PROVA DE SORONEUTRALIZAÇÃO EM MICROPLACAS

Material:
• Placa para cultivo celular, estéril ( 96 orifícios)
• Meio EAGLE-MEM sem SFB (soro fetal bovino)
• Meio EAGLE-MEM com 5% de SFB (MEM 5% SFB)
• Calhas para meio e células
• Pipetador multicanal
• Pipetador monocanal
• Soros a testar
• Soros controle
• Ampola de vírus com título conhecido
• Células tripsinizadas

Método:
1. No fluxo laminar, colocar 50 ul de meio (*) - ou outro volume apropriado - em
cada um dos orifícios da placa.

2. Diretamente na placa, preparar diluições do soro a testar (**). Nesse caso,

utilizaremos diluições ½, ¼, etc. Logo, sobre 50 ul de meio adicionamos 50 ul
de soro a testar, em quadruplicata, nos primeiros quatro orifícios da linha “A” da
placa.

3. Com a pipeta ajustada para 50 ul, misturar várias vezes e transferir 50 ml do

soro diluído ½ para a linha “B”. Misturar novamente e transferir 50 ul para a
linha “C” e assim por diante até a diluição. Reserve 16 orifícios em uma placa
para as diluições de controle do vírus.

4. Preparar um volume apropriado da diluição do vírus contendo 100 DICC50

por orifício, bem como diluições controle contendo 10, 1 e 0,1 DICC50.

5. Adicionar diluições controle do vírus, quatro orifícios por diluição, nos

orifícios reservados a esse fim.

6. Adicionar 50 ul da diluição do vírus contendo 100 DICC50 por orifício

contendo soro em teste.

7. Incubar a placa por 1 hora a 37 oC (este período pode variar de 1 hora a 24

horas).

8. Faltando cerca de 15 minutos para o final do período de incubação, preparar

uma suspensão de células contendo aproximadamente 1.000.000 de células/ml
(ou seja, 50 000 células/50 ul).

9. Ao final do período de incubação, colocar 50 ml da suspensão de células por

orifício.
Atenção: Não agite nem bata nas placas após a adição das células! Se
agitadas, células em suspensão tenderão a se acumular nas bordas dos
orifícios!
10. Manter a placa a 37°C durante 48 a 120 horas, dep endendo do vírus em
teste, observando o desenvolvimento do efeito citopatogênico (ECP) ao
microscópio óptico. Para vírus que não produzem ECP, fixar a placa de acordo
conforme o método a ser usado para a detecção do vírus (imunoperoxidase,
imunofluorescência, etc.) ao final do período estabelecido.

(*) O meio para as diluições do vírus usualmente não contém soro fetal bovino
(SFB). As diluições podem ser preparadas em meio com SFB, desde que o
mesmo tenha sido previamente testado para garantir a ausência de anticorpos
ou outros inibidores no próprio SFB.

11. O fator de diluição e a forma de diluição adequada – ou seja, em qual

diluição deve-se começar - tem sido determinada empiricamente, dependendo
do tipo de vírus em teste. Ex: para herpesvírus, ½, ¼, etc.; para pestivírus:
1/10, 1/20, etc; para o vírus da raiva, 1/5, 1/125, etc.).

Observação: A quantidade de vírus é determinada empiricamente. A grande maioria

dos testes emprega 100 DICC50. Em alguns casos, como na SN para raiva, emprega-
se 32 DICC50.