Professional Documents
Culture Documents
Hình 1: Bacillus cereus trên kính hiển vi Hình 2: khuẩn lạc Bacillus cereus
trên môi trường BA
1
1.2. Đặc điểm nuôi cấy: Là loại vi khuẩn dễ mộc
• Hiếu khí và kị khí tùy nghi.
• Nhiệt độ 5-50oC, tối ưu 35-40oC.
• ph 4,5-9,3, thích hợp 7-7,2
• Trên môi trường NA hay TSA sau 24 giờ tạo khóm lớn, nhăn nheo, xù xì.
• Trên môi trường BA tạo dung huyết rộng.
• Trên môi trường MYP (Mannitol Egg Yolk Polymixin): khóm hồng chung quanh
có vòng sáng.
• Trên môi trường Mossel (thạch cereus selective agar): khóm to hồng chung quanh
có vòng sáng.
• Trên môi trường canh NB, TSB: đục tạo váng, sau cặn lợn cợn
1.3. Tính chất sinh hóa:
• Trên môi trường đường: lên men glucose trong điều kiện hiếu khí và kị khí, không lên
men mannitol.
• Khử nitrat thành nitrit.
• Phản ứng VP (+)
• Phân giải Tyroxin
• Catalase (+), Citrate (+)
• Mọc trên NB + 0,001% lyzozym
1.4. Tính chất gây bệnh- Độc tố-Triệu chứng:
Vi khuẩn Bacillus cereus phân bố nhiều trong tự nhiên, nhiễm vào các loại thức ăn qua
đêm hay trữ lạnh lâu, thường gây ngộ độc thực phẩm.
Độc tố: vi khuẩn sản sinh 2 loại độc tố
• Độc tố gây tiêu chảy (Type 1): Diarrhoed toxin. Vi khuẩn sản sinh độc tố trên thịt , rau
quả, gia vị. Bản chất là một loại protein gây hủy hoại biểu bì và niêm mạc ruột gây tiêu
chảy có thể nguy hiểm đến tính mạng.
• Độc tố gây nôn mửa (Type 2): emetic toxin. Vi khuẩn nhiễm trong gạo, cơm nguội, đậu
các loại. Bản chất độc tố là phospholipit có tính ổn định cao không bị phân hủy ở nhiệt
độ cao và dịch dạ dày.
2
Ngoài ra vi khuẩn còn có enzyme hemolyzin là một protein gây độc mạnh có thể gây chết
người. Độc tố này có thể trung hòa bởi cholesterol trong huyết thanh nhưng nó đã góp phần cho
sự phát triển của vi khuẩn.
Triệu chứng trúng độc:
• Thức ăn chứa mật độ vi khuẩn: 105 vi khuẩn/g thực phẩm đủ gây độc.
• Biểu hiện đau bụng, buồn nôn và nôn sau 1-5 giờ ăn phải thực phẩm nhiễm vi khuẩn. Bệnh
có thể kéo dài 24 giờ.
Trường hợp nhiễm type 1 có triệu chứng đau bụng tiêu chảy nhưng không sốt. Bắt đầu
sau 4-16 giờ sau khi ăn thực phẩm nhiễm khuẩn và kéo dài 12-24 giờ.
Phòng: không ăn thức ăn để nguội qua đêm, thức ăn luôn hâm nóng trên 80oC trước khi ăn
So sánh độc tố type 1 và type 2:
2. Đặc tính 3. Type 1 4. Type 2
5. Bền với nhiệt 6. 45oC/30 phút 7. 120oC/90 phút
8. pH 9. ổn định pH 4-11 10. ổn định pH 2-11
11. Tính nhạy 12. Nhạy với enzyme protease và 13. Kháng pepsin và
trypsin trypsin
Ở nước ta hiện nay theo báo cáo từ bộ y tế, chỉ có khoảng 38 trung tâm y tế có khả năng
kiểm nghiệm được loài vi khuẩn này, khoảng 60% các tình thành có năng lực kiểm nghiệm. Tuy
nhiên hiện nay phương pháp xét nghiệm vẫn dựa trên phương pháp đếm tổng số khuẩn lạc trên
môi trường thạch dinh dưỡng kết hợp với các xét nghiệm hóa sinh khác. Phương pháp này có
nhược điểm là thời gian lâu, có thể mất nhiều ngày hoặc vài tuần và độ chính xác không cao.
Trong những năm gần đây, các phương pháp xét nghiệm vi sinh vật dựa trên nguyên tắc
di truyền phân tử và miễn dịch học đã được thiết lập như: lai phân tử, PCR (Polymerase Chain
Reaction), Elisa... cho kết quả rất khả quan với độ chính xác cao, thời gian rút ngắn có thể xuồng
vài giờ, không đòi hỏi nhiều máy móc thiết bị do đó khả năng cơ động là rất cao. Những phương
pháp trên đã mở ra cho ngành vi hóa sinh học nói riêng và cả ngành công nghệ thực phẩm hiện
đại.
2. Cơ chế sản sinh độc tố Bacillus cereus
2.1. Giới thiệu chung về độc tố của B. cereus
Vì ngộ độc thực phẩm do B.cereus không phải là loại bệnh được nói đến nhiều, sự thật là
phạm vi ảnh hưởng của loại bệnh này ít được biết đến, được báo cáo là nguyên nhân gây ngộ độc
thực phẩm và chiếm khoảng 33% trong tổng số các nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm (đa số
các nguyên nhân là do vi rút) ở Norway (1988-1993), 47% ở Iceland (1985-1992). Tỷ lệ thấp
3
hơn nhiều được báo cáo ở các quốc gia khác bao gồm U.S (1.3%) và Canada (2.2%). Ở Anh và
xứ Wales, có đến 468 trường hợp từ 1990 đến 1995.
B. cereus là một thực vật hoại sinh trong đất rất phổ biến. Nó được phân lập từ nhiều
nguồn thực phẩm đa dạng, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật, từ thịt, các và các sản
phẩm từ thịt cá cũng vậy. Phát hiện đầu tiên các về các mầm bệnh gây ngộ độc thực phẩm là từ
năm 1949 khi Hauge đã phân lập mẫu từ xốt vani sau khi có một ca ngộ độc thực phẩm gây tiêu
chảy tại bệnh viện ở Oslo, Norway. Xốt vani được nấu trước khi tiêu thụ và bảo quản ở nhiệt độ
phòng cho đến khi sử dụng. Để khẳng định B. cerus là nguyên nhân gây ngộ độc, Hauge đã phát
triển mẫu phân lập đến nồng độ khoảng 4x106ml-1 và uống 200ml cocktail. Sau 13h, ông cảm
thấy đau bụng và đi tiêu ra nhiều nước, triệu chứng này dai dẳng khoảng 8h. Hơn 20 năm sau,
một triệu chứng gây ngộ độc thực phẩm khác do chủng B. cereus gây ra lại xuất hiện ở các công
nhân người Anh. Triệu chứng này nặng hơn triệu chứng nôn mửa và kéo dài một thời gian ngắn
(chưa đến 5h), điều này cho thấy rằng đây là một sự nhiễm độc. Ngày nay, bệnh này liên quan
đến triệu chứng gây nôn mửa do B. cereus.
Bacillus cereus có thể gây ra sự nhiễm trùng và nhiễm độc khác nhau, thêm vào đó,
những ngộ độc khác do B.cereus gây ra là sự nhiễm trùng máu, viêm màng não, và nhiễm trùng
mắt. Hai loại ngộ độc thực phẩm là nguyên nhân bởi rất nhiều nhấn tố gây độc hại khác nhau.
Bệnh nôn mửa được mô tả với thời kỳ ủ bệnh ngắn (1-5h), nguyên nhân gây ra ngộ độc này là do
chuỗi polypeptide nhỏ (cereulide) đã hình thành trước ở trong thực phẩm (ví dụ như Gạo). Triệu
chứng bao gồm sự buồn nôn, sự nôn mửa ra và đau dạ dày (bảng 1-1). Bệnh tiêu chảy được mô
tả với thời kỳ ủ bệnh từ 8 – 16h, triệu chứng bao gồm đau bụng, đi tiêu ra nhiều nước và đau thắt
trực tràng (bảng 1-2). Nguyên nhân của triệu chứng này là do sự sản sinh ra độc tố đường ruột
trong thời kỳ sinh trưởng của B.cereus trong ruột non từ việc ăn vào bụng các tế bào hay bào tử
của vi khuẩn. Thông thường cả hai triệu chứng này là tương đối nhẹ, kéo dài ít nhất là 24h và
không phải luôn luôn đòi hỏi phải dùng thuốc. Tuy nhiên, nhiều trường hợp ngộ độc gây tiêu
chảy có thể xảy ra, nguyên nhân có lẻ là do các tế bào biểu mô chiếm đa số trong ruột non khi
các bào tử của B.cereus sinh sôi nảy nở và sản sinh ra độc tố đường ruột.
Bảng 1-1 Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của triệu chứng gây nôn mửa do B. Cereus
Tính chất/ Hoạt động Mô tả
Liều nhiễm độc Số lượng B.cereus: 105 - 108 tb/g thực phẩm
Khối lượng độc tố: 12 - 32 μg/kg
4
Độc tố được sản sinh ra Trong thực phẩm (25 - 30oC)
Thời kỳ ủ bệnh ½ đến 5h
Khoảng thời gian mang bệnh 6 - 24h
Triệu chứng Buồn nôn, nôn mửa
Loại thực phẩm thường gặp nhất Cơm nấu chin / chiên, mì ống, phở
Tên của độc tố Cereulide
Cấu trúc của độc tố Chuỗi polypeptide [D-O-Leu-D-Ala-L-O-Val-L-Val]
Khối lượng phân tử 1.2 kDa
Sinh kháng thể Không (none)
Hoạt động sinh học trên người Gây nôn
Cơ quan nhận cảm 5-HT3
Cytotoxic No
Hoạt động trên tế bào HEp-2 Hoạt động không bào
Khả năng chịu nhiệt 90 phút ở 121oC
Ảnh hưởng của sự phân giải protein Không
Việc sản sinh ra độc tố như thế nào Chưa biết, nhưng có thể liên quan đến enzyme
(not known, but probably enzymatically)
2.2. Cơ chế gây bệnh
2.2.1 Triệu chứng nôn mửa
Đặc điểm của bệnh nôn mửa và tính chất của độc tố gây nôn mửa đã được thể hiện ở
bảng 1-1. Sự giải thích về cấu trúc của độc tố emetic đã đưa đến những hiểu biết sâu sắc hơn về
triệu chứng này. Độc tố emetic có tên là cereulide và là một chuỗi polypeptide ba lần lặp lại của
bốn amino và/hoặc oxy-acid (bảng 1-1)
Cereulide (polypeptide) là tên của một độc tố quan trọng gây ra triệu chứng nôn mửa do
Bacillus cereus sản sinh ra. Bài báo này giải quyết được nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp
độc tố này dựa trên sự bất thường của độc tố depsipeptide từ Cacbon số 13 (13C) liệt kê ra trên 3
loại tiền L- amino acid (Valin, Alanin, Leuzin) trên môi trường tổng hợp trung gian. Sự phân
tích này được thực hiện dựa vào mức cấu tạo phân tử của amino hay oxy acid qua NMR và ESI
– MS của phương pháp kính quang phổ trên cereulide và sản phẩm thủy phân là các dipeptide
của nó. Sự hợp nhất của nguyên tử cacbon số 13 (13C) là chiếm đến 95% trong O-Val, O-Leu và
L-Val, trong khi đó chỉ có 40% 13C là kết hợp trong D-Ala của Cereulide.
5
Bacillus cereus được biết là nguyên nhân gây ra hai loại ngộ độc thực phẩm, đó là triệu
chứng nôn mửa và triệu chứng tiêu chảy. Phần lớn những ngộ độc do Bacillus cereus gây ra chỉ
mới phát hiện sau này. Cereulide được biết đến với cấu trúc bậc 1, với 1 dodecadepsipeptide
tuần hoàn, với 12 góc lập thể trung tâm. Hóa học lập thể được chỉ ra từ sản phẩm thủy phân là
các dipeptide kiềm tính, D-O-Leu, D-Ala, L-O-Val và L-Val. Đó là 1 ion Kali mạnh, nó liên kết
yếu với các ion Li+, ion Na+, ion Cs+, nhưng với ion Rb+ nó lại liên kết mạnh nhất, hơn bất kỳ ion
kim loại kiềm nào. Cereulide tạo cấu trúc bậc 2 từ NMR và sự tính toán cơ học các phân tử được
biểu thị ở hình 1. Độc tố này là nguyên nhân dẫn đến sự hình thành các ty lạp thể có chứa ATP
và các enzyme lien quan đến hoạt động chuyển hóa tế bào trong các mô khác nhau. Chúng ta bắt
đầu quan tâm đến con đường sinh tổng hợp của độc tố này cho các chương trình phòng chống
ngộ độc thực phẩm trong tương lai. Nghiên cứu quá trình sinh tổng hợp tương tự như
dodecadepsipeptide, valinomycin. Agata – một trong nhiều tác giả đã nghiên cứu quá trình phát
triển và sinh độc tố của bacillus cereus trong quá trình tổng hợp trung gian một cách đầy đủ từ
CADM (hỗn hợp các amino acid) và đường sucrose (đường mía). Người ta nhận thấy rằng,
bacillus cereus cho phép (chấp nhận) việc sản sinh ra cereulide cấu trúc bậc 1 và 3 amino acid
Val, Leu và Thr là cần thiết. Những nghiên cứu khác về quá trình sinh tổng hợp cereulide có lẻ
là cần thiết để thúc đẩy việc nghiên cứu tìm ra phương pháp ngăn chặn những ngộ độc từ thực
phẩm. Xét đoán từ cấu trúc của 1, tiền thân của D-Ala, L-O-Val và D-O-Leu sẽ lien quan đến
các amino acid như L-Ala, L-Val, và L-Leu.
6
có cùng độc tính ở điều kiện này đã được đánh dấu để phục vụ cho phân tích các nghiên cứu tiếp
theo. 1H NMR của mẫu này là đồng nhất với quang phổ đáng tin cậy ngoại trừ chất đồng vị của
cacbon 13C. ESI mass (interpreting Electrospray Mass Spectra) của nó xuất hiện ở 7 đỉnh trung
tâm với m/z là 1201.48 khá hơn mức bình thường M + K với m/z là 1191.55 (thể hiện ở hình 2),
vì vậy cứ trung bình 10 đơn vị mass thì cao hơn bởi vì sự kết hợp cao của 13Cs. Chính vì sự liên
hợp cao của 13Cs vào phân tử cereulide đã thúc đẩy chúng ta trong việc đo lường mức quang phổ
NMR 13C của ion K+ trong phức hợp CDCl3 để đạt được mức quang phổ như ở hình 3, với số liệu
đáng kể 171.4 (L-O-Val), 172.2 (D-O-Leu), 175.7 (L-Val) và 176.2 (D-Ala) đã được chuyển
sang mối tương quan giữa C-H của nó. Tương ứng với cường độ của 3 cacbon (C6, C9, C12) của
L-O-Val, D-O-Leu và L-Val là nhiều hơn hai lần C6 D-Ala.
7
Figure 4.Decoupled NHs by irradiating a-protons
Tương tự với việc làm riêng các thí nghiệm đã đạt được với bức xạ β proton của 4 hợp
phần amino hay oxy – acid. Loại bỏ các kết quả đạt được với α proton của O-Val ở 4.61 ppm với
bức xạ β-H của nó ở 2.30 ppm để thay đổi từ bộ ba sang bộ kép (J=3.8 Hz cặp với 13C của O-
Val) như đã thể hiện ở hình 5 . Bức xạ β-H của L-Val ở 2.24 ppm đã làm thay đổi α proton của
Val ở 3.82 ppm từ bộ năm thành bộ ba (J=5 Hz). Cả hai kết quả trên đều chỉ ra được sự kết hợp
cao cacbonyl cacbon của 13C tiền thân của các amino acid đối với L-O-Val và cả L-Val. Chưa có
kết quả chính xác nào về sự kết hợp của 13C, tuy nhiên trường hợp này lại đúng đối với Ala và O-
Leu (hình 5). Sự chiếu xạ gốc metyl của Ala ở 1.47 ppm gây ra α-H của nó (4.27 ppm) giống
như sự pha trộn của bộ ba và bộ kép biểu kiến với J=4 và 5 Hz, theo thứ tự định sẵn (tách biệt ra)
có nghĩa là tỷ lệ sát nhập lại để tạo thành cacbonyl cacbon là không quá cao (không đạt đến
100%). Sự chiếu xạ của β-Hs của O-Leu trong khoảng 1.84 ppm là không đạt kết quả bởi vì dải
13
sóng tự nhiên của nó quá rộng. Tuy nhiên, quang phổ NMR của C (hình 3) và những thí
nghiệm riêng lẻ (hình 4, 5) là những minh chứng gần như 100% của sự kết hợp 13C tiền amino
acid với 3 hợp phần (O-Leu, Val và O-Val) của cereulide.
8
Figure 5.Decoupling experiments of a protons of the four components by irradiating b protons.
Một phần trăm sự kết hợp của 13C là được xác định bởi phép đo phổ từ các sản phẩm thủy
phân cereulide, vì vậy hai dipeptide thu được từ sự thủy phân bằng kiềm cereulide (1) với 0.1N
KOH (hoặc 1N NH4OH) ở rt trong 30 phút. Các sản phẩm thủy phân dipeptide là D-O-Leu-D-
Ala và L-O-Val-L-Val, được phân tích bằng phương tiện ESI (electrospray ionization)- thước
MS/MS ở trên Q-TOF của phép đo phổ (Mcro Mass Co.,Ltd, Manchester, UK). Để làm được
điều này các chất đồng vị thừa và 13C kết hợp lại với nhau thành mẫu, pha loãng mẫu đó đến độ
hòa tan 10-100 pmol/μL trong 99,8% methanol: 0.2% acid formic trước khi bị electrospray ở
5μL/phút.
Ngày nay, L-Leu và L-Ala đã được chứng minh để xác định rõ là có được từ quá trình
sinh tổng hợp cereulide, vì hai acid amin này là cần thiêt cho B. cereus. Một trong những khả
năng có thể được nghiên cứu là cả ba L-amino acid sẽ ít nhất một lần được biến đổi thành các α-
keto acid và sau đó biến đổi thành D-O-Leu và L-O-Val hoặc là sự chuyển hóa amin để tạo
thành D-Ala. Trong trường hợp này chỉ có acid pyruvic sẽ bị pha loãng bởi vì số gốc cao vì L-
Ala là không cần thiết cho B. cereus. Nghiên cứu này có thể giải thích đến 95% sự kết hợp để tạo
thành D-O-Leu, L-O-Val, và L-Val khoảng (40%) sự kết hợp để tạo thành D-Ala.
10
Số lượng và loại độc tố liên quan đến triệu chứng tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm từ B.
cereus là đề tài tranh cải từ nhiều năm qua và cho đến nay vẫn còn đang tranh luận. Cả dạng đơn
và dạng phức của độc tố đường ruột được xác định là nguyê nhân gây ra bệnh tiêu chảy. Có hai
sự khác biệt trong ba hợp phần của độc tố đường ruột được sản sinh bởi các thực phẩm nhiễm B.
cereus, một số nhóm cũng được mô tả độc tố đường ruột một hợp phần với các phân tử trọng
lượng khoảng từ 40 – 100 kDa. Một số hiểu biết hiện tại về độc tố đường ruột của B. cereus
được thể hiện ở bảng 1-3
Bảng 1-3 Properties of Enterotoxin Isolated from Bacillus cereus
Enterotoxin/Reference Molecular Weight Biogogical Test Used DNA Sequenced
Once main Pro 50 kDa Positive on: rabit loop tests No
and two other pro vascular permeability tests
component and mouse lethality
11
Những nghiên cứu về quá trình sinh tổng hợp giúp thiết lập nên các giải pháp ngăn ngừa
các độc tố sinh ra từ B.cereus trong tương lai gần. Hoặc có thể đưa ra các phương pháp giúp phát
hiện ra độc tố cereulide trong tự nhiên bất cứ lúc nào.
3. Các phương pháp phát hiện vi sinh vật trong mẫu thực phẩm
Để kiểm soát Bacillus cereus thì có nhiều phương pháp khác nhau. Dựa vào thời gian cho
kết quả, người ta có thể chia thành hai nhóm phương pháp chính là phương pháp truyền thống
và phương pháp phân tích nhanh.
Nhóm các phương pháp này dựa trên đặc điểm phát triển của vi sinh vật trên các môi
trường đặc trưng và đặc điểm sinh lí, sinh hoá của các chủng, các loài vi sinh vật khác nhau.
Ưu điểm của phương pháp này là thao tác đơn giản, dễ làm, không phải đầu tư dụng cụ,
thiết bị đắt tiền. Tuy nhiên với nhóm phương pháp này còn một số hạn chế như độ nhạy không
cao, tốn nhiều nhân công và thời gian phân tích thường kéo dài do đó hạn chế trong công tác
phòng ngừa.
Bacillus cereus phân biệt với các loài khác trong Bacillus nhóm 1 như B.anthracis gây
bệnh than cho người, B.thuringiensis tạo độc tố kết tinh gây bệnh cho côn trùng, B.mycoides,
B.megaterium dựa vào các đặc tính sinh hóa Các khuẩn lạc được khẳng định dựa trên các thử
nghiệm sinh hóa với các đặc điểm như lên men glucose, sinh acid trong điều kiện kị khí, khử
nitrate thành nitrite, thử nghiệm VP (+), thủy phân L-tyrosine, tăng trưởng được trong 0.001%
lysozyme, được trình bày trong bảng sau:
Loài
Đặc tính B.cereus B.thuringiensis B.mycoides B.anthracis B.megaterium
Gram +(a) + + + +
Catalase + + + + +
Di động +/-(b) +/- -(c) - +/-
Khử nitrate + + + + -(d)
Phân hủy tyrosine + + +/- -(d) +/-
Kháng lysozyme + + + + -
Phản ứng với lòng đỏ
trứng + + + + -
Lên men glucose + + + + -
Phản ứng VP + + + + -
Sinh acid từ manitol - - - - +
Tan máu (cừu) + + + -(d) -
Các đặc tính của Bacillus nhóm I
12
a
+ :90 - 100% các chủng dương tính ; b +/- : 50% các chủng dương tính; c - : 90 – 100% : các
chủng âm tính; d - : Hầu hết các chủng âm tính.
Do có hình thái đặc trưng trên các môi trường thạch chọn lọc như : Mannitol-Egg Yolk-
Polymycin (MYP), Cereus Selective Agar (MOSSEL), Polymicin Elgelb Mannitol
Bromothymol Blue Agar (PEMBA), nên B.cereus còn được phát hiện và định lượng bằng môi
trường này. Ngoài ra B.cereus cũng được định lượng bằng phương pháp MPN.
Qui trình phân tích:
25g mẫu + 225ml môi trường pepton đệm (BPW) -> đồng nhất bằng Stomacher/ 1phút
để có độ pha loãng 10-1 -> pha loãng thành dãy thập phân để có các độ pha loãng thích hợp.
Trải 0.1ml mỗi độ pha loãng lên các môi trường thạch rồi ủ 24h ở 30oC:
MYP: do B.cereus không lên men mannitol, tạo lecithinase và kháng polymicin nên khuẩn lạc
B.cereus có màu hồng eosin, được bao quanh bởi vùng có tủa, chứng tỏ lecithinase được tạo
thành.
MOSSE: khuẩn lạc to, màu hồng, xung quanh có vòng sáng.
Chọn từ 5 khuẩn lạc (+) cấy sang thạch nghiên chuẩn bị cho các phản ứng khẳng định
B.cereus.
Nhuộm Gram:
Cấy ria các khuẩn lạc được chọn từ môi trường MYP/MOSSEL sang ống thạch dinh
dưỡng -> ủ ở 30oC/ 24h -> nhuộm Gram -> quan sát dưới kính hiển vi tế bào nhuộm
bằng vật kính 100X nhúng trong dầu.
Chọn phiến kính sạch -> vẽ lên kính 1 vòng tròn, đường kính 2cm -> ở vị trí tương ứn
với vòng tròn, mặt còn lại nhỏ vài giọt nước cất thành 1 giọt lớn -> chuyển một ít sinh khối
khuẩn lạc vào giọt nước trên kính bằng que cấy vòng -> khuấy nhẹ bằng đầu que cấy -> dung
dịch huyền phù đồng nhất -> bôi đều trong khu vực của vòng tròn -> để yên cho vệt bôi khô ->
đưa phiến kính ở vị trí cạnh vệt bôi qua lại trên ngọn lửa đèn cồn/đèn Bunsen để cố định vệt bôi
(tránh để vệt bôi tiếp xúc trực tiếp với ngọn lửa)
13
Tương tự cho hai chủng vsv đối chứng trong cùng một phiến kính khác: E.coli làm chủng
đối chứng cho Gram (-) và Staphylococcus aureus làm chủng đối chứng cho Gram (+).
• Phương pháp Jensen: nhỏ vài giọt dd methy violet lên vệt bôi -> giữ yên 20giây ->
dùng bình xịt nước lên vệt bôi -> rửa sạch phẩm nhuộm -> nhỏ vài giọt KI/I 2 lên vệt bôi/ để yên
1phút -> dùng bình xịt cồn 95% lên vệt bôi -> rửa phẩm nhuộm đến khi mất màu -> để yên vài
giây -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd safranin/30giây -> rửa sạch bằng nước, thấm nước dư
bằng giấy lọc.
• Phương pháp Hucker: tương tự như phương pháp Jensen, nhuộm vệt bôi bằng dd
crystal violet/ 1 phút -> rửa bằng nước -> nhuộm bằng dd KI/I2 / 1 phút -> khử màu bằng cách
xịt cồn 95% -> rửa lại bằng nước -> nhuộm màu bằng dd safranin/2phút.
Kết thúc qui trình nhuộm, quan sát dứơi kính hiển vi cho ta thấy tế bào nhuộm Gram (+)
có màu xanh tía (S.aureus), tế bào nhuộm Gram (-) có màu đỏ hồng (E.Coli). B.cereus là trực
khuẩn lớn, Gram (+), thường kết hợp với nhau thành dạng chuỗi; bào tử hình bầu dục, không có
dạng bào tử nang.
Dùng que cấy vòng chuyển một lượng sinh khối chủng thử nghiệm trong ống thạch dinh
dưỡng vào 0.5ml BPW vô trùng. Tạo huyền phù hóa dịch cho các phản ứng sinh hóa phía sau.
Thử nghiệm lên men glucose: Cấy vi khuẩn vào 3ml canh Phenol Red Glucose Broth ->
ủ ở 35oC/ 24h, kị khí -> lắc mạnh ống nghiệm -> quan sát độ đục ( sự phát triển); sự chuyển màu
môi trường từ đỏ sang vàng ( chứng tỏ có sự sinh acid glucose trong điều kiện kị khí).
14
Thử nghiệm khả năng khử nitrate: cấy vi khuẩn vào 5ml canh trường Nitrate Broth ->
ủ 35oC/24h -> bổ sung vài giọt dd của thuốc thử nitrate -> có màu cam xuất hiện trong 10phút
(chứng tỏ nitrate bị khử thành nitrit)
• Ống A đã cấy vi khuẩn trên canh trường Nitrate Broth chưa bổ sung thuốc thử.
15
• Ống B và C có bổ sung thuốc thử alpha-naphthylamine và sulfanilic acid. Ống B
cho kết quả dương tính (nitrate bị khử thành nitrite ), Ống C cho kết quả âm tính
với nitrite.
Thử nghiệm VP: Ở vi sinh vật, biến dưỡng năng lượng bằng phương thức lên men từ
glucose qua con đường đường phân sẽ tạo ra chất trung gian chủ yếu là pyruvic acid. Để khôi
phục dự trữ NAD+ trong tế bào phục vụ cho con đường đường phân ở các loài vi sinh vật, sau
đó pyruvic acid tiếp tục được chuyển hóa khác nhau tạo ra các sản phẩm lên men cuối cùng khác
nhau. Họ Enterobacteriacceace có đặc tính chung là lên men sinh tổng hợp acid như acid formic,
acid acetic, acid succinic, ethanol, H2 và CO2. Họ này có thể được chia thành hai nhóm là nhóm
không sinh 2,3-butanediol (ví dụ : E.coli) và nhóm sinh 2,3-butanediol (ví dụ: Enterobacter).
Phân tử 2,3-butanediol có thể được chuyển hóa qua lại thành acetoin: trong điều kiện có oxi và
môi trường có tính kiềm nhờ xúc tác của enzyme 2,3-butanediol dehydrogenase. Ngược lại
acetoin có thể bị khử thành 2,3-butanediol do hoạt tính của enzyme diacetyl reductase; ngoài ra
acetoin còn bị oxi hóa thành diacetyl, chất này tham gia vào phản ứng tạo màu trong thử nghiệm
VP.
Như vậy, thử nghiệm VP có thể giúp phân biệt các loài trong Enterobacteriaceace dựa
trên sự oxi hóa acetoin (acetylmethylcarbinol, AMC) từ 2,3-butanediol thành diacetyl. Sự oxi
hóa acetoin thành diacetyl được tăng cường nhờ xúc tác của α-naphthol. Diacetyl kết hợp với
nhân guanidine có trong peptone kết tụ thành phức diacetyl-guanidine có màu đỏ. Trong thuốc
thử Koblentz và O’Meara có chứa creatine có tác dụng bổ sung nguồn nhân guanidine.
Các bước tiến hành:
Môi trường được sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường lỏng Clark-Lubs (môi
trường MR-VP), có pH 6.9. Dùng que cấy vòng cấy vào các ống môi trường MR-VP một ít sinh
khối (trường hợp dùng thuốc thử Koblenntz thì cấy nhìu sinh khối) từ khuẩn lạc của chủng thuần
đã ủ 18-24h trên môi trường KIA hoặc TSI. Ủ yên các ống môi trường này ở 37oC / 24-48h hoặc
đến 10 ngày. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Có 3 loại thuốc
thử VP là:
• Thuốc thử Barritt: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn tuyệt đối, dung dịch B
là 40% KOH hoặc NaOH.
• Thuốc thử Koblentz: gồm dung dịch A là 5% α-naphthol trong cồn 95%, dung dịch B là
0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH.
• Thuốc thử O’Meara: dung dịch 0.3% creatine, 40% KOH hoặc NaOH
16
Khi sử dụng các loại thuốc thử 2 thành phần, trước tiên nhỏ 6 giọt dung dịch A, sau đó
nhỏ 2 giọt dung dịch B, bổ sung 1ml thuốc thử vào ống môi trường. Lắc nhẹ ống 1 phút để oxi
hóa acetoin. Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất 4h.
Trước khi sử dụng nên kiểm tra thuốc thử bằng các chủng đối chứng như E.Coli (VP -)
bề mặt môi trường không đổi màu và Enterobacter cloacae (VP +) có màu đỏ trên bề mặt
môi trường.
Thử nghiệm khả năng thủy phân tyrosine: cấy vi khuẩn vào thạch nghiêng tyrosine ->
ủ 35oC/48h -> xuất hiện khuẩn lạc ( chứng tỏ tyrosine bị phân hủy)
Thử nghiệm với canh Lysozyme Broth: cấy vi khuẩn vào 2.5ml môi trường Nutrient
Broth chứa 0.001% lysozyme, thực hiện tương tự với môi trường không chứa lysozyme -> ủ ở
35oC/24h -> kiểm tra sự tăng trưởng trong môi trường chứa và không chứa lysozyme -> những
ống có kết quả âm tính ủ thêm 24h -> kết luận vi khuẩn có kháng lysozme hay không.
Dựa vào bảng để khẳng định dòng đã chọn là B.cereus hay không.
Các thử nghiệm phân biệt các loài trong Bacillus nhóm I:
• Phương pháp 1: Dùng que cấy vòng cấy thẳng dịch 24h nuôi vào giữa môi trường
kiểm tra di động -> ủ 30oC/ 18-24h -> kiểm tra dưới ánh đèn kiểu mọc, dọc theo đừơng cấy. Kế
quả: loài di động mọc khuýêch tán vào môi trường theo hướng xa đường cấy, loài không di động
mọc trong và dọc theo đường cấy.
17
• Phương pháp 2: bổ sung 0.2ml nước cất vô trùng vào bề mặt môi trường thạch
nghiêng Nutrient Agar -> cấy huyền phù vi khuẩn vào -> ủ thạch nghiêng ở 30oC/6-8h -> nhỏ
nước vô trùng lên kính hiển vi, đặt sinh khối vi khuẩn vào -> quan sát dưới kính hiển vi để kiểm
tra sự di động.
Sự hình thành rễ giả: chạm nhẹ que cấy vòng mang huyền phù 24 giờ lên giữa đĩa
Nutrient agar -> ủ ở 30oC/48-72h -> kiểm tra sự phát triển của rễ giả (B.cereus không tạo cấu
trúc rễ giả, thường tạo nhóm khuẩn lạc xù xì khác với cấu trúc rễ giả đặc trưng của B.mycoides
(cấu trúc giống như rễ hoặc tóc mở rộng vài centimet từ vị trí cấy).
18
Bacillus Mycoides (có cấu trúc rễ giả)
Thử nghiệm làm tan máu: cấy chủng lên môi trường thạch máu Trypticase Soy -> ủ ở
35oC/24h -> B.cereus làm tan máu mạnh, tạo vùng tan máu hòan tòan (β) 2-4 mm xung quanh
vùng phát triển. B.thuringiensis và B.mycoides cũng tan máu β. B.anthracis thường không làm
tan máu sau 24h.
19
Sự tạo độc tố protein dạng tinh thế: cấy huyền phù tế bào 24h lên ống thạch nghiêng
nutrient agar -> ủ 30oC/ 24h -> để yên ở nhiệt độ phòng /2-3ngày -> nhuộm bằng phẩm màu
fuchsin -> quan sát dưới kính hiển vi.
Tinh thể độc tố của B.thuringiensis xuất hiện sau 3 đến 4 ngày nuôi cấy, phát hiện được
bằng kỹ thuật nhuộm khi bào tử nang vỡ ra (tinh thể độc tố hình tứ giác dạng kim cương được
nhuộm màu tối, nhỏ hơn bào tử). Do đó nếu không quan sát được bào tử tự do cần để thêm vài
ngày rồi kiểm tra lại. B.cereus và các Bacillus khác cùng nhóm không tinh thể độc.
• Số tế bào B.cereus/1g mẫu dựa vào số khuẩn lạc mọc ở mỗi độ pha lõang và hiệu chỉnh
bằng tỉ lệ khẳng định (phần trăm khuẩn lạc được xác nhận là B.cereus).
Ví dụ: số khuẩn lạc đếm được ở độ pha lõang 10 -4 là 65, có 4 trong 5 khuẩn lạc được chọn
xác nhận là B.cereus (được kiểm tra bằng các phản ứng sinh hóa).
Theo nguyên lí của các phương pháp phân tích vi sinh vật có thể chia phương pháp này
thành hai nhóm nhỏ: nhóm dựa trên nguyên tắc của sự kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên-
kháng thể (phương pháp miễn dịch) và nhóm dựa trên sự bắt cặp bổ sung các nucleotit
Nhóm các phương pháp này dựa trên phản ứng của kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên
bề mặt của tế bào vi sinh vật. Dựa trên nguyên tắc này có rất nhiều kĩ thuật đã phát triển thành
phương pháp phát hiện nhanh vi sinh vật.
3.2.2 Phương pháp Elisa
3.2.2.1. Giôùi Thieäu Chung Veà Elisa
Elisa (Enzyme linked Immunosorbent Assay) ñöôïc taïm dòch laø
phöông phaùp phaân tích haáp thuï mieãn dòch lieân keát vôùi enzyme, laø
phöông phaùp phaân tích trong ñoù söû duïng khaùng theå ñaëc hieäu ñeå
nhaän dieän khaùng nguyeân (thöôøng laø Protein).
Phöông phaùp Elisa ñöôïc phaùt trieån töø kó thuaät RIA (Radio
Immuno Assay) vaøo nhöõng naêm 1960, bôûi Rosalyn Sussman Yalow vaø
20
Solomon Berson. Kó thuaät naøy nhaän bieát khaùng nguyeân döïa treân söï
ñaùnh daáu phoùng xaï khaùng theå.
Phöông phaùp phaân tích Elisa ñöôïc öùng duïng nhieàu trong lónh
vöïc y hoïc, döôïc hoïc hay thöïc phaåm döïa treân lieân keát khaùng theå
vaø khaùng nguyeân nhö: chuaån ñoaùn beänh ung thö, HIV, caùc beänh do
vi sinh vaät khaùc hay trong xeùt nghieäm nhanh söï nhieãm vi sinh vaät
trong thöïc phaåm.
Öu ñieåm noåi baät cuûa phöông phaùp naøy laø ñoä nhaïy cao, phaùt
hieän ñöôïc lieân keát khaùng theå-khaùng nguyeân ôû möùc ñoä nhaát
nhoû, thôøi gian cho keát quaû nhanh hôn caùc phöông phaùp xeùt nghieäm
hoùa sinh, vi sinh truyeàn thoáng.
ÔÛ ñaây, khaùi nieäm khaùng theå hay khaùng nguyeân laø coù tính
töông ñoái vì trong nhieàu tröôøng hôïp khaùng theå naøy coù theå laïi laø
khaùng nguyeân ñoái vôùi khaùng theå khaùc.
Caùc enzyme söû duïng trong ñaùnh daáu thöôøng laø: peroxidase,
beta-galactoxidase, alkaline phosphatase.
Hình 3.1 : Caùc gieáng vaø pipettes trong phaân tích Elisa
21
3.2.2.2. Caùc phöông phaùp phaân tích Elisa
Phöông phaùp Elisa tröïc tieáp (Direct Elisa)
Trong tröôøng hôïp naøy, khaùng nguyeân naèm troän laãn trong dung
dòch ñeäm seõ ñöôïc cho vaøo ñaùy gieáng. Khaùng nguyeân seõ lieân keát
coá ñònh vaøo beà maët cuûa ñaùy gieáng. UÛ moät thôøi gian ngaén, sau
ñoù tieán haønh röûa troâi. Nhöõng khaùng nguyeân naøo khoâng lieân keát
seõ ñöôïc ñöa ra ngoaøi.
Theâm dung dòch chöùa khaùng theå coù gaén enzyme vaøo gieáng,
khaùng theå seõ lieân keát vôùi khaùng nguyeân taïo phöùc hôïp gaén chaët
vaøo gieáng. UÛ moät thôøi gian ñeå phöùc hôïp oån ñònh, sau ñoù tieán
haønh röûa troâi. Nhöõng khaùng theå naøo khoâng lieân keát vôùi khaùng
nguyeân seõ ñöôïc röûa troâi.
Theâm dung dòch cô chaát coù heä ñeäm vaøo gieáng. Neáu coù söï
toàn taïi cuûa phöùc hôïp khaùng theå_E_khaùng nguyeân thì cô chaát döôùi
taùc dung cuûa E seõ taïo maøu cho dung dòch. Döïa vaøo söï xuaát hieän
maøu vaø cöôøng ñoä maøu trong dung dòch seõ ñònh tính vaø ñònh löôïng
ñöôïc khaùng nguyeân.
22
Phöông phaùp Elisa giaùn tieáp (Indirect Elisa)
Khaùng nguyeân seõ ñöôïc cho vaøo ñaùy gieáng. Khaùng nguyeân
seõ lieân keát coá ñònh vaøo beà maët cuûa ñaùy gieáng. UÛ moät thôøi
gian ngaén, sau ñoù tieán haønh röûa troâi. Nhöõng khaùng nguyeân naøo
khoâng lieân keát seõ ñöôïc ñöa ra ngoaøi.
Ñöa khaùng theå muïc tieâu ñaëc hieäu vaøo gieáng, uû moät thôøi
gian vaø tieán haønh röûa troâi, chæ nhöõng khaùng theå ñaëc hieäu môùi
ñöôïc giöõ laïi cuøng khaùng nguyeân treân beà maët ñaùy gieáng.
Ñöa tieáp dung dòch ñeäm chöùa khaùng theå thöù caáp coù gaén
emzyme vaøo, khaùng theå naøy seõ lieân keát vôùi khaùng theå muïc
23
tieâu. Taïo phöùc hôïp khaùng nguyeân_khaùng theå muïc tieâu_khaùng
theå thöù caáp_E. Cuõng tieán haønh uû vaø röûa troâi.
Khi cho dung dòch chöùa cô chaát vaøo gieáng, cô chaát döôùi xuùc
taùc cuûa E seõ coù phaûn öùng taïo maøu.
Phöông phaùp naøy chæ khaùc vôùi daïng tröïc tieáp laø phaûi söû
duïng khaùng theå thöù caáp ñeå gaén E do khaùng theå muïc tieâu khoâng
theå gaén vôùi E.
Mẫu cần phân tích được cho vào trong đĩa giếng đã được phủ kháng thể chuyên biệt.
Kháng nguyên trong mẫu sẽ kết hợp với kháng thể trên đĩa giếng và trở nên bất động. Đĩa giếng
này tiếp tục được rửa để loại bỏ những kháng nguyên không kết hợp được với kháng thể. Sau
đó, phức hợp kháng thể - enzym (gồm kháng thể liên kết với enzym qua liên kết cộng hóa trị)
được thêm vào. Kháng thể của phức hợp này sẽ kết hợp với kháng nguyên bất động trên đĩa
giếng còn lại sau khi rửa để hình thành 1 bánh sandwich gồm: kháng thể – kháng nguyên –
kháng thể/enzyme trên đĩa giếng.
Sau khi loại bỏ kháng nguyên hoặc kháng thể, các cộng hợp tự do, cơ chất và chất phát
màu tương ứng với enzyme sẽ được cho vào và màu sẽ xuất hiện trong các giếng thử. Việc định
24
lượng hàm lượng kháng thể hoặc kháng nguyên được thực hiện bằng cách đo mật độ quang
giữa mẫu và chất chuẩn nhờ máy máy đọc ELISA.
Gián tiếp:
25
Xaùc Ñònh Bacillus Cereus Baèng Phöông Phaùp Elisa
Hai loaïi ñoäc toá gaây ra truùng ñoäc thöïc phaåm do Bacillus cereus sinh ra
laø Emetic
oxin (ñoäc toá gaây noân) vaø Diarrhoeal Enterotoxin (ñoäc toá gaây tieâu
chaûy).
Phöông phaùp xaùc ñònh Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin (BDE) baèng kó
thuaät
phaân tích Elisa ñöôïc Terca International Pty ñöa ra qua boä Kit Tecra®
Bacillus
26
Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immuno Assay, hieän nay ñang aùp dung taïi
nhieàu
®
Hình 3.7 : Kit Tecra Bacillus Diarrhoeal Enterotoxin Visual Immuno Assay.
• Maùy li taâm
• Boä ño pH
• Pipettes
27
cuï:
Laáy 10g moãi maãu thöïc phaåm nghi chöùavi khuaån B.cereus, theâm
-1
vaøo 20ml dung ñeäm Tris 0.25 mol1 . Xay nghieàn maãu.
Ly taâm maãu trong 10phuùt baèng maùy ly taâm toác ñoäc cao.
Loïc boû baõ sau li taâm, theâm vaøo dòch maãu moâi tröôøng ñeäm
vaø chænh pH cho tôùi 8
28
Cho 200 µl moãi maãu thöû vaø chaát chuaån (positive control) vaøo
moãi gieáng, nuùt chaët caùc gieáng vaø uû trong 2h ôû nhieät ñoä 35-37 oC.
Sau ñoù thaùo boû dòch maãu vaø röûa gieáng 4 laàn baèng dung
dòch röûa (wash solution)
Böôùc 2:
Theâm vaøo moãi gieáng sau khi röûa 200 µl conjugate (chaát tieáp
hôïp), nuùt chaët gieáng vaø uû trong 1h ôû 20 – 25 oC.
Thaùo boû conjugate vaø röûa laïi 5 laàn baèng dung dòch röûa.
Böôùc 3:
Theâm vaøo gieáng 200 µl substrate (chaát neàn), ñeå trong 30 phuùt
ôû nhieät ñoä 20 – 25 oC
Theâm tieáp 20 µl stop solution neáu coù theå.
Böôùc 4:
So maøu vaø ñoïc keát quaû theo catalogue: coù theå ñoïc baûng do maøu
hau baèng maùy.
29
Keát quaû vaø thaûo luaän
Cuõng vôùi boä Kit Tecra, A.Tan thuoäc vieän coâng ngheä öùng duïng
vi sinh ñaõ xeùt nghieäm treân caùc maãu thöïc phaåm vaø beänh phaåm
coù ñoäc toá BDE cuûa loaøi Bacillus cereus.
Sử dụng các hạt cao su có mầu có đính kháng thể đặc hiệu để định tính nhanh các chủng
vi khuẩn đã được phân lập. Khi có mặt kháng nguyên tương ứng, quá trình kết tụ
(agglutination) sẽ diễn ra và có thể quan sát trực tiếp bắng mắt thường (tạo ra hạt hoặc
dải có màu). Kĩ thuật này có thể sử dụng để xác định nhanh vi sinh vật nhiễm tạp trong
môi trường thuần sau khi phân lập từ thực phẩm.
Kỹ thuật này có thể sử dụng đầu dò với đoạn rARN đích do vậy có tính chính xác và
độ nhạy cao. Đây là kĩ thuật cho phép phát hiện sự có mặt của nhiều loài vi sinh vật
một lúc với thời gian nhanh. Tuy nhiên kỹ thuật cũng phức tạp và phải tốn công thiết
kế các mẫu dò và sử dụng vật liệu phóng xạ.
31
khuaån Thermus aquaticus, nhöõng E naøy goïi laø Tag, Flu. Nhieät ñoä
110oC Tag vaø Flu vaãn khoâng bò bieán tính.
Veà cô baûn, ñeå thöïc hieän ñöôïc kó thuaät PCR caàn moät soá caùc
phaàn sau :
• Ñoaïn DNA maãu (Template) chöùa ñoaïn DNA caàn khueách ñaïi
• Ñoaïn moài (Primer) xaùc ñònh ñieåm baét ñaàu vaø ñieåm keát thuùc
• Enzyme DNA Polymerase nhaân ñoâi ñoaïn DNA
• Nucleotide laø nguyeân lieäu cho phaûn öùng nhaân ñoâi DNA
• Dung dòch ñeäm
Ngoaøi ra, do PCR thöïc hieän trong chu trình nhieät (khoaûng 20-30
laàn) neân caàn coù maùy ñun noùng vaø laøm nguoäi moâi tröôøng phaûn
öùng trong caùc oáng nghieäm. Thieát bò ñieän di caàn thieát ñeå xaùc
ñònh kích thöôùc DNA ( thöïc teá laø troïng löôïng ñoaïn DNA ñaõ ñöôïc
khueách ñaïi)
32
• Böôùc 3 : Keùo daøi ôû 72oC trong 2 phuùt. Enzyme seõ xuùc taùc phaûn
öùng keùo daøi maïch DNA boå sung cho tôùi khi gaëp ñieåm keát thuùc.
33
Hình 2.3 : Caùc böôùc cuûa phaûn öùng PCR
Hoãn hôïp sau khi chaïy PCR seõ ñöôïc nhuoäm maøu vaø phaân
tích baèng ñieän di treân baûn gel Agarose. Löôïng DNA sau khi
khuyeách ñaïi seõ coù cuøng trong löïông phaân töû vaø taäp trung ôû
cuøng moät vi trí treân baûn gel. Keát quaû ñieän di seõ ñem so saùnh
vôùi thang DNA chuaån ñeå bieát trong löôïng phaân töû cuûa ñoaïn
DNA khueách ñaïi, cuõng chính laø maûnh DNA luùcbanđầu
34
Hình 2.4 : Keát quaû ñieän di saûn phaåm chaïy PCR
Xaùc ñònh B.cereus baèng PCR
Nhö ñaõ trình baøy ôû phaàn môû ñaàu, Bacillus cereus laø loaøi vi
khuaån gaây ngoä ñoäc thöïc phaåm vôùi hai trieäu chöùng : Noân möûa
(Emetic) vaø tieâu chaûy (Diarrheic). Trong ñoù ñoäc toá gaây moân
möûa (Emetic toxin) laø loaïi beàn nhieät do moät loaïi gene coù teân
Cereulide Synthetic (CRS) cuûa vi khuaån toång hôïp.
Nagoya City Public Health Research Institute, Nagoya University
keát hôïp cuøng haõng Takara ñaõ ñöa ra boä Kit xeùt nghieäm nhanh
Bacilus cereus cuøng vôùi quy trình xeùt nghieäm döïa treân kó thuaät
PCR.
Boä Kit naøy xeùt nghieäm hai loaïi gene toång hôïp :
• CRS cuûa Bacillus cereus
• LE ( Lecithinase enzyme gene) cuûa bacillus cereus vaø caùc loaøi
cuøng chi nhö bacillus atharcis, bacillus thuringiensis
35
Hình 2.5 : Bộ Kit PCR
Thaønh Phaàn Chính Cuûa Kit: (25 µl X 50 Reactions)
• 5 x PCR Premix * 500 µl ( Goàm hoãn hôïp dNTP, IC, enzyme TaKaRa
Ex TaqTM HS)
• Hoãn hôïp CRS Primer 50 µl (Ñeå phaùt hieän cereulide synthetic
enzyme gene)
• Hoãn hôïp LE Primer 50 µl (Ñeå phaùt hieän lecithinase gene)
• Hoãn hôïp I.C Primer 50 µl (Ñeå phaùt hieän internal control)
• Khuoân maãu döông CRS 10 l
• Khuoân maãu döông LE 10 l
Baûo Quaûn Boä Kit : -20 oC
Caùc Loaïi Hoùa Chaát Vaø Duïng Cuï Khaùc:
• Nöôùc chöng caát vaø ñöôïc tieät truøng
• NuSieve 3:1 agarose ( Lonza biosciences)
• Heä ñeäm ñieän di (TBE powder (Cat.#T905)
• Thang chuaån DNA
pHY marker (Cat.#3404A/B)
Ф X174 Hin C II digest (Cat.#3406A/B)
100 Bp DNA (Cat.#3407 A/B)
• Heä ñeäm chæ thò (6x : 30% glycerol, 0.03% bromophelnol blue,
0.03% xylene cyanol, 30mM EDTA, do haõng TaKaRa cung caáp)
36
• Hoùa chaát nhuoäm maøu DNA (Ethidium bromide, hoaëc SYBR green,
hoaëc Gelstar Nucleic acid stain (Haõng Lonza Biosciences))
• Maùy gia nhieät ( tôùi 95oC)
• Maùy li taâm töông thích vôùi caùc oáng nghieäm 1.5ml
• TaKaRa PCR Thermal Cycler DiceTM (Cat.#TP600,650)
• Duïng cuï ñieän di
• Nguoàn ñieän
• Ñeøn cöïc tím
• Polaroid Camera chuïp aûnh ñieän di
• Ống nghieäm 1.5 ml (TaKaRa (Cat.#9047))
• Micropipettes loaïi 20 µl vaø 200 µl
• Nuùt ñaäy Micropipettes
• Maøng Polaroid
• Khay nhuoäm maøu Agarose Gel
Caùch Thöùc Tieán Haønh
Chuaån bò maãu:
• Maãu vi sinh vaät ñaõ phaân laäp
• Laáy moät löôïng vi khuaån töø khuaån laïc nuoâi caáy treân moâi
tröôøng NGKG (Nissui Pharmaceutical Co.,Ltd) baèng micropipette.
Theâm vaøo maãu 100 µl nöôùc tieät truøng.
• Gia nhieät maãu leân 95oC trong 5 phuùt.
• Laáy 1 µl maãu sau gia nhieät ñeå chaïy PCR.
Maãu töø thöïc phaåm
• Laáy 1 löôïng nhoû maãu thöïc phaåm, cho maãu vaøo moâi
tröôøng SCD (Tryptosoya bouillon, Nissui Pharmaceutical Co.,Ltd)
coù chöùa theâm Polymixin. Theå tích moâi tröôøng gaáp 10 laàn
theå tích maãu. Xay maãu nhuyeãn.
• Ñeå maãu ôû nhieät ñoä 35 oC trong 5-6h hoaëc qua ñeâm
• Ly taâm 1.3ml maãu trong 1 phuùt (1000voøng/phuùt). Laáy 1ml
phaàn phía treân dòch maãu sau li taâm cho vaøo trong oáng
37
nghieäm saïch vaø ly taâm ôû vaän toác 12,000 voøng/phuùt trong
3 phuùt.
• Boû phaàn baõ noåi phía treân, theâm vaøo oáng nghieäm 100 µl
heä ñeäm TE.
• Gia nhieät tôùi 95 oC trong 5 phuùt.
• Laáy 1ml dòch sau gia nhieät chuaån bò chaïy PCR
38
• Gia nhieät trong 2-3 phuùt baèng loø vi soùng. Sau ñoù khuaáy
ñeàu cho tôùi khi hoãn hôïp ñoàng nhaát. Tieáp tuïc gia nhieät
theâm laàn nöõa.
• Thieát laäp baûn gel
• Khi dòch Agarose gel nguoäi xuoáng 50-60 oC, tieán haønh theâm
hoùa chaát nhuoäm maøu Ethidium bromide 0.5 µg/ml, khuaáy
ñeàu hoãn hôïp gel
• Ñoå gel leân baûn gel vaø taïo raõnh treân baûn gel.
• Ñeå baûn gel ôû nhieät ñoä phoøng trong 30 phuùt ñeå gel cöùng
laïi.
• Sau khi gel ñaõ ñaït ñoä cöùng, ñöa baûn gel vaøo thieát bò ñieän
di.
Chaïy ñieän di
• Keát noái caùc daây ñieän theo ñuùng cöïc
• Theâm 2 µl heä ñeäm chæ thò vaøo moãi oáng saûn phaåm chaïy
PCR vaø laéc ñeàu hoãn hôïp.
• Roùt töø töø hoãn hôïp vaøo caùc raõnh treân baûn gel baèng
micropipette. Löu yù hai raõnh beân phaûi vaø traùi baûn gel ñöôïc
roùt DNA maker (Thang DNA chuaån 100 bp).
39
Kỹ thuật này thực chất là dựa trên kỹ thuật lai phân tử, trên các phiến kính hoặc các
màng cellulose có gắn hàng chục nghìn mẫu dò ADN theo một trình tự xác định. Nhờ vào
phản ứng lai, bắt cặp của ADN có trình tự tương đồng mà sự có mặt một đoạn gen của một
vi sinh vật đích nào đó có thể được phát hiện và số copy có thể xác định chính xác. Với kỹ
thuật này có thể xác định được nhiều gen đích ( vi sinh vật) trong cùng một thời điểm với
mức độ chính xác cao và thời gian nhanh và chính xác
3.2.7 Phương pháp phát hiện vi sinh vật bằng kỹ thuật Real Time PCR:
Nguyên tắc :
Kỹ thuật Real Time PCR hay còn gọi là PCR động về cơ bản dựa trên nguyên tắc
của kỹ thuật PCR. Tuy nhiên nó cho phép hiển thị và theo dõi trực tiếp qúa trình nhân bản
DNA đang diễn ra theo từng chu trình nhiệt qua sử dụng kỹ thuật phát huỳnh quang. Dựa
vào độ phát huỳnh quang ta có thể định lượng các đoạn DNA hình thành
41
Do mồi có tính phát quang cho nên có thể đánh dấu chúng với các chất nhuộm khác
nhau, nhờ thế để có thể nhân các đoạn khác nhau trong cùng một phản ứng PCR. Tuy nhiên
phương pháp này có hạn chế là phải tổng hợp các mẫu dò khác nhau cho các trình tự nhận
biết khác nhau.[10]
Chất nhuộm mầu này được gắn với rãnh nhỏ của chuỗi DNA kép, khi được gắn với
sợi DNA kép thì cường độ phát huỳnh quang tăng lên, khi bản sao tạo ra càng nhiều thì tín
hiệu phát ra của chất mầu sẽ tăng lên theo tỉ lệ thuận. Ưu điểm của phương pháp này là
SYBR sẽ đính vào bất cứ chuỗi DNA kép nào có mặt.
Kỹ thuật này sử dụng các đầu dò có thể phát huỳnh quang, các mẫu dò là một
oligonucleotit trong đó một đầu được gắn với chất nhuộm mầu có phát huỳnh quang, đầu
kia được gắn với chất nhuộm có vai trò làm tắt sự phát huỳnh quang. Khi có mặt đoạn
DNA cần nhân, mẫu dò sẽ gắn vào DNA khuôn ở vùng dưới của mồi theo hướng 5’. Ở
trạng thái này không có hiện tượng phát huỳnh quang.
Khi bắt đầu tiến hành quy trình PCR với sự hoạt động của enzyme taq-polymerase
mồi được kéo dài cho tới khi gặp mẫu dò thì mẫu dò sẽ bị phân giải bởi hoạt tính 5’
nuclease của taq-DNA polymerase.Sự phân giải mẫu dò sẽ làm giải phóng chất nhuộm mầu
có khả năng phát huỳnh quang khỏi ảnh hưởng kìm hãm của chất nhuộm có vai trò làm tắt
sự phát huỳnh quang. Sự phát huỳnh quang này có thể nhận biết được.
Trong kỹ thuật này một đầu dò được gắn với một chất cho huỳnh quang ở đầu 3’ và
một đầu dò thứ hai gắn với một chất nhuộm huỳnh quang. Khi hai đầu dò này tiến lại gần
nhau, cách nhau khoảng 1-5 nucleotide, chất phát quang phát ra từ chất cho huỳnh quang sẽ
kích thích chất nhận huỳnh quang và kết quả là phát ra tín hiệu huỳnh quang.
42
Hình 3 Sơ đồ một số phương pháp của kỹ thuật Real Time PCR
Ưu điểm :
• Kỹ thuật này khắc phục được những nhược điểm của PCR như sau:
• -Có thể định lượng chính xác sản phẩm PCR, trong khi sử dụng PCR thông thường
việc phân biệt dựa trên độ lớn của vạch thu được sau điện di
• -Độ đặc hiệu và độ nhạy cao hơn, thời gian tiến hành phản ứng ngắn
• -Có thể tiến hành với nhiều đoạn DNA cùng lúc trong cùng một ống nghiệm nên
giảm khả năng nhiễm mẫu
43
thấy trong các nguồn thực phẩm dạng tươi hay đã qua chế biến ngoại trừ các thực phẩm đã
được thanh trùng bằng nhiệt hay chiếu xạ.
Phần lớn các giống vi khuẩn B. cereus có thể phát triển trong các thực phẩm có độ
chua thấp ở nhiệt độ dưới 150C và trên 550C (nhiệt độ tối thích là 30 – 350C), phát triển
được trog khoảng pH 5.0 và 8.8
Độc tố emetic (gây nôn mửa) của B. cereus rất bền nhiệt, có thể tồn tại ở 1260C
trong 90 phút. Ngược lại, độc tố diarrheal (gây tiêu chảy) rất nhạy cảm với nhiệt độ và bị
vô hoạt khi nấu chín ở nhiệt độ 560C trong 5 phút.
Chủng loại, cấu trúc và thành phần cấu tạo độc tố đường ruột của B. cereus cần
được nghiên cứu xa hơn. Cần các thao tác kiểm tra trên ống nghiệm đối với độc tố emetic
và kiểm tra cụ thể hoạt động về mặt sinh học đối với độc tố diarrheal.
44
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
2. Nguyễn Thị Hiền, Phan Thị Kim, Trương Thị Hoà, Lê Thị Lan Chi (2003), Vi sinh vật
nhiễm tạp trong công nghệ thực phẩm, NXB Nông Nghiệp Hà Nội.
3. Nguyễn thị Kim Hoa (2004), Phát triển kỹ thuật PCR trong phân tích listeria
monocytogenes gây bệnh thực phẩm, Luận văn thạc sỹ khoa học, Hà Nội.
4. Lâm Xuân Thanh (2004), Giáo trình công nghệ các sản phẩm sữa, NXB KHKT, Hà
Nội.
5. Trần Linh Thước, Các phương pháp kiểm tra vi sinh vật trong nước và thực phẩm,
NXB giáo dục và đào tạo.
6. Phùng Thị Thủy (2006) Góp phần kiểm soát sự nhiễm tạp vi sinh vật trong quá trình
sản xuất sữa tiệt trùng với sự hỗ trợ của kỹ thuật PCR, Luận văn thạc sỹ khoa học
Tiếng Anh
1. Applied Biosystems (AB). SYBR Green PCR and RT-PCR reagents. 2001
8. http://www.medinet.hochiminhcity.gov.vn/VSATTP/qddanhmuc/gioihanonhiem. asp
9. http://aem.asm.org/cgi/content/full/68/10/4853
10. http://pathmicro.med.sc.edu/pcr/realtime-home.htm
11. http://www.appliedbiosystems.com/support/tutorials/pdf/rtpcr_vs_tradpcr.pdf
12. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-4a.html
13. http://www.takara-bio.com
14. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-14.html
15. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-20a.html
46