Bovino

Martín Palomino, P.; Gómez Calle, L.; Fernández González, O.; Salinas Lorente, L.J.

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Introducción

Las clamidias son bacterias esféricasintracelulares obligadas, Gram negativas,Stamp positivas, que no crecen en mediosde cultivo inertes y ampliamente distri-buidas por la naturaleza. Poseen un ciclode desarrollo atípico durante el cual sedesarrollan formas infecciosas únicas. Lafamilia

Chlamydiaceae

se encuadra den-tro del orden

Chlamydiales

. En dicha fami-lia se encuadran dos géneros,

Chlamydia

Chlamydophila

, así como nueve especies.El tracto gastrointestinal parece ser ellugar habitual de infección por las especiesde Chlamydophila en los animales. Lasinfecciones intestinales son con frecuenciasubclínicas y persistentes. La eliminaciónfecal de estos microorganismos, en prin-cipio prolongada, puede volverse intermi-tente con el paso del tiempo.Una gran variedad de especies ani-males resultan susceptibles a las infec-ciones por clamidias (Vanrompay y col.,1995). Tanto la gravedad como el tipode enfermedad producida resultan muyvariables, desde infecciones clínicamenteinaparentes hasta infecciones sistémicasgraves. Las enfermedades asociadas coninfecciones clamidiales incluyen conjun-tivitis, artritis, aborto, uretritis, enteritis,neumonía y encefalomielitis. Los síntomasclínicos y su gravedad se ven influidos porfactores relacionados con el hospedador ycon el patógeno, y en los brotes de enfer-medad normalmente predomina un tipo depresentación clínica.En el ganado porcino,

Chlamydia suis

,anteriormente clasificada dentro de laespecie

C. trachomatis

, incluye cepas ais-ladas de procesos que cursan con enteritis,conjuntivitis, neumonías, abortos tardíosy orquitis en los machos. Se cree quela infección se produce principalmentepor vía aerógena aunque también porvía genital y oral. Se presupone que esteagente se encuentra ampliamente extendi-do en las piaras porcinas, la mayoría de lasveces causando infecciones asintomáticasque pasan totalmente desapercibidas.Como es sabido, resulta bastante difícilproteger a las explotaciones porcinas fren-te a esta infección, ya que las clamidiasaparecen con frecuencia en el ganadobovino, ovino, en aves, y en los pequeñosroedores, cuyos gérmenes, por lo menosexperimentalmente, también son infeccio-sos para el ganado porcino.Debido a lo anteriormente expuesto, ydada la escasa literatura científica relacio-nada con las clamidias en el ganado porcino,nos propusimos este trabajo de investigacióncuyo único

objetivo

planteado fue:1.- estudiar la prevalencia de clamidia enuna explotación porcina de raza Ibérica.

Estudio seroepidemiológico de la clamidiosisporcina en una explotación de cerdo ibérico

Martín Palomino, P*; Gómez Calle, L*; Fernández González, O*; Salinas Lorente, L.J**

* Laboratorio veterinario Aljibe** Departamento de Sanidad Animal. Facultad de Veterinaria. Murcia

nº 32

Estudio seroepidemiológico de la clamidiosis porcina en una explotación de cerdo ibérico

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Materiales y métodos

1.- ANIMALES OBJETO DEL ESTUDIO

Nuestro trabajo de investigación seha basado en el análisis de 107 suerosporcinos de ambos sexos, procedentes deuna explotación ubicada en la provincia deToledo. Todos los animales pertenecen a laraza Ibérica.Todos los animales que se encuentranen la explotación están sujetos a los pro-gramas sanitarios obligatorios así como alos controles serológicos y demás actuacio-nes según legislación vigente.

2.- TOMA DE MUESTRAS

Las técnicas de extracción sanguíneason variadas en el porcino; podemos citar elsangrado de vena cava craneal, vena yugu-lar externa, venas auriculares y arteria yvena caudal media. En casos experimentalespuede abordarse la vena porta o la puncióncardiaca directa. Las extracciones deben serrealizadas por veterinarios que dominen lastécnicas para que sean rápidas y seguras, yaque los cerdos suelen pasar bastante miedo.La técnica utilizada por nosotros parala toma de muestras ha sido la de sangradoen seno venoso oftálmico. El seno venosooftálmico está constituido principalmentepor la vena oftálmica externa dorsal y lavena oftalmica externa ventral. Además,drenan a este seno la vena lacrimal, la venasupraorbital y la vena conjuntival. La técni-ca de extracción del seno venoso oftálmicoes simple. A diferencia de la extracciónsanguínea del cuello, si se dirige correcta-mente la aguja (tangente al globo ocular)hacia el lugar donde se aloja el seno venoso(suelo de la órbita), no existe posibilidadalguna de dañar vasos o nervios.Aunque se recomienda el uso de agu- jas de 25 mm de longitud para animalespequeños y de 38-40 mm para animales demás de 30 Kg., dependiendo de la periciadel técnico ambas pueden usarse indistin-tamente en diferentes edades.La misma lágrima asegura que el campode abordaje esté extremadamente limpio,con lo que la posibilidad de contaminacióncuando la aguja penetra por la piel, comosucede en el caso del cuello, aquí no existe.

3.- CHLAMYDOPHILA ABORTUS: CEPAUTILIZADA

Para el presente trabajo hemos utilizadola cepa AB7 de

Chlamydophila

abortus

.Esta cepa ha sido cultivada y producida ensaco vitelino de embrión de pollo y en lalínea celular McCoy, respectivamente.

4. CULTIVO Y PRODUCCIÓN DE

C. ABORTUS

EN SACO VITELINO DEEMBRIÓN DE POLLO

El cultivo de

C. abortus

se realiza enhuevos de gallina embrionados, libres depatógenos específicos, de 7 días de incu-bación en una estufa de 37 ºC y en movi-miento.Para ello, primero se marca la posicióndel embrión y el área delimitada por lacámara de aire, observando el huevo a travésde un ovoscopio. La inoculación de la sus-pensión bacteriana se realiza en condicionesestériles con una aguja de 0,9 x 40 mm, através de la cámara de aire, depositando elinóculo en el lado opuesto al que ocupa elembrión. El punto de inoculación se sella ylos huevos, una vez inoculados, se mantie-nen en incubadora a temperatura de 37,5 ºCy humedad constante y se observan diaria-mente con un ovoscopio para detectar lasposibles muertes embrionarias.Se considera que si un embrión muereen los primeros 3 días no se debe a la infec-ción, sino a posibles problemas traumáticoso tóxicos. Por lo tanto, se eliminan los hue-vos en los que el embrión muere antes de 4días tras la inoculación. La infección por

C.abortus

provoca la muerte embrionaria tras6 u 8 días post-infección (p.i.) por lo que loshuevos se abren en este momento, una vezque, mediante visualización al ovoscopio, secomprueba que el embrión ha muerto.Previamente a su apertura, los huevosse mantienen a 4 ºC durante 2 horas, parafacilitar la manipulación del saco vitelino.Una vez retirada la cáscara que cubre lacámara de aire en condiciones estériles,se extrae la membrana del saco vitelino, yse macera. El macerado se centrifuga paraeliminar, por un lado, la fracción lipídica,que se queda en la parte superior del sobre-nadante y, por otro, los restos celulares másgroseros, que sedimentan. De esta forma,se recoge únicamente la porción intermediade este centrifugado, que es la más rica enbacterias.Algunos huevos embrionados se inocu-lan con PBS estéril, para obtener maceradosde sacos vitelinos que emplearemos comocontroles negativos de infección.

5. CULTIVO Y PRODUCCIÓN DE

C. ABORTUS

EN LA LÍNEA CELULARMCCOY

La línea celular McCoy proviene decélulas epiteliales humanas cultivadas juntocon fibroblastos de ratón, y resulta espe-cialmente sensible a la infección clamidial.La obtención de clamidia por este métodolleva una serie de pasos:

• Descongelación y puesta en cultivo de

las células.

• Recuento y estimación de la viabilidad.• Multiplicación de células McCoy.

El antígeno clamidial obtenido fue utili-zado para la realización de la técnica ELISA.Se llevaron a cabo dos tipos de ELISA dondela única diferencia estribaba en el tapizadode las placas; unas fueron tapizadas conantígeno de clamidia obtenido en sacovitelino de embrión de pollo, y otras conantígeno de clamidia obtenido en la líneacelular McCoy. El resto de la metodologíaa seguir para la realización de la técnicainmunológica fue común para ambas (adi-ción del suero problema, del substrato y delconjugado).

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Resultados y discusión

Los resultados obtenidos, expresados endensidad óptica (DO), al aplicar la técnicainmunoenzimática ELISA, utilizando antí-geno de

Clamidia

cultivado y producidoen saco vitelino de embrión de pollo, asícomo antígeno obtenido en la línea celular

Bovino

Martín Palomino, P.; Gómez Calle, L.; Fernández González, O.; Salinas Lorente, L.J.

McCoy, aparecen reflejados en la tablaque mostramos a continuación.El primer paso a seguir en la obtenciónde los resultados fue calcular el umbral depositividad. Para ello empleamos 10 suerosporcinos negativos por inmunofluerescen-cia indirecta que forman parte de la sero-teca de la Unidad de Microbiología de laFacultad de Veterinaria de Murcia. Dichossueros fueron analizados con la técnicaELISA conjuntamente con los sueros pro-cedentes de los animales objeto del estu-dio para que éste fuese más homogéneo.El umbral de positividad lo hemosobtenido considerado la media de lasdensidades ópticas de los 10 sueros mástres veces la desviación típica. Dichoumbral se estableció en un densidadóptica de 0,474 y 0,734 al llevar a cabola técnica ELISA para Clamidias obtenidaspor cultivo en saco vitelino de embriónde pollo y por cultivo en la línea celularMcCoy, respectivamente.En gráfico 1 aparecen representadaslas densidades ópticas de los diez suerosporcinos negativos por inmunoflueres-cencia indirecta utilizados como contro-les. De la misma forma aparece repre-sentado el umbral o límite de positividadresultante.Según lo anteriormente expuesto, acontinuación se presentan una serie detablas donde irán apareciendo los resulta-dos obtenidos al aplicar el umbral o limitede positividad para ambas técnicas a losanimales objeto del estudio.Como se puede observar en la men-cionada tabla, 39 animales de los 107objeto del estudio han resultado positi-vos. Esto supone el 36,4%.Como se puede apreciar, de los 107animales objeto del estudio, sólo 27 deellos (25,2%) han resultado positivos aClamidias por ambas técnicas.En el gráfico 2 aparecen representadaslas densidades ópticas obtenidas en aquellosanimales que han resultado ser positivosa Clamidias después de realizar la técnicaELISA con antígeno obtenido en saco viteli-no de embrión de pollo y el obtenido en lalínea celular McCoy. Igualmente, aparecenrepresentados en el gráfico, los umbraleso límites de positividad de ambas técnicas.

Muestra

DO Ag Saco vitelinoembrión polloDO Ag línea celularMcCOY

10,2231,10520,2720,53030,3110,59740,3820,58150,3380,53260,4130,77970,5110,86380,6360,75690,5931,678100,3260,582110,5350,789120,5641,427130,3360,536140,5610,806150,5201,204160,5460,645170,3900,517180,2560,421190,6921,350200,6761,148210,4990,540220,5130,799231,1050,637240,6120,481250,5320,784260,2430,345271,3651,389280,3290,593291,2321,139300,2650,403310,2690,920320,3590,568330,5690,750340,8760,561350,8961,730360,3500,527370,8640,581380,5470,782390,6950,803400,7420,774410,7210,562420,8260,437430,9111,499441,1240,835451,5360,823461,4230,811470,2300,623480,2710,527490,3210,530500,7510,502510,2110,563520,2680,328530,2060,466

MuestraDO Ag Saco vitelinoembrión polloDO Ag línea celularMcCOY

540,3350,345550,2640,305560,4420,538570,7590,637580,4210,566590,2350,551600,4010,440610,3350,324620,2310,332630,3650,628640,5120,642650,2300,566660,4150,535670,5360,783680,3610,575690,3950,804700,5610,849710,2660,587720,2310,697730,3100,571740,3530,511750,4120,532760,2960,407770,2120,349780,3640,431790,2400,378800,4360,867810,2140,560820,3210,611830,4630,589840,3670,498850,3930,480860,2860,688870,2610,861880,4230,577890,5460,866900,3640,551910,5921,779920,3210,510930,2400,331940,3260,369950,2610,311960,3650,521970,3560,564980,4230,582990,2370,3571000,5120,5461010,3200,5041020,4310,4781030,5930,9631040,4520,5211050,4190,5101060,3210,3471070,4620,491

Tabla I. Cálculo del límite de positividad.

SuerosDO Ag Saco vitelinoembrión polloDO Ag línea celular McCOY