UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONOMA DE

NICARAGUA
Instituto Politécnico de la Salud

Temas:
-Generalidades y características de
Enterobacterias.
-Pruebas bioquímicas
Gram + y Gram –
-BLEE

Elaborado por:

- Elena Manzanares
- Faviola Martínez

Carrera: Lic. Bioanálisis Clínico

III año

Managua , 24 de Julio de 2009

GENERALIDADES DE ENTEROBACTERIAS
Las Enterobacterias pueden vivir libres en la naturaleza y habitualmente
forman parte de la Flora Normal del Colón Humano, en escaso porcentaje (mas
del 98% de la flora intestinal son anaerobios de los géneros Bacteroides y
Prevotella). Pueden encontrarse transitoriamente en la piel (especialmente
perianal), el tracto genital femenino y muy ocasionalmente, el tracto
respiratorio superior de los individuos sanos. Las enterobacterias parecen en
una mayor proporción en la flora de individuos hospitalizados, especialmente
en aquellos que sufren enfermedades graves y debilitantes.

Taxonómicamente las enterobacterias se le han definido mas de 25 géneros y

110 especies o grupos: sin embargo, las enterobacterias clínicamente
significativas comprenden 20 a 25 especies. Entre ellas los géneros mas
importaNtes son: Escherichia, Shigella, Salmonella, Klepsiella, Serratia,
Enterobacter, Proteus, Morganella, Providencia, Pseudomona, Acinobacter y
Yersinia, entre otras.
Las enterobacterias poseen 3 grupos de antígenos que se han usado
para su clasificación: 1) flagelares “H” que son termolábiles; 2)
capsulares “K” y 3) somáticos “O”.

Factores de Patogenicidad:

1) Adhesinas, actividad presente en fimbrias, que se asocian con

uropatogenicidad de E. coli y enteropatogenicidad para otros géneros de
enterobacterias. También existen adhesinas afimbricas.
2) Pseudocápsula, que permite la adherencia a fómites, como sondas
urinarias y catéteres.
3) Capsula, se asocia con mayor invasividad, particularmente en la
Meningitis por E. coli.
4) Exotoxinas y exoenzimas: especificas para cada género y especie.
5) Endotóxinas, representada por LPS. Puede provocar el Shock
endotoxico.
6) Sideróforos.
7) Plásmidos, permiten la transferencia de factores de patogenicidad y genes
que otorguen resistencia antibiótica a otras bacterias.
CARACTERISTICAS DE
ENTEROBACTERIAS
- Son bacilos gram (-) dotados por flagelos peritricos o carentes de
motilidad.
Crecen sobre peptonas o medios con extracto de carne sin adición de
cloruro de sodio ni otros suplementos, crecen bien en Agar MacConkey,
ASC, Ach.
No forman esporas, Son oxidasa (-), son catalasa (+), reducen los
nitratos, fermentan la glucosa en vez de oxidarla con producción de gas o
sin la misma y son aerobios o anaerobios facultativos.
 Crecen a temperaturas de 30-37 grados C excepto Salmonella y
Shigella y Ph de 7.2 a 7.5
 Características en el crecimiento
Identificación presuntiva rápida, bacterias entéricas gram (-)
Fermentación rápida Fermentación lenta No fermentación de
de lactosa de lactosa lactosa
Escherichia coli: brillo Edwarsiella, Serratia, Especies de Shigella:
metalico sobre medio Citrobacter, Arizona, carentes de motilidad, no
diferencial: dotado de Providencia, Erwinia. forman gas a partir de
motilidad, colonias no glucosa.
viscosas, aplanadas. Especies de Salmonella:
Enterobacter aerogenes: dotado de motilidad;
colonias elevadas, sin brillo habitualmente forman acido
metálico; con frecuencia y gas a partir de glucosa.
motiles; crecimiento mas Especies de Proteus:
viscoso. swarming sobre agar,
Klepsiella pneumoniae: hidrólisis rápida de la urea
muy viscoso, crecimiento (olor amoniacal).
mucoide, no motil. Especies de Pseudomonas:
pigmentos solubles,
fluorescencia azul-verdoza,
olr a taml pisque o a uva.
 Pruebas Bioquímicas de las Enterobacterias
Reacción bioquímica por enterobacterias comunes de importancia clínica
Citrobacter Enterobacter Escherichia Klebsiella Morganella Proteus Providencia Salmonella Serratia Shigella

TSI K/A A/A A/A A/A K/A K/A K/A K/A K/A K/A
HS
2
+/- - - - - + - +/- - -
Gas + + + +/- + +/- +/- +/- +/- -
Lisina - +/- + + - - - + + -
Fenilalanina - - - - + + + - - -

Motilidad + + +/- - + + + + + -
Indol +/- - + +/- + +/- + - - +/-
Ornitina +/- + +/- - + +/- - + + +/-
Citrato + + - + - +/- + +/- + -
Malonato

Ureasa - - - + + +/- - - -
VP - + - - - - - + -
Glucosa + + + + + + + + + +
Arginina +/- +/- - - - - - +/- - -
Pseudomona auroginosa
- Son gram (-),rectos o ligeramente curvos(0.5-1)
- Poseen flagelos polares.
- No producen fragmentacion.
- Emplean pocos hidratos de carbono (glucosa, ribosa, gluconalo), mediante metabolismo
oxidativo,.
- Citocromo-Oxidasa (+), catalasa +, lactosa –
- Aerobios obligados.
- Algunas cepas son mucoides (capsula polisacárido) en pacientes con fibrosis quistica.
-Algunas seudomonas (aeruginosa) producen pigmentos difusibles en el medio de cultivo:
a)piocianina(azul)
b)Fluoroceina (amarilla)
c)Pioverdina (verde)
d)Piorrubina (roja-parda)
e)Piomelanina (marron o negro)
TSI :K/K
LIA: K/Ac
Crecimiento a 42 grados.
FLUJOGRAMADELPROCESAMIENTO DE MUESTRAS BACTERIOLOGICAS PARA
IDENTIFICACION DE BACILOS GRAM NEGATIVOS:

MUESTRA (medio de trasporte STUART) sembrar en:

ASC/McK

Observar caracteristicas morfologicas del crecimiento, sospechamos de Gram negativo

Fermenta dor LA C+ No Fe rme nta dor LAC-
o sólido y diferencial. El fundamento se basa en la capacidad de fermentación de dos azucares (glucosa y lactosa), en la producción de ác. sulfhídrico
Interpretación del TSI:

TSI
El agar Hierro Tres Azucares (TSI), es un medio sólido y diferencial. El fundamento se basa en la
capacidad de un microorganismo de atacar un hidrato de carbono especifico. Incorporado en un medio de
crecimiento básico, con producción o no de gas. Junto con la determinación de posible producción de
acido sulfhidrico H2S.

Extracto de carne 3.0 Extracto de levadura 3.0

Peptona 20.0 Lactosa 10.0
Glucosa 1.0 Cloruro sódico 5.0
Tiosulfato sódico 0.5 : fuente de azufre, las bacterias lo reducen
Citrato férrico amónico 0.5
produciendo ác. sulfhídrico (precipitado negro)
Rojo de fenol 0.03 : indicador, si vira a rosáceo , indica basicidad del medio, si es amarillo indica
acidificación (derivada de ác. de la fermentación)

Interpretación:
NC o SC: no cambio o sin cambio LC, Alk o K : alcalinidad
H2S o subíndice s: si produce ác. sulfhídrico G: productora de gas
A/As indica que es fermentador de glucosa, lactosa y sacarosa, si se observa ennegrecimiento del medio
hay producción de acido sulfhídrico
Ak/Ac con o sin gas, lo que significa que solamente hay fermentación de glucosa. Si además se observa
ennegrecimiento del medio, hay producción de acido sulfihidrico.

1
Fermentador glucosa, productor ác. sulfhídrico y de gas.
2
3 Fermentador glucosa, lactosa y sacarosa, productor de gas.
 sto:descarboxilasa (LDC). el medio contiene como indicador Purpura de Bromocresol, cuando la lisina se descarboxila, el medio se acidifica y el indicad
ma
ma descarboxilasa
fhídrico, (LDC).
en cuyo caso el medio contiene
el precipitado como
negro nos indicador
impedirá Purpura
ver si es LDCde
+ oBromocresol,
-. cuando la lisina se descarboxila, el medio se acidifica y el indicad
fhídrico, en cuyo caso el precipitado negro nos impedirá ver si es LDC + o -.

LIA
Principio:
Medir la capacidad enzimática de un microorganismo para descarboxilar un
aminoácido en ambiente anaerobio para formar una amina. Con consiguiente
alcalinidad. Junto con la determinación de posible producción de ácido
sulfhídrico (H2S) y la capacidad enzimática para desminar en ambiente
aerobio el aminoácido formando un complejo de color anaranjado que al
combinarse con el púrpura del medio da un color rojo en la parte inclinada del
tubo.
Este medio pone de manifiesto:
- Descarbosilacion de la lisina (K/K o K/N) Si la bacteria posee la enzima descarboxilasa (LDC) el medio
contiene como indicador Purpura de Bromocresol, al activarse la lisina s descarboxilasa en un pH acido, el
indicador vira a purpura o conserva el color sin inocular. Cualquier cambio de color en el fondo después de
la producción de acido es una prueba positiva.
- Desaminación de la lisina (R/A): El inclinado del tubo se torna inicialmente alcalino por la utilización
oxidativa de las peptonas; al activarse la desaminasa. El PH alcalino , el color del medio se torna rojo. El
fondo del tubo permanece acido (amarillo) por fermentación de la glucosa.
No utilización de la lisina: El color amarillo del fondo del tubo se debe exclusivamente a la utilización de la
glucosa.
Si es productora de ác. sulfhídrico, en cuyo caso el precipitado es negro.
- Si es productora de gas.
1. LDC -, NO H2S, PRODUCTORA GAS.

2. LDC + ó -, PRODUCTROA H2S Y GAS.

3. LDC - , NO H2S, PRODUCTORA DE GAS

 MIO
Principio:
Es un medio que se utiliza para determinar la presencia de flagelos, así como los enzimas descarboxilasa de ornitina y triptofanasa. Por lo tanto, sirve para determinar la movilidad, descarboxilación de la ornitina y
producción de Indol.
Movilidad:
Algunas bacterias poseen flagelos y otras carecen de ellos. Este medo ayuda a diferenciar las bacterias móviles de las no móviles.
Producción de Indol:
Si la bacteria posee la enzima triptofanasa, el aminoácido triptófano será degradado en varios productos entre los cuales esta el indol, el cual se hace visible al agregarle el reactivo Kovac (para
dimetilaminobenzaldehido), o Erlich con un color rosado intenso. Sin la presencia de la enzima y ausencia del indol, el reactivo se transparente.
Descarboxilacion de la Ornitina:
Detecta la presencia de la enzima descarboxilasa de la ornitina, que de estar presente desdobla la ornitina en putrescina, un producto con Ph alcalino, lo que hace intensificar el color violeta el medio.
CITRATO
Se usa para determinar si el organismo es capaz de utilizar el citrato como única fuente de
carbono y compuesto amoniacales como única fuente de nitrógeno. El medio contiene
citrato sódico, fosfato de amonio y azul de bromotimol como indicador; este se tornará
azul cuando el medio se basifica. Las bacterias que metabolizan el citrato liberan iones
amonio al medio (degradación del fosfato amónico) lo que provoca que este se alcalinice y
el indicador vire azul.
MALONATO
Evalúa la capacidad del microorganismo de utilizar el malonato como única fuente
de carbono y la desanimación de la fenilalanina, en forma combinada. Las
enterobacterias no tienen la capacidad enzimática de realizar las dos reacciones
simultáneamente, por lo que, o se observa la utilización del malonato o la
desanimación de la lisina. Las bacterias que no utlizan el malonato no poseen la
enzima fenilalanina desaminasa, por lo que es posible reacciones de malonato y
fenilalanina desaminasa negativas.
UREA
Principio:
Determinar la capacidad de un microorganismo de desdoblar la UREA formando
2 moléculas de amoniaco por acción de la enzima UREASA.
Interpretación:
1-Reaccion Positiva: Rojo o rosado intenso o rosado chicha o rosado cíclame.
2- Reacción Negativa: No se produce cambio de color es decir el medio conserva
su color original de amarillo pálido o el amarillo es un poco mas intenso.
VOGES-PROSKAUER/ROJO DE METILO
Principio:
VP: Determinar la capacidad de un microorganismo de producir un producto final neutro, el
acetilmetilcarbino (acetoina), a partir de la fermentación de la glucosa.
RM: Comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los
productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad
amortiguadora del sistema.
Utilización de los reactivos:
1- Dividir asepticamente el medio VP/RM en dos porciones iguales de 1.5ml.
2- Agregar a un tubo 5 gotas de rojo de metilo. Interpretando el resultado inmediatamente.
3- Agregar al otro tubo:
a. 0.6 ml de una solucion de alfa –naftol (6gotas)
b. 0.2ml de una solucion de KOH al 40% (2gotas).
c. Agitar suavemente el tubo para exponer el medio al oxigeno atmosferico a fin de oxidar la
acetona y obtener una reaccion de color.
d. Dejar descansar el tubo por lo menos 15 minutos (15-30minutos)
PRUEBA DE LA OXIDASA
Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La
reacción de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa
que activa la oxidación del citocromo que es reducido por el oxígeno molecular
que produce agua o peróxido de hidrógeno según la especie bacteriana.
Durante al prueba la enzima oxidasa en presencia de oxigeno, citrocromo C y el
reactivo de la oxidasa, este se oxida para producir un compuesto colorido
llamado indofenol, el reactivo mas usado es el reactivo de kovacs oxidasa, que
es una solución de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%.
El oxígeno actúa por tanto como aceptor final de electrones en la cadena
transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa sólo
se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y,
excepcionalmente, en algún microaerófilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios
estrictos carecen de actividad oxidasa.
 Así mismo, la presencia de oxidasa va ligada a la producción de catalasa, ya que
ésta degrada el peróxido de hidrógeno  que se produce como consecuencia de
la reducción del oxígeno y cuya acumulación es tóxica.
LA PRUEBA SE USA SOBRE TODO PARA
      Identificar todas las especies de Neisseria (+)
      Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las
enterobacterias.
      También se usa en algunos casos para diferenciar género y especie
de otras bacterias.
El reactivo de la oxidasa más recomendado es la solución acuosa al 1%
de diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es
menos tóxico y mucho más sensible que el correspondiente compuesto
dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es más caro. Este
reactivo tiñe las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira
gradualmente a púrpura-negruzco intenso.
LA PRUEBA SE REALIZA:
1. Método en placa directa
Realización de la prueba:
Método en placa directa
Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no
invertirla.
Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reacción se produce en unos 10-15
segundos(UN COLOR VIOLETA), mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-
30 minutos.
2. Método indirecto sobre papel
Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri.
Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel.
Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado.
La reacción de color positiva se produce a los 5-10 segundos.
 
 
GRAM POSITIVOS
Los cocos Gram positivos aerobios y anaerobios facultativos que están constituidos por la familia
Micrococaecceae (genero Staphylococcus, Micrococcus, PLanococcus y Stomacoccus) y los generos
Streptococcus y Enterococcus.
El genero Staphylococcus es aerobio-anaerobio facultativo, se agrupan en racimos, coagulasa+, catalasa+.
Dentro del genero las especies de importancia clínica: S.aureus, S.saprophyticus y s. epidermidis.
Los estreptococos son  organismos anaerobios facultativos y Gram Positivos que a menudo aparecen
formando cadenas o por pares y son catalasa-negativa (los estafilococos son catalasa positivos). Los
estreptococos se subdividen en grupos mediante anticuerpos que reconocen a los antígenos de superficie
(Figura 4). Estos grupos incluyen una o más especies. Las agrupaciones de estreptococos más importantes
son A, B, y D. Entre los grupos de estreptococos, la enfermedad contagiosa (especificamente faringitis) es
causada por el grupo A, el cuál se enfatiza aquí. Streptococcus pneumoniae (es la causa principal de pulmonía
humana), Streptococcus mutans y otros estreptococos llamados viridans (entre las causas de caries dental)
no pertenecen a grupos antigénicos.
Después del crecimiento de estreptococos en agar con sangre de oveja se observan tres tipos de reacción de
hemólisis (alfa, beta, gamma). La hemólisis alfa se refiere a una lisis parcial de eritrocitos que produce una
coloración verde que se observa alrededor de las colonias (debido a la  liberación de un producto de
degradación de la hemoglobina llamado bili-verdina); la hemólisis beta se refiere a un halo de hemólisis
completamente claro y la hemólisis gama se refiere a la ausencia de hemólisis. Los estreptococos del grupo
A y B son beta hemolíticos, mientras que D es generalmente alfa o gamma. Los Streptococcus pneumoniae y
viridans ("verde") son alfa-hemolíticos. Por lo tanto la reacción de hemólisis es importante para la
clasificación de los estreptococos. La reacción de hemólisis junto con otra de las características fisiológicas
es suficiente para una identificación clínica presuntiva.
Flujograma de las bacterias GRAM positivas
Prueba de catalasa
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra el
la mayoría de las
bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen citocromo. La
principal excepción es
Streptococcus.
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes
géneros:
· Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
· Bacillus (+) de Clostridium (-).
· Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones de
C.pyogenes y
C.haemolyticum, ambos -) de Erysipelothrix (-)
Una prueba de rutina de la catalasa a temperatura ambiente puede hacerse
siguiendo dos técnicas:
1. Método del portaobjetos (recomendado):

· Con el asa de siembra recoger el centro de una colonia pura de 18-24

horas y colocar sobre un portaobjetos limpio de vidrio.
· Agregar con gotero o pipeta Pasteur una gota de H2O2 al 30% sobre
el microorganismo sin mezclarlo con el cultivo.
· Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
· Desechar el portaobjetos en un recipiente con desinfectante.
· Si se invierte el orden del método (extender la colonia sobre el agua
oxigenada) pueden producirse falsos positivos.
2. Método del tubo de ensayo:
· Agregar 1ml de H2O2 al 3% directamente a un cultivo puro de agar en
slant densamente inoculado.
· Observar la formación inmediata de burbujas (resultado positivo).
PRUEBA DE LA COAGULASA
La prueba de la coagulasa es usada específicamente para diferenciar las
especies del genero staphylococccus:
La coagulasa es una enzima producida por S. aures, es relativamente
estable al calor, resiste temperaturas arriba de 60C por 30 minutos.
Algunos microbiólogos establecen que al coagulación del plasma
ocurre en 2 etapas:
Hay una reacción entre la enzima producida por la bacteria, una porción
coagulasa, con un factor o activador presente en el plasma para
producir la coagulasa.
La coagulasa real del plasma es activada por la coagulasa.
Tecnica en portaobjeto
Prepare una suspensión gruesa y bien homogénea de cada microorganismo en
una solución salina estéril.
Ponga una gota de la suspensión y una gota de plasma humano o de conejo
sobre un portaobjetos, mezclar suavemente con el asa y después por rotación.
Observe si hay aglutinación microscópica lo que indica una prueba positiva
Observe si hay aglutinación microscópica lo que indica una prueba positiva
INTERPRETACION:
Una prueba positiva, usualmente ocurre entre 5-20 segundos.
La prueba negativa si la aglutinación no ocurre dentro de 3-4 minutos.
Tecnica en tubo
En un tubo de 13 x 100 esteril mezclar 0.5 ml  de plasma humano o de
conejo y una asada grande de la bacteria aprobar. Rotar suavemente el
tubo sin sacudir.
Incubar a 35 grados C de 4-6 horas, observe cada 30 minutos.
PRECAUCIÓN: cuando este checando no sacude el tubo, inclínelo
suavemente para ver el coagulo, si este no es visible al final de las 6 horas,
déjelo en la incubadora por 24 hrs.
CAMP TEST
Fundamento: determina la capacidad de un microorganismo de producir
factor CAMP, el cual es un factor extracelular poducida por los
Streptococos del grupo B que intensifica la lisis de los globulos rojos
producida por la B lisina estafilocócica
Procedimiento: con una cepa de Staphylococcus aureus conocida, haga
una estria recta en un plato ASC, perpendicularmente al inoculo y sin
tocarlo, trace una estria del Streptococcus beta hemolítico en estudio.
Incubar a 35 grados por 4 horas.
Lectura e interpretación:
Una imagen similar a un apunta de flecha, indica reacción positiva.
 Tinción Zielh Neelsen
La tinción de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una técnica de
tinción diferencial rápida y económica, que se basa en que las
paredes celulares de ciertos parásitos y bacterias contienen
ácidos grasos (por ejemplo, el ácido micólico) de cadena larga (50 a 90
átomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la
decoloración con alcohol-ácido, después de la tinción con colorantes
básicos. Por esto se denominan bacilos ácido-alcohol r
esistentes o BAAR. Las micobacterias como M. tuberculosis y M.
marinum y los parásitos coccídeos como Cryptosporidium se caracterizan
por sus propiedades de ácido-alcohol resistencia. La coloración clásica
de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese
la pared bacteriana que contiene ceras. La tinición fue descrita por
primera vez por dos médicos alemanes, Franz Ziehl (1859 to 1926), un
bacteriólogo y Friedrich Neelsen (1854 to 1894), un patólogo.
 TINCION DE GRAM
La tinción de Gram es la prueba más simple utilizada en el laboratorio
de microbiología. Es elprocedimiento diferencial más comúnmente
usado para el examen directo de gran variedad de génerosbacterianos.
Fue concebido por Hans Christian Joachim Gram en el siglo IX y se
mantiene hasta elmomento sin modificaciones sustanciales. Divide a
las bacterias en dos grupos: Microorganismos grampositivos que
retienen el colorante primario cristal violeta y se observan de color azul
oscuro o púrpura y microorganismos gramnegativos que pueden ser
decolorados, esto es que pierden el colorante primario.
Subsecuentemente toman el colorante de contraste safranina y
aparecen de color rojo o rosa.
PROCEDIMIENTO:
1. PREPARACIÓN DEL FROTIS:
 
1.1. Colocar una pequeña gota de solución salina en el centro de la lámina. Si son varias muestras, divida la lámina
portaobjetos en su parte posterior en 6 y o más cuadrantes y coloque una pequeña gota de solución salina en cada uno
de ellos, según la cantidad de muestras que teñirá.
Las gotas pequeñas hacen que el secado sea rápido. En caso de muestras obtenidas de caldos, no se requiere la
solución salina.
 
1.2. Tomar la muestra con asa recta (una UFC) o redonda si se trata de caldos de cultivo y mezclarla con la gota de
solución salina. Al mismo tiempo que se hace la mezcla, se dispersa en un área de aproximadamente 1cm por lado. El
grosor de la muestra deber ser tal que permita la lectura de letras pequeñas a través del frotis.
 
1.3. Ponga la lámina sobre una superficie plana y espere a que se seque a temperatura ambiente.
 
1.4. Rotular la lámina adecuadamente. Si tiene mas de un Gram en la misma lámina cerciórese que con la rotulación le
será posible evitar equivocaciones acerca de la proveniencia de la muestra.
 
1.5. Una vez que el frotis esté seco, fijar la muestra pasándola rápidamente dos veces por encima de la flama del
mechero. Evite el sobrecalentamiento ya que la pared celular se destruye y las bacterias grampositivas se observarían
como gramnegativas. Para saber la temperatura adecuada coloque inmediatamente la lámina flameada sobre el
dorso de una mano. En estos casos, la temperatura se debe tolerar sin hacer ningún esfuerzo de resistencia al calor.
 
1.6. Dejar que el frotis se enfríe.
2. TINCIÓN:
 
2.1. Cubrir el frotis ya fijado y frío con cristal violeta, dejar el colorante por un minuto.
2.2. Enjuagar, dejando resbalar el agua con un chorro suave. Escurrir muy bien.
2.3. Cubrir con lugol y dejar por un minuto.
2.4. Repita el numeral 2.2
2.5. Aplicar 2 ó 3 gotas de alcohol acetona (1:1) o alcohol 70o y balancear la lámina de tal
manera que se pueda observar la decolaración. El tiempo adecuado es aquel en que las
partes más gruesas han dejado de decolorar al realizar el balanceo.
2.6. Inmediatamente repita el numeral 2.2
2.7. Cubrir el frotis con safranina o fucsina acuosa durante 30 segundos.
2.8. Repita el numeral 2.2
2.9. Dejar secar a temperatura ambiente.
2.10. Examinar en el microscopio con lente de inmersión, empleando aceite de inmersión.
 
En lo relativo a la coloración, ya hemos explicado anteriormente que hablamos de
microorganismos Gram-positivos cuando aparecen teñidos de color azul-violeta y de
Gram negativos cuando se visualizan de color rojo-rosado.
 
Formas básicas en que se puede visualizar la
morfología bacteriana en una tinción GRAM:
  Cocos

Bacilos

Espirales
 Gram+
Cadenas: forma típica de Streptococcus sp, como
Cocos Gram-negativos
Gram -
Diplococos: forma usual de Neiseria sp, como N. meningitidis
S. pneumoniae, Streptococcus grupo B

También Moraxella sp y Acinetobacter sp aparecen con morfología de diplococos.

Acinetobacter puede ser pleomórfico, y a veces aparece como coco Gram-positivo.
Cocos Gram-positivos
Racimos: forma típica de Staphylococcus sp, c
omo S. aureus

Cocobacilos: forma usual de Acinetobacter sp, que puede ser Gram-

positivo o Gram negativo,y, a menudo, Gram-variable.

Tetradas: forma típica de Micrococcus sp

Bacilos Gram-negativos
Bacilos Gram-positivos Bacilos finos: forma usual de enterobacteriaceae, como E. Coli
Gruesos: forma típica de Clostridium sp, como C.
perfringens, C. septicum
Cocobacilos: forma
usual de Haemophilus sp, como H. influenzae

Finos: forma típica de Listeria sp Curvados: forma usual de Vibrio sp, como V. cholerae, y Campylobacter sp, como C

Ramificados: forma típica de Actinomycetes

Forma de aguja fina: forma usual de Fusobacterium sp
Métodos para la detección de betalactamasas de espectro
extendido (BLEE) en bacilos gramnegativos
Las BLEE son enzimas que son sintetizadas por los bacilos
 
gramnegativos (enterobacterias y no fermentadores) e hidrolizan los
antimicrobianos betalactámicos y por lo tanto, confieren resistencia a
penicilinas, cefalosporinas (de primera, segunda, tercera y cuarta
generación) y monobactames. Dada su particular estructura química,
algunos de estos betalactámicos son resistentes a la hidrólisis:
cefamicinas (cefoxitina, cefotetan y otros) y carbapenems (imipenem,
meropenem y otros).
CONFIRMACIÓN DE BLEE POR DIFERENCIA EN EL TAMAÑO DE LOS HALOS ENTRE DOS
DISCOS:
Cuando la diferencia entre ceftacidima (o cefotaxima) y ceftacidima/ácido clavulánico (o
cefotaxima/ ácido clavulánico) es >5mm se confirma la presencia de BLEE. Es necesario realizar
las dos pruebas para determinar si la las BLEE son ceftacidimazas, cefotaximasas o ambas.

MÉTODO DEL “HUEVO” (DEFORMACIÓN) CON TRIPLE DISCO:

2.2.1. Discos a utilizar:
2.2.1.1 Ceftacidima (CAZ) 30 g
2.2.1.2 Ceftriaxona (CRO)* 30 g o cefotaxima (CTX) 30 g
2.2.1.3. Amoxicilina con ácido clavulánico (AMC) 20/10 g

Fundamentos fisiológicos del método:

Para realizar el antibiograma se colocan en fila los tres discos anteriores teniendo cuidado de colocar el de
amoxicilina/clavulánico en el centro de la fila. La distancia recomendada debe ser entre 2 a 3 cm entre el centro
de la cefalosporina y el centro del disco de AMC.

El efecto huevo se debe a que el inhibidor se difunde radialmente con gradientes de concentración decrecientes
alrededor del disco de AMC. Las bacterias que se encuentran en la zona alrededor de este disco tendrán la BLEE
inhibida hasta una distancia tal que el ácido clavulánico haya disminuido lo suficiente como para no seguir
inhibiendo a la enzima. Es decir, a mayor distancia del disco de AMC, menor concentración de clavulánico,
menor inhibición de la BLEE. Por otro lado, el mismo fenómeno de gradientes de concentración ocurre en los
discos de las cefalosporinas puestos a los lados del disco de AMC: a mayor distancia del disco, menor
concentración de la cefalosporina de tercera generación. La interacción de estos dos gradientes es la que
determina la deformación del halo de inhibición (ver figura
CONTROL DE CALIDAD DE BLEE POR DIFERENCIA EN EL TAMAÑO DE LOS HALOS:
Escherichia coli ATCC 25922:
<2mm de incremento en la zona de inhibición.
Klebsiella pneumoniae ATCC 700603:
>5mm de incremento en el halo entre ceftacidima y ceftacidima/ácido clavulánico.
>3mm de incremento en el halo entre cefotaxima y cefotaxima/ácido clavulánico
GRACIAS POR SU
ATENCION!!!!!!!