Professional Documents
Culture Documents
CONTENIDOS
1. Concepto
2. Tipos de tinciones:
2.1. Tinciones vitales y no vitales
2.2. tinciones habituales y especiales
1. CONCEPTO
Las tinciones hematológicas son un conjunto de procesos que conducen
a la coloración de las estructuras que componen las células sanguíneas.
Esto tiene por objeto el aumentar el contraste entre esas estructuras y el
medio que las rodea, y permite por tanto que las células sean
visualizadas microscópicamente con mayor facilidad.
2. TIPOS DE TINCIONES
Las tinciones hematológicas pueden clasificarse según distintos criterios:
• Atendiendo al nivel de vitalidad de las células que se pretenden
colorear, se dividen en tinciones vitales y no vitales.
• Atendiendo a su frecuencia de realización en el diagnostico
hematológico cotidiano, se dividen en tinciones habituales y
especiales.
2.1. Tinciones vitales y no vitales
Las tinciones vitales y supravitales son aquellas que se practican
sobre células que están vivas.
Son colorantes vitales, por ejemplo, las sales de tetrazolio y el verde
Jano.
Las tinciones no vitales se realizan sobre células muertas.
La coloración de células muertas requiere un proceso previo de
fijación, que tiene por objeto el conservar inalterada la estructura de
las células y el adherir a éstas firmemente a la superficie del porta.
La fijación puede realizarse mediante calor, aunque habitualmente se
realiza con etanol o metanol.
TINCIÓN DE GIEMSA
INTRODUCCIÓN
Las tinciones hematológicas tipo Romanowsky utilizan azul de metileno y sus
productos de oxidación (azur A, Azur B y azur C) como colorantes básicos,
combinándolos con la eosína como colorante ácido.
METÓDICA
Es un extracto de las técnicas de tinción hematológicas de la casa Panreac.
Fundamento
Utilizamos como colorante la mezcla de azul de metileno y eosina propuesta por
Giemsa.
Material necesario
• Microscopio óptico
• Portas bien limpios
• Cristalizador
• Puentes de tinción
• Pipetas Pasteur con chupete
• Frascos lavadores
• Tubos de ensayo
Reactivos
• Colorantes en solución según Giemsa de Panreac
• Solución tampón pH 7,2 de Panreac
• Metanol
• Aceite de inmersión.
Muestra
Sangre capilar fresca o vanosa anticoagulada. El anticoagulante de elección es
la heparina o el EDTA, ya que el citrato sódico y el oxalato potásico pueden dar
preparaciones defectuosas.
Técnica
Preparamos una frotis sanguíneo según la técnica descrita e la práctica n° VII.
Colocamos el frotis sobre el puente de tinción en el cristalizador en posición
horizontal.
Cubrimos con metanol durante 3 minutos. Escurrimos y dejamos secar al aire.
Con esto procedemos a fijar el frotis.
Diluimos en el tubo de ensayo 0,2 ml de azur-eosina-azul de metileno según
Giemsa con 2 ml de solución tampón pH 7,2. es importante realizar esta dilución
en el momento de la tinción, ya que el colorante precipita y no es válido para
otro día.
Mezclamos suavemente en el tubo y con una pipeta Pasteur cubrimos el frontis
dejando actuar durante 25 minutos.
Escurrimos y lavamos con agua del grifo. Posteriormente lavamos con tampón
pH 7,2 hasta eliminar los restos del colorante. Dejamos escurrir y secamos en
posición vertical (véase figura 4.VIII.1)
Lectura de resultados
Una vez seca la tinción, echamos una gota de aceite de inmersión y
examinamos al microscopio óptico con el objetivo de 100x.
Los eritrocitos se tiñen de color rosa asalmonado y las plaquetas de color
violeta.
Los neutrófilos presentan el núcleo de color azul violeta, el citoplasma rosa y la
granulación de un color violeta rojizo.
Los eosinófilos se observan con el núcleo azul violeta, el citoplasma azul y los
gránulos de color rojo anaranjado.
Los basófilos presentan un núcleo de color púrpura y granulación de color azul
oscuro.
Los monolitos y linfocitos se observan con un núcleo color violeta y el
citoplasma azul, un poco más claro en el monolito.
1° ¿Cuáles son los anticoagulantes más adecuados para esta técnica?
2° ¿Con qué reactivo fijamos el frotis?
3° ¿Cuánto tiempo debe actuar el colorante en el frontis?
Resultados obtenidos
Dibuje las células observadas con colores semejantes a los que ha visto en el
microscopio.
TINCIÓN DE WRIGHT
METÓDICA
Extracto de las técnicas de tinción hematológicas de las casa Panreac.
Fundamento
El colorante utilizado es una solución de eosina y una mezcla de azul de
metileno (del 50 al 75%) y azur B (del 10ª 25%) junto con otros derivados del
alcohol metílico.
Sólo si se van a guardar las extensiones sin teñir de un día para otro
precederemos a su fijación para evitar el deterioro del frotis.
Material necesario
• Microscopio óptico
• Cristalizador
• Puentes de tinción
• Pipetas Pasteur con chupete.
• Frasco lavador
• Guantes
• Tubos de ensayo.
Reactivos
• Solución de eosina-azul de metileno según Wright.
• Solución tampón pH 7,2
• Aceite de inmersión.
Muestra
Sangre capilar fresca o venosa anticoagulada. Los anticoagulantes más
adecuados son la heparina y el EDTA.
Técnica
Realizar un frotis sanguíneo muy fino. Dejar secar al aire.
Sobre la extensión colocada horizontalmente en el puente de tinción verter 1ml
de eosina – azul de metileno. Dejamos actuar un minuto y lavamos con solución
tampón pH 7,2. Dejamos escurrir y se4car en posición vertical.
Resultados obtenidos
Dibuje las células observadas coloreando adecuadamente las características
morfológicas de cada una.
METÓDICA
Extracto de la técnica Panóptico rápido de la casa QCA
Fundamento
Este método de tinción diferencial es un sistema que aúna la policromía y la
calidad que proporcionan los métodos clásicos (Giemsa y Wright) con una gran
rapidez de ejecución (15 segundos solamente).
Frente a las técnicas de tinción descritas anteriormente, donde el colorante se
extendía sobre el frotis, ésta presenta la peculiaridad de ser un método de
inmersión donde el frotis se sumerge en la solución colorante durante un tiempo
determinado.
Material necesario
• Cubetas de Wertheim o similares
• Cestillo para portas
• Frasco lavador.
Reactivos
• Solución n° 1: Solución alcohólica de triarilmetano.
• Solución n° 2: Solución tamponada de xanteno
• Solución n° 3: Solución tamponada de tiamina.
• Agua destilada
Muestra
Frotis sanguíneo preparado recientemente que se ha dejado secar al aire.
Técnica
En tres cubetas de Wertheim o similares se disponen los colorantes solución n°
1, n°2 y n°3 (véase figura 4.X.1).
Lectura de resultados
Depositamos una gota de aceite de inmersión sobre el frotis y observamos con
el objetivo de 100 x.
Las coloraciones obtenidas en las células sanguíneas son similares a las de la
tinción de Wright y Giemsa. Sin embargo, podemos variar la intensidad de la
tinción modificando el número de inmersiones en los colorantes n° 2 y n° 3,
según se desee destacar las tonalidades rosas o las azules.
RECUENTOS CELULARES
CONTENIDOS
1. Concepto
2. Recuentos en cámara
2.1. Material necesario
2.2. reactivos
2.3. muestra
2.4. limpieza del material
1. CONCEPTO
Los recuentos celulares son una serie de procedimientos que tienen por
objeto determinar el número de cada uno de los tipos celulares que están
comprendidos en una unidad de volumen de sangre (generalmente, en 1
mm3).
Todos los recuentos celulares constan de 3 fases:
1° Dilución de la sangre.
2° Cómputo del número de células.
3° Cálculo matemático del número de células presentes en 1 mm3 de
sangre.
Los recuentos celulares pueden realizarse mediante métodos manuales
(recuentos en cámaras) o automáticos (recuentos en contadores
electrónicos).
2. RECUENTOS DE CÁMARA
2.1. Material necesario
Cámara de recuento
También se llama cámara cuentaglóbulos o hemocitómetro.
Consiste en una placa gruesa de cristal con forma de porta, cuya
porción central está divida en 3 bandas perpendiculares al eje
longitudinal de la cámara. De ellas, las dos laterales se hallan
sobreelevadas 0,1 mm con respecto a la central, y en una última
hay grabado un retículo cuadrangular.
La banda central puede estar, a su vez, subdividida en 2
semibandas idénticas y separadas por un surco paralelo el eje
longitudinal de la banda. En cada una de estas dos semibandas
hay grabado un retículo idéntico (véase figura 5.1).
Cubreobjetos
Preferiblemente, debe ser algo más grueso que los normalmente utilizados.
Se coloca de forma que apoye sobre las dos bandas laterales de la porción
central de la cámara. De esta manera queda delimitado un espacio entre la
banda central y el cubre, en el que se deposita la muestra y cuyo espesor es de
0,1 mm.
Algunas cámaras también constan de dos pinzas especiales que parten, cada
una, de una de las porciones laterales de la cámara y que tienen por misión la
de asegurar la fijación del cubre a la misma.
Cuando está bien montado sobre la cámara, se observan unas irisaciones de
colores entre las dos láminas de vidrio llamadas anillos de Newton.
El bulbo contiene una perla de vidrio para facilitar la mezcla de la sangre con el
liquido de dilución, y acaba en un tubo capilar corto. La perla de vidrio es roja en
las pipetas empleadas para el recuento de hematíes, y blanca en las usadas
para el recuento de leucocitos. Además, en as pipetas para hematíes la
capacidad del bulbo es 100 veces superior a la del tubo capilar largo, por lo que
en el tubo capilar corto hay una marca de 101, y en las pipetas para leucocitos
la capacidad del bulbo es 10 veces mayor que la del tubo capilar largo, por lo
que en el tubo capilar corto hay una marca de 11.
Goma de aspiración
Es un tubo de goma que permite la aspiración de la muestra y del líquido de
dilución.
Es uno de sus extremos tiene encajada una boquilla, y por el otro se ensambla
al tubo capilar corto de cualquiera de las pipetas de Thoma (véase figura 5.3).
2.3. Muestra
Sangre capilar o venosa anticoagulada con EDTA. Esta sangre se
utilizará convenientemente diluida.
Transductor
Transforma las señales, procedentes del dispositivo de medida, en
impulsos eléctricos.
Suele ser un fotomultiplicador
Discriminador
Diferencia los impulsos eléctricos generados por cada uno de los
tipos de células sanguíneas.
Lector
Recoge los datos obtenidos, los procesa y los proyecta en una
pantalla.
Registrador
Imprime en papel los resultados conseguidos.
3.2. Métodos electrónicos de recuento celular
3.2.1. Método de la resistencia o de la impedancia
Es el utilizado por los primeros contadores, ya que fue
descubierto por Coulter en 1956.
Se basa en lo siguiente:
• Mientras que las células sanguíneas conducen mal la
electricidad, el líquido diluyente es un buen conductor de la
electricidad (posee una gran conductividad eléctrica).
• El dispositivo de medida consiste en un pequeño
orificio, a través del cual se hace pasar la sangre diluida.
Tiene colocados un electrodo a su entrada y otro a su
salida.
• También se hace pasar una corriente eléctrica
constante a través de ese mismo orificio.
• Si el orificio es atravesado solamente por líquido
diluyente, la resistencia eléctrica medida por los electrodos
es mínima y constante, pero cuando el orificio es
atravesado por una célula sanguínea, se produce un
aumento de la resistencia eléctrica y un cambio de potencial
entre los electrodos.
• El número de señales eléctricas generales indica el
número de células presentes en la sangre y la amplitud de
estas señales es directamente proporcional al volumen
celular (véase figura 5.4).
Figura 5.4. Esquema de la dispersión de la luz o de la difracción
Figura 5.5. Esquema del dispositivo de medida basado en el método del campo oscuro
Método del rayo láser
El dispositivo de media consta de un detector situado detrás de un capilar
por el que circula un flujo continuo de sangre diluida; es pues un citómetro de
flujo. Un rayo láser* atraviesa el capilar y se dirige hacia el detector.
Cuando no pasan células a lo largo del capilar, el rayo láser incide sobre
el detector, pero si una célula pasa a través del capilar, el rayo láser es
interceptado por ella y deja de incidir sobre el detector.
Figura 5.6. Esquema del dispositivo de medida basado en el método del rayo láser.
METÓDICA
Material necesario
• Un microscopio
• Una cámara de recuento con un retículo de Neubauer mejorado
Procedimiento
1. Observar con el microscopio el retículo de la cámara de recuento
• Primero, con el objetivo de pequeño aumento (4 x)
• Luego, con el objetivo de mediano aumento (10 x)
• Después, con el objetivo de gran aumento (40 x)