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TP Gram

TP Gram

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TP MICROBIOLOGIE BIOLOGIE GRAM COLORATION DIFFÉRENTIELLE BATNA OUSSAMA
TP MICROBIOLOGIE BIOLOGIE GRAM COLORATION DIFFÉRENTIELLE BATNA OUSSAMA

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1
Introduction :
 
La coloration différentielle ou coloration de gram est l’étape essentielle de l’identification bactérienne, surtout dans
le domaine médical
, à partir d’une culture pure
(culture pure contenant une seule espèce), elle est aussi appeléecoloration
V.L.A.F
(
V
iolet,
L
ugol,
A
lcool,
F
uschine)La coloration de gram est un caractère « Tinctorial
» c’set à dire l’affinité de la cellule bactérienne à se colorer.
 
La coloration de Gram doit son nom au bactériologiste danois 
 qui a mis au point leprotocole en 1884. C'est une coloration qui permet de mettre en évidence les propriétés de la 
,et d'utiliser ces propriétés pour les distinguer et les classifier. Son avantage est de donnerune information rapide sur les bactéries présentes dans un produit ou un milieu tant sur le type que sur laforme.
But :
La coloration de Gram est la méthode de coloration la plus utilisée en bactériologie médicale; elle permetde colorer lesbactérieset de les distinguer à l'examen direct par leur aptitude à fixer le violet de gentiane(Gram +) ou la fuschine (Gram -). L'intérêt de cette coloration est de donner une information rapide etmédicalement importante.
Principe :
La coloration de Gram est fondée sur l'action successive d'un colorant d'aniline, le cristal violet, d'iodepuis d'un mélange d'alcoolet d'acétone. Dans un premiertemps,le colorant pénètre dans la paroi et lecytoplasme.Dans un second temps, l'iode réagit avec le colorant et le rend insoluble. La perméabilitéplus grande desbactéries à Gram négatif à l'alcool permet la décoloration. Lesbactéries à Gram positif restent colorées en violet ou mauve. Une contre-coloration (par exemple en rose) permet devisualiser à nouveau, les corps cellulaires des bactéries à Gram négatif.
Mode opératoire :
 
Réactif :-
le violet phénique : violet de gentiane (Crystal de violet) + alcool absolu + eau phéniquée- liquide de Lugol : iode + iodure de potassium + eau distillée- alcool 96° (agent de décoloration)- solution de fuschine ou de safranine (colorant de contraste)
: solution de fuschine saturée a l’alcool+eau
distillée
 
Matériels :-
Microscope optique, lame, bec de bunsen, pipette pasteur, anse de platine, huile de cèdre, ainsi que lematériel habituel du laboratoire de Microbiologie.
 
 
2
 
Préparation du Frottis :
En effectuant une fixation simple à l'eau et à la flamme selon les indications suivantes : sur une lame, déposer unegoutte d'eau stérile. Ajouter à l'ansede platine stérilisée une goutte de la colonie isolée. Étaler et fixer à la chaleur àenviron 40°C pendant 10 à 15 minutes. Poser la lame séchée sur le portoir reposant sur un bac de coloration.
 
Réalisation de la coloration :1-
Coloration primaire : Coloration par leviolet de gentianeou cristal violet. Laisser agir de 30 secondesà 1 minute. Rincer à l'eau déminéralisée.
2
-Mordançageaulugol(solution d'iodeiodo-iodurée): étaler le lugol et laisser agir 60 secondes ; Rincer à l'eau déminéralisée. On peut réaliser une deuxième fois l'opération identiquement pour plus de sécurité.
3
- Décoloration (rapide) à l'alcool(+acétone): verser goutte à goutte l'alcool ou un mélange alcool- acétone sur la lame inclinée obliquement, et surveiller la décoloration (5 à 10 secondes). Le filet doit êtreclair à la fin de la décoloration. Rincer sous un filet d'eau déminéralisée.
4
- Contre-coloration à lasafranineou à lafuchsine.Laisser agir de 30 secondes à 1 minute. Laver doucement à l'eau déminéralisée. Sécher la lame sur une platine chauffante à 40°C, 10 à 15 minutes.
 
 
3
Les étapes 1 et 2 colorent en violet le contenu de labactérie.Le violet de gentiane se fixe sur lescomposants cytoplasmiques de toutes les bactéries. Le lugol permet de fixer cette coloration interne.L'étape 3 (alcool) sert à décolorer le cytoplasme des bactéries qui seront dites «Gram négatives». Eneffet, celles-ci ont uneparoipauvre enpeptidoglycanes- donc plus fine - qui va laisser passer l'alcool (molécule lipophile) ou le mélange alcool-acétone, et qui décolorera le cytoplasme en éliminant le violetde gentiane. Au contraire, pour les bactéries dites «Gram positif » la paroi constitue une barrièreimperméable à l'alcool car elle est composée d'une « couche » de peptidoglycanes plus importante doncde ce fait ; plus épaisse. Elles resteront alors violettes. L'étape 4 est une contre-coloration ayant pour butde donner aux bactériesGram négativesprécédemment décolorées une teinte rose permettant de lesvisualiser au microscope. Les bactéries àGram positif restées violettes seront évidemment insensibles àcette contre-coloration plus pâle que le violet imprégnant leur cytoplasme. la coloration de Gram permetde différencier la paroi bactérienne et de scinder les bactéries en deux grand groupes:- Gram+ qui ont une paroi de peptidoglycanes épaisse (ex : 
) - Gram- qui ont une paroi de peptidoglycanes fine, mais ont en plus unemembrane externelipidique(ex : 
).
 
Ces différences de coloration et les différences de formes(bacilleoucocci)sont à l'origine de la classification des bactéries
.
 
LugolDécolorisation
Contre-coloration par laSafranine ou la Fuschine

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