MECANISMOS DE ADAPTACIÓN DE

OENOCOCCUS OENI

ALMAYOR GRADO ALCOHÓLICO Y OTRAS CONDICIONES DELCAMBIO CLIMÁTICO

Albert Bordons; Cristina Reguant; Nicolas Rozès; Isabel Araque, Nair Olguín, JoanOriol Alegret, Meritxell Bordas

Línia de Bacteris Làctics, Grup de Biotecnologia Enològica, Departament de Bioquímica i Biotecnologia,Facultat d’Enologia, Universitat Rovira i Virgili, C. Marcel·lí Domingo, s/n, 43007 Tarragona, Catalunya.E-mail: albert.bordons@urv.cat

RESUMEN

En esta comunicación se presenta el trabajo que se está realizando con las bacterias lácticasdel vino en la línea troncal del proyecto del consorcio Démeter (2008-2010), del ProgramaCenit, subvencionado por el CDTI en el programa Ingenio 2010. Los cambios en lacomposición del vino debidas al cambio climático, sobretodo el aumento de etanol, puedenafectar a

Oenococcus oeni

, la principal bacteria implicada en la fermentación maloláctica. Porello, procedemos a estudiar en esta bacteria los diversos genes relacionados con elmetabolismo y la resistencia al estrés, viendo como el mayor contenido en etanol y otrascondiciones cambiantes afectan la expresión de DNA a RNA, así como las variaciones enproteínas mediante estudios proteómicos.

RESUM

En aquesta comunicació es presenta el treball que s'està realitzant amb els bacteris làctics delvi a la línia troncal del projecte del consorci Démeter (2008-2010), del Programa Cenit,subvencionat pel CDTI en el marc del programa Ingenio 2010. Els canvis en la composiciódel vi degudes al canvi climàtic, sobretot l'augment d'etanol, poden afectar

Oenococcus oeni

,el principal bacteri implicat en la fermentació malolàctica. Per això, hem procedit a estudiaren aquests bacteris els diversos gens relacionats amb el metabolisme i la resistència a l'estrès,veient com el major contingut en etanol i altres condicions canviants afecten l'expressió deDNA a RNA, així com les variacions en proteïnes mitjançant estudis proteòmics.

ABSTRACT

In this communication we present the work being done with lactic acid bacteria of wine, inthe main line of Demeter consortium project (2008-2010), the Cenit Program, funded by theCDTI in the Ingenio 2010 program. Changes in the composition of the wine due to climatechange, especially the increase of ethanol, may affect

Oenococcus oeni

, the main bacteriainvolved in malolactic fermentation. Therefore, we proceed to study in this bacterium thevarious genes related to the metabolism and resistance to stress, seeing as the higher ethanolcontent and other changing conditions affect the expression of DNA to RNA, as well asvariations in proteins by proteomics . 1

INTRODUCCIÓN

El cambio climático que ya se está percibiendo a nivel global está dando lugar a unincremento de las temperaturas en la mayoría de nuestras D.O., con el consiguiente aumentode contenido de azúcares en mosto, que da lugar a un mayor grado alcohólico. Entre otrosefectos, la mayor maduración de las uvas también da lugar a pH más altos del mosto y a unmenor contenido en ácido málico. Todo ello significa que las bacterias lácticas responsablesde la fermentación maloláctica como

O. oeni

, a consecuencia del cambio climático, tendránque realizar su papel en unas condiciones diferentes respecto a las tradicionales. De estoscambios, el que sin duda puede afectar más a la correcta realización de la FML es el mayorcontenido en alcohol.Las condiciones tradicionales de actuación de

O. oeni

en el vino ya suponen de por sí unestrés para estas bacterias. Su posible crecimiento, cuando tiene lugar, y la realización de laFML, están sometidos a unas inhóspitas condiciones de etanol, bajo pH y pocos nutrientes,entre otros factores. Para superar esta situación de estrés, las células de

O. oeni

tienen variosmecanismos, que se resumen en tres (Figura 1): a) modificaciones de la membrana paraadecuarse a las variaciones que provoca el etanol; b) síntesis de proteínas de estrés, que por unlado ayudan a los enzimas y otras proteínas a poder seguir realizando sus funciones, y porotro lado contribuyen a la expulsión del etanol que ha entrado en la célula; y c) el sistema deATPasa, que expulsa los protones que han entrado en la célula a causa de las alteraciones enla membrana que ha provocado el etanol, y que necesita ATP, el cual se puede producirgracias al metabolismo del ácido málico (FML) o de la utilización de citrato. Con los cambioscomentados como el aumento de etanol, que son consecuencia del cambio climático, estasituación de estrés se acentúa.

Estrés

:Etanol, pH,etc

señalRespuesta

Figura 1

. Esquema de una célula de

Oenococcus oeni

, con los mecanismosde respuesta al estrés que supone la supervivencia en el hábitat vino.

proteínasde estrésmodificacionesmembrana

sistemaATPasa

Estrés

:Etanol, pH,etc

señalRespuesta

proteínasde estrésmodificacionesmembrana

EtOHEtOHnH

sistemaATPasa

O. oeni

, la toxicidad del etanol se asocia al aumento de permeabilidad de la membranacelular debido a modificaciones en la composición lipídica (Desens y Lonvaud-Funel, 1988).El aumento de la permeabilidad supone un aumento del transporte pasivo de protones hacia elinterior de la célula, provocando una acidificación del medio interno, además de pérdida dematerial intracelular. Así pues, los mecanismos que contribuyen a la respuesta al pH ácidoestarían también relacionados con la tolerancia al etanol.Ahora bien, las células crecidas en presencia de etanol presentan adaptación a este estrés ypueden disminuir la permeabilidad celular manteniendo la integridad de la membrana (DaSilveira

et al

, 2002). Las células adaptadas al etanol parece que presentan cambios decomposición, aumentando los ácidos grasos insaturados y disminuyendo la cantidad total delípidos celulares, con lo cual puede disminuir la fluidez de membrana y por tanto supermeabilidad (Da Silveira

et al

, 2003). En cuanto a la variación de la composición en lípidosde membrana de

Oenococcus

en presencia de etanol, uno de los efectos que se ha comprobadoes el aumento de ácido lactobacílico (C19-ciclo) (Teixeira

et al,

2002).Por otra parte, se ha sugerido que un transportador del tipo ABC (ATP Binding Cassette)podría estar implicado en la destoxificación de la célula expulsando etanol al exterior(Bourdineaud

et al

., 2004). En presencia de etanol también se han visto variaciones enproteínas relacionadas con el equilibrio redox de la célula, o de otras proteínas transportadorasde azúcares, y en general parece existir un aumento de proteínas de membrana (Da Silveira

et al,

2004).Respecto a la respuesta al pH ácido, los mecanismos involucrados serían los relacionados conla degradación de ácidos presentes en el vino, como el málico y el cítrico, asociados a bombasde protones ligadas a ATPasa que ayudan a mantener la homeostasis del pH interno (Drichi-Cachon

et al.,

1996; Galland

et al

., 2003). Finalmente, otro de los mecanismos descritos en

O.oeni

de respuesta a las condiciones desfavorables es la síntesis de proteínas de estrés. Laproteína más fuertemente inducida es la conocida como Hsp18 (18 kD), asociada a lamembrana citoplasmática, aunque también detectada en la fracción citoplasmática (Jobin

et al

., 1997). Algunos autores han sugerido que la proteína Hsp18 podría ser regulada por losniveles de fluidez de la membrana, por lo que se trataría de un mecanismo de activaciónrápida en condiciones de estrés (Tourdot-Maréchal

et al

., 2000). De todas maneras, se hacuestionado el papel de la inducción de esta proteína de respuesta al calor (Hsp) en relacióncon la tolerancia al etanol (Swan

et al

, 1999).

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

Dado que el aumento en la concentración de etanol es el cambio que más puede afectar a lasbacterias lácticas que llevan a cabo la FML, es preciso estudiar cuáles son los mecanismosintracelulares que están implicados en una mayor tolerancia a grados alcohólicos superioresen vino, y al mismo tiempo ver cómo afectan las otras condiciones cambiantes (pH mayor,menor málico, etc) a dichos mecanismos del funcionamiento celular. Conociendo cuales sonlos puntos clave de estos mecanismos, se podrá actuar en los aspectos tecnológicos de lavinificación para que la FML se lleve a cabo correctamente y al mismo tiempo se mantenga lacalidad de los vinos. Además, dichos conocimientos podrán ser útiles para seleccionar cepasde

O. oeni

con mayor potencial de expresión de genes relacionados con la tolerancia al etanol.La aplicación práctica de las cepas comerciales estárters que puedan sobrevivir la inoculacióndirecta en vino requiere conocer los mecanismos involucrados en la toxicidad del etanol y latolerancia de

Oenococcus

al mismo.3