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pruebas bioquimicas fundamentos microbiologia

pruebas bioquimicas fundamentos microbiologia

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Published by: Leidy Yudith Angarita Bautista on Jun 10, 2008
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08/13/2013

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MEDIOS DE AISLAMIENTO Y ENRIQUECIMIENTO

Si se desea recuperar determinados m.o. de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimentos, etc.) puede recrearse en el laboratorio un medio ambiente artificial que favorezca el crecimiento de ellos frente a otros m.o. que los acompa\u00f1en en ese ecosistema. Se puede emplear un medio de cultivo y condiciones de incubaci\u00f3n (atm\u00f3sfera, temperatura, pH) considerando las caracter\u00edsticas fisiol\u00f3gicas del m.o. buscado, para otorgarle ventajas frente al resto de m.o. de ese ecosistema. Pretendemos inhibir la mayor cantidad posible de m.o. no deseados, de manera que estos no interfieran durante el aislamiento de los que s\u00ed interesan.

Un esquema general para el enriquecimiento, aislamiento e identificaci\u00f3n de m.o. es el siguiente:
Debemos realizar las siguientes consideraciones si deseamos detectar y aislar un determinado tipo
de m.o. y simult\u00e1neamente minimizar la interferencia de otros:
Muestra
Elegir la muestra adecuadamente. El m.o. que se est\u00e1 buscando debe ser factible de estar
presente, ya sea si lo estamos buscando per se, o como contaminante.

Debemos considerar si es \u00fatil someter la muestra a un tratamiento previo. Cuanto mayor selecci\u00f3n se realice en este paso inicial, menos selectivos deber\u00e1n ser los medios de cultivo a utilizar. \u00bfDebemos comenzar con un enriquecimiento o aislar la muestra directamente? Si el m.o. que deseamos aislar est\u00e1 en un bajo n\u00famero, se siembra la muestra en un caldo de cultivo que favorezca su multiplicaci\u00f3n (enriquecimiento). Cuando un enriquecimiento se realiza en un medio formulado para frenar el desarrollo de m.o. acompa\u00f1antes no deseados, se denomina enriquecimiento selectivo. Cuando el m.o. deseado est\u00e1 en alto n\u00famero, no se necesita realizar un enriquecimiento, y se puede sembrar la muestra en un medio s\u00f3lido adecuado directamente.

Medio de cultivo

Debemos realizar una formulaci\u00f3n adecuada de los medios de cultivo empleados. En general en las primeras etapas se utilizan medios de cultivo selectivos. Dicha selectividad se puede determinar ya sea, a) agregando un inhibidor de la flora acompa\u00f1ante, o b) haciendo el medio restrictivo al incluir un nutriente que s\u00f3lo el m.o. deseado sea capaz de utilizar.

Debemos utilizar las condiciones de incubaci\u00f3n adecuadas: temperatura, luz, atm\u00f3sfera (aerobia o
anaerobia, atm\u00f3sfera con concentraci\u00f3n de CO2, etc.).
Los componentes del medio de cultivo que se pueden manejar son:
\u2022Fuente decarbono. A modo de ejemplo, se podr\u00edan quitar todos los compuestos org\u00e1nicos

para permitir el crecimiento de m.o.aut\u00f3 trofos que son capaces de obtener su fuente de carbono del CO2 (que difunde de la atm\u00f3sfera al medio o por agregado de bicarbonato). O incluir exclusivamente una fuente de carbono particular, por ej, fenol si queremos aislar degradadores de ese compuesto.

\u2022Fuente denitr\u00f3geno. Se puede omitir el agregado de fuente nitrogenada (org\u00e1nica u
inorg\u00e1nica) para permitir el crecimiento de fijadores libres de nitr\u00f3geno, que son capaces
de obtener su fuente de nitr\u00f3geno del N2 atmosf\u00e9rico.
\u2022Fuente deenerg\u00eda. Si no se agrega ning\u00fan compuesto capaz de ser utilizado como fuente
de energ\u00eda y se incuba a la luz, s\u00f3lo crecer\u00e1n los m.o. fotosint\u00e9ticos que usan la luz como
fuente de energ\u00eda.
\u2022Se pueden agregar o no compuestos que sean utilizados como factores de crecimiento
(vitaminas, amino\u00e1cidos, \u00e1cidos nucleicos, \u00e1cidos grasos, etc.) seg\u00fan se necesiten o no.
P\u00e1g. 28
Fuente de in\u00f3culo
Caldo de enriquecimiento
Aislamiento
Identificaci\u00f3n
PRUEBAS BIOQU\u00cdMICAS
INDOL
Introducci\u00f3n

El indol es uno de los productos de degradaci\u00f3n metab\u00f3lica del amino\u00e1cido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con producci\u00f3n de indol, \u00e1cido pir\u00favico y amon\u00edaco. La producci\u00f3n de indol es una caracter\u00edstica importante para la identificaci\u00f3n de muchas especies de m.o.

Principio

La prueba de indol est\u00e1 basada en la formaci\u00f3n de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldeh\u00eddo del p-dimetilaminobenzaldeh\u00eddo. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs descrito m\u00e1s adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.

Medios y reactivos
Caldo triptofano
Peptona o digerido pancre\u00e1tico de case\u00edna
2g
Cloruro de sodio
0,5 g
Agua destilada
100 ml
Reactivo de Kovacs
Alcohol am\u00edlico o isoam\u00edlico
150 ml
p-dimetilaminobenzaldeh\u00eddo 10 g
HCl conc.
50 ml
Procedimiento
Inocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35\u00b0C durante 18 a 24 horas. Al
finalizar este per\u00edodo, a\u00f1adir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo.
Interpretaci\u00f3n
El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despu\u00e9s de
a\u00f1adir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva.
Controles
Escherichia coli: positivo
Klebsiella pneumoniae: negativo (mayor\u00eda de las cepas)
ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP)
Principio

Una de las caracter\u00edsticas taxon\u00f3micas que se utilizan para identificar los diferentes g\u00e9neros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporci\u00f3n de productos de fermentaci\u00f3n que se originan por la fermentaci\u00f3n de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentaci\u00f3n \u00e1cido-mixta y la fermentaci\u00f3n del 2,3 butanodiol. En la fermentaci\u00f3n \u00e1cido mixta se forman fundamentalmente l\u00e1ctico, ac\u00e9tico y succ\u00ednico, adem\u00e1s de etanol, H2 y CO2. En la v\u00eda del butanodiol se forman cantidades menores de \u00e1cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2.

El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo),
que se utiliza para visualizar la producci\u00f3n de \u00e1cidos por la v\u00eda de fermentaci\u00f3n \u00e1cido mixta.

El acetil-metil-carbinol (o aceto\u00edna) es un producto intermediario en la producci\u00f3n de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de ox\u00edgeno la aceto\u00edna es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsia

P\u00e1g. 29
Medios y reactivos
Caldo RM/VP
Peptona
7g
Glucosa
5g
Fosfato dipot\u00e1sico
5g
Agua destilada
1L
pH = 6,9 \u00b1 0,1

Indicador de pH rojo de metilo
Rojo de metilo 0,1 g en 300 mL de etanol 95\u00b0
Agua destilada 200 ml

Revelador VP
alfa-naftol (soluci\u00f3n al 5% en etanol 95\u00b0)
Soluci\u00f3n de KOH al 40% en agua destilada

Procedimiento

Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no m\u00e1s de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a 35\u00b0C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubaci\u00f3n transferir 1 mL del caldo a un tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al ox\u00edgeno atmosf\u00e9rico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos.

Interpretaci\u00f3n

La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la producci\u00f3n de \u00e1cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. ferment\u00f3 la glucosa por la v\u00eda de \u00e1cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo.

La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la
presencia de diacetilo, producto de oxidaci\u00f3n de la aceto\u00edna.

Controles
RM positivo, VP negativo: Escherichia coli
RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes

UTILIZACI\u00d3N DE CITRATO
Introducci\u00f3n
La utilizaci\u00f3n de citrato como \u00fanica fuente de carbono es una prueba \u00fatil en la identificaci\u00f3n de
enterobacterias.
Principio

La utilizaci\u00f3n de citrato como \u00fanica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como \u00fanica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizaci\u00f3n del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

P\u00e1g. 30

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