timpului trombodinamic
• investigheaza indirect si hemostaza primara, depinde de activarea
trombocitara, se desfasoara normal in functie de numarul si functia
trombocitelor
• recoltare 5 ml sange, eprubeta in baie de apa la 37 grade, se apreciaza
retractia cheagului la 2 si la 24 ore prin cantitatea de ser expulzat
• n= 30% ser expulzat la 2 ore si 45% dupa 24 ore

• varianta: apreciere retractie pe lama timpul necesar pt aparitia unei

picaturi de ser pe lama cu o pic sange
• n=30 min

53
EVALUAREA FIBRINOLIZEI
Extrinsec: t-PA, urokinaza
Plasminogen Intrinsec: factor XIIa, HMWK, kallikrein
Exogeni: streptokinaza

Fibrina, fibrinogen

Plasmina

Fibrina, fibrinogen,
produsi degradare

1. Timpul de liza a cheagului euglobulinic

2. Evidentierea produsilor de degradare fibrina

54
 1. Timpul de liza a cheagului
euglobulinic- TLCE
• plasma de cercetat citratata, fara plachete (inlaturare prin centrifugare la
viteza inalta, deoarece contin inhibitor-1 al plasminogenului) diluata cu apa
distilata pt a scadea puterea inhibitorilor fibrinolizei + acid acetic 
precipitare fractiune euglobuline (factori ai coagularii, t-PA, complex
activator tisular plasminogen-inhibitor1 al activatorului tisular al
plasminogenului)
• dizolvare precipitat in mediu tamponat
• coagulare prin adaos de trombina  cheag euglobulinic
• liza cheagului euglobulinic in 60 minute
• interpretare:
• TLCE  - sindrom fibrinolitic – supraacut < 15 min, acut 15-30 min,
subacut 30-60 min
• nu poate face diferenta intre un sindrom fibrinolitic primar (crestere
t-PA, scadere inhibitor t_PA) si unul secundar (CID)

55
 2. Evidentierea produsilor de
degradare fibrina-PDF
• PDF exista in ser in cant foarte mici, nedecelabili prin metode obisnuite
• cresterea concentratiei se face fie prin cresterea productiei, fie prin
scaderea degradarii si eliminarii lor
• reactie de hemaglutinare: aglutinare particule de latex acoperite cu Ac
anti-fibrinogen
• daca testul foloseste Ac policlonali, nu se face diferenta intre
monomeri si D-dimeri fibrina
• test cu Ac monoclonali  metoda dozare D-dimeri

• n: PDF – monomeri <10 mcg/ml; D-dimeri <250 mcg/ml

•Nivele crescute PDF:

•CID, fibrinoliza primara, ciroza hepatica (asociaza un grad de CID dar si
scaderea eliminare PDF), tumori solide, tromboza venoasa periferica, TEP

56
 Algoritm de interpretare valori PDF
CID FIBRINOLIZA CIROZA TROMBOZA
PRIMARA HEPATICA, VENOASA
TUMORI PERIFERICA
SOLIDE,
LEUCEMII

PDF  PDF PDF D-dimeri 

D-dimeri  D-dimeri -- D-dimeri (nivele
detectabile)

Diagnostic diferential CID – fibrinoliza primara

TLCE TQ aPTT Tr T. FIBRIN PDF D dimeri
TROMBI OGEN
NA
CID        

FIBRIN    n    n

OLIZA
PRIMAR
A
57
 Cauze ce determina anomalii ale
testelor de hemostaza
Partial Prothrombin Time Thrombin Time Bleeding Time (BT)
Thromboplastin (PT) (TT)
Time (aPTT)
Factor deficiency VII, X, V, II, fibrinogen Low or absent Thrombocytopenia
(except VII) deficiency fibrinogen

Antibodies to clotting Antibodies Dysfibrinogenemia, Von Willebrand’s

factors hypofibrinogenemia disease

Heparin Warfarin; Vit K Heparin Drugs (Aspirin,

defficiency (mild to NSAIDs, high dose
severe) penicillins, etc.)
Excessive Warfarin Excessive Heparin Cirrhosis, Uremia,
PLTs dysfunction

58
TESTE SCREENING:
Numar trombocite
Timp partial tromboplastina activata / PTT, aPTT
INR, timp protrombina/TQ
Timp trombina
Timp sangerare
Fibrinogen, dimeri
Retractia cheagului

59
Test Purpose
Formation of initial platelet plugs