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Fundamentos de PCR3

Fundamentos de PCR3

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11/17/2012

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 PCR3
Las lipasas (triacilglicerol hidrolasas) que catalizan reacciones dehidrólisis y de síntesis de cadenas de acilglicéridos, tienenactualmente amplia aplicación en la industria alimentaria yfarmacéutica. De especial interés científico e industrial son las lipasasproducidas por microorganismos extremófilos, ya que son capaces defuncionar óptimamente en condiciones extremas de reacción ypresentan alta resistencia a la presencia de solventes orgánicos.Para la obtención de múltiples copias del gen que codifica para estaenzima se realiza la PCR reacción en cadena de la polimerasa
.Fundamento e Importancia.
Esta técnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADNpolimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclosde altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras deADN recién formadas entre sí tras cada fase de replicación y, acontinuación, dejar que vuelvan a unirse a polimerasas para quevuelvan a duplicarlas.Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas sedesnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y eranecesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que lastemperaturas del ciclo (95 °C en las fases de desnaturalización delADN) suponen la inmediata desnaturalización de toda proteína, seemplean ADN polimerasas termoestables, extraídas demicroorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivaspara la mayoría de los seres vivos. Dichos microorganismos,generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq),Pyrococcus furiosus (Pfu).
 
 
Termociclador:
aparato en el que se efectúa la PCR convencional.Hoy, todo el proceso de la PCR está automatizado mediante unaparato llamado termociclador, que permite calentar y enfriar los tubosde reacción para controlar la temperatura necesaria para cada etapade la reacción. Muchos termocicladores modernos hacen uso delefecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubossimplemente invirtiendo la corriente eléctrica. Los tubos usados paraPCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buenaconductividad térmica, permitiendo que se alcance rápidamente elequilibrio térmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistemaque calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensación sobrelos tubos de reacción.Por lo general, la PCR es una técnica común y normalmenteindispensable en laboratorios de investigación médica y biológica parauna gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonaciónde ADN para la secuenciación, la filogenia basada en ADN, el análisisfuncional de genes, el diagnóstico de trastornos hereditarios, laidentificación de huellas genéticas (usada en técnicas forenses y testde paternidad) y la detección y diagnóstico de enfermedadesinfecciosas.
Reactivos.
Para realizar la técnica se necesitan:Desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs), el sustrato para polimerizarnuevo ADN.Dos cebadores (o primers), oligonucleótidos que son, cada uno,complementarios a una de las dos hebras del ADN. Sonsecuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucleótidos,normalmente de 18 a 22, que son reconocidos por la polimerasapermitiendo iniciar la reacción. Deben estar situados enfrentadosy a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar.Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregadocomúnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algún otrocatión divalente. También se puede emplear manganeso (Mn2+),
 
para mutagénesis de ADN mediante PCR, ya que altasconcentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante lasíntesis de ADN. Actúan como cofactores de la polimerasa.Iones monovalentes, como el potasio.Una solución tampón (buffer) que mantiene el pH adecuado parael funcionamiento de la ADN polimerasa.ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas contemperatura óptima alrededor de 70 °C (la más común es la Taqpolimerasa).ADN molde, que contiene la región de ADN que se va aamplificar.Termociclador, el aparato que va a mantener la temperaturanecesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.
Ciclo de amplificación
El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo sueleconsistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR común serealiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos deciclos a menudo están precedidos por un choque térmico (llamado"hold") a alta temperatura (> 90 °C), y seguido por otro hold al final delproceso para la extensión de producto final o el breve almacenaje. Lastemperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen degran variedad de parámetros. Éstos incluyen la enzima usada para lasíntesis de ADN, la concentración de iones divalentes y dNTPs en lareacción, y la temperatura de unión de los cebadores, así como lalongitud del ADN que se desea amplificar.
Inicialización
Este paso consiste en llevar la reacción hasta una temperatura de 94-96 °C (ó 98 °C si se está usando una polimerasa termoestableextrema, que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto sólo es necesariopara ADN polimerasas que requieran activación por calor.

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