Fundamentos y técnicas de análisis microbiológico.

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Pruebas de identificación bacteriana

Identificación bacteriana

La identificación es un proceso por el cual debemos determinar a qué especie pertenece una determinada
cepa bacteriana, mediante la comparación de una serie de características que pueden ser puestas en evidencia en el
laboratorio y que han sido estudiadas para la gran mayoría de las especies importantes desde el punto de vista de la
patología infecciosa humana.
Cuanto más semejanza haya entre las características obtenidas en el laboratorio y las que habitualmente
presenta una determinada especie, mayor será la probabilidad de que esa cepa problema pertenezca a dicha especie.
Las características utilizadas en la identificación de cada grupo de microorganismos dependen de las
posibilidades de cada laboratorio, fundamentalmente económicas y de cualificación del personal, así como de la
epidemiología específica de la zona.
Las características que se tienen en cuenta para lograr una correcta identificación son las siguientes:

Características no bacterianas:
? Paciente: ? Muestra:
Edad Obtención
Sexo Conservación
Patología Transporte

Características bacterianas:
? de cultivo: ? individuales:
Medios en los que crece Características estructurales:
Temperatura - Tinción de Gram
Atmósfera de crecimiento - Morfología
Crecimiento en aero o anaerobiosis - Dimensiones
Morfología de las colonias - Forma de agruparse
- Presencia de estructuras:
- Cápsula, Flagelos, Esporas
- Movilidad
Características metabólicas:
Acción bacteria/sustrato
Enzimáticas
un enzima aislado
un sistema enzimático
No enzimáticas
Acción agente químico/bacteria
Pruebas de susceptibilidad
Determinación de metabolitos libres
Características inmunológicas.
Análisis de DNA.

En el proceso de identificación tradicional se establecen tres niveles de procesamiento:

a) el primero hace referencia a la morfología y a su comportamiento ante la tinción de Gram u otras tinciones
que se utilicen específicamente para cada grupo.
b) el segundo nivel de identificación debe especificar el género a que pertenece el microorganismo.
c) por último, la conclusión debe hacerse con la identificación a nivel de especie

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Pruebas de identificación

Tradicionalmente la identificación de una cepa bacteriana comienza con la visualización de un frotis de la

colonia aislada al que se le ha realizado una tinción de Gram:
Básicamente los cuatro grandes grupos que nos encontraremos en este primer paso son los siguientes:
Cocos Gram positivos Bacilos Gram negativos y
Cocos Gram negativos Bacilos Gram positivos

La identificación puede realizarse también sobre grupos de microorganismos con características especiales
que veremos específicamente cuando tratemos a dichos grupos, como son:
Micobacterias Micoplasmas
Anaerobios Espiroquetas
Rickettsias y Chlamydias Actinomices y Nocardias
Ciñéndonos a los cuatro grupos descritos más arriba, los laboratorios deben utilizar una rutina específica que
vaya realizando de forma secuencial o simultánea una serie de pruebas que nos permitirá ir diferenciando las
especies más importantes desde el punto de vista infeccioso.
Quizás las más utilizadas cuantitativamente sean las pruebas bioquímicas que nos permiten determinar
características metabólicas de los microorganismos objeto de identificación, aunque las reacciones de aglutinación o
precipitación utilizadas son más rápidas y más específicas.
Las pruebas podríamos clasificarlas fundamentalmente en aquellas que nos permiten la identificación de
Gram positivos y pruebas para identificación de Gram negativos, aunque hay una serie de pruebas comunes a
ambos grupos que vamos a enumerar,

Pruebas de identificación iniciales:

Morfología bacteriana Catalasa
Tinción de Gram Citocromo - oxidasa
Agrupamiento celular Oxidación -fermentación
Movilidad Fermentación de azúcares
Atmósfera de crecimiento
Gram positivos Gram negativos
- Lisostafina - ß galactosidasa (ONPG)
- Coagulasa - Arginina dehidrolasa
- DNAsa - Lisina y ornitina decarboxilasa
- Fosfatasa - Utilización de citrato
- CAMP - Producción de SH2
- Hidrólisis de esculina - Producción de indol
- Hidrólisis del hipurato - Ureasa
- Triptófano desaminasa (TDA)
- Sensibilidad a novobiocina - Reducción de nitratos
- Sensibilidad a optoquina - Rojo de metilo
- Sensibilidad a bacitracina - Voges Proskauer
- Sensibilidad a SXT - Kligler
- Hidrólisis de la gelatina
- Crecimiento en ClNa -
- Crecimiento en bilis - Pruebas inmunológicas
- Producción de hemólisis

- Pruebas inmunológicas

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Una bacteria es un complejo ser vivo con un sistema de estructuras y moléculas intracelulares en parte
similar al nuestro. La presencia de ciertos enzimas hace que las bacterias puedan actuar sobre algunos substratos y
transformarlos; la ausencia de un enzima determinado impedirá esa transformación o al menos la retardará, si el
proceso puede desarrollarse siguiendo otra vía. La presencia de determinadas moléculas, ya provengan de la propia
estructura bacteriana, ya sean subproductos de su metabolismo intermediario, puede ponerse de manifiesto
mediante una serie de reacciones químicas adecuadas.
Casi todos los miembros de una misma especie bacteriana deben poseer un sistema metabólico similar, por lo
que las enzimas y metabolitos presentes en la bacteria, no diferirán mucho entre sí.
La dificultad en la identificación de una especie bacteriana estriba en que los enzimas o moléculas
responsables de determinados procesos metabólicos no siempre se expresan fenotípicamente.
Si todos los miembros de una misma especie reaccionaran idénticamente ante determinados substratos y
poseyeran siempre las mismas rutas metabólicas, el problema de la identificación sería mínimo.
El problema reside en que no siempre pueden ponerse de manifiesto las mismas transformaciones
enzimáticas o la presencia de determinados metabolitos. Esto hace que tengamos que utilizar simultáneamente una
gran diversidad de pruebas (pruebas bioquímicas) y comparar los resultados obtenidos con aquellas especies que
presentan una mayor coincidencia.
Las pruebas bioquímicas, unidas a otras características de identificación, hacen fiables casi en un 100% los
procedimientos rutinarios de identificación bacteriana.
Determinadas pruebas son específicas de género o de especie en un 99,99%, pero aún queda un 0,01% que
podría llevar al traste con nuestro proceso de identificación si lo hiciésemos de forma dicotómica.
La elección de una prueba o de una batería de pruebas debe hacerse en función de
- Muestra estudiada
- Especies bacterianas que se pretenden identificar
- Factores económicos
- Experiencia en esas pruebas
En ningún caso, el procedimiento de identificación puede darnos una certeza absoluta sobre las
conclusiones obtenidas. Unicamente nos indicará cuál es la especie a la que el microorganismo identificado tiene
mayor probabilidad de pertenecer.
Para que la cepa aislada del paciente no experimente un gran número de transformaciones o mutaciones, que
podrían equivocarnos al mostrar falsas reacciones, es imprescindible tener en cuenta lo siguiente:
- Conservar la muestra en las condiciones establecidas si no va a ser inmediatamente procesada
- No diluir la muestra en medio líquido
- Realizar el menor número posible de resiembras
- Procurar realizar la identificación a partir de un cultivo puro
- Evitar medios demasiado selectivos

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Clasificación de las pruebas de identificación

Las pruebas para realizar una identificación bacteriana deben partir de un cultivo puro donde las colonias estén
perfectamente aisladas.
En función del tiempo utilizado en la realización de la prueba podemos diferenciarlas en

Pruebas inmediatas (desde segundos a algunos minutos)

Dentro de este grupo tenemos la catalasa y la oxidasa. También pueden incluirse todas las pruebas
inmunológicas de detección de antígenos bacterianos por reacciones de aglutinación o precipitación.

Pruebas intermedias (menos de 6 horas)

Lisostafina y coagulasa, por ejemplo.
Hoy día, con la utilización de sustratos cromogénicos de conversión rápida, la mayoría de las pruebas
bioquímicas pueden leerse en cuatro horas aproximadamente.

Pruebas lentas (de 18 a 48 horas)

A este grupo pertenecen la mayoría de las pruebas que detectan componentes metabólicos o aquellas que
determinan la sensibilidad de un microorganismo a una sustancia dada.

En función del tipo de prueba o de su fundamento, las pruebas de identificación pueden dividirse en:

Pruebas bioquímicas

Pruebas inmunológicas

Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos

Pruebas de tolerancia a condiciones especiales

Hoy día se han desarrollado multitud de galerías multipruebas que permiten su lectura en un intervalo de tiempo
muy corto, entre dos y cuatro horas, de manera que la identificación puede realizarse en la misma jornada laboral.

Las pruebas de identificación bioquímica pueden clasificarse en función de la parte del metabolismo que están
poniendo de manifiesto. Los aspectos metabólicos que pueden estudiarse son: (ver página siguiente)

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Metabolismo respiratorio:
Catalasa
Citocromo-oxidasa
Mecanismo de producción de energía:
Oxidación-Fermentación
Reducción de nitratos a nitritos
Rojo de metilo
Voges Proskauer
Metabolismo hidrocarbonado
Fermentación de hidratos de carbono
Utilización del citrato
Beta galactosidasa (ONPG)
Metabolismo proteico:
Hidrólisis de la gelatina
Hidrólisis de la urea por ureasa
Producción de indol
Producción de ácido sulfhídrico
Fenilalanina desaminasa (TDA)
Prueba de las decarboxilasas
LDC
ODC
ADH
Detección de exoenzimas:
Cogulasa
Fosfatasa
Desoxirribonucleasa

Las pruebas inmunológicas utilizan las reacciones de aglutinación para poner en evidencia antígenos
bacterianos. Las más utilizadas son pruebas de aglutinación para detección de:
Staphylococcus aureus
Estreptococos beta hemolíticos
Streptococcus pneumoniae
Serotipos de Salmonella
Serotipos de E. coli
Haemophilus influenzae
Neisseria meningitidis

Por último, las pruebas de sensibilidad utilizan una característica de los microorganismos frente a una
sustancia química o antimicrobiano que consiste en la sensibilidad o resistencia constante frente a dicha sustancia, lo
cual nos puede permitir confirmar o descartar la presencia del microorganismo. Las pruebas de susceptibilidad más
utilizadas son:
- Sensibilidad a Novobiocina
- Sensibilidad a Optoquina
- Sensibilidad a Bacitracina
- Sensibilidad a Metronidazol y Sulfatiazol

Dentro de este grupo podríamos incluir las pruebas de crecimiento bacteriano en condiciones especiales
(inhibidoras para algunos microorganismos). Entre las más importantes tenemos:
- Crecimiento en ClNa al 6,5%
- Crecimiento (solubilidad) en bilis
- Crecimiento a temperatura de 10º C

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Sistemas de identificación multipruebas (galerías)

Las características metabólicas de un microorganismo solo buscan poner de manifiesto la existencia de

enzimas bacterianas que son capaces de metabolizar un sustrato específico. Tanto la disminución del sustrato
consumido como la formación del producto resultante de la reacción, pueden ser objetivados mediante la utilización
de un sistema visualizador que nos permita reconocer fácilmente si la reacción ha tenido lugar o no.
Como ejemplo podemos poner la utilización de un medio diferencial que contenga lactosa y un indicador de
pH. Los microorganismos que fermenten la lactosa darán como resultado final unos productos ácidos que harán que
el pH del medio disminuya y, por lo tanto, que el indicador vire hacia el color correspondiente al pH ácido; en caso
contrario, el pH del medio no cambiará y el indicador tampoco variará o, en el peor de los casos, virará hacia el
color correspondiente al lado básico.
Sin embargo, una determinada característica no es exhibida siempre por todos los miembros de una especie
bacteriana. La frecuencia con que una especie bacteriana muestra una determinada característica metabólica, puede
variar desde el 0% hasta el 100%; esto hace difícil la elección de pruebas para poder distinguir especies, que deben
escogerse entre aquellas que tengan mayor poder diferenciador.
Pongamos otro ejemplo: la prueba de la oxidasa es una prueba que Escherichia coli y Proteus mirabilis
darán negativa en el 100% de los casos. Evidentemente ésta no es un prueba que nos permita diferenciar entre
ambas especies. Sin embargo, la prueba de la TDA es positiva en P. mirabilis en un 100% de casos y negativa en
E. coli siempre: ésta sí es una prueba que nos serviría para diferenciar entre las dos especies.
Una prueba cualquiera, X, que dos especies diferentes dieran positiva en un 50% de los casos, tampoco
serviría para diferenciar las cepas, pues la probabilidad de que se tratase de una u otra especie estaría repartida al
50%.
Hasta hace relativamente pocos años, la identificación de bacterias en el laboratorio de microbiología se hacía
basándose en unos esquemas arborescentes, dicotómicos, que atendiendo a los resultados de una prueba seguían
bifurcándose con otras pruebas, limitando cada vez más las posibilidades, hasta que al final de una de las ramas se
conseguía una identificación presuntiva.
Estas pruebas eran elegidas de manera que tuvieran un poder discriminador muy alto, en general mayor del
95%, aunque tanto mejores serían cuanto más se acercasen al 100%. Una prueba que discriminase solo el 80% de
las bacterias estaría cometiendo un error de identificación en una de cada 5 identificaciones. El inconveniente de
este procedimiento era que no se podía realizar la siguiente prueba hasta conocer el resultado de la anterior. Si
tenemos en cuenta que, en general, cada prueba tarda en realizarse 18-24 horas, a veces era necesario esperar
varios días hasta concluir el proceso de identificación.
Estos esquemas de identificación estaban rígidamente estructurados y tenían poca flexibilidad ante cualquier
prueba con menor poder de discriminación. Una prueba incorrecta, o una alteración o excepción en el metabolismo
de una especie bacteriana, conducía por un camino equivocado y terminaba en una identificación incorrecta.
El siguiente paso fue la realización simultánea de varias pruebas, para así, aumentar la velocidad de
procesamiento. Es célebre, por su importancia histórica, la batería de pruebas denominada IMVyC, que realizaba a
la vez las pruebas de Indol, rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato.
Finalmente aparecieron las galerías multipruebas, un sistema de celdillas aisladas con sustrato liofilizado que
se inoculaban individualmente y que permitían realizar simultáneamente entre 10 y 25 pruebas bioquímicas. El
procedimiento dicotómico que históricamente había servido para avanzar por el camino correcto de la
identificación, ya solo podía utilizarse en contados casos.
Con el advenimiento de la informática y la posibilidad de manejar muchos datos a velocidades impensables
para el ser humano, fue posible codificar el enorme número de pruebas que se hacían mediante la asignación de un
código numérico a cada microorganismo en función de los resultados obtenidos, ante la realización de determinadas
pruebas. API fue una de las primeras denominaciones comerciales de este sistema que había logrado disminuir los
costes y el tiempo para llegar a una identificación aceptable.
Así, cada microorganismo era sometido a una batería de pruebas cuyos resultados se expresaban de forma
numérica. Cada especie estaría definida por un código numérico, resultado de la codificación de las reacciones a
que hubiera sido sometido. Ante un microorganismo problema, no tendríamos más que buscar el código numérico y
comprobar a qué bacteria pertenecería.

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El procedimiento de codificación más sencillo hubiese sido asignar un 1 a las pruebas positivas y un 0 a las
negativas. El resultado hubiese sido que los códigos numéricos deberían tener entre 10 y 25 dígitos, dependiendo
del número de pruebas, con el consiguiente engorro en el manejo de un número con tantos dígitos. Para evitar este
excesivo número de dígitos se utilizó un procedimiento ingenioso: agrupar los resultados de las pruebas de tres en
tres, de manera que el resultado de cada trío de pruebas quedase reducido a un dígito.
Supongamos tres pruebas cualesquiera: las combinaciones posibles de positividad y negatividad de todas ellas
entre sí quedan reducidas a 8 casos. Veámoslo:

Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3

+ + +
+ + -
+ - +
+ - -
- + +
- + -
- - +
- - -

A cada combinación de resultados podríamos asignarle un dígito de 0 a 7; así el 0 podría indicar las tres
pruebas negativas, el 1 solo la primera prueba positiva, etc.
Para codificar el dígito de un trío de pruebas se establece el siguiente sistema:
- Si una prueba cualquier es negativa se le asigna un valor de 0 (cero) a la prueba.
- Si la primera prueba es positiva se asigna un valor de 1.
- Si la segunda prueba es positiva se asigna un valor de 2.
- Si la tercera prueba es positiva se asigna un valor de 4.

El código numérico se obtiene sumando los valores de las tres pruebas. Los límites inferior y superior del
código son 0 y 7 respectivamente. La codificación quedaría de la siguiente manera:

Prueba 1 Prueba 2 Prueba 3

positivo = 1 positivo = 2 positivo = 4 Código numérico
negativo = 0 negativo = 0 negativo = 0
- 0 - 0 - 0 0
+ 1 - 0 - 0 1
- 0 + 2 - 0 2
+ 1 + 2 - 0 3
- 0 - 0 + 4 4
+ 1 - 0 + 4 5
- 0 + 2 + 4 6
+ 1 + 2 + 4 7

Para cada trío de resultados se adjudicaría un dígito. En caso de que el número de pruebas no fuese múltiplo
de tres, se efectuaría el agrupamiento de las sobrantes (dos o una prueba), asignándose los dígitos de 0 a 3 en el
primer caso y de 0 a 1 en el segundo.

Por ejemplo, un batería de 10 pruebas con unos resultados establecidos aleatoriamente por nosotros, podría
tener el siguiente código numérico:

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Resultado Valor Dígito

Prueba 1 + 1
Prueba 2 - 0 5
Prueba 3 + 4
Prueba 4 - 0
Prueba 5 + 2 6
Prueba 6 + 4
Prueba 7 + 1
Prueba 8 + 2 3
Prueba 9 - 0
Prueba 10 + 1 1

El código numérico de esta combinación de resultados sería 5631 y ese sería el código que deberíamos
buscar en nuestro libro de códigos para conocer la identificación del microorganismo. Si la batería fuese de 20
pruebas, el código numérico tendría 7 dígitos, y el último de ellos correspondería a la suma de valores de dos
pruebas. La ventaja de este sistema de identificación es que permite calcular la probabilidad de que una bacteria
muestre un perfil de pruebas bioquímicas concreto, expresándolo en forma de porcentaje sobre el total de bacterias
investigadas.

Fundamento del sistema de codificación numérica en la identificación de microorganismos

La identificación de los microorganismos basándose en los sistemas dicotómicos tradicionales que valoraban
las pruebas bioquímicas una a una ha dejado de ser válida. La razón es que en muchas ocasiones existen especies
atípicas que nos desvían en el árbol de identificación sin llevarnos a ninguna caracterización concreta.
Utilizando la teoría de probabilidades y aprovechando las capacidades actuales de los ordenadores (rapidez y
memoria), hemos sido capaces de valorar no una sólo, sino varias decenas de características simultáneamente para
poder identificar correctamente un microorganismo.
El primer paso seria estudiar los porcentajes de positividad de una bacteria para una determinada prueba o
característica. Para ello habría que valorar un número de cepas de cada especie relativamente alto ( más de 300).
Una vez hecho esto podríamos encontrarnos, por ejemplo, con la siguiente tabla que nos permitiría diferenciar entre
estos microorganismos utilizando tres pruebas

Indol Citrato Voges Proskauer

E. coli 96% 6% 1%
K. pneumoniae 1% 98% 92%
P vulgaris 85% 30% 1%

A la vista de estos resultados, podríamos predecir que si estudiásemos cualquier cepa de alguna de estas
especies, los resultados podrían ser:

Indol Citrato Voges Proskauer

E. coli + - -
K. pneumoniae - + +
P vulgaris + V- -

+ : positivo; - : negativo ; V- : Variable negativo

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Si nosotros realizásemos estas tres pruebas a un microorganismo que queremos identificar y obtenemos los
siguientes resultados:
Indol +, Citrato +, Voges Proskauer - ,

está claro que esta combinación no se ajusta a ninguno de los patrones normales, y en principio, podríamos
pensar que pertenece a cualquier especie de las tres citadas que presentase una alteración en su metabolismo.
Sin embargo, con la taxonomía numérica, podríamos calcular la probabilidad de que esa combinación
correspondiese a cada uno de los gérmenes estudiados. Esto se haría así:

Para E. coli, la probabilidad sería:

Probabilidad de ser Indol positivo: 0,96
Probabilidad de ser Citrato positivo: 0,06
Probabilidad de ser Voges Proskauer negativo: (1- 0,01) 0,99

La probabilidad total será el producto de las probabilidades:

p1 = 0,96 * 0,06 * 0,99 p1 = 0,57024

Haciendo lo mismo con los otros dos microorganismos encontraríamos:

Para K. pneumoniae p2 = 0,01 * 0,98 * (1 - 0,92) : p2 = 0,000784

Para P. vulgaris p3 = 0,85 * 0,30 * (1 - 0,01) ; p3 = 0,25245

Sumadas las tres probabilidades tendíamos:

pt = 0,57024 + 0,000784 + 0,25245 pt = 0,823474

Si la probabilidad total es la sumada, la probabilidad relativa de que esa combinación de resultados corresponda a
cada uno de los tres microorganismos será:

0,57024 * 100 / 0823474 = 69,24% para E. coli

0,000784 * 100 / 0823474 = 0,09% para K. pneumoniae
0,25245 * 100 / 0823474 = 30,66% para P. vulgaris

Por todo ello podríamos concluir que, a la vista de estos resultados, la probabilidad mayor de obtener una correcta
identificación con estas tres pruebas y basándonos en los resultados obtenidos previamente, sería para Escherichia
coli a pesar de que el citrato no sea una prueba que esta especie dé positiva con frecuencia.

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