Laporan Praktikum Hari/Tanggal : Senin/29 Maret 2010

Struktur dan Fungsi Subseluler Waktu : 08.00-11.00 WIB

PJP : Ramdan Hidayat, M.Si
Asisten : Akmal
Amelinda Irena
Resti Siti M
Sapto Gontoro

FRAKSINASI SUBSELULER

Kelompok 4

Rizki Ayu Kartini (G84080061)

Arena Yogi Pratiwi (G84080026)
Winahyu Hapsari (G84080021)

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2010
Pendahuluan
Fraksinasi merupakan proses pemisahan suatu larutan menjadi fraksi atau
bagian-bagian tertentu. Pembagian atau pemisahan ini didasarkan pada bobot dari
tiap fraksi, fraksi yang lebih berat akan berada paling dasar sedang fraksi yang
lebih ringan akan berada diatas. Salah satu contoh fraksinasi ialah fraksinasi
subseluler. Fraksinasi subseluler sendiri ialah memisahkan sel menjadi bagian-
bagian, memisahkan organel-organel utama sehingga fungsinya masing-masing
dapat dipelajari. Alat yang biasa digunkan untuk memfraksionasi sel ialah
sentrifugasi, sejenis komidi-putar untuk tabung reaksi yang mampu berputar pada
berbagai kecepatan. Fraksinasi biasanya dilakukan pada suhu rendah, perlakuan
ini berguna untuk mempertahankan struktur dan fungsi dari organel. Prinsipnya
untuk memperoleh organel yang besar maka diperlukan kecepatan sentrifugasi
yang rendah sedangkan apabila untuk memperoleh organel yang kecil, diperlukan
kecepatan sentrifugasi yang besar (Campbell 2002).
Sentrifus adalah suatu alat yang digunakan dalam pemisahan atau
memfraksinasi organel-organel yang ukurnnya berbeda yang dijalankan dengan
rotor. Sentrifugasi dilakukan dengan meletakkan sampel pada suatu gaya yang
memutar sampel pada kecepatan tinggi menyebabkan pengendapan partikel dan
organel sel atau makromolekul pada ukuran dan bobot jenisnya. Sentrifus yang
berulang-ulang dengan laju yang semakin tinggi menghasilkan ekstrak-ekstrak sel
yang terpilah menurut komponen-komponennya. Semakin kecil komponen
subseluler yang harus diendapkan, semakin besar pula gaya sentrifugal yang
dibutuhkan (Rickwood 1984).
Sentrifugasi sendiri diartikan sebagai proses pengendapan organel sel
dengan cara memberikan suatu gaya sentrifugal pada organel sel yang
disentrfugasi. Menurut Kimball (2005), alat sentrifugasi yang biasa disebut
sentrifus, bekerja dengan prinsip pemberian gaya sentrifugal yaitu dengan
memutar bahan dengan kecepatan tertentu dan selang waktu tertentu, sehingga
terjadi pemisahan berdasarkan bobot. Ada 2 macam prinsip sentrifugasi yang
didasarkan atas: 1) massa, ukuran atau panjang partikel dan 2) densitas partikel.
Sentrifugasi zonal merupakan contoh sentrifugasi didasarkan atas massa dan
ukuran partikel. Dalam sentrifugasi ini, partikel berbeda ukuran akan terpisah
pada lapisan-lapisan (zona) yang berbeda. Jenis kedua adalah sentrifugasi
berdasarkan pada keadaan yang setimbang, sentrifugasi keseimbangan gradien-
densitas. Sentrifugasi jenis ini bekerja berdasarkan prinsip partikel dan cairan
yang berada pada level keseimbangan densitas (disebut keadaan isopiknik).
Teknik sentrifugasi keseimbangan gradien-densitas dapat memisahkan molekul-
molekul dengan perbedaan densitas sampai 0,02 g/ml. Misal : DNA dan RNA
yang perbedaan densitasnya dalam larutan cesium klorida (CsCl) berturut-turut
adalah 1,3; 1,6-1,7 dan 1,75-1,8 gr/ml.
Percobaan kali ini menggunakan sentrifugasi perberbedaan kecepatan. Hal
ini dikarenakan metode ini cukup sederhana untuk pemisahan homogenat menjadi
fraksi-fraksi yang berbeda. Metode ini yang melibatkan sentrifugasi homogenat
dengan penambahan kecepatan untuk mendapatkan serangkaian pelet yang
mengandung komponen dari sel, yaitu fraksi inti, mitokondria, mikrosom, dan
lain-lain (Rickwood 1984).

Tujuan percobaan
Praktikum ini bertujuan memahami prinsip fraksinasi subseluler, dapat
menangani hewan uji dan terampil mengisolasi organ dari hewan uji tersebut,
serta dapat melakukan fraksinasi subseluler untuk mengisolasi salah satu organel
subseluler.

Alat dan Bahan

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini, yaitu sentrifus Beckman J2-
21, homogienizer, labu erlenmeyer, gelas ukur, tabung Sorvall, tabung vial, dan
pipet tetes. Kemudian pinset, gunting, pisau bedah.
Bahan-bahan yang digunakan dalam praktikum ini,yaitu sel hati tikus dan
eter. Larutan sukrosa 0.25 M-EDTA, larutan sukrosa 0.34 M-EDTA I m M,
larutan sukrosa 0.25 mM-CaCl2, es batu, dan kain blacu.

Prosedur Percobaan
Praktikum ini diawali dengan pembiusan tikus yang telah disediakan oleh
laboran untuk dibedah dan diambil hatinya. Hati yang sudah didapat dibilas
dengan larutan sukrosa-EDTA 0,25 M sebanyak 3-4 kali hingga larutan tersebut
tidak berwarna. Setelah pembilasan selesai dilanjutkan dengan penimbangan berat
dari organ hati tikus tersebut. Kemudian hati yang telah ditimbang dimasukkan
kembali ke dalam gelas piala yang berisi larutan sukrosa-EDTA untuk dipotong-
potong. Hasil pemotongan hati tersebut di bilas sebanyak 3-4 kali dan dihaluskan
dengan homogenizer dan tambahkan 15 mL sukrosa-EDTA dingin.
Hati yang sudah dihaluskan itu sebagiannya dibagi menjadi tiga bagian dan
dimasukkan dalam vial (tabung plastik berukuran kecil), masing-masing bagian
berisi 2 ml larutan homogenat hati tikus. Sisa larutan homogenate sebanyak 13
mL ditambahakan 0.34 M-EDTA sebanyak 13 mL kemudian ditempatkan dalam
tabung sentrifus untuk disentrifugasi dengan 700 gravitasi selama 10 menit.
Setelah sentrifugasi selesai, supernatant dipindahkan ke tabung untuk isolasi
mitikondria dan pelet yang diperoleh digunakan untuk fraksi inti.
Pada praktikum selanjutnya, pelet fraksi inti disuspensi kembali dalam
tabung dengan 10 mL sukrosa 0.25 mM-CaCl2. Kemudian disentrifus pada 1500 g
selama 10 menit. Setelah disentrifugasi, supernatant dibuang, sedangkan pelet
yang diperoleh diresuspensi dengan 10 mL sukrosa-CaCl2. Suspensi diambil
sebagian saja sebanyak ukuran tabung vial dan diberi label “fraksi inti”.
Supernatan yang diperoleh dari praktikum sebelumnya disentrifugasi pada
5000 g selama 15 menit. Supernatan dituang ke wadah lain, kemudian pelet
dipindahkan secara kuantitatif dengan cara menambahakan larutan sukrosa 10 mL
0.34 mM-EDTA 1 mM, dimasukkan ke dalam tabung sentrifus 50 mL lalu pelet
dihaluskan dengan batang pengaduk. Kemudian ditambahkan larutan sukrosa-
EDTA hingga volumenya menjadi 20 mL, kemudian pelet disentrifugasi pada
24000 g selama 10 menit.

Data dan Hasil Percobaan

Tabel 1 Hasil fraksinasi subseluler
Meja Bobot hati (gram) Volume Homogenat (mL)
1 8.5713 g 19 mL
2 5.8890 g 15 mL
3 8.9600 g 28.8 mL
Lanjutan
Meja Bobot hati (gram) Volume Homogenat (mL)
 4 8.6300 g 20.21 mL

Contoh perhitungan:
RCF = 24000 g
r = 108 mm
RPM?
2
RPM
RCF = 1.12 × r × ( )
1000
2
RPM
24000 = 1.12 × 108 mm × (
1000 )
RPM = 14086 rpm

Pembahasan
Fraksinasi merupakan proses pemisahan suatu larutan menjadi fraksi atau
bagian-bagian tertentu. Prinsip fraksinasi adalah pembagian atau pemisahan yang
didasarkan pada bobot tiap fraksi, fraksi yang lebih berat akan berada paling dasar
sedangkan fraksi yang lebih ringan akan berada di atas. Fraksinasi umumnya
dibantu dengan sentrifugasi (Anonim 2008).
Praktikum kali ini menggunakan organel hati tikus dengan fraksi subseluler
untuk mengambil fraksi homogenat, fraksi inti, fraksi mitokondria, dan fraksi
mikrosom di dapat hasil dari percobaan, yaitu dari meja 1 diperoleh bobot hati
8.5713 gram dan volume homogenat 19 mL, meja 2 diperoleh bobot hati 5.880
gram dan volume homogenat 15 mL, meja 3 diperoleh bobot hati 8.9600 gram
dan volume homogenat 28.8 mL, dan meja 4 diperoleh 8.6300 gram dan volume
homogenat 20.21 mL.
Sentrifugasi adalah suatu metode yang digunakan untuk pemisahan sel atau
organel subseluler serta komponennya. Prinsip dasar sentrifugasi adalah partikel
yang terusupensi akan mengendap ke dasar karena pengaruh gravitasi. Ada dua
macam prinsip sentrifugasi yang didasarkan pada perbedaan kecepatan dan
sentrifugasi bobot jenis bertingkat. Sentrifugasi perbedaan kecepatan
pemisahannya dilakukan berdasarkan ukuran organel sel, sentrifugasi dilakukan
dari kecepatan rendah dan waktu yang singkat kemudian ditingkatkan kecepatan
dan waktunya. Hasil isolasi tidak sepenuhnya murni dari komponen yang lain,
sehingga perlu pemurnian lebih lanjut (Rickwood 1984).
Sentrifugasi bobot jenis bertingkat menggunakan suatu metode gradien dari
larutan yang pekat untuk memisahkan organel seluler berdasarkan bobot jenis
yang digunakan untuk tahap pemurnian. Sentrifugasi ini ada dua jenis, yaitu
sentrifugasi zonal dan sentrifugasi isopiknik (Rickwood 1984).
Sentrifugasi perbedaan kecepatan adalah yang digunakan dalam percobaan
kali ini. Hal ini disebabakan dalam sentrifugasi ini dapat diperoleh pecahan-
pecahan subseluler dari komponen sel berdasarkan ukuran organel selnya.
Pemisahan ini dilakukan dari kecepatan rendah dan waktu yang singkat, kemudian
ditingkatkan kecepatan dan waktunya, sebab organel memiliki ukuran yang
berbeda-beda sehingga diperlukan kecepatan yang berbeda-beda pula untuk
mengisolasi organel-organel tersebut. Selain itu, pada praktikum ini digunakan
sentrifugasi berdasarkan kecepatan karena teknik penggunaannya mudah dan
cepat (Rickwood 1984).
Isolat yang dihasilkan tidak murni karena dari percobaan tidak dapat dilihat
aktvitas enzim rendah atau tinggi dan fraksi-fraksi seperti inti, mitokondria,
mikrosom, lisosom, dan sitoplasma tidak dilakukan dalam praktikum kali ini.
Praktikum kali ini tikus yang digunakan adalah tikus berjenis kelamin jantan.
Tikus jantan yang digunakan karena tidak mengalami masa periode seperti yang
terjadi pada tikus betina, yaitu masa perubahan secara hormonal yang dapat
mempengaruhi aktivitas enzimatik. Tikus percobaan terdiri atas beberapa galur,
anatara lain: Wistar, Sprague Dawley, Long-evans, Zucker, Hairless, dan RCS.
Organ tubuh yang digunakan adalah hati, karena hati merupakan organel terbesar
dalam tubuh dan mengandung banyak organel seperti mitokondria yang berfungsi
sebagai penghasil ATP pada proses respirasi dan enzim-enzim yang dibutuhkan
oleh tubuh. Pemecahan sel hati tikus ini harus dilakukan pada suhu rendah dan
untuk menjaga agar tidak timbul panas yang dapat mengakibatkan organel sel
tidak aktif (Evenhius 1978).
Pemecahan sel hati dilakukan dengan menggunkan homogenizer yang
berfungsi untuk menghaluskan organ hati dan memecah membran plasma. Pada
fraksinasi subseluler ini digunakan larutan sukrosa-EDTA 0.34 mM yang
berfungsi melisis membran sel, meningkatkan stabilitas biokimia mitokondria dan
aktivitas degradasi mitokondria, serta meningkatkan fosforilasi endogenus. Selain
itu, dilakukan juga proses dekantasi sukrosa-EDTA atau larutan isotonis untuk
memecah-mecahkan selubung sel yang belum pecah. Dekantasi adalah pemisahan
komponen-komponen dalam campuran dengan cara dituang secara langsung
(Abynoel 2008).
Setelah proses penuangan berbagai macam larutan dilakukan proses
sentrifugasi. Hasil yang diperoleh adalah nukleus (inti sel) memerlukan gaya
sentrifus sebesar 1500 g atau setelah dikonversi menjadi 3522 rpm (rotations per
minute), sedangkan mitokondria memerlukan gaya yang lebih besar, yaitu 5000 g
setelah dikonversi menjadi 6429 rpm dan 24000 g setelah dikonversi menjadi
14086 rpm. Hal tersebut menunjukkan semakin kecil ukuran suatu komponen sel
maka akan semakin sulit untuk mendapatkan fraksinya dan juga semakin besar
kecepatan sentrifugasi yang diperlukan untuk mengisolasi komponen tersebut.
Dibawah ini dapat dilihat bagan fraksinasi subseluler.

Gambar 1 Skema isolasi komponen sel dengan cara sentrifugasi diferensial

(Campbell 2002)
Simpulan
 Didapat hasil fraksinasi subseluler, yaitu dari meja 1 diperoleh bobot hati
8.5713 gram dan volume homogenat 19 mL, meja 2 diperoleh bobot hati 5.880
gram dan volume homogenat 15 mL, meja 3 diperoleh bobot hati 8.9600 gram
dan volume homogenat 28.8 mL, dan meja 4 diperoleh 8.6300 gram dan volume
homogenat 20.21 mL. Nilai RPM yang dipakai dalam sentrifus dengan gaya 700 g
adalah 2406 rpm. Untuk memperoleh fraksi inti pada gaya 1500 g nilai RPM yang
digunakan adalah 3522 rpm, sedangkan untuk isolasi mitokondria digunakan gaya
5000 g dengan nilai RPM-nya adalah 6429 rpm, dan gaya 24000 g dengan nilai
RPM 14086 rpm.

Daftar Pustaka
Abynoel. 2008. Pemisahan Dalam Campuran [terhubung berkala].
http://abynoel.com/modul-kimia [8 maret 2010]
[Anonim]. 2008. Dasar-dasar Isolasi Protein. [terhubung berkala].
http://inherent.brawijaya.ac.id/biomol/materi/Lectutre13.pdf.htm [9 maret
2010]
Campbell NA, Jane BR, Lawrence GM. 2002. Biologi. Lestari R et al,
penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Biology
Evenhius ES. 1978. Methods of Folair Analysis. Amsterdam: Institut Koninklikj
Voor de Amsterdam
Rickwood D. 1984. Centrifugation 2nd: a practical approach. Washington DC:
IRL pr