Instituto Mexicano Del Seguro Social

Hospital General De Zona N° 46.

Programa Académico para pasantes en servicio social.

Manual de prá cticas bá sicas

en el á rea de patología
clínica.

Pasante en servicio social de técnico Laboratorista clínico.

Periodo de servicio social:

1 de agosto de 2009 a 1 de febrero de 2010.

Villahermosa, Tabasco a 29 de enero de 2010.

 Introducció n.

La división de patología es, posiblemente, una de las áreas

menos conocidas por los pacientes de cualquier hospital. En ella se
lleva a cabo una serie de procedimientos y actividades que
garantizan el correcto diagnóstico del paciente, utilizando múltiples
técnicas que se han ido perfeccionando.

El objetivo de este manual es mostrar cuáles son estas técnicas

más comunes y básicas a realizarse dentro un laboratorio de
patología clínica. A su vez está diseñado para futuras generaciones
de pasantes de servicio social de laboratorio que cumplan con la
condición de realizar sus prácticas en ésta área y también para
todos aquellos que deseen consultarlo.
 1. Conceptos principales.

Para que sea de fácil comprensión este texto inicio con las
definiciones de los conceptos que utilizare después.

Primero definiré los conceptos de patología clínica, médico

patólogo, etc. y todos los que sean necesarios para un
adentramiento inicial.

1.1. Patología clínica.

La Patología constituye la especialidad médica encargada de

explicar la evolución de la enfermedad a través de la interpretación
científica de las modificaciones que esta produce en las células, los
tejidos, los órganos y en los sistemas que conforman el organismo
humano, razón por la cual integra bajo una visión morfológica el
conocimiento aportado por las ciencias básicas como la anatomía,
la fisiología y la bioquímica, con las diversas especialidades medico
quirúrgicas.

El desarrollo acelerado de la inmunología, la biología molecular,

la genética y su aplicación en los campos de la oncología y la
microbiología, se ha logrado en parte, gracias al papel integrador de
la Patología, es así como en la actualidad, sobre especímenes ya
procesados por el método tradicional de inclusión en parafina, se
aplican técnicas inmunológicas para establecer por ejemplo la
expresión de un determinado antígeno, de un receptor, o de un gen
sobre la superficie o en el interior de una célula, metodología que
ha jalonado el avance de la investigación médica, pero que además
ha permitido mejorar el diagnóstico de muchas enfermedades y de
la misma manera, el pronóstico y la calidad de vida de los
pacientes.
 El Departamento de Patología tiene un papel importante en los
procesos de vigilancia en salud pública o vigilancia epidemiológica,
teniendo en cuenta que es un centro de recepción de muestras de
toda el área de influencia, como del Hospital, donde se procesa
material de biopsia o de autopsia, para confirmar o descartar
diagnósticos de posibles enfermedades de notificación obligatoria,
con el fin de aportar en la implementación de medidas de
prevención y control y así evitar que las enfermedades se
propaguen a la comunidad y los daños en salud sean mayores1.

1.2. Médico patólogo.

Mediante su actuar médico científico, el especialista en

Patología, interviene en labores de promoción y prevención, apoyo
diagnóstico, educación médica e investigación. Como especialidad
de apoyo diagnóstico a las demás especialidades médicas, es muy
notorio su papel, ya que en la actualidad el desarrollo
biotecnológico ha permitido la implementación de una diversidad
de equipos mediante los cuales, con mínimo riesgo para el paciente
es posible explorar e intervenir en la mayoría de órganos internos y
de manera simultánea tomar minúsculas muestras de tejido y a
veces tan solo células, las cuales al ser analizadas por el médico
patólogo, se puede llegar a un diagnóstico definitivo. En el mismo
campo del apoyo diagnóstico, es además ya muy conocido el papel
del patólogo en el estudio de las diferentes piezas anatómicas
extirpadas en cirugía.
 1.3. Biopsia

Una biopsia es procedimiento diagnóstico que consiste en la

extracción de una muestra de tejido obtenida por medio de
métodos cruentos para examinarla al microscopio.

La palabra biopsia es compuesta y procede del griego bio, vida,

y opsia, ver.

Tipos de biopsia.

La biopsia entrega la máxima certeza al diagnóstico. Hay

distintas modalidades dependiendo de las circunstancias clínicas:

1. Biopsia de tejido como la bronquial o transbronquial en el

curso de una fibrobroncoscopia.

2. Biopsia ganglionar.

3. Biopsia percutánea de ganglios palpables se debe realizar una

exploración física detallada y si existen adenopatías se suelen
biopsiar.

4. Biopsia de Daniel o biopsia de ganglios escalénicos: consiste

en extirpar la grasa preescalénica y estudiarla
histopatológicamente. Si el estudio es positivo, es un criterio
de inoperabilidad.

5. Biopsia de masa de partes blandas: se biopsiará las lesiones

sospechosas accesibles si aún no se ha establecido el
tratamiento o si la determinación del estadio se basa en el
hecho de que una determinada lesión sea o no cáncer.

6. Biopsia ósea de una lesión osteolítica: se determina por la

radiología del hueso afecto o por gammagrafía ósea.
 7. Biopsia de médula ósea: se suele hacer una punción de cresta
ilíaca sobre todo en el cáncer de pulmón que suele
metastatizar en médula ósea frecuentemente.

8. Biopsia pleural: si es tumor periférico y existe derrame

pleural.

1.3.1. Biopsia excisional 

También se llama excéresis. Una biopsia es la extirpación

completa de un órgano o un tumor, generalmente sin márgenes,
que se realiza normalmente en quirófano bajo anestesia general o
local y con cirugía mayor o menor respectivamente. La biopsia
excisional se realiza, por ejemplo en:

a) La extirpación de una adenopatía aislada.

b) En los tumores de mama pequeños: Si es un tumor benigno, la

misma biopsia es terapéutica, pero si es maligno hay que
volver a intervenir, ampliar márgenes y realizar una
linfadenectomía o vaciamiento axilar homolateral.

c) En las lesiones cutáneas sospechosas, sobre todo melánicas:

Si son benignas, no se realiza más tratamiento quirúrgico y si
es maligna como un melanoma, hay que ampliar márgenes y
realizar la prueba del ganglio centinela.

d) El bazo, no se puede biopsiar, en caso de linfoma, tomando

una muestra por el riesgo de hemorragia, por lo que se
extirpa completamente (esplenectomía).

e) Biopsia intraoperatoria: Es la que se obtiene durante una

laparotomía exploradora por ejemplo en un cáncer de ovario .
 f) Biopsia Cérvica Perpendicular: La cual se realiza en la zona
Cervical a 45 grados procediendo a extraer solo 1 cm de
ligamento cérvico. El estudio arrojara si la muestra es dañina
o sana.

1.3.2. Biopsia incisional.

Es la biopsia en la que se corta o se extirpa

quirúrgicamente sólo un trozo de tejido, masa
o tumor. Este tipo de biopsia se utiliza más a
menudo en los tumores de tejidos blandos como
el cerebro, hígado, pulmón, para distinguir
patología benigna de la maligna, porque estos
órganos no se pueden extirpar, o porque la lesión
es muy grande o difusa.

1.3.3. Biopsia estereotáxica.

Son un conjunto de biopsias obtenidas y guiadas por pruebas de

imagen que indican las coordenadas del espacio donde se
encuentra la lesión, como por ejemplo lesiones de mama no
palpables que se marcan con arpón en una mamografía, o con ABBI
(AdvancedBreastBiopsyInstrumentation). Las biopsias cerebrales
suelen ser biopsias estereotáxicas.
 1.3.4. Biopsia endoscópica.

Es la biopsia obtenida por medio de un endoscopio que se

quirúrgica. El endoscopio contiene un sistema de luz y de
visualización para observar las lesiones de órganos huecos o
cavidades corporales junto con pinzas que discurren a lo largo del
tubo del endoscopio y que pueden extirpar pequeños fragmentos
de la superficie interna del órgano o cavidad.

 La biopsia obtenida en una colonoscopia suele ser el método

diagnóstico más frecuente en el cáncer colorrectal.
 La biopsia de una esofagoscopia o gastroscopia puede
diagnosticar un cáncer de esófago o de estómago.

1.3.5. Biopsia colposcópica.
 Es la biopsia en la que se obtiene tejido de la vagina o del cuello
del útero y que realizan los ginecólogos ante una prueba de
Papanicolaou positiva, para descartar un cáncer de cérvix o de
vagina, mediante un colposcopio.

1.3.6. Punción aspiración con aguja fina (PAAF).

Es la biopsia obtenida mediante la punción con una aguja de

escaso calibre conectada a una jeringa y la realización de una
aspiración enérgica. Se obtiene generalmente células aisladas que
se extienden sobre una laminilla. Más que una biopsia es
una citología. La PAAF suele utilizarse para obtener muestras de
órganos profundos como el páncreas y el pulmón, guiadas
por TAC o ecografía. El inconveniente de la citología es que no es un
diagnóstico de certeza.

1.3.7. Biopsia con sacabocados.

También se llama punch. Es la biopsia de piel, que se realiza con

una cuchilla cilíndrica hueca que obtiene un cilindro de 2 a 4
milímetros, bajo anestesia local y un punto de sutura.

1.3.8. Biopsia de médula ósea.

 Es la biopsia que practican los hematólogos (también patólogos
e internistas) procedente de la cresta ilíaca posterosuperior de
la pelvis, del sacro o del esternón para obtener médula
ósea y diagnosticar el origen de determinados trastornos
sanguíneos principalmente. Se debe insensibilizar la piel y el
periostio con anestésico local. A continuación, se introduce en el
espacio medular una aguja rígida
de mayor calibre, se fija una jeringa
a la aguja y se aspira. Las células de
la médula ósea son absorbidas al
interior de la jeringa. En el
contenido de la jeringa, aparece
sangre con fragmentos pequeños
de grasa flotando en su entorno.
Después de la aspiración se realiza
una biopsia para extraer tejido
óseo con una aguja hueca.

1.3.9. Biopsia por punción con aguja gruesa.

También se llama core biopsia o tru-cut que se realiza mediante

la obtención de biopsia con pistolas automáticas, que reduce las
molestias en el paciente. Una vez que se coloca la aguja en posición
de predisparo, guiada por palpación o prueba de imagen, se
presiona el disparador y la parte interior de la aguja, que es la que
succiona el tejido, se proyecta atravesando la lesión y saliendo de
ella con la muestra muy rápidamente. Precisa de anestesia local.

2. Proceso Histológico.
 La mayoría de las técnicas histológicas van encaminadas a
preparar el tejido para su observación con el microscopio, bien sea
óptico o electrónico. Ello es debido a que la estructura de los
tejidos está basada en la organización de los tipos de células que los
componen y, salvo contadas ocasiones, las características
morfológicas de las células sólo se pueden observar con estos
aparatos. Existen procedimientos para la observación de tejidos y
células vivas que reciben el nombre de vitales.

Las técnicas histológicas postvitales son aquellas en las que las

células mueren durante el proceso, pero las características
morfológicas y moleculares que poseían en estado vivo se
conservan, más o menos dependiendo del tipo de técnica. Estas
páginas estarán dedicadas a este tipo de técnicas, puesto que son
las más comúnmente usadas en los laboratorios de histología.

Denominamos proceso histológico a una serie de métodos y

técnicas utilizados para poder estudiar las características
morfológicas y moleculares de los tejidos. Hay diversos caminos
para estudiar los tejidos, es decir, series de técnicas que se
utilizarán dependiendo de qué característica deseemos observar.
En el siguiente esquema se muestran los métodos y técnicas
comúnmente empleados para el procesamiento de los tejidos. Sin
embargo, hay que tener en cuenta que existen muchas variantes a
estos "caminos" y su elección dependerá del resultado final que
queramos obtener.

Esquema del proceso histológico.

 El proceso histológico comienza con la obtención del tejido
objeto de estudio. En el caso de los tejidos vegetales se toman
muestras de los distintos órganos que componen el cuerpo de la
planta, mientras que para los tejidos animales podemos optar por
dos opciones: coger una porción de dicho tejido o procesar una
parte, órgano o parte corporal, o el animal completo. En cualquier
caso las muestras son habitualmente fijadas con unas soluciones
líquidas que contienen unas sustancias denominadas fijadores, las
cuales mantienen las estructuras celulares y moleculares en sus
posiciones iniciales durante el procesamiento posterior. También
podemos fijar las moléculas de los tejidos por congelación rápida.
Fijar un tejido es como si hiciésemos una fotografía del tejido que
se mantendrá hasta su observación. Sin embargo, el uso de
fijadores o medios de inclusión afectan a veces las características
tisulares que queremos observar y por tanto tenemos que recurrir
a la congelación para endurecer el tejido para después poder
obtener secciones del mismo.

Normalmente, tras la fijación se procede a incluir el tejido para

posteriormente obtener secciones. Cuanto más delgada queramos
que sea nuestra sección más tenemos que endurecer nuestra
muestra. Esto se consigue embebiendo el tejido con sustancias
líquidas que posteriormente polimerizarán (resinas) o se volverán
consistentes (ceras). También se puede conseguir el mismo efecto
mediante congelación rápida. Cortes más gruesos de 40 µm se
pueden cortar sin necesidad de inclusión usando el vibratomo. Los
medios de inclusión son normalmente no hidrosolubles por lo que
tenemos que sustituir el agua de los tejidos por solventes orgánicos
liposolubles y posteriormente añadir el medio de inclusión.

Tras la inclusión o la congelación se procede a cortar los tejidos.

Existen diferentes aparatos de corte que permiten conseguir
secciones ultrafinas (del orden de nanómetros), semifinas (de 0.5 a
2 µm), finas (entre unas 3 y 10 µm) y gruesos (mayores a 10 µm).
Estas secciones hay que procesarlas para poder observarlas,
aunque ciertos tipos de microscopía, por ejemplo con contraste de
fase, permiten observar tejidos sin teñir. Normalmente las
secciones se tiñen con colorantes que son hidrosolubles, por lo que
hay que eliminar el medio de inclusión para que los colorantes
puedan unirse al tejido. Las secciones, secciones ultrafinas, que se
observan con el microscopio electrónico se pueden contrastar con
metales pesados, opacos a los electrones, sin eliminar la resina.

Los tejidos procesados se observan con los microscopios. Existen

dos tipos básicos de microscopios: electrónico y óptico. Los
primeros permiten un gran poder de resolución, pudiéndose
observar características ultraestructurales, mientras que los
segundos, con menor poder de resolución, ofrecen una gran
versatilidad en cuanto a modos de observar los tejidos:
fluorescencia, contraste de fase, polarización o contraste de
interferencia diferencial.

Como dijimos al comienzo existen múltiples variaciones sobre

este esquema general. Por ejemplo, se pueden observar tejidos con
el microscopio electrónico de barrido sin necesidad de incluir ni
cortar, pero sólo observaremos superficies. En las siguientes
páginas veremos con cierto detalle algunas de las técnicas más
empleadas para la observación de los tejidos.

2.1. Fijación.
 Todos los tejidos, cuando se extraen del organismo o el
organismo muere, sufren dos tipos de procesos degradativos:
autolisis (acción de enzimas intracelulares, es decir, autodigestión)
y putrefacción (acción bacteriana). Además, el procesamiento
histológico posterior del tejido para poner de manifiesto y observar
determinadas estructuras supone una metodología que puede
degradar las estructuras tisulares. Fijar un tejido es preservar sus
características morfológicas y moleculares lo más parecidas
posibles a las que poseía en estado vivo. Es como hacer una
fotografía del tejido vivo y poder observarla, tras cierto
tratamiento, con el microscopio. Así, los fijadores deben proteger
frente a ataques bacterianos, evitar autolisis, insolubilizar
elementos solubles que se quieren estudiar, evitar distorsiones y
retracciones tisulares, penetrar y modificar el tejido para poder
llevar a cabo tinciones específicas posteriores, si es necesario,
etcétera.

No existe un fijador universal, ni un método de fijación único.

Incluso podemos usar varios fijadores secuencialmente según
nuestras necesidades. La elección depende de las características
fijadoras que necesitemos. Por ejemplo, si queremos estudiar
actividades enzimáticas debemos usar un fijador que no nos altere
el centro activo de dichas enzimas, y quizá para ello tengamos que
sacrificar en cierta medida la morfología tisular. Si queremos
estudiar la ultraestructura celular debemos usar fijadores que la
preserven y que protejan a las membranas celulares durante el
procesamiento de inclusión en resinas, y quizá esto altere su
apetencia por los colorantes generales. Si queremos teñir un
determinado componente celular difícilmente teñible quizá
debamos usar un fijador que lo modifique para que sea reconocido
más fácilmente por los colorantes.

En cualquier caso, hay características de los fijadores que

tenemos que tener en cuenta antes de su uso:
 Velocidad de penetración. El proceso de fijación ha de ser
rápido y la velocidad de difusión de la sustancia fijadora en los
tejidos es un factor determinante. Este parámetro condiciona el
tamaño de la pieza que queramos fijar, más pequeña cuanto menor
la velocidad de difusión, y el tiempo de fijación, mayor cuanto
menor tiempo de difusión.

Velocidad de fijación. Esta característica no depende de la

velocidad de difusión sino de las propiedades químicas del fijador y
condiciona el tiempo que debe permanecer el tejido en contacto
con el fijador.

Endurecimiento. Los fijadores generalmente endurecen los

tejidos, lo cual depende del tipo de fijador y del tiempo que el
tejido haya estado expuesto a él.

Ósmosis y pH. Es indispensable evitar cambios de volumen en la

célula producidos por una osmolaridad del fijador diferente a la del
tejido. Por tanto, hay que equilibrar la osmolaridad de las
soluciones fijadoras y la de los tejidos a fijar. No es necesario añadir
sustancias complejas. Por ejemplo, para los tejidos de animales
terrestres basta con añadir 0.9 % de cloruro sódico. Son sales que
no afectan a la capacidad del fijador. Normalmente se suelen usar
soluciones tamponadas a un pH semejante al del tejido e
isosmóticas con dicho tejido.

2.2. Fijación.
 Existen diferentes formas de fijar los tejidos, dependiendo del
tipo de fijador, de la estructura a fijar y de lo queramos observar.
Los métodos de fijación se pueden clasificar en dos tipos: físicos y
químicos.

Los fijadores físicos están basados en una congelación muy

rápida del tejido, en la aplicación de calor o microondas. Se utilizan
cuando el tipo de muestra lo requiere, cuando los fijadores
químicos alteran la estructura que queremos observar, o cuando
necesitamos una fijación muy rápida. La congelación rápida es un
buen método de preservación de las características moleculares y
es conveniente que sea rápida puesto que así se impide la
formación de grandes cristales de hielo que nos destrozarían la
estructura del tejido. Existen variantes de esta técnica como son la
criodesecación o liofilización y la criosustitución. La criodesecación
parte de tejido previamente congelado, pero posteriormente se
realiza una sublimación del hielo, es decir, el agua pasa de estado
sólido a gaseoso sin pasar por estado líquido. Al eliminar el agua se
impide que se den reacciones químicas por lo que además de la
fijación preserva el tejido en el tiempo. La criosustitución también
parte de tejido congelado pero en este caso se produce una
sustitución lenta del hielo por una solución fijadora. Con ello se
posibilita una fijación química sobre un material que no ha sufrido
deterioro puesto que está congelado. Los métodos de fijación por
calor de fijación no son frecuentemente usados, excepto para
observar microorganismos.

Los métodos químicos utilizan soluciones acuosas compuestas

por moléculas fijadoras que establecen puentes entre las moléculas
celulares, manteniéndolas en sus lugares originales e impidiendo su
degradación. Hay dos métodos de fijación con fijadores líquidos:
inmersión y perfusión. En cualquier caso el fijador debe entrar en
contacto con el tejido lo más rápidamente posible.
Inmersión.
 Por el método de inmersión las piezas de tejido se sumergen en
la solución fijadora. Tenemos que tener en cuenta algunas
precauciones.

a) Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5 cm de

espesor para que el fijador alcance el interior de la pieza
antes de que ésta comience a deteriorarse. Esto depende
de la velocidad de penetración del fijador y de las
características del tejido, por ejemplo, si tiene cavidades
por donde penetre la solución fijadora.

b) El volumen recomendado de fijador debe

ser 20 veces superior al volumen de la pieza.

c) La osmolaridad entre tejido y solución

fijadora deben estar equilibradas.

d) El pH del fijador debe ser próximo al fisiológico.

e) El tiempo de fijación depende de cada tipo de fijador, pero

generalmente existe un tiempo máximo para cada uno de
ellos que no debe ser excedido.

Perfusión.

Por este procedimiento la solución fijadora se introduce a través

del sistema circulatorio mediante el cual accede a todas las células
del tejido gracias a la red de capilares. Mediante este método se
puede fijar un animal completo introduciendo la solución fijadora a
través del ventrículo cardiaco, con lo que el fijador llegará a todas
las células irrigadas por la sangre bombeada por dicho ventrículo
(circuito pulmonar o corporal).
También podemos fijar un único órgano en el caso de que
podamos aislar e introducir la solución fijadora en la arteria
principal que irriga dicho órgano. La perfusión no siempre es
posible llevarla a cabo, como es el caso de biopsias o tejidos
vegetales. Este método es mucho más efectivo que el de inmersión,
ya que la solución fijadora llega a escasa distancia de todas las
células de la estructura refundida. Por tanto, la velocidad de
penetración del fijador no es una condición limitante. El volumen
de fijador necesario también es menor puesto que la solución
fijadora se va renovando constantemente y por tanto no se diluye
con el medio acuoso del tejido y no pierde potencial fijador.

Respecto a las precauciones mencionadas anteriormente en el

método de inmersión debemos cuidar aquí también la osmolaridad,
el pH y el tiempo de fijación.

2.2.1. Fijadores.
 Existen multitud de fijadores en los manuales de técnicas
histológicas. Aquí sólo trataremos aquellos que consideramos de
uso más común para la observación de tejidos al microscopio, es
decir, aquellos que mejor preserven la estructura celular. Los
fijadores químicos son los más frecuentemente empleados, bien
con un solo tipo de sustancia fijadora o con mezclas de varias de
ellas.

¡Atención! La mayoría de las sustancias fijadoras son tóxicas por

inhalación o por contacto, algunas de ellas cancerígenas. Hay que
seguir las indicaciones de seguridad para su manejo y utilización.

2.2.1.1. Fijadores simples

Alcohol etílico. (Etanol: CH3-CH2-OH) Fija por deshidratación y se

usa entre el 70 y 90 %. Es un buen elemento para
preservar moléculas, como ciertas enzimas, propiedades
antigénicas, glucógeno, pigmentos y para las extensiones
citológicas. Debido a que deshidrata, a la vez que fija, se
puede usar también como un conservante de las
muestras. Tiene inconvenientes como el endurecimiento
y la retracción de los tejidos. Carece de efecto mordiente.

Ácido acético. (CH3COOH)Su proceso de fijación

consiste en cambiar el estado coloidal de las
proteínas. Se utiliza a una concentración que varía
entre el 1 y el 5 %. Es el fijador ideal para ácidos
nucleícos y nucleoproteínas. Como inconvenientes
cabe destacar la destrucción de las mitocondrias y
mala fijación de membranas y citoplasma. Se suele
usar en combinación con otros fijadores.
Formaldehido. (C2H=O) Actúa mediante la
formación de puentes entre las moléculas tisulares. Se utiliza
a concentraciones próximas al 4 %. Es un fijador
ampliamente usado por la buena preservación del tejido, actúa
como conservante, produce poca retracción tisular, es un buen
fijador para lípidos, es compatible con la mayoría de las tinciones
histológicas, incluidas las de inmunocitoquímica e hibridación de
ácidos ribonucleicos. Normalmente se usa en solución tamponada e
isotónica.

2.2.1.2. Mezclas fijadoras.

La mayor parte de los procesos de fijación usan distintas

sustancias fijadoras, bien mezcladas en la solución acuosa inicial o
utilizada sucesivamente en el tiempo. Con ello se aprovechan las
ventajas de cada una de ellas y se pueden contrarrestar sus
desventajas. Hay multitud de formas de usar los diferentes
fijadores, tanto en sus componentes como en las proporciones de
éstos, dependiendo de las necesidades posteriores, es decir, qué
tipo de tejido queremos fijar y qué queremos ver de dicho tejido. A
continuación vamos a mencionar algunas combinaciones usadas
frecuentemente porque tienen unas propiedades de fijación que las
hace apropiadas para la observación de una gran variedad de
tejidos y de técnicas de tinción.

Líquido de BOUIN.

Está formado por ácido pícrico, formaldehido y ácido acético

glacial. Es una solución muy utilizada para el procesamiento de
tejidos que se incluirán en parafina (ver capítulo de inclusión) y a
cuyas secciones se le pueden aplicar un amplio espectro de
tinciones. Es muy útil para tejidos blandos y embriones, y preserva
bien el núcleo y el glucógeno. Hay que tener cuidado con el tiempo
de fijación, que no debe exceder de 48 h en el caso de fijaciones
por inmersión. Tras la fijación las muestras de tejido se pueden
conservar en alcohol de 70°. No está recomendado para el riñón ni
para el estudio de mitocondrias. Antes de la inclusión en parafina
es conveniente eliminar el ácido pícrico mediante lavados en
alcohol de 70° porque puede hacer que no se produzca una buena
inclusión o que las tinciones no sean adecuadas.

Karnoy.

Es un buen fijador para el glucógeno, para los hidratos de

carbono simples y para las proteínas fibrosas. Es bueno para
visualizar los ácidos nucleícos, aunque no la morfología nuclear, y
para los grumos de Nissl del sistema nervioso. Puede producir
retracciones tisulares. Está formado por etanol absoluto 60 %,
cloroformo 30 % y ácido acético glacial 10 %.

Mezclas con formaldehido.

El formaldehido es quizá el fijador más usado hoy en día, tanto

para técnicas histológicas rutinarias como para otras como la
inmunocitoquímica o la hibridación de ácidos nucleícos. Lo más
frecuente es utilizarlo en solución al 4 % junto con otros fijadores.
Por ejemplo, el Bouin. Se suelen disolver en soluciones tamponadas
que tienen una osmolaridad similar a la del tejido que se pretende
fijar. Para fijaciones de tejidos destinados a microscopía electrónica
se suelen utilizar soluciones fijadoras que contienen formaldehido y
glutaraldehído. La función del formaldehido es iniciar una fijación
rápida, por su mayo capacidad de penetración, mientras que el
glutaraldehído realizará una fijación más poderosa, pero más lenta
que afectará a la estructura tisular puesto que el formaldehido ya
ha realizado una fijación previa.

2.3. Inclusión.
 Una vez fijado el tejido tenemos que procesarlo para su
observación con el microscopio. Ello implica hacer secciones para
teñirlas primero y posteriormente observarlas. Como regla general
se procede al endurecimiento de la muestra para poder obtener
dichas secciones ya que lo normal es que cuanto más delgada
queramos una sección más consistente debe ser la muestra de la
que se obtiene. Los tejidos se endurecen a consecuencia de la
fijación, pero ésta no es muy alta e impide la obtención de cortes
generalmente más delgados que 20 o 30 µm. Sólo en el caso de que
queramos trabajar con secciones relativamente gruesas (entre 30 y
200 µm) se puede aprovechar el endurecimiento provocado por el
fijador y obtener dichas secciones con el vibratomo, que se utiliza
en ciertas técnicas donde es necesaria una buena preservación
molecular. Sin embargo, en muchos casos necesitamos endurecer
más el tejido para obtener secciones más finas y se puede hacer de
dos formas: congelación e inclusión.

2.3.1. La congelación

De los tejidos previamente fijados permite la obtención de

secciones que pueden ir desde unas 50 µm hasta nm., para lo que
se utilizan diferentes aparatos: micrótomo de congelación para
secciones de decenas de µm, criostato para secciones de entre 5 y
20 µm y ultracriotomo para secciones ultrafinas del orden de nm.
Para evitar los daños que se producen durante los procesos de
congelación, formación de cristales de hielo que nos agujerean los
tejidos, se han de tener en cuenta dos procesos:

a) Anticongelantes que impidan la formación de cristales. El

crioprotector más usado es la sacarosa al 30 %, aunque también se
usa el dimetil sulfóxido, el glicerol, etilén glicol y otros. La elección
de uno u otro depende del tipo de muestra y de la técnica que se
vaya a usar.
 b) Una congelación lo más rápida posible, por ejemplo, con
nitrógeno líquido. Cuanto más rápida es la congelación menores
son las dimensiones de los cristales de agua formados.

Se pueden obtener secciones de grosor variable utilizando

diferentes métodos. Secciones más finas se obtienen endureciendo
más el tejido. Esto se puede conseguir mediante la congelación o
embebiendo el tejido en sustancias que solidifican como la parafina
o resinas. Téngase en cuenta que las dimensiones de los cortes y
objetos del dibujo no están a escala. Una rejilla es mucho más
pequeña que un portaobjetos. Las dimensiones en µm y nm se
refieren al espesor de las secciones.
 2.3.2. La inclusión.

Es el método más común de endurecer el tejido y consiste en

infiltrar la muestra con sustancias líquidas que tras un proceso de
polimerización o enfriamiento se solidifican, sin afectar a las
características del tejido. Con ello se consigue obtener cortes
delgados (desde decenas de µm a nm según el medio de inclusión)
sin que el tejido se rompa o se deteriore. Además son un buen
método de preservar las muestras durante largos periodos de
tiempo.

Existen diferentes sustancias o medios de inclusión

dependiendo del grosor del corte y de la técnica que necesitemos
realizar. Cuando se quieren hacer secciones para su observación
con el microscopio óptico los medios de inclusión más
frecuentemente usados son la parafina o la celoidina, mientras que
si vamos a realizar observaciones con el microscopio electrónico la
inclusión se realiza con resinas, principalmente de tipo acrílicos o
epoxy.

La mayoría de los medios de inclusión no son hidrosolubles, es

decir, no miscibles con el agua, luego si queremos que la sustancia
en la que vamos a incluir ocupe todo el tejido tenemos que eliminar
el agua y sustituirla por un líquido miscible con nuestro medio de
inclusión. Si una muestra no está completamente embebida en el
medio de inclusión se deteriorará y la obtención de secciones
homogéneas será imposible.
 2.3.3. Inclusión En Parafina.

Para la inclusión de muestras que han de observarse con

microscopía óptica se utiliza sobre todo la parafina, y en menor
medida la celoidina, como medio de inclusión. Vamos a describir los
pasos para la inclusión en parafina de muestras de tejido
previamente fijadas.

La parafina es una sustancia de aspecto ceroso que está

formada por mezclas de hidrocarburos saturados. A temperatura
ambiente es sólida y su punto de fusión puede variar entre 40 y 70
°C según su composición de la mezcla de hidrocarburos. Resultan
distintos tipos de parafinas a temperatura ambiente que se
emplean según las necesidades. Así, parafinas más duras a
temperatura ambiente tienen un punto de fusión mayor, mientras
que las más blandas uno menor. Es recomendable una dureza
mayor para incluir muestras más duras. Las parafinas más usadas
tienen un punto de fusión en torno a los 60 °C. Podemos también
modificar las características de las parafinas añadiendo sustancias
para variar su dureza, viscosidad, fragilidad, etcétera.

La parafina no es miscible con agua, mientras que todos los

tejidos están formados principalmente por agua. Además, la
mayoría de los fijadores son soluciones acuosas. Esto implica que
para que la parafina líquida pueda penetrar completamente en el
tejido ha de sustituirse el agua por un solvente orgánico. Esto se
consigue mediante la deshidratación del tejido en alcoholes,
normalmente metanol, de gradación creciente hasta alcohol de
100°. Posteriormente se transfiere el tejido a un líquido que sea
miscible tanto con el alcohol de 100° como con la parafina,
denominado sustancia intermediaria, como es el benceno, xileno,
tolueno o el óxido de propileno, entre otros. Estas sustancias son
normalmente aclarantes por lo que comprobando la translucidez
de la pieza podemos cerciorarnos de la penetración de la sustancia
intermediaria en el tejido.
 El tiempo de incubación de la pieza por algunos de estos
líquidos intermediarios como el tolueno o xileno no debe ser
excesivo puesto que estas sustancias endurecen la pieza y provocar
problemas hacer las secciones.

Por último se pasa el tejido a parafina previamente licuada en

una estufa regulada a la temperatura apropiada para dicho tipo de
parafina. Se dan tres pasos por parafina para favorecer una buena
impregnación. El tiempo que duran dichos pasos depende de lo
volátil que sea el líquido intermediario y lo grande que sea nuestra
pieza. Será mayor cuanto menos volátil es el líquido intermediario o
mayor sea la muestra de tejido. Hay que tener en cuenta que un
tiempo excesivo en parafina puede endurecer el tejido. Tras el
embebimiento completo de la muestra se vierte parafina líquida en
un molde, se introduce la muestra y se coloca según la orientación
deseada de corte y se deja solidificar a temperatura ambiente.

Esquema de la inclusión en parafina de una muestra de tejido

previamente fijada. Los tiempos de incubación en cada sustancia
pueden variar en función del tamaño de la muestra, tipo de tejido
o, por ejemplo, el líquido intermediario. Sin embargo, los pasos son
comunes a cualquier inclusión en parafina.

Un protocolo común de inclusión en parafina es el de la página

siguiente:
 2.4. Corte.

Las características tisulares y celulares microscópicas internas se

observan con microscopios ópticos o electrónicos de transmisión.
Con estos aparatos sólo se pueden observar grosores muy
pequeños de tejido por problemas de difusión y penetración de la
luz en el caso de los microscopios ópticos y de penetración de los
electrones en el caso del microscopio electrónico de transmisión.

Por tanto tenemos que hacer secciones de los tejidos que

queremos estudiar, que pueden ir desde un grosor de unos cuantos
nanómetros hasta centenares de micras. La dureza de los tejidos
depende de sus características, de la fijación que hayamos realizado
y sobre todo del material en que hayamos incluido dicho tejido.
Una manera más directa de endurecer el tejido es mediante
congelación.

Los aparatos mecánicos para hacer secciones de un grosor de

micrómetros se denominan micrótomos y existen diferentes tipos
según el grosor que queramos conseguir en nuestras secciones, el
medio de inclusión en el que se encuentre el tejido o si se ha
endurecido por congelación o por inclusión. Los micrótomos más
usados son:

Micrótomo para parafina: Se utiliza principalmente para

material incluido en parafina y se obtienen secciones de 5 a 20 µm
de grosor, para observar con el microscopio óptico.

Vibratomo: Corta material no incluido, aunque sí fijado o duro,

en secciones de 30 a centenares de µm de grosor, para observar
con el microscopio óptico.

Micrótomo de congelación: Con él se consiguen secciones de 30

a unas 100 µm de material congelado para su observación con el
microscopio óptico.
 Criostato: Consigue secciones a partir de material congelado y
se obtienen grosores de 10 a 40 µm, para observar con el
microscopio óptico.

Ultra micrótomo: Con él se corta material incluido en resinas y

se obtienen secciones del orden de nanómetros de grosor, para
observar con el microscopio electrónico de transmisión.

Ultracriotomo: Su uso no está muy extendido pero se suele

emplear cuando se necesitan secciones del orden de nanómetro de
material que no se debe incluir, para observar con el microscopio
electrónico de transmisión.

Los aparatos de corte más usados tradicionalmente para

estudiar las características generales de los tejidos y de las células
son el micrótomo para material incluido en parafina para
observaciones con el microscopio óptico y el ultra micrótomo para
observaciones con el microscopio electrónico de transmisión. El
criostato se usa también frecuentemente en microscopía óptica por
el ahorro de tiempo que supone ya que no necesita incluir el tejido,
incluso se puede cortar material no fijado.

2.4.1. Micrótomo parafina

Los micrótomos para cortar material incluido en parafina son

probablemente los más usados en los laboratorios de histología.
Todos poseen varias partes comunes: una cuchilla, un porta
bloques y un sistema mecánico que permite acercar el bloque de
parafina a la cuchilla una distancia que se corresponde con el
grosor de la sección que pretendemos obtener y realizar el corte.
 Micrótomo para parafina con mecanismo de rotación.

Hay dos tipos de micrótomo para parafina: el de rotación y el de

deslizamiento.

El micrótomo de rotación provoca el corte gracias a la

transformación de un movimiento de rotación en otro de ascenso y
descenso del portamuestras. En el movimiento de bajada sobre la
cuchilla se produce un acercamiento del portamuestras hacia la
cuchilla según el espacio seleccionado. En el portamuestras existe
un sistema que permite orientar la superficie de corte de la
muestra respecto a la cuchilla. En estos micrótomos la cuchilla se
mantiene fija durante el proceso de corte, pero puede regularse el
ángulo de ataque a la muestra.

Con el micrótomo de deslizamiento se obtienen cortes mediante

un movimiento de deslizamiento del bloque sobre la cuchilla, o
viceversa. En estos micrótomos el movimiento lo proporciona
directamente la mano y es de ida y vuelta, siendo en la vuelta
cuando se eleva la posición del bloque, o de la cuchilla, una
distancia que nos dará el grosor del corte.
 Tanto el micrótomo de rotación como el de deslizamiento
tienen ventajas e inconvenientes. La principal ventaja del de
rotación es su precisión, la posibilidad de obtener secciones
seriadas con facilidad y la automatización del proceso de corte. Los
micrótomos de deslizamiento son más sencillos mecánicamente y
su disposición permite cortar bloques más grandes o bloques de
celoidina, aunque están cayendo en desuso.

Hay que llevar a cabo una serie de procesos sobre el bloque de

parafina antes de hacer el primer corte útil a nuestra muestra. En
primer lugar hay que retallar el bloque hasta hacer una pirámide
truncada. Antes de retallar hay que considerar cual de las caras de
esta pirámide será el frente de ataque, es decir, cual será la que
primero se ponga en contacto con la cuchilla. Esta cara deberá ser
más ancha que la opuesta, y ambas han de ser paralelas. Con todo
ello se consigue una buena orientación de nuestra muestra en las
secciones, que cada nuevo corte arrastre sin problemas al
previamente cortado y que se puedan obtener tiras rectas de
cortes. Una vez retallada la pirámide nuestra muestra queda dentro
de ella pero no está en contacto directo con la cara superior o de
corte, por lo que es necesario un proceso de desbastado, es decir,
la eliminación del espesor de parafina que hay entre la superficie
del bloque y nuestra muestra.
 Otro aspecto que hemos de tener en cuentan antes de empezar
a cortar es la orientación de la cuchilla respeto a la superficie de
corte de la pirámide. Lo normal es orientar la cuchilla con un ángulo
de uno 10° respecto a la superficie de corte, aunque se puede
modificar según nuestras necesidades.

Una vez comenzado el corte de nuestra muestra se obtienen

tiras de secciones unidas por las caras paralelas a la cuchilla. Estas
tiras se suelen manipular con pinceles o lancetas y, antes de su
fijación definitiva en la superficie de un portaobjetos, han de
estirarse para que nuestro tejido quede perfectamente extendido.
Aprovechando la hidrofobicidad de la parafina, las secciones se
colocan sobre agua calentada a unos 35 °C a 40 °C y el calor las
hace extenderse sin llegar a su punto de fusión, que está en torno a
los 60 °C. El estiramiento se puede realizar en baños de agua con
regulación térmica o sobre los propios portaobjetos cubiertos de
agua y colocados sobre una plancha térmica regulable.
 Una vez se ha retallado y desbastado el bloque se obtienen las
secciones en tiras que serán colocadas sobre un portaobjetos
cubierto con agua calentada a unos 40 °C. El portaobjetos ha sido
tratado previamente son soluciones adhesivas. El calor y la
hidrofobicidad de la parafina hacen que las secciones se estiren
sobre la superficie del agua y una vez evaporada queden adheridas
al portaobjetos.

La superficie del portaobjetos donde se colocan las tiras de

cortes ha de estar previamente tratada para que nuestro tejido
quede adherido durante el procesamiento posterior. Para ello los
portaobjetos se recubren con soluciones de gelatina, albúmina, u
otras sustancias y se dejan secar, de manera que hacen de adhesivo
entre el cristal y nuestro tejido.

Una vez que el agua se ha evaporado y están extendidas las tiras

de cortes de parafina sobre el portaobjetos, se procede a un secado
exhaustivo en una estufa a una temperatura de entre 35 °C y 40 °C
durante toda la noche. Una vez secos, los portaobjetos con las
secciones están listos para el procesamiento posterior.

2.4.2. Criotomo o criostato

La congelación de los tejidos es una manera rápida de

endurecerlos sin necesidad de inclusión, por lo que la preservación
molecular es máxima.

Muy importante si el procesamiento posterior requiere el

reconocimiento molecular. Igual preservación se consigue con los
cortes de vibratomo, pero las muestras congeladas pueden cortarse
en secciones más finas, del orden de varias µm, cosa muy difícil con
el vibratomo.
 Otra ventaja de la obtención de secciones mediante congelación
es que la calidad de las secciones no depende del tipo de tejido
(excepto tejidos mineralizados como el hueso o aquellos
excesivamente cornificados). Por último, es posiblemente la
manera más rápida de obtener secciones puesto que es posible
congelar la muestra sin necesidad de fijación y cortarla de
inmediato, como las biopsias. Pero para preservar correctamente la
estructura del tejido ha de ser una congelación muy rápida,
normalmente en isopentano enfriado con nitrógeno líquido, lo que
evita la formación de cristales de hielo que deterioran las
estructuras celulares.

En el caso de que no se requiera un corte rápido las muestras se

fijan y posteriormente se incuban en una solución anticongelante
que contiene sacarosa y glicerol. Con ello se evita que durante la
congelación se formen cristales de hielo grandes que puedan dañar
las estructuras celulares. Como dijimos anteriormente, se puede
congelar de manera muy rápida con nitrógeno líquido. Dicha
congelación permite preservar incluso la ultraestructura celular y
observarla al microscopio electrónico, siempre con el uso previo de
anticongelantes. Pero normalmente se suele realizar la congelación
de la muestra a temperaturas superiores que dependen del aparato
empleado para realizar los cortes, lo cual hace necesario el uso de
anticongelantes.

Los dos aparatos más usados para realizar cortes por

congelación son el micrótomo de congelación y el criostato. El
micrótomo de congelación realiza cortes de decenas de µm de
grosor y consiste en una plataforma que se enfría a bajas
temperaturas sobre la que se coloca la muestra. Tras cada corte la
plataforma se eleva un espacio correspondiente al grosor de corte
seleccionado.
Actualmente se produce la congelación (de -30 a menos -40 °C)
de la plataforma mediante tubos que parten de un sistema de
refrigeración externo al propio dispositivo de corte. Además, existe
la posibilidad de congelar también la cuchilla si se desea. En los
apartados actuales la muestra se congela por contacto directo con
la plataforma y su temperatura es constante durante todo el
tiempo de corte. Las secciones que se obtienen, de decenas a
cientos de µm, se recogen con un pincel, se añaden a un recipiente
con tampón de trabajo y se trabaja con ellas en flotación, igual que
en el caso del vibratomo.

El criostato se utiliza para obtener secciones por congelación de

10 a 30 µm, aproximadamente. En este aparato todo el sistema de
corte se encuentra encerrado en una cámara refrigerada cuya
temperatura se puede regular, normalmente entre -20 y -30 °C. La
congelación se suele hacer en una plataforma dentro de la propia
cámara refrigerada que se encuentra a una temperatura inferior,
en torno a -50 °C.

También se puede congelar el tejido externamente con la

rapidez que deseemos, por ejemplo con nitrógeno líquido, pero es
conveniente colocar la muestra en la cámara del criostato hasta
que consiga igualar su temperatura con la de ésta para obtener
secciones homogéneas. Antes de la congelación, la muestra se
encastra en un medio que es líquido a temperatura ambiente y
sólido a la de corte. Por tanto, tenemos nuestra muestra en un
bloque sólido, encastrado pero no incluido. Esto permite manipular
la muestra y adherirla a un soporte portamuestras, el cual se fijará
a un eje que avanza sobre la cuchilla.

La preparación del bloque y el mecanismo de corte son similares

al que se describió para el micrótomo de rotación para parafina. Las
secciones que se van obteniendo se adhieren por contacto a
portaobjetos con superficies adhesivas. Las secciones se
descongelan rápidamente en este proceso de pegado puesto que
los portaobjetos están a temperatura ambiente y una vez secas
pueden procesarse para las técnicas que deseemos.

2.5. Tinción
 Los tejidos animales son en su gran mayoría incoloros, excepto
aquellos que poseen algún tipo de pigmento como la sangre o la
melanina de la epidermis.

Cuando se inventaron los primeros microscopios hubo que

descubrir cómo teñir los tejidos para poder desentrañar sus
características morfológicas. Se observó que algunos pigmentos
como el carmín o la eosina, disueltos en agua, se unían a
determinados componentes de las células. La expansión de la
industria textil y su necesidad de colorear las telas provocó un
rápido desarrollo de los tintes o pigmentos en el siglo XIX. Muchas
de estas sustancias fueron usadas como colorantes en la histología
de los animales y de las plantas desde mediados del siglo XIX hasta
la actualidad, alcanzándose un enorme desarrollo y
perfeccionamiento de nuevas técnicas y moléculas sintéticas que se
usan según las necesidades del investigador.

Con la llegada de la biología molecular se han puesto en marcha

otras técnicas mucho más sofisticadas para observar elementos
celulares, entre las que se pueden destacar aquellas que usan
anticuerpos, inmunocitoquímica, las que usan sondas de ADN o
ARN, hibridaciones "in situ", o más sofisticadas aún como las que
mediante el diseño de animales transgénicos permiten identificar y
observar a las células que expresan un determinado gen, incluso en
el organismos vivo, gracias a la fluorescencia de la proteína verde
fluorescente (GFP).

No vamos a describir con detalle las técnicas más complejas, al

menos no en estas páginas básicas, sino las más comunes, las que
se suelen emplear en un laboratorio para el estudio general de los
tejidos. Dividiremos el conjunto de técnicas histológicas en cuatro
categorías.
a) Tinciones generales. Aquellas que usan sustancias coloreadas
que se unen a componentes tisulares por afinidad química.
 b) Histoquímica. Son aquellas técnicas de tinción que implican la
modificación química de algunas moléculas tisulares para
posteriormente ponerlas de manifiesto con colorantes.

c) Lectinas. Las lectinas son dominios de proteínas, como las

selectinas, que son capaces de reconocer glúcidos que forman
parte de polisacáridos.

d) Inmunocitoquímica. Son técnicas histológicas muy potentes

basadas en la alta especificidad de unión de los anticuerpos a los
antígenos contra los que se produjeron. Estos antígenos pueden ser
cualquier molécula tisular que, purificada en inyectada en un
animal, sea capaz de desarrollar una respuesta inmune. Estos
anticuerpos añadidos a una sección de tejido reconocerán y se
unirán específicamente a dicha molécula.

La mayoría de los tejidos, sobre todo los de los animales, son

incoloros y por ello necesitamos teñirlos para observar sus
características morfológicas. Las tinciones generales están basadas
en el uso de colorantes, sustancias mediante las cuales se consigue
colorear a los tejidos.

Los colorantes son normalmente hidrosolubles y se caracterizan

por unirse a ciertas moléculas presentes en los tejidos gracias a
afinidades químicas. Se utilizan normalmente para teñir a las
células y componentes tisulares que van a ser observados con el
microscopio óptico y por ello se realizan habitualmente sobre
secciones de tejido, siendo las más utilizadas las secciones
obtenidas a partir de inclusiones en parafina u obtenidas en el
criostato.

Los colorantes son los elementos principales de las tinciones

generales. Son moléculas que poseen tres componentes
importantes: un esqueleto incoloro, que normalmente es un anillo
aromático de benceno, al cual se le unen dos tipos de radicales:
uno que aporta el color, denominado cromóforo, y otro que
posibilita la unión a elementos del tejido denominado auxocromo.

Al conjunto de estos tres elementos unidos en una molécula se

denomina cromógeno.

Según la naturaleza química del radical auxocromo los

colorantes se clasifican en:

Básicos: son sales en las que la base aporta el color, mientras

que la parte ácida es incolora. Ejemplos de colorantes básicos son
la tionina, safranina, azul de toluidina, el azul de metileno o la
hematoxilina.

Ácidos: son sales con el anión coloreado y la base incolora.

Tienen apetencia por sustancias básicas, sobre todo estructuras
proteicas localizadas en el citoplasma celular y también el colágeno
de la matriz extracelular. Ejemplos de colorantes ácidos son la
fucsina ácida, verde rápido, naranja G o la eosina.

Neutros: poseen una porción ácida y otra básica, ambas con

capacidad para aportar color. Por tanto un mismo colorante puede
teñir tanto las partes básicas como las ácidas de los tejidos. Por
ejemplo, eosina de azul de metileno.

Indiferentes: realmente no se unen a elementos de los tejidos

por afinidad química sino porque se disuelven en ellos. Por
ejemplo, el colorante Sudán se disuelve en los lípidos y por tanto
teñirá a las gotas de lípidos, especialmente en los adipocitos.

Tinción general.
 Una de las tinciones más comúnmente usada en histología es la
hematoxilina-eosina sobre cortes de parafina. Como vemos se usa
un colorante básico y otro ácido para teñir de diferente color a las
estructuras ácidas y básicas de la célula. Antes de proceder a la
tinción, si partimos de cortes de parafina, tenemos que llevar a
cabo unos tratamientos previos sobre las secciones como es el
desaparafinado, puesto que estos cortes son hidrosolubles. Si
partimos de cortes de criostato esto no se lleva a cabo.

El paso por agua de grifo es típico de la hematoxilina y se

denomina diferenciación. Las sales del agua permiten obtener una
coloración más violácea, en vez de púrpura. La deshidratación final
es necesaria porque el medio de montaje no suele ser hidrosoluble.
Estos medios de montaje no afectan al tejido, ni a los colorantes y
tienen unas propiedades ópticas excelentes. Además, conservan las
preparaciones durante años en buenas condiciones. Tras el
montado y secado (evaporación del xileno), las secciones se puede
observar con el microscopio óptico.
2.6. Inmunohistoquimica
 Las reacciones químicas consisten en la modificación química de
moléculas del tejido para posteriormente poder colorearlas. Existen
técnicas histoquímicas para detectar glúcidos, proteínas y
nucleótidos.

Pasos de la tinción histoquímica. Los pasos con letras en color

verde son los específicos para esta tinción.
 La histoquímica enzimática o histoenzimología se basa en la
capacidad que tienen algunos enzimas del tejido de mantener
funcional su centro activo tras el proceso de fijación. Estos enzimas
y las células que los poseen se ponen de manifiesto mediante una
reacción enzimática que convierte a unos sustratos solubles e
incoloros en productos insolubles y coloreados. Los sustratos son
específicos para el enzima y los productos se depositan en el lugar
preciso donde se produjo la reacción, es decir, donde se localiza el
enzima.

Las enzimas que se pueden detectar son variadas como las

peroxidasas, fosfatasas, deshidrogenasas, diaforasas,
acetilcolinesterasa, etcétera. Hay que tener en cuenta que cuando
queremos detectar una actividad enzimática es recomendable no
incluir el material para obtener secciones puesto que la
deshidratación y la temperatura elevada pueden dañar la
conformación de la enzima y por tanto la actividad de su centro
activo. Por ello estas técnicas se realizan normalmente en secciones
obtenidas por congelación o con el vibratomo.

2.7. Observación.
 El último paso de todo proceso histológico es la observación del
resultado producido por la técnica realizada. El poder de resolución
del ojo humano es de 0.2 mm (poder de resolución: distancia
mínima a la que se discriminan dos puntos), mientras que una
célula eucariota típica suele tener unas dimensiones que oscilan
entre 10 y 50 micrómetros (µm. 1 µm=10-6 mm). Además, si
queremos estudiar la ultraestructura celular hay que tener en
cuenta que el grosor de una membrana celular es de unos 70
nanómetros.

Todo ello implica que necesitamos aparatos que nos permitan

aumentar al imagen de las muestras para discriminar estructuras
tisulares diminutas como son las células o sus compartimentos.
Estos aparatos se llaman microscopios.
Hay dos tipos de microscopios: los ópticos y los electrónicos.

Los microscopios ópticos, o de campo claro, utilizan la luz visible

y lentes de cristal que permiten un aumento de las muestras de
unas 1000 veces, con un poder de resolución de unos 0,2
micrómetros. Esto es la máxima resolución que permite la luz
visible, por sus propiedades de onda. Se usan para observaciones
generales, características celulares y tisulares, y están presentes en
todos los laboratorios de histología.

Los microscopios electrónicos se basan en la alta frecuencia de

los electrones para conseguir un poder de resolución de 1
nanómetro. Se usan para observar la ultraestructura de la célula y
los tejidos, es decir, para estudiar el nivel subcelular, como
orgánulos, membranas u organizaciones moleculares (por ejemplo,
se pueden observar los ribosomas).

A los microscopios, sobre todo los ópticos, se les puede añadir

dispositivos que permiten ampliar su potencialidad. Por ejemplo, al
microscopio óptico se le puede adaptar una fuente luminosa y una
serie de filtros para observar moléculas fluorescentes, o filtros para
destacar cambios de densidad en el tejido, etcétera.

2.8. Diagnóstico final.

De acuerdo con las alteraciones histológicas y citológicas se

llegará a un diagnóstico concluyente; el cual ratifique o desmienta
el probable diagnóstico por el cual la pieza quirúrgica fue enviada al
área de patología.

Hasta este punto concluye la laboriosa tarea diaria de todo

laboratorio patológico y el personal que todos los días procura
mantener las condiciones adecuadas para realizar las acciones
antes mencionadas.

Conclusión.
 Los procedimientos aquí descritos con anterioridad son algunos
de los más importantes y utilizados en todas partes.

Por lo cual es imprescindible el saber acerca de esto. Los pasos y

ejemplos se colocaron con la mayor simplicidad posible, tratando
de ser adecuados para todo el público que le sea posible leer este
material.

Sin más que aclarar espero que este trabajo haya sido de su
agrado.