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fundamentos elisa

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fundamentos prueba de ELISA
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Published by: rockkko on May 18, 2010
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07/23/2013

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S 48
Gac Méd Méx Vol. 140, Suplemento No. 3, 2004
Los ensayos inmunológicos son procedimientos en loscuales se utilizan anticuerpos como reactivos enlazantes“específicos”. Y tienen aplicación universal para ladeterminación o cuantificación de fármacos terapéuticos yno terapéuticos, diversas sustancias biológicas, sustanciasinfecciosas o anticuerpos de respuesta del huésped en elsuero, en la orina, en el líquido cefalorraquídeo en saliva yen cualquier líquido biológico donde se encuentre lasustancia a investigar.El radioinmunoensayo desarrollada en 1959 por Yalow yBerson, es el precursor de los ensayos enmunoenzimáticosque fueron descritos originalmente en 1971 por Engvall yPerlmann, y Van Wemen y Schuurs, sin embargo el uso dematerial radioactivo ha limitado el uso del radioinmunoensayo,y a la vez a popularizado el empleo del inmunoensayoenzimático (EIA), del que hay dos técnicas principales: elensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas y el ensayoinmunológico multiplicado por enzimas (EMIT).El ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)utiliza como sus siglas lo indican una enzima como marcadorpara mediar la formación de complejos antígeno-anticuerpo.Existen diversas variaciones al método de ELISA paradetectar y cuantificar ligandos de alto peso molecular (>30000 daltons), el marcador enzimático que se emplea enestos análisis se conjuga con un ligando, que puede ser unantígeno, un anticuerpos específico para el antígeno deinterés o un anticuerpo para el anticuerpo primario. Casitodas las pruebas ELISA son ensayos en fase sólida en loscuales se adsorbe un antígeno o un anticuerpo sobre unsoporte sólido. Algunos de los protocolos se basan enreacciones de enlace competitivo y otras en reacciones deenlace no competitivo, pero en todas las pruebas ELISA serequiere de un paso de separación para eliminar el conjugadoenzimático libre antes de proceder a determinar la cantidad deconjugado enzimático enlazado. Para lo cual se añadesustrato enzimático y se mide la reacción catalítica entre laenzima y el sustrato. Por sus características catalíticas lasenzimas son marcadores muy sensibles y versátiles. Unasola proteína enzimática puede transformar en algunosminutos gran número de moléculas de sustrato en unacantidad igualmente abundante de producto final, produciendoun cambio de color amplificado y que se detecta confacilidad.En el método ELISA de inhibición el cambio de colorse reduce, porque la actividad enzimática se inhibe cuandoel anticuerpo se enlaza al conjugado enzimático
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.La prueba ELISA se basa en varias teorias: 1)Elantígeno y anticuerpo pueden enlazarse a una superficieportadora insoluble y retener su reactividad inmunológica;2)las enzimas tienen actividad específica alta y conviertenuna cantidad relativamente grande de sustrato en productodetectable, lo que permite detectar concentraciones muybajas del ligando; 3) la actividad enzimática o reactividadinmunológica de los conjugados se preserva y permaneceestable durante el análisis y el almacenamiento; y 4) lasenzimas no están presentes en el líquido biológico que seva a analizar.Los anticuerpos utilizados en el método ELISA son deorigen monoclonal o policlonal que se suministran comoantisuero no fraccionado o fracciones de inmunoglobulinapurificada, pueden ser solubles o estar inmóviles en unsoporte sólido, son empleados como conjugados nomarcados o enzimáticos y por ultimo reaccionan condeterminante antigénico específico de un antígeno o deun anticuerpo ligando-específico (anticuerpo primario)según el protocolo de análisis.Los antígenos se purifican o se producen con tecnologíarecombinante, y al igual que los anticuerpos se utilizancomo conjugados marcados o enzimáticos y son inmóvileso solubles, dependiendo del protocolo de análisis. Comose puede deducir los conjugados enzimáticos sonantígenos o anticuerpos unidos en forma covalente a laenzima de elección . Así pues, el reactivo que se formade la unión covalente entre enzima y antígeno o anticuerpoes el conjugado. Se conoce que es posible, también,marcar de forma no covalente anticuerpos o enzimas conbiotina y agregar avidina. La avidina posee cuatro sitiosde enlace para la biotina y no todos ellos participan en lainteracción con el anticuerpo marcado con biotina. Lossitios de enlace libres funcionan como aceptores para laenzima marcada con biotina. Este procedimiento seacorta utilizando anticuerpo marcado con biotina y avidinamarcada con enzima
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.Las combinaciones de enzima y sustrato que seemplean en los diversos métodos ELISA incluyen:1)peroxidasa de rábano y su sustrato, peróxido dehidrógeno que en presencia de cromógeno o-fenilendiaminaproduce un producto color amarillo-naranja medible; 2)galactosidasa beta y su sustrato o-nitrofenil-beta-D-galactopiranósido que se transforma en un productonitrofenolado amarillento medible; o 3)fosfatas alcalina y
V. Las pruebas de Elisa
Elizabeth Guzmán-Vázquez*
* Química fármaco-bióloga.
Correspondencia y solicitud de sobretiros: Banco de Sangre Instituto Nacional de Cancerología.Laboratorio de Endocrinología Instituto Nacional de Pediatría.

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