TESTARE ŞI SCREENING

GENETIC

Conf. dr. EUSEBIU VLAD GORDUZA

Disciplina de Genetică Medicală
Universitatea de Medicină şi Farmacie
“Gr. T. Popa” Iaşi
1
 Probleme abordate
 Metode de testare genetică

 Modalităţi de screening genetic

 Stadiu actual în lume

 Stadiu actual în România

 Posibilităţi de ameliorare a situaţii prezente

2
 Introducere
 Testarea genetică – modalitate de identificare a
mutaţiilor genetice ale unui individ la nivelul
întregului genom sau a unei porţiuni a acestuia

 Screening genetic – modalitate de identificare

într-o populaţie sau grup populaţional a unui posibil
genotip anormal

3
U.M.F IAŞI

Metode de identificare a mutaţiilor :

directe - DIAGNOSTIC GENOTIPIC
prin analiza ADN,
prin analiza cromozomilor;

indirecte

prinstudiul efectelor primare (proteină

anormală)
sau efectelor secundare (la nivel celular)

4
 Metode de testare genetică

 Testare genomică

 Testare genică

5
 Metode de testare genetică
Testare genomică
 Analiza cromosomică clasică
 directă – celule în diviziune;
 după cultură celulară (limfocite T, amniocite,

fibroblaşti);
 Analiză citogenetică moleculară
 Tehnica FISH;
 MLPA;

 Array-CGH

6
Metafază cu marcaj R FISH prenatal interfazic

microarray FISH postnatal metafazic 7

 Metode de testare genică
 Obţinerea de fragmente genice;
 Enzime de restricţie;
 Obţinere de ADNc (complementar)

 Sinteză chimică de fragmente oligonucleotidice

(sonde şi amorse marcate specific)

 Amplificarea fragmentelor genice
 Clonare celulară
 Clonare acelulară - tehnica PCR

8
 Metode de testare genică
 Obţinerea de fragmente genice;
 Enzime de restricţie;
 Obţinere de ADNc (complementar)

 Sinteză chimică de fragmente oligonucleotidice

(sonde şi amorse marcate specific)

 Amplificarea fragmentelor genice
 Clonare celulară
 Clonare acelulară - tehnica PCR

9
Clonare celulară Tehnica PCR 10
 U.M.F IAŞI

METODE DE ANALIZĂ A ACIZILOR NUCLEICI

 Principiu – hibridizarea moleculară a

acizilor nucleici:
 recunoaşterea genei (sonde directe)
 recunoaşterea unor markeri genotipici
(secvenţe necodante) situaţi în
vecinătatea genei (sonde indirecte).

a).Analiza ADN genomic uman prin metoda de transfer

Southern
b). Analiza cu sonde oligo-nucleotidice specifice unei alele
(ASO) (dot blot).
c). Analiza ARNm prin Northern blot.
d). Analiza proteinelor prin Western blot.
e) Secvenţierea unor gene 11
11
U.M.F IAŞI

SCREENINGUL BOLILOR GENETICE

Screeningul genetic:
 identificarea într-o populaţie a persoanelor cu risc genetic -
potenţiali bolnavi sau purtători de genotip anormal – înainte
ca maladia să fie manifestă clinic,
 prin aplicarea unor proceduri simple, rapide, ieftine şi cu
acurateţe ridicată,
 separă persoanele aparent sănătoase care probabil AU
boala de cele care probabil NU au boala.
12
 U.M.F IAŞI

SCREENINGUL BOLILOR GENETICE

 Testele de screening :
 NU PUN DIAGNOSTICUL de boală
 Identifică un grup populaţional cu risc genetic → TESTARE GENETICĂ.

 AVANTAJE:
 Identificarea procesele patologice înainte ca acestea să devină
ireversibile → TRATAMENT (screening neonatal, presimptomatic);
 Luarea unei DECIZII REPRODUCTIVE INFORMATE (screening
prenatal).

13
 U.M.F IAŞI

TIPURI DE SCREENING GENETIC

Screening populaţional:
 prenatal : DTN, aneuploidii, boli monogenice grave +
frecvente;
 neonatal : fenilcetonurie; hipotiroidie congenitală, ş.a.
 postnatal : purtători sănătoşi de mutaţii:
- heterozigoţi (Na sau X NX a) pentru o boală recesivă
frecventă (talasemie, fibroză chistică; distrofie musculară
Duchenne, etc);
14
 U.M.F IAŞI

TIPURI DE SCREENING GENETIC

Screening familial - depistarea precoce a bolii la rudele bolnavului, pentru

a preveni boala sau pentru a lua o decizie reproductivă informată.
4 tipuri:
 presimptomatic (ADPKD; hipercolesterolemie familială,

boală Huntington; cancer sân sau colon);

 purtătorii sănătoşi de anomalii cromosomice echilibrate;

 heterozigoţii în boli recesive (fibroza chistică; distrofia

musculară Duchenne);
 premutaţii (în sdr. X fragil şi alte boli prin mutaţii dinamice).

15
 Stadiul actual în lume
 Testare genetică
 scumpă indiferent de ţară - ÎN MAJORITATEA
ŢĂRILOR DEZVOLTATE DECONTATE DE CASELE
DE ASIGURĂRI SAU DE MINISTERUL SĂNĂTĂŢII
PRIN PROGAME NAŢIONALE;
 nu se face în orice laborator → laboratoare regionale

(analiză cromosomică, unele analize moleculare) sau

laboratoare de referinţă sau naţionale (analize
scumpe şi care sunt aplicate doar la puţini pacienţi);
 necesită aparatură complexă şi personal ultracalificat

 depinde major de calitatea examenului clinic genetic

16
 ALGORITM DE TESTARE ÎNTR-O BOALĂ MONOGENICĂ CU
DIAGNOSTIC CLINIC CERT
Examen clinic genetic Diagnostic clinic Recoltare sânge

Trimitere ADN lab regional Extragere ADN

Testare moleculară pentru

Mutaţie prezentă Confirmare diagnostic
mutaţii frecvente

Mutaţie absentă Trimitere ADN lab referinţă Secvenţiere genică

Confirmare diagnostic Mutaţie prezentă

Reconsiderare Mutaţie absentă

diagnostic clinic 17
 ALGORITM DE TESTARE ÎNTR-UN SINDROM PLURIMALFORMATIV

Sindrom plurimalformativ Examen clinic genetic

Etiologie cromosomică Etiologie cromosomică

evocatoare posibilă

Cultură de limfocite Cultură de limfocite Extracţie de ADN

Examen cromosomic Examen cromosomic cu MLPA

cu marcaj marcaj
+
+ +
FISH cu sonde adecvate
FISH cu sonde FISH cu sonde telomerice
+
adecvate sdr.
Array CGH

IDENTIFICARE ANOMALIE NEECHILIBRATĂ 18

 Stadiul actual în lume
 Screening genetic
 Sunt aplicate cel puţin screeningul neonatal pentru boli
frecvente şi cu terapie posibilă şi cel biochimic/ecografic
prenatal pentru detecţia aneuploidiilor şi al defectelor de tub
neural - ÎN ŢĂRILE DEZVOLTATE DECONTATE DE CASELE
DE ASIGURĂRI SAU DE MINISTERUL SĂNĂTĂŢII PRIN
PROGAME NAŢIONALE;
 În cazul screening-ului neonatal probele de sânge sunt
recoltate în secţiile de neonatologie şi sunt trimise la
laboratoare de referinţă zonale sau naţionale → suspiciune de
diagnostic → testare genetică sau de alt tip (hormonal etc.);
 Screeningul biochimic prenatal → recoltare de ser matern în
maternitate → laborator biochimic uzual → suspiciune de
diagnostic →PVC sau amniocenteză → diagnostic
cromosomic
 depinde major de modul de recoltare şi transport a probelor
19
 Stadiul actual în lume
Screening genetic neonatal
• Europa - 3 boli sunt evaluate obligatoriu:
FENILCETONURIA; HIPOTIROIDIA CONGENITALĂ;
GALACTOZEMIA + HIPOACUZIA→ toate sunt inaparente
la naştere, au evoluţie gravă şi generatoare de handicap şi
beneficiază de terapie ce permite o dezvoltare normală;
• În unele ţări europene screeningul a fost crescut până la
20 de boli diferite
• SUA – diferă de la stat la stat între 28 şi 80 de afecţiuni
sunt testate neonatal

20
 Stadiul actual în lume
Screening genetic neonatal
• Irlanda – PKU, GALT, HT, homocistinurie, boala urinii cu
miros de arţar;
• UK – PKU, HT, mucoviscidoză, sicklemie,
• Franţa – PKU, HT, mucoviscidoză, siklemie, hiperplazia
congenitală suprarenaliană
• Italia – PKU, HT, mucoviscidoză;
• SUA – PKU, HT, hiperplazia congenitală suprarenaliană,
hemoglobinopatii (Hb S, Hb C, β-TH), mucoviscidoză,
GALT, boli ale acizilor graşi (5 afecţiuni) boli ale acizilor
organici (9 afecţiuni), aminoacidopatii (6 afecţiuni)

21
Situaţia
screeningului
neonatal în Europa
2004

22
 Stadiul actual în lume
Conform CE aplicarea screening-ului genetic neonatal
 1. boala pentru care se face screeningul să fie o problemă
de sănătate publică.
 2. istoria naturală a bolii este cunoscută

 3. boala poate fi detectată precoce.

 4. tratamentul aduce beneficii imediate şi definitive.

 5. testul de screening trebuie să fie aplicat cât mai curând

după naştere.
 6. testul trebuie să fie acceptabil.

 7. intervalul de repetare a testului trebuie fie bine

cuantificat.
 8. rezultatele screeningului trebuie confirmat prin testare
genetică.
 9. riscurile trebuie să fie mai mici decât beneficiile.

 10. costurile trebuie să fie inferioare beneficiilor.

23
 Stadiul actual în România

 Testarea genetică cromosomică postnatală şi

parţial prenatală – laboratoare slab echipate şi
lipsite de personal în principalele centre
universitare medicale (Iaşi, Timişoara, Cluj,
Oradea, Craiova, Tg Mureş, Sibiu şi Bucureşti) +
laboratoare private în Bucureşti, Timişoara, Cluj →
absenţa standardizării şi controlului extern de
calitate + absenţa posibilităţii de perfecţionare a
specialiştilor (+ absenţa interesului pt. acest
domeniu)
24
 Stadiul actual în România

 Testarea genetică moleculară – câteva

laboratoare în principalele centre universitare
medicale (Iaşi, Timişoara, Cluj, Craiova, şi
Bucureşti) + laboratoare private în Bucureşti →
absenţa standardizării şi controlului extern de
calitate + absenţa posibilităţii de perfecţionare a
specialiştilor (+ absenţa interesului pt. acest
domeniu) + absenţa colaborării

25
 Stadiul actual în România

 Screeningul genetic neonatal – pentru

fenilcetonurie şi hipotiroidie congenitală în 20
judeţe → absenţa controlului extern de calitate +
absenţa verificării modului de aplicare + absenţa
validării modului de efectuare a screeningului

 Screeningul biochimic prenatal – nu se aplică

26
 Ce trebuie făcut ?
 Îmbunătăţirea modalităţilor de testare genetică prin:
 Identificarea laboratoarelor capabile să efectueze teste de citogenetică,
citogenetică moleculară şi genetică moleculară - prin colaborarea dintre
Comisia de Genetică Medicală din cadrul Ministerului Sănătăţii şi Societatea
Română de Genetică Medicală – şi dotarea adecvată a acestora.
 Acreditarea acestor laboratoare şi atragerea de personal calificat;
 Identificarea de către Comisia de Genetică Medicală din cadrul Ministerului
Sănătăţii şi Societatea Română de Genetică Medicală a unui grup de 50 –
100 de boli rare pentru care să fie efectuată testarea moleculară în
România;
 Susţinerea financiară constantă a acestor laboratoare pentru testarea
moleculară a bolilor rare cu fonduri de la bugetul de stat sau prin diverse
sponsorizări;
 Identificarea de către Comisia de Genetică Medicală din cadrul Ministerului
Sănătăţii şi stabilirea unor parteneriate cu laboratoare din Comunitatea
europeană care să poată realiza testarea moleculară în bolile pentru care
nu există posibilităţi în România;
 Decontarea de către Ministerul Sănătăţii a serviciilor medicale efectuate în
străinătate pe baza avizării de către o comisie de specialişti;
 Acordarea pre- şi posttestare a unui sfat genetic corect şi competent în
centrelor regionale de genetică medicală.
27
 Ce trebuie făcut ?
 Realizarea unei reţele de screening în bolile rare prin organizarea şi
implementarea programelor de screening populational:
 stabilirea unei proceduri generale de control care să definească exact
etapele de implementare şi modalităţile de evaluare a corectidunii
aplicării metodelor de screening;
 o evaluare sistematică înainte şi după aplicarea programului de
screening din partea tuturor organismelor interesate (Ministerul
Sănătăţii, Institutul de Sănătate Publică, Societatea Română de
Genetică Medicală, Asociaţiile de pacienţi etc.).
 realizarea de către Ministerul Sănătăţii a unui ghid metodologic pentru
evaluarea calităţii programelor de screening;
 instituirea unui comitet consultativ independent, care să analizeze
eficienţa programelor de screening şi să ofere soluţii pentru ameliorarea
aplicării acestora;
 formarea şi pregătirea unor echipe de evaluatori care să permită
dezvoltarea şi implementarea de noi metode şi programe de screening
în bolile rare;
 realizarea cadrului legal şi a normelor metodologice necesare
implementării programelor de screening în bolile rare. 28