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Técnicas de ADN recombinante - genetica medica

Técnicas de ADN recombinante - genetica medica

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Published by: Grecia Lizbeth Lazaro Baca on Sep 10, 2010
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Técnicas de ADN recombinante: la manipulación genética
 A partir de los años 70 se desarrollaron las herramientas de la biologíamolecular o la ingenieríagenética o lo que se ha llamado técnicas del ADN recombinante. Y esto ocurrió,en comparación con lo que fue el resto de la historia de la ciencia, de formamuy rápida entre los años 70 y 80.En estas primeras etapas se estaba trabajando sobre la posibilidad demanipular los genes, es decir:a) Tenerlos aislados.b) Amplificarlos, en el sentido de tener muchas copias de la mismasecuencia.c) Conocer la secuencia exacta, es decir el orden de las bases de esosgenesd) Una vez aislado poderlo expresar fuera de su localización natural, lo cualtendrá una enormidad de otras aplicaciones.Toda esta manipulación genética está simplemente basada en unas pocaspropiedades del ADN que han permitido avanzar muchísimo en las técnicas.Recordemos el hecho de que el ADN sea una doble cadena, y las cadenassean complementarias y que la complementariedad de bases sea un requisitosuficiente para que dos cadenas que estaban en simple hebra se encuentren yse vuelvan a reconstituir es la base de la mayor parte de la manipulación. Dossimples cadenas de ADN reconstituyen una doble cadena unida por puentes dehidrógeno basado simplemente en la complementariedad de bases, en elhecho de que si en una de las hebras hay una serie de nucleótidos con lasbases GCAT cualquier otra hebra que tenga CGTA, es decir complementaria,va a poder unirse y reconstituir una doble cadena en determinadas condicionesde temperatura y de Ph dadas. Esta es una de las características básicas. Aesto se agrega el hecho de que el ADN tiene la información en el orden de lasbases y que el código por el cual esa información es trascripta y traducida auna proteína es prácticamente universal: ese tramo de ADN si es que codificapara algo puede producir esa proteína en diversas condiciones.
Las enzimas de restricción
Uno de los avances más importante en los inicios de la biología molecular, fueel descubrimiento de las endonucleasas de restricción, es decir de enzimas quepueden cortar el ADN y que tienen la ventaja de que lo cortan en sitiosconcretos. Fueron descubiertas en bacterias, y son enzimas que estasbacterias usan para destruir ADN que ingresa a ellas, por ejemplo ADN de virusbacteriófagos. Con las enzimas, la bacteria puede degradar este ADN foráneosin degradar su propio ADN. Varias de ellas fueron identificadas en la décadadel 70 y siguieron descubriéndose otras posteriormente, aisladas de diferentescepas bacterianas. La ventaja de estas enzimas es que reconocen un sitio paracortar, pueden ser un diseño de4, 6, 8 bases, pero tienen que estar organizadas con una secuencia exacta yno otra. Por ejemplo, la enzima que se llama EcoR1 (porque se aisló de labacteria
Escherichia coli 
, que reside normalmente en el intestino), solo corta si
 
encuentra la secuencia GAATTC. Si hay una base que está cambiada ya nocorta. Estas enzimas de restricción, entonces permiten cortar el ADN en sitiosespecíficos. Algunas de ellas cortan dejando extremos cohesivos que sepueden pegar nada más que por complementariedad de bases. Esto quieredecir que un extremo que generó una enzima y otro que generó la mismaenzima aunque provengan de moléculas de ADN diferentes, se pueden unir ygenerar lo que se llamó inicialmente un ADN recombinante. Este hito de losaños 70 de poder recombinar, es decir hacer construcciones genéticas, hacer ingeniería en genética fue la base de una enormidad de otros avances.En 1972 justamente se genera el primer ADN recombinante combinando el ADN de un plásmido, con un tramo de ADN de anfibio.
La clonación
Recordemos que los plásmidos son moléculas de ADN circulares, pequeñas,que se encuentran en las bacterias por fuera del ADN cromosómico. Dado quese adaptan a albergar otro pedazo de ADN, se abre la posibilidad de poner ungen determinado en un plásmido circular, generando un ADN recombinante. Enestas circunstancias el plásmido está funcionando como un ³vector´: es capazde llevar el trozo de ADN (que denominamos inserto) mantenerlo, tenerloaislado, lo cual era uno de los propósitos de la manipulación genética.El plásmido, que naturalmente está en las bacterias, puede volver a lasbacterias y crecer con ellas. Se pueden transformar bacterias con plásmidosque llevan inserto. Una vez dentro de la bacteria, el plásmido se replica conella. Así se consigue que el trozo de ADN además de estar aislado, seaamplificado y se obtienen rápidamente muchas copias idénticas. Decimos queel trozo de ADN fue clonado. Teniendo una cantidad mayor de ADN del tramode interés éste puede ser secuenciado, cortado con enzimas de restricción uotras manipulaciones.
Los vectores
Con el paso del tiempo surgió la necesidad de que los vectores albergaranpedazos más grandes.El tamaño medio del inserto de un plásmido es de 10000 bases. El objetivo declonar genes eucariotas completos o de secuenciar un genoma exige poder incluir trozos de mayor tamaño. De esta manera, uno de los grandes polos dedesarrollo que surgieron fue loa obtención de mejores vectores, vectores quealbergaran pedazos grandes en lo posible genes enteros. El primer paso fuepasar a utilizar como vectores los propios bacteriófagos (virus que infectanbacterias); y después se desarrollaron otros, que fueron construcciones,combinaciones, de trozos de plásmido, de bacteriófago, de cromosoma delevadura, etc. Siempre buscando vectores que llevaran mayores insertos y quefueran eficientes. Así surgen muchos, como por ejemplo los BACs (bacterialartificial chromosome) en los que están contenidos actualmente los trozos de ADN del genoma humano. Así se pudo por ejemplo clonar un gen que tienealrededor de un millón de pares de bases que es el gen de la distrofiamuscular, el gen se pudo tener entero para poderlo estudiar y eventualmenteexpresar.

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