UNIVERSITATEA DE ŞTIINłE AGRICOLE ŞI

MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

Domeniu: BIOTEHNOLOGII

Rezumatul Tezei de Doctorat

Studiul activităŃii unor enzime vegetale

(lipoxigenaze şi lipaze) implicate în biotehnologia
şi metabolismul lipidelor

Conducător ştiinŃific
Prof.Dr. Carmen SOCACIU

Doctorand
Ing.Veronica Sanda CHEDEA

Cluj-Napoca
2009
 CUPRINS
CUPRINS..............................................................................................................................................2
INTRODUCERE: Scop şi obiective.....................................................................................................3
I. STUDII ALE ACTIVITĂłII LIPOXIGENAZICE ..........................................................................8
I.1. CINETICA DIVERSELOR LIPOXIGENAZE DIN BOABELE DE SOIA ESTE
INFLUENłATĂ DE pH, DISPONIBILTATEA SUBSTRATULUI ŞI PROCEDURA
DE EXTRACłIE ..............................................................................................................................8
I.2. CINETICA OXIDĂRII SN1-PALMITOIL, SN2-LINOLEOIL FOSFATIDIL
COLINEI (PC) CA SUBSTRAT PENTRU LIPOXIGENAZA RECOMBINATĂ DIN
PORUMB (RM9-LOX) ..................................................................................................................11
I.3. EVALUAREA COMPARATIVĂ A ACTIVITĂłII LIPOXIGENAZEI ÎN
DIFERITE CONDIłII DE REACłIE, UTILIZÂND PARAMETRII SĂI CINETICI .................14
I.3.1. Determinarea parametrilor cinetici KM şi Vmax pentru LOX-1 standard având
ca substrat acidul linoleic în absenŃa şi prezenŃa Tween 20 şi a 13-HPOD în
amestecul de reacŃie ....................................................................................................................14
I.3.2. Cinetica oxidării acidului linoleic de către LOX-1 din soia într-un mediu de
reacŃie saturat în oxigen ..............................................................................................................15
I.3.3. InfluenŃa unor detergenŃi asupra oxidării acidului linoleic şi a 1-linolenoil-ras-
glicerolului de către LOX-1 standard şi RZM9-LOX.................................................................16
I.3.4. Determinarea parametrilor cinetici (KM, Vmax) a LOX pure folosind ca substrat
acidul docosadienoic acid (acid brasic) (22:2)............................................................................19
II. STUDII PRIVIND INHIBIłIA LIPOXIGENAZEI ......................................................................21
II.1. INHIBIłIA LIPOXIGENAZEI DE CĂTRE QUERCETINĂ ...............................................21
II.1.1. InfluenŃa quercetinei pure asupra oxidării linoleatului de sodiu de către
lipoxigenaza pură din boabele de soia LOX-1............................................................................21
II.1.2. InteracŃiunea intermoleculară între lipoxigenază şi quercetină este influenŃată
de pH şi timpul de incubare ........................................................................................................26
II.2. EFECTUL INHIBITOR AL IZOFLAVONELOR DIN SOIA ASUPRA
ACTIVITĂłII LIPOXIGENAZEI DIN BOABELE DE SOIA.....................................................28
II.3. ACTIVITATEA LIPOXIGENAZEI ÎN PREZENłA CATECHINEI,
EPICATECHINEI ŞI A UNOR PROCIANIDINE ÎN MEDIU BIOTIC ŞI ABIOTIC.................32
II.3.1. CompoziŃia în polifenoli şi stabilitatea extractului apos din sâmburi de
struguri din soiul Merlot Recaş...................................................................................................32
II.3.2.CompoziŃia în polifenoli a extractului enzimatic LE ........................................................38
II.3.3. InteracŃiunea dintre lipoxigenaza pură şi din extract şi catechina pură şi dintr-
un extract polifenolic ca model de studiu al modulării echilibrului
oxidant/antioxidant în condiŃii abiotice şi biotice.......................................................................39
II.4. EVALUAREA UNOR CAROTENOIDE CA INHIBITORI DE
LIPOXIGENAZĂ…43
CONCLUZII GENERALE.................................................................................................................49
 INTRODUCERE: Scop şi obiective

Lipazele şi lipoxigenazele sunt enzime cheie implicate în metabolismul

lipidic atât la nivelul celulei vegetale cât şi al celei animale. Date extinse din
literatura de specialitate se referă la implicaŃiile acestor enzime în bolile umane şi
mult mai puŃin la implicaŃiile lor în fiziologia şi patologia plantelor. Tehnologia şi
biotehnologia alimentară au profitat de cunoştintele deja acumulate despre lipaze
şi lipoxigenaze, în special pentru găsirea unor soluŃii în vederea modulării sau
inhibării activităŃii acestora, evitându-se distrugerea (prin hidroliză şi oxidare) a
matricelor lipidice şi formarea de mirosuri neplăcute.
Lipoxigenazele, care se găsesc atât în regnul vegetal cât şi cel animal, sunt
o familie de proteine monomerice dioxigenaze care conŃin ionul de fier neheminic
ca şi cofactor, nu conŃin sulf şi catalizează oxidarea acizilor graşi polinesaturaŃi
cum ar fi, acidul linoleic, linolenic şi arahidonic, acizi ce conŃin în molecula lor cel
puŃin un fragment structural 1Z, 4Z-pentadienă. În urma reacŃiei lipoxigenazei se
formează hidroperoxizi folosind trecerea de la ionul Fe+2 la Fe+3 şi oxigenul
molecular, prin transfer de electroni între radicali intermediari. Enzima poate să
catalizeze de asemenea şi cooxidarea carotenoidelor, ducând astfel la pierdera
culorii naturale şi a anumitor nutrienŃi esenŃiali. LOX sunt implicate in generarea
aromelor în numeroase produse din plante, în decolorarea pigmenŃilor şi în
potenŃiala compromitere a statusului antioxidant. De exemplu ele sunt
responsabile pentru mirosurile nedorite produse în timpul procesării şi depozitării
produselor proteice derivate din seminŃele de leguminoase şi dezvoltarea gustului
de învechit a berii în timpul păstrării acesteia. În cazul pastelor făinoase LOX sunt
implicate în pierderea culorii, demonstrată şi prin corelaŃia pozitivă între scăderea
conŃinutului în β-caroten după pastificare şi activitatea lipoxigenazelor. În plus,
hidroperoxidarea şi reacŃiile de decolorare a LOX sunt corelate, demonstrând că
decolorarea poate fi datorată unei acŃiuni co-oxidative a LOX.
S-a demonstrat în literatura de specialitate că lipazele deŃin un loc secundar
în formarea de molecule cu potenŃial toxic şi au mecanisme mai puŃin interesante
legate de stresul oxidativ, şi prin urmare experienŃele ce fac obiectul acestei teze
au fost dezvoltate în direcŃia inhibării lipoxigenazelor vegetale. Scopul prezentei
teze este cel de a contribui la dezvoltarea cunoştinŃelor legate de activitatea
lipoxigenazelor de origine vegetală (utilizând boabele de soia ca matrice şi
sursă de enzime şi lipide), de implicarea acestor enzime în producerea de
molecule toxice, oxidate şi mirosuri neplăcute precum şi de mecanismele
inhibării acestora de către compuşi antioxidanŃi naturali.
Cum deja a fost propus în urma cercetărilor anterioare, efectul inhibitor al
antioxidanŃilor asupra lipoxigenazei depinde de starea fizico-chimică a substratului
şi de tipul de lipoxigenază, şi se poate schimba complet în funcŃie de condiŃii.
Stresul oxidativ, consecinŃa dezechilibrului dintre prooxidanŃi şi
antioxidanŃi la nivelul organismului, ducând la formarea de hidroperoxizi toxici, a
câştigat rapid atenŃia cuvenită ca un fenomen cheie în bolile cronice: boli
cardiovasculare, hipertensiune, diabet şi cancer.
Complexe ale radicalilor peroxil se formează în tipul ciclului catalitic al
LOX, complexe ce pot servi ca sursă de radicali liberi. Din această direcŃie
lipoxigenazele pot fi văzute ca un inductor de stres oxidativ, stres oxidativ ce
favorizează la rândul lui un întreg set de procese co-oxidative şi peroxidări
lipidice, mediate sau nu enzimatic de LOX. Având în vedere efectele distructive la
nivelul organismului ale dezechilibrului cauzat de oxidarea acizilor graşi, există un
interes considerabil în găsirea şi caracterizarea de noi inhibitori ai LOX.
 Efectele distructive ale poceselor oxidative pot fi reduse printr-o dietă
bogată în flavonoide şi carotenoide, compuşi care se găsesc în fructe, legume şi
anumite băuturi. AntioxidanŃi ca flavonoidele şi carotenoidele care acŃioneaza
împotriva radicalilor liberi pot acŃiona şi ca inhibitori de LOX.

Principalele obiective experimentale ale tezei sunt:

1. Studiul activităŃii lipoxigenazei, pure sau în extract în diferite condiŃii de
reacŃie. Lipoxigenazele folosite au fost: lipoxigenaza pură, standard din
boabele de soia, lipoxigenazele din extractul nepurificat din boabele de soia
şi lipoxigenaza recombinată din porumb. A fost studiat modul în care
cineticile diferitelor lipoxigenaze din soia sunt influentate de pH,
disponibilitatea substratului şi diferitele proceduri de extracŃie folosite.

2. Studiul activitaŃii lipoxigenazei prin inhibiŃia specifică de către două clase

de inhibitori naturali : polifenolii (quercetina- inhibitor generic din clasa
flavonoidelor, izoflavone, catechina şi alŃi flavan-3-oli, procianidine) şi
carotenoide. Aceste studii au avut ca scop explicarea activităŃii enzimatice
în relaŃie cu interacŃiunea moleculară directă sau indirectă a lipoxigenazei
cu moleculele inhibitoare.

Structura tezei. Prima parte a tezei reprezintă studiul de literatură iar

partea a doua conŃine procedurile experimentale: materiale şi metode, rezultate şi
discuŃii, concluzii.
Prima parte include două capitole (I-II):
• Capitolul I - Lipoxigenaze: caracterizare generală şi mecanismele
biochimice specifice
• Capitolul II - Lipaze: caracterizare generală
Partea a Doua (ContribuŃii originale) este organizată în două capitole:
• Capitolul III – Studii ale activităŃii lipoxigenazice. În prima parte a
acestui capitol s-a studiat comportamentul cinetic a diferitelor lipoxigenaze
extrase din boabele de soia şi s-a arătat că acesta este influenŃat de pH,
disponibilitatea substratului şi procedurile de extracŃie. În partea a doua
sunt prezentate rezultatele legate de cinetica oxidării sn1-palmitoil, sn2-
linoleoil fosfatidil colinei ca substrat al 9-lipoxygenazei din porumb
recombinate. În partea a treia a acestui capitol o evaluare comparativă a
activităŃii lipoxigenazei în diferite condiŃii de reacŃie este prezentată: mediu
de reacŃie saturat cu oxigen, prezenŃa clorurii de sodiu sau a diverşilor
detergenŃi în mediul de reacŃie.

• Capitolul IV – Studii privind inhibiŃia lipoxigenazei. În prima parte sunt

prezentate importanŃa şi mecanismele de inhibiŃie a lipoxigenazei.
Capitolul continuă cu partea a doua, tratând influenŃa quercetinei pure
asupra oxidării linoleatului de sodiu de către lipoxigenaza pură din boabele
de soia. Partea a treia este dedicată interacŃiunilor intermoleculare dintre
lipoxigenază şi quercetină şi cum acestea sunt influenŃate de pH şi timpul
de incubare. În partea a patra este prezentat efectul inhibitor al
izoflavonelor din soia asupra lipoxigenazelor din soia. Activitatea
lipoxigenazei în prezenŃa catechinei, epicatechinei şi a procianidinelor în
mediu abiotic şi biotic este prezentată în partea a cincea. În partea a şasea
unele carotenoide sunt evaluate ca inhibitori de lipoxigenază.

Experimentele ce alcătuiesc această teză au fost efectuate în laboratoarele

Departamentului de Chimie şi Biochimie a UniversităŃii de ŞtiinŃe Agricole şi
Medicină Veterinară Cluj-Napoca sub coordonarea Prof. Carmen Socaciu, în
cadrul Departamentului de Oxilipine, Institutul de Biochimie şi Biofizică din
Kazan, filială a Academiei de ŞtiinŃe Ruse şi în Departamentul de Biochimie a
UniversitaŃii din Kazan, FederaŃia Rusă sub coordonarea Prof. Alexander
Grechkin şi în Departamentul de Chimie Organică, Facultatea de Inginerie în
BioştiinŃe, Universitatea din Ghent, Belgium, sub coordonarea Prof. Roland
Verhe. Activiatea desfăşurată în cadrul acestei teze a fost în parte finanŃată de un
proiect CNCSIS, PNII, proiectul TD 392/2007.
 I. STUDII ALE ACTIVITĂłII LIPOXIGENAZICE

I.1. CINETICA DIVERSELOR LIPOXIGENAZE DIN BOABELE DE SOIA

ESTE INFLUENłATĂ DE pH, DISPONIBILTATEA SUBSTRATULUI ŞI
PROCEDURA DE EXTRACłIE

Scop şi obiective
Enzimele LOX s (MW≈ 95 kDa) sunt active în diferite condiŃii, fiecare
enzimă din familia LOX având un pH optim specific, acest fapt explicând
diferenŃele de comportament kinetic.
Scopul experimentelor efectuate în cadrul acestui capitol a fost evaluarea
comportamentului cinetic a trei lipoxigenaze din extractul primar din boabele de
soia. Aceste enzime catalizează formarea mirosurilor neplăcute în timpul
procesării boabelor de soia în vederea obŃinerii de produse alimentare. Studiul de
faŃă se doreşte a fi o etapă premergatoare celei reprezentate de inhibiŃia
lipoxigenazelor de către compuşi naturali cu potenŃial antioxidant.
Experimentele au avut următoarele obiective:
1. Determinarea parametrilor cinetici a LOX-1 din soia pură, la diferite pH-uri.
2. Determinarea comparativă a parametrilor cinetici a diverselor extracte din
boabele de soia, extracte ce conŃin enzime LOX, în funcŃie de procedura de
extracŃie şi testare.
3. Evaluarea parametrilor care influenŃează activitatea LOX: pH-ul şi raportul
enzimă substrat, ca indicatori ai afinităŃii enzimatice în diferite medii de reacŃie.

Rezultate
Curbele cinetice la diferite pHm (6.1, 7.1 şi 9) prezintă activitatea specifică
a LOX-1, LOX-2 şi LOX-3.
Am confirmat date din literatura de specialitate legate de dependenŃa
enzimelor LOX de pHm (Siedow, 1991; Loiseau şi col, 2001; Kosary şi col,
2004). InfluenŃa pH-ului asupra activităŃii SLOX (LOX-1 din boabele de soia),
poate fi explicată prin faptul că la diferite pHm situsul catalitic al enzimelor de
LOX are conformaŃii şi stări oxidative ale ionului de fier diferite. (Gardner, 1989).
Considerând rezultatele noastre obŃinute prin testul T0 (enzima pură) putem
afirma că cele mai bune condiŃii de evaluare a activităŃii LOX este să se aleagă un
pHdil şi un pHm de 9.0 (în tampon borat 0.2M) la E/LS = 0.095·10-3. Când
raportul E/LS a crescut de 2 ori, activitatea LOX-1 a scăzut cu aproximativ 40%,
E/LS optim fiind observat între 0.05 şi 0.1·10-3 mg protein/nmol substrat. Pentru
studiile de inhibare a LOX asemenea observaŃii pot fi utile, indicând cel mai
potrivit pH şi raport E/LS pentru măsurători cinetice.
Testele T1-T3 pentru extractul primar (E1) au evaluat activitatea LOX-1 la
pH=9 (T1), activitatea LOX-2 la pHm=6.1 (T2) şi LOX-3 la pH=7.1 (T3).

Fig.I.1. Curbele cinetice ale activităŃii lipoxigenazei LOX-1, din diferite extracte
din făina de soia (E1-E4), măsurate la pHm =9.0. Extractele au fost preparate la
diverse pHdil, folosindu-se diferite rapoarte de concentraŃie enzimă-substrat,
exprimate ca mg proteină·10-3/nmol substrate. Creşterea în absorbanŃă (Abs) (0-
300 sec) la 234 nm indică în fiecare caz formarea de 13-HPOD. A. pHdil= 6.1 şi
E1/LS = 1.44 ; B. pHdil= 6.1 şi E1/LS = 11.56; C. pHdil= 6.1 şi E2/LS = 6.12; D.
pHdil= 6.8 şi E3/LS = 2.52; E. pHdil= 7.1 şi E4/LS = 2.64.
Fig.I.2. Curbele cinetice ale LOX-2 din extractele bogate în lipoxigenază (E1-E4),
măsurate la pHm =6.1. Extractele au fost obŃinute la diferite pHdil folosindu-se
diferite rapoarte (E/LS), exprimate ca mg protein·10-3/nmol substrate. Creşterea în
absorbŃie (0-300 sec) la 234 nm indică, în fiecare caz, formarea unui amestec de
13- şi 9-HPOD. A. pHdil= 6.1 şi E1/LS = 2.88; B. pHdil= 6.1 şi E1/LS = 2.32; C.
pHdil= 6.1 şi E1/LS = 1.44; D. pHdil= 6.1 şi E2/LS = 1.52; E. pHdil= 6.8 şi E3/LS
= 1.24; pHdil=7.1 şi E4/LS = 1.64.

1.5
1.4
c

1.2
b
Abs 1 a

0.8

0.6
0 100 200 300
Time [sec]

Fig.I.3. Curbele cinetice suprapuse ale activităŃii LOX-3, din extractele bogate în
lipoxigenază (E1-E4), măsurate la pHm =7.1. Extractele au fost obŃinute la diferite
pHdil folosindu-se diferite rapoarte (E/LS), exprimate ca mg proteină·10-3/nmol
substrat. Creşterea în absorbŃie (0-300 sec) la 280 nm indică, în fiecare caz,
formarea de cetodiene; a-E1, pHdil=6.1 şi E1/LS = 0.36; b-E2, pHdil=6.1 şi E2/LS
= 0.38, şi E3 pHdil=6.8, E3/LS = 0.155; c-E4, pHdil=7.1 şi E4/LS = 0.205.

În cazul testului T1, la pHm=9, extractele E2 şi E3, dar nu E1 au avut o fază

de lag corespunzătoare unei viteze de reacŃie scăzute. A fost demonstrate că faza
de lag creşte la concentraŃii mari ale acidului linoleic şi descreşte cu creşterea
concentraŃie de produs de reacŃie, respectiv HPOD (Wang et al, 1993). Faze de lag
au fost de asemenea observate pentru pHm=6.1 pentru toate extractele E1-E4.
T1 indică o mai bună extracŃie a LOX-1 în E1 şi E3, T2 indică activitatea
scăzută a LOX-2 în extractele din boabele de soia, în timp ce T3 indică faptul că
extractele degresate E3 şi E4 au avut o activitate mai bună a LOX-3 decât extractul
primar sau E2. Rezultatele măsurătorilor efectuate prin testul T3 pentru cinetica
LOX-3 sunt mai dificil de interpretat deoarece produsul de hidroperoxidare este
parŃial transformat în cetodiene care absorb la 280nm (Axelrod et al, 1981).

I.2. CINETICA OXIDĂRII SN1-PALMITOIL, SN2-LINOLEOIL FOSFATIDIL

COLINEI (PC) CA SUBSTRAT PENTRU LIPOXIGENAZA RECOMBINATĂ
DIN PORUMB (RM9-LOX)

Scop şi obiective

Scopul acestui experiment (efectuat la Universitatea din Kazan, FederaŃia

Rusă, Departmentul de Biochimie şi la Institutul de Biochimie şi Biofizică din
Kazan, filială a Academiei de ŞtiinŃe Ruse, Departamentul de Oxilipine sub
coordonarea Prof. Alexander Grechkin) a fost elucidarea supoziŃiei că 9-LOX
catalizează dioxigenarea lipidelor complexe cum ar fi PC în poziŃia 9 a lanŃului de
carbon. Am luat în studiu 9-lipoxigenaza din porumb recombinată (RM9-LOX),
care adaugă oxigen la carbonul 9 a acidului linoleic şi prezintă activitate de
hidroperoxidare la pH cuprins între 6.5 şi 7.5-activitatea maximă a fost observată
la pH 7.0 (Wilson et al, 2001).
Rezultate

Fig.I.4. prezintă cromatograma produşilor de oxidare a 1- palmitoil, 2-

linoleoil fosfatidil colina catalizată de 9-LOX din porumb recombinată. Au fost
identificate 6 semnale, patru dintre ele fiind identificate pe baza cromatogramelor
standard din baza de date lipidice (http://lipidbank.jp/image/DFA0014SP0001.gif)
pusă la dispoziŃie de dr. T. Kasama. Semnalele 5 şi 6 au fost identificate ca fiind
trimetilsilil eterii a 9-HPOD (semnalul 5) şi a13-HPOD (semnalul 6).

Fig.I.4. Gaz cromatograma produşilor de reacŃie în cazul oxidării 1- palmitoil, 2-

linoleoil fosfatidil colina în prezenŃa lipoxigenazei recombinate din porumb, 9-
LOX. 6 semnale au fost identificate ca fiind: 1-acidul miristic, 2- acidul palmitic,
3- acidul heptadecenoic (margaric, daturic), 4-acidul stearic, 5-, 9-OTMS-stearat,
6-, 13-OTMS-stearat.
Identificarea semnalelor este prezentată în Tabelul I.1.
 Tabel I.1.
Identificarea celor mai importanŃi produşi de reacŃie obtinuŃi prin oxidarea 1-
palmitoil, 2-linoleoil phosphatidil colinei de către 9-LOX din porumb în
concordanŃă cu timpii de retenŃie şi raporturile m/z

Peak Retention Identification m/z ratio for Chemical structure

No. time/min the base
Semnal Timpul de Identificarea peaks [M-H]- Structura chimică
nr. retenŃie/min raportul m/z
pentru
semnalele de
bază [M-H]-
1. 8.74 Acid Miristic 211, 242
C14:0
2. 11.05 Acid Palmitic 239, 270
C16:0
3. 12.11 Acid 241, 284
Margaric
C17:0

4. 13.28 Acid Stearic 255, 298

C16:0

5. 16.02 9-HPOD* 229, 259

6. 16.30 13-HPOD* 173, 315

*
Compuşii identificaŃi au fost prezenŃi în cromatogramă ca trimetilsilil eteri.
 I.3. EVALUAREA COMPARATIVĂ A ACTIVITĂłII LIPOXIGENAZEI ÎN
DIFERITE CONDIłII DE REACłIE, UTILIZÂND PARAMETRII SĂI
CINETICI

I.3.1. Determinarea parametrilor cinetici KM şi Vmax pentru LOX-1 standard

având ca substrat acidul linoleic în absenŃa şi prezenŃa Tween 20 şi a 13-
HPOD în amestecul de reacŃie

Scop şi obiective

Folosind LOX-1 standard şi acidul linoleic ca substrat am determinat

parametrii cinetici KM şi Vmax, şi curba Michaelis-Menten ca date de referinŃă
pentru studii viitoare în condiŃiile noastre experimentale. Pornind de la această
ideie am evaluat şi influenŃa Tween 20 şi a 13-HPOD asupra oxidării acidului
linoleic de către LOX-1 std.

Rezultate

În cazul activităŃii LOX în absenŃa Tween 20 şi a 13-HPOD în amestecul de

reacŃie (considerate condiŃii standard de reacŃie), curba Michaelis-Menten arată că
la concentraŃii mai mari de 100 µM avem o inhibiŃie generată de substrat pentru
concentraŃia de enzimă luată în studiu de această dată. Pentru a obŃine graficul
Lineweaver-Burke, 1/[S] şi 1/v au fost calculate pentru concentraŃii diferite de
substrat (5-100µM).
Valorile KM şi Vmax calculate au fost:

KM=20 µM, vmax=40 µM* s-1*mg.enz.-1în cazul activităŃii enzimatice în absenŃa

Tween 20 şi a 13-HPOD în amestecul de reacŃie
şi

KM=25 µM, vmax=48 µM* s-1*mg.enz.-1 în cazul activităŃii enzimatice în prezenŃa

Tween 20 şi a 13-HPOD în amestecul de reacŃie
 I.3.2. Cinetica oxidării acidului linoleic de către LOX-1 din soia într-un mediu
de reacŃie saturat în oxigen

Scop şi obiective

Acest experiment a avut ca obiect de studiu oxidarea acidului linoleic de

către LOX-1 când mediul de reacŃie a fost saturat cu oxigen.

Rezultate

Tabelul I.2 prezintă viteza oxidării acidului linoleic de către LOX-1 în

absenŃa şi în prezenŃa oxigenului adăugat în amestecul de reacŃie.
Tabel I.2.
Vitezele de reacŃie pentru oxidarea acidului linoleic în prezenŃa sau absenŃa O2
adăugat în amestecul de reacŃie.

Substr. conc. Reaction velocity for the oxidation Reaction velocity for the oxidation
(µM) of linoleic acid in oxygen of linoleic acid in medium
Conc.substr. saturated medium unsaturated in O2
Viteza de reacŃie pentru oxidarea acidului linoleic Viteza de reacŃie pentru oxidarea
în mediu saturat în oxigen acidului linoleic în mediu nesaturat în
oxigen
5 0,0005 0,0005
6,25 0,0005 0,0005
10 0,0004 0,0003
20 0,0019 0,0027

Oxigenul influenŃează viteza de reacŃie proporŃional cu creşterea concentraŃiei de

substrat.
InfluenŃa sării (NaCl) asupra comportamentului cinetic al oxidării acidului
linoleic de către LOX-1
În acord cu experimente cinetice efectuate de alte grupuri de cercetare
(Coffa şi col, 2005), a fost de asemenea evaluată oxidarea acidului linoleic de
către LOX-1 în prezenŃa sării în amestecul de reacŃie.
AbsorbanŃele înregistrate pentru vitezele maxime de reacŃie au fost 0,015
AU în absenŃa sării şi 0,015 AU în prezenŃa acesteia.

I.3.3. InfluenŃa unor detergenŃi asupra oxidării acidului linoleic şi a 1-

linolenoil-ras-glicerol de către LOX-1 standard şi RZM9-LOX

Scop şi obiective

Lipoxigenazele catalizează oxidarea acidului linoleic în mediu apos doar

dacă substratul este disponibil pentru enzimă în special ca emulsie. Starea instabilă
de agregare a emulsiilor acizilor graşi polinesaturaŃi în faza apoasă au dus la
concluzia că ar trebui utilizaŃi detergenŃi pentru a stabiliza emulsiile substratului.
Datele de literatură relevă faptul că cele mai multe rezultate au fost obŃinute pentru
acil gliceroli şi fosfolipide care sunt substrat pentru lipaze şi fosfolipaze însă puŃin
s-a lucrat în acest sens pe lipoxigenază.

DetergenŃii utilizaŃi în urmatoarele experimente sunt: Tween 20, SDS,

zwittergent şi deoxicolat şi influenŃa acestora asupra oxidării 1-Linolenoil-ras-
glicerolului (18:3-G) de către LOX-1 standard şi RZM9-LOX a fost evaluată.

Rezultate

Într-un experiment precedent (Capitolul III.3.1.) s-a arătat că Tween 20 a

crescut viteza de reactie a acidului linoleic de către LOX-1. Acest set de
experimente au urmărit influenŃa anumitor detergenŃi asupra oxidării lipidului
complex 1-Linolenoil-ras-glicerol de către RMZ-9LOX. Oxidarea acidului linoleic
de către LOX-1 şi RMZ-9LOX au fost luate ca situaŃii control.
Adăugând SDS în amestecul iniŃial de reacŃie viteza acesteia nu a fost
modificată însă este nevoie de un timp mai îndelungat pentru a obŃine maximul de
produşi de reacŃie. 13-HPOD adăugat amestecului de reacŃie a dus la creşterea
vitezei de reacŃie. Dublând cantitatea de Tween 20 în prezenŃa SDS-ului şi a 13-
HPOD, 18:3-G a fost oxidat mai rapid rezultând o mai mare cantitate de produs de
reacŃie. Acest fapt sugerează că raportul dintre cei doi detergenŃi influenŃează de
asemenea disponibilitatea substratului pentru LOX-1. O foarte slabă oxidare s-a
înregistrat în cazul RZM-9LOX având ca substrat 18:3-G fără a adăuga SDS în
amestecul de reacŃie. În prezenŃa SDS, enzima recombinată a fost inactivată , în
aceleaşi condiŃii în care 18:3-G a fost oxidat de către LOX-1 cu viteza maximă.

Este posibil că SDS afectează enzima recombinată deci detergentul ar
trebui înlocuit cu un altul, pentru a avea o mai bună oxidare a 18:3-G de
către RZM-9LOX

Adăugând SDS, 13-HPOD şi dublând volumul iniŃial de Tween 20, s-a
obŃinut o rată de oxidare a 18:3-G de către LOX-1 în comparaŃie cu situaŃia
când aceşti compuşi nu au fost folosiŃi.

Raportul Tween 20:SDS influenŃează disponibilitatea substratului în
vederea oxidării lui de către LOX-1.
Din experimentul anterior a rezultat faptul că lipoxigenaza recombinată a
fost inactivată de SDS, şi în consecinŃă acesta a fost înlocuit cu zwittergent
(detergent zwitterionic) (3-dodecildimetilamoniu-1-propansulfonate) şi deoxicolat.
Şi de această dată cea mai înaltă rată de oxidare s-a înregistrat pentru
reacŃia acidului linoleic în prezenŃa LOX-1 şi a Tween 20. Adăugând SDS în
amestecul iniŃial de reacŃie (soluŃie tampon+substr.+ enz.+Tween 20) viteza
reacŃiei a scăzut la aproape jumătate (de la 0.00805, la 0.00383). Dacă în
amestecul iniŃial de reacŃie am adăugat 5 µl ZW viteza a scăzut de 8 ori iar prin
adăugarea a 40 µl DOX. La 1/5 din volumul iniŃial de DOX viteza de reacŃie a
înregistrat o creştere remarcabilă, de la 0.00080 la 0.0062. Aceeaşi situaŃie s-a
înregistrat în cazul folosirii a 1/5 din volumul iniŃial de ZW când creşterea a fost
de la 0.00111 la 0.00668-de 6 ori mai mare. Un raport adecvat Tween 20:ZW şi
Tween 20:DOX duce la creşterea vitezei de oxidare a acidului linoleic de către
LOX-1.
Dacă SDS nu a influenŃat oxidarea acidului linoleic de către LOX-1 prin
creşterea vitezei de reacŃie, pentru 18:3-G, cea mai bună rată de formare a
hidroperoxizilor s-a realizat când 5 µl SDS au fost adăugaŃi amestecului de reacŃie
(0.00748 când 18:3-G a fost oxidat de LOX-1 în prezenŃa SDS 0.00383 în
prezenŃa ZW). 1/5 din volumul iniŃial de ZW a influenŃat diferit oxidarea celor
două substraturi având o mai bună acŃiune în cazul acidului linoleic, viteza de
reacŃie crescând de două ori în comparaŃie cu 1-linolenoil-ras-glicerolul (0.00668
şi 0.00368).
O proporŃie de 1/5 din volumul iniŃial de DOX a avut aceeaşi influenŃă în
cazul 18:3-G şi a 18:2 oxidaŃi de către LOX-1 (0.00625 şi respectiv 0.00662).
Împreună cu sonicarea SDS a avut de asemenea o influenŃă pozitivă asupra vitezei
de oxidare (0.00748) a 1-Linolenoil-ras-glicerolului–cea mai bună pentru acest
substrat oxidat de LOX-1-în comparaŃie cu cea a acidului linoleic.

Zwittergent a avut o influenŃă pozitivă asupra oxidării acidului linoleic de
către LOX-1 la 1/5 din volumul iniŃial (1 µl 0.1%)

SDS are o influenŃă mult mai bună asupra oxidării 1-Linolenoil-ras-
glicerolului decât asupra celei a acidului linoleic implicând LOX-1

DOX a avut aceeaşi influenŃă asupra oxidării 1-Linolenoil-ras-glicerolului
şi a acidului linoleic de către LOX-1 la 1/5 din volumul iniŃial (5 µl DOX
10mM)
În cazul folosirii 1-Linolenoil-ras-glicerolului ca substrat şi RM9-LOX ca
enzima ce-i catalizează oxidarea, în prezenŃa DOX viteza de reacŃie a fost
0.00227, aproape de 3 ori mai mică decât atunci când oxidarea a fost catalizată de
Tween 20. Adăugând mai mult Tween 20–dublându-i volumul-viteza de reacŃie nu
 a suferit nici o modificare. În ceea ce priveşte volumul de DOX adăugat, s-a
observat că dublând volumul iniŃial sau scăzându-l la jumătate nu a dus la
creşterea vitezei de reacŃie ci la scăderea acesteia. Adăugând 13-HPOD la volum
dublu de DOX, a menŃinut viteza de reacŃie la un nivel inferior celui iniŃial.
Interesantă a fost observaŃia ca scăzând concentraŃia substratului la jumătate, fără
13-HPOD şi la jumătate volum de DOX viteza de reacŃie a crescut fiind
înregistrată cea mai mare valoare a acesteia pentru acest experiment. În aceleaşi
condiŃii dar scăzând concentraŃia substratului la 1/5 din cea iniŃială a fost
înregistrată o bună viteză de reacŃie, aproape 75% din cea prezentată mai sus, când
½ din cantitatea iniŃială de 18:3-G a fost utilizată. Cu 4µl DOX 1.750µl 1-
Linolenoil-ras-glicerol au fost oxidaŃi de către RMZ-9LOX cu o viteză de reacŃie
de 0.00294 iar în prezenŃa a 4µl DOX, 0.5 µl de 1-Linolenoil-ras-glicerol au fost
oxidaŃi cu o viteză de 0.00193, aceasta demonstrând faptul că viteza oxidării
depinde de raportul 1-Linolenoil-ras-glicerol:DOX .

Viteza de oxidare a 1-Linolenoil-ras-glicerolului de către RMZ-9LOX este

influenŃată de raportul substrat:DOX

I.3.4. Determinarea parametrilor cinetici (KM, Vmax) a LOX pure folosind ca

substrat acidul docosadienoic acid (acid brasic) (22:2)

Scop şi obiective

Modelarea moleculară (Gillmor şi col, 1997; Browner şi col, 1998) a

sugerat că volumul situsului catalitic poate fi important pentru specificitatea
poziŃională a reacŃiei lipoxigenazei, respectiv formarea hidroperoxizilor. Această
ipoteză legată de volumul situsului catalitic a fost la început contrazisă de teoria
bazată pe orientarea substratului care sugerează posibilitatea alinierii substratului
în interiorul situsului cu gruparea carboxil întâi şi nu cu cea metil cum ar fi în mod
obişnuit (Gardner, 1989; Prigge şi col, 1998). Date experimentale recente
sugerează că ambele teorii ar fi corecte (Meruvu şi col, 2005). Experimentul de
faŃă a evaluat posibilitatea oxidării substratului prin alinierea în situsul catalitic cu
gruparea carboxil la început.

Rezultate

Reprezentând [A]/t unde [A] este absorbŃia iar t reprezintă timpul de reacŃie
la care absorbŃia a fost determinată, în funcŃie de concentraŃia de substrat [S], s-a
observat că, la concentraŃii ale substratului mai mari de 200µM, enzima a fost
inhibată de către substrat.
Din graficul Linewaver-Burke parametrii cinetici au fost determinaŃi ca
fiind KM=27.8 µM iar vmax=12.8 µM* s-1*mg.enz.-1
 II. STUDII PRIVIND INHIBIłIA LIPOXIGENAZEI

II.1. INHIBIłIA LIPOXIGENAZEI DE CĂTRE QUERCETINĂ

II.1.1. InfluenŃa quercetinei pure asupra oxidării linoleatului de sodiu de

către lipoxigenaza pură din boabele de soia LOX-1

Scop şi obiective
Pentru a studia modul în care quercetina inhibă reacŃia de oxidare a acidului
linoleic de către LOX-1, trei protocoale experimentale au fost folosite. DiferenŃele
între acestea este dată de ordinea în care reactanŃii (enzima, substratul, inhibitorul)
au fost amestecaŃi, şi de timpul de incubare a acestora. Parametrii cinetici au fost
de asemenea determinaŃi.

Fig.II.5. Reprezentarea schematică a protocoalelor experimentale (1,2,3).

Rezultate

Parametrii cinetici pentru oxidarea linoleatului de sodiu de către LOX-1

Parametrii cinetici calculaŃi pentru LOX-1 oxidând linoleatul de sodiu au
arătat că enzima are o afinitate mare faŃă de substrat (KM=0.13mM) şi că oxidarea
este rapidă (vmax= 30.7 mM/s* µg enzimă).
Parametrii cinetici pentru oxidarea linoleatului de sodiu de către LOX-1 în
prezenŃa quercetinei în diferite concentraŃii
Fig.II.6 prezintă reprezentarea Lineweaver-Burk pentru LOX-1 oxidând
linoleatul de sodiu în prezenŃa quercetinei în următoarele concentraŃii: 100 µM,
50µM, 25µM (A) şi 10µM (B).
A.

40
y = 1.3058x + 11.256
35
R2 = 0.9866
30
y = 3.5445x + 17.774
25 100 uM
R2 = 0.956
20 50 uM

y = 7.8125x + 22.177 25 uM
1/v

15
R2 = 0.7861 trendline (100 uM)
10 trendline (50 uM)
5 trendline (25 uM)

0
-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4
-5

-10
1/[s]

B.
 600
y = 2413.6x - 59.178
500 R2 = 0.878

400

300

200 10uM

100 trendline (10 uM)

0
-0.1 0 0.1 0.2 0.3
-100

-200

-300

Fig.II.6. Reprezentarea Lineweaver-Burke pentru lipoxigenaza-1 oxidând linoleatul de

sodiu în prezenŃa quercetinei la concentraŃii de 100 µM, 50µM, 25µM (A) and 10µM (B);
reprezentarea a fost realizată folosind programul Excel.

Pentru calcularea lui KM şi a vmax ecuaŃiile liniilor de tendinŃă au fost

folosite. În urma calculelor am obŃinut valorile prezentate în tabelul II.3. Din
Fig.II.6.(B) s-a constatat că la concentraŃia de 10 µM quercetina nu are un efect
inhibitor ci mai degrabă acŃionează ca un activator (existând posibilitatea să fie şi
ea oxidată alături de substrat). După cum arată Fig. II.6.A inhibiŃia quercetinei este
una mixtă.
Tabel II.3.
KM, KMapp şi vmax calculate folosind ecuaŃiile liniilor de tendinŃă a reprezentarilor
grafice Linewaver-Burk (Fig.II.6.), în cazul LOX-1 oxidând linoleatul de sodiu în
absenŃa şi în prezenŃa quercetinei în concentraŃii de 10 µM, 25µM, 50µM şi
100µM.

Quercetin KM
vmax
conc. (mM)
(nM/s* µg
µM enzyme)
100 0.12 0.40
50 0.20 0.28
25 0.35 0.20
 10 40.80 0.085*10-3
0 0.13 0.30

InfluenŃa quercetinei 100 µM asupra oxidării linoleatului de sodiu de către

LOX-1 pentru diferite protocoale experimentale (Protocol 1, 2 şi 3)

Din Fig.II.7. se poate observa că cea mai puternică inhibiŃie se realizează în

cazul protocolului 1 când inhibitorul a fost amestecat 5 min cu enzima. O formă
diferită se observă pentru protocolul 2 când quercetina a fost adăugată după 15
minute în amestecul de reacŃie (soluŃia tampon+enzimă+substrat).

inhibition of LOX reaction by Q100 microM

0,065
0,06
0,055
protocol 1
0,05
protocol 2
0,045
v

protocol 3
0,04
without inhibitor
0,035
0,03
0,025
0 5 10 15 20 25
substr.conc.

Fig.II.7. Efectul inhibitor al quercetinei 100 µM asupra reacŃiei lipoxigenazei în

concordanŃă cu Protocol 3, cu Protocol 2 şi cu Protocol 1. Curba de cinetică,
superioară reprezintă formarea produsului de reacŃie în absenŃa quercetinei

Pentru protocolul 1 am obŃinut o curbă Michaelis-Menten tipică. La

concentraŃii de substrat scăzute pentru protocoalele 2 şi 3 (Fig.II.7.), curbele
cinetice încep cu o fază de creştere rapidă a vitezei de reacŃie. Urmează o scădere a
vitezei de reacŃie, care este rapidă, în cazul protocolului 3 şi mai înceată în cazul
protocolului 2. Pentru protocolul 2 graficul continuă cu o uşoară creştere, care în
cazul nostru nu a atins faza de platou, de echilibru. În cazul protocolului 3 o nouă
creştere –nu aşa de mare comparată cu prima fază-urmează pentru concentraŃii ale
substratului cuprinse între 5mM şi 7.5 mM, urmată de o uşoară descreştere pentru
concentraŃii ale substratului mai mari de 7.5mM.

Când substratul a fost amestecat cu inhibitorul pentru câteva secunde, iar

apoi enzima a fost adăugată (Fig.II.7. protocol 3), curba cinetică prezentând o
primă fază de creştere rapidă, arată că hidroperoxizii se formează în cazul
concentraŃiilor mici de substrat chiar dacă este prezentă şi quercetina în amestecul
de reacŃie iniŃial. LOX este parŃial inhibată de quercetină pentru concentraŃia
substratului de 5mM, dar apoi la concentraŃii mai mari ale acestuia enzima devine
activă din nou, nu în aceeaşi proporŃie însă ca atunci când concentraŃia de substrat
este mică.

Dacă LOX a fost incubată cu substratul pentru 15 secunde şi apoi

quercetina adăugată-protocolul 2-, curba cinetică arată că LOX oxidează substratul
producând cea mai mare cantitate de hidroperoxizi pentru concentraŃii foarte mici
de substrat oxidate. Quercetina inhibă parŃial reacŃia la concentraŃii ale substratului
cuprinse între 5mM şi 7.5mM.
 \

II.1.2. InteracŃiunea intermoleculară între lipoxigenază şi quercetină este

influenŃată de pH şi timpul de incubare

Scop şi obiective

Aceste experimente au avut ca scop studiul interacŃiunilor intermoleculare

dintre LOX-1 pură şi quercetină prin spectroscopie UV-Vis, precum şi studiul
influenŃei pH-ului şi a timpului de incubare asupra acestei interacŃiuni.

Rezultate

InfluenŃa pH-ului asupra interacŃiunii dintre lipoxigenază şi quercetină

 În figura II.8 sunt prezentate spectrele amestecului LOX+quercetină. Trei
maxime de absorbŃie (1, 2, 3) se înregistrează la momentul t=0 şi la t=60 min de
incubare. Maximul 1 corespunde Benzii II, maximul 3 Benzii I, ambele
caracteristice spectrului UV-Vis characteristic flavonoidelor, în timp ce maximul 2
indică formarea unui nou compus ca rezultat al reacŃiei dintre lipoxigenază şi

quercetină.
Fig.II.8. Spectrele de absorbŃie ale amestecului LOX (S1)+quercetină (50µM) la
momentul iniŃial (min 0) (A), şi după 60 min de incubare(B).

Analizând maximul de absorbŃie pentru semnalele 1 şi 3 după 60 min de

incubare a LOX cu quercetină se poate vedea că efectul batocromic este menŃinut
şi chiar accentuat (392 nm pentru pH=9 şi 394,2 pentru pH=6.1) pentru semnalul 3
dar nu pentru 1. Această observaŃie indică faptul că pH-ul alcalin favorizează
structura mezomerică I a quercetinei. Structura mezomerică I este dată de tranziŃia
electronilor în cadrul sistemului cinamoil (nucleele benzenice B+C), sistem care în
continuare constituie baza de formare a acidului protocatecuic. Acidul
protocatecuic reprezintă produsul de degradare a quercetinei sub acŃiunea
lipoxigenazei (Borbulevych et al, 2004).
După 60 min de incubare, (Fig.II.8) se observă pe lângă deplasarea
batocromică şi o dscădere a intensităŃii de absorbŃiepentru ambele benzi I şi II.
Zsila şi col (2003) studiind interacŃiunea intermoleculară dintre quercetină şi
albumină, au observat ca o deplasare batocromică a maximului şi descreşterea
intensităŃii de absorbŃie indică legarea quercetinei în formă anionică şi în
conformaŃie ne-planară. În cazul nostru ruperea nucleului cinamoil este favorizată
la pH=9, şi de asemenea de prezenŃa quercetinei în formă anionică. La pH alcalin
structura mezomerică I a quercetinei pierde protonul de la C4’ şi forma anionică
dată de atomul de oxigen legat de C4 devine preponderentă. De asemenea după 60
min se inregistrează un nou semnal; semnalul 2 (λ~321nm), apare indicând că un
nou compus s-a format în amestecul de reacŃie după 60 min.

InteracŃiunea lipoxigenază - quercetină pentru concentraŃii diferite de

quercetină
Reprezentând absorbŃia în funcŃia de lungimea de undă se poate observa
(Fig.II.9) că absorbanŃa creşte proporŃional cu concentraŃia de quercetină.
DependenŃa interacŃiunii lipoxigenază-quercetină ,de concentraŃia quercetinei este
ilustrată în Fig.II.9.

Fig.II.9. Spectrele suprapuse a lipoxigenazei diluată în tampon borat şi a

amestecului lipoxigenază-quercetină la diferite concentraŃii a acesteia din urmă

II. 2. EFECTUL INHIBITOR AL IZOFLAVONELOR DIN SOIA ASUPRA

ACTIVITĂłII LIPOXIGENAZEI DIN BOABELE DE SOIA

Scop şi obiective
 Scopul acestui experiment este evaluarea spectroscopică a inhibiŃiei
lipoxigenazei pure din boabele de soia (sLOX-1) de către un extract bogat în
genisteină şi daidzeină (SIE), prin determinarea parametrilor cinetici.

Rezultate

Caracterizarea SIE prin analiza HPLC

Izoflavonele agliconice majoritare din extractul din boabele de soia, au fost

daidzeina şi genisteina (Fig.II.10).
mAU

Genistein
20

15
Daidzein

10

0 5 10 15 20 25 30

Retention time

Fig.II.10. Cromatograma HPLC a extractului de izoflavone din soia (SIE).

Genisteina şi daidzeina au fost identificate. SIE a fost analizat prin HPLC folosind
un sistem Hewlett-Packard cu detector PDA şi coloană Eclipse XDB-C18 (25cm x
4.6mm, 5µm). Faza mobilă izocratică a fost metanol: acid orto-fosforic (50:50,
v/v). Rata de injecŃie a fost ml/min. Volumul de injecŃie a fost de 10 µl, iar
cromatogramele au fost înregistrate la 280 nm.

InhibiŃia lipoxigenazei standard de către SIE

Curbele cinetice Michaelis-Menten ale reacŃiei de oxidare a lipoxigenazei
în prezenŃa şi absenŃa quercetinei şi a izoflavonelor standard şi în extract la o
concentraŃie a acestora de 0.5 µM (pentru inhibitorii standard nu şi pentru extract)
sunt prezentate în Fig.II.11.
Fig.II.11. Curbele de cinetică Michaelis-Menten pentru inhibiŃia lipoxigenazei-1
de către quercetină, b, (-■-), genisteină, c, (-▲-), daidzeină, d, (-●-), şi extractul
izoflavonic, e, (-♦-) la aceeaşi concentraŃie (0.5 µM) suprapuse cu curba cinetică a
reacŃiei lipoxigenazei fără inhibitor, a (…♦…).

Rata reacŃiei lipoxigenazei în absenŃa şi în prezenŃa extractului izoflavonic

SIE este prezentat în Fig.II.12.

Fig.II.12. Rata reacŃiei lipoxigenazei în absenŃa (A) sau prezenŃa extractului SIE
(B) (ce conŃine 2 mM genisteină şi 1.8 mM daidzeină).

Ca şi în cazul inhibitorilor standard, SIE a inhibit activitatea LOX. Trebuie

menŃionat faptul ca în extract concentraŃia izoflavonelor (2mM pentru daidzeină şi
1.8 mM pentru genisteină) decât cea a standardelor luate în lucru. Rezultatele arată
ca extractul are o activitate inhibitorie crescută la concentraŃii mici de substrat
(2.5-5 mM), comparativ cu standardele. În cazul concentraŃiilor mai mari de
substrat (33-40 mM), SIE prezintă o activitate inhibitorie slabă raportata la
standarde, quercetină şi izoflavone. EficienŃa inhibitorie a izoflavonelor depinde
atât de concentraŃia lor cât şi de cea a substratului. Spre exemplu genisteina la
concentraŃiile de 0.5 şi 2.5 µM prezintă cea mai bună activitate inhibitorie la
concentraŃii ale substratului între 5 şi 10 mM.

Izoflavonele din boabele de soia inhibă LOX fie ca agliconi fie în formă
glucozilată. Izoflavonele acŃionează ca inhibitori în două moduri: alterând
formarea hidroperoxizilor şi astfel prevenind generarea de enzimă activă în stare
ferică, activă (1) şi reducând enzima ferică la starea sa inactivă, feroasă (2)
(Mahesha şi col, 2007). Mahesha şi col, (2007) propun următorul mecanism prin
care izoflavonele inhibă lipoxigenaza: un electron donat de izoflavone este
acceptat de forma ferică (Fe3+) a LOX, care este redusă astfel la forma sa inactivă,
feroasă (Fe2+). Genisteina nu este nici consumată, nici nu suferă schimbări
structurale în timpul acestui proces (Mahesha şi col 2007), în timp ce quercetina
intrând în situsul catalitic al lipoxigenazei este degradată la acid protocatecuic
(Borbulevych şi col, 2004) poziŃionat în vecinătatea ionului de fier, centrul
catalitic al lipoxigenazei.
 II.3. ACTIVITATEA LIPOXIGENAZEI ÎN PREZENłA CATECHINEI,
EPICATECHINEI ŞI A UNOR PROCIANIDINE ÎN MEDIU BIOTIC ŞI
ABIOTIC

Experimentele prezentate în acest capitol au avut ca scop evaluarea

inhibiŃiei lipoxigenazei standard (LS)şi în extract (LE) de către catechina pură
(CS) şi un extract polifenolic(PE) din sâmburi de struguri, ce are în compoziŃie
catechină, epicatechină şi procianidine. Evaluarea s-a făcut atât în mediu abiotic
cât şi în mediu biotic-cultură de leucocite. Ambele extracte au fost analizate prin
LC-MS.

II.3.1. CompoziŃia în polifenoli şi stabilitatea extractului apos din sâmburi de

struguri din soiul Merlot Recaş

Aceste experimente au fost parŃial finanŃate de proiectul TD 392/2007 şi a

fost realizat în colaborare cu Departmentul de Chimie Organică a FacultăŃii de
Inginerie în BioştiinŃe a UniversităŃii din Ghent, Belgia.
Având în vedere acŃiunile benefice asupra sănătăŃii ale extractului apos din
sâmburii de struguri precum şi potenŃiala exploatare a resturilor rămase de la
fabricarea vinului, compoziŃia extractului a fost determinată calitativ şi cantitativ
prin LC-UV-DAD şi LC-ESI -MS
Cum polifenolii sunt sensibili la oxygen, lumină şi mediu alcalin, dar mai
puŃin la temperatură, respectiv căldură, stabilitatea flavan-3-olilor şi a
procianidinelor din extract a fost evaluată după 6 luni de păstrare la 4ºC.

Rezultate

Caracterizarea prin HPLC-MS a flavan-3-olilor şi a procianidinelor din

extractul proaspăt (PE)
Determinarea compuşilor fenolici a fost făcută la 220, 280 şi 320 nm.
Pentru a verifica prezenŃa sau absenŃa antocianilor analiza a fost făcută şi la 520
nm. Cromatogramele prezentate în Fig.II.13 (A şi B) au fost obŃinute la 280 nm,
lungimea de undă specifică pentru absorbŃia catechinelor. La 520 nm, nu s-a
observat nici un semnal şi în consecinŃa s-a dovedit absenŃa antocianilor atât în
extractul proaspăt cât şi în cel păstrat.

A.

B.

Fig.II.13. (A and B). Cromatograma extractului PE înregistrată la 280 nm, obŃinută

prin analiza LC-MS (A). Valorile m/z ale semnalelor indică prezenŃa compuşilor
de tip catechinic. Aceşti compuşi sunt prezenŃi ca monomeri, dimeri şi trimeri
după cum sunt prezentaŃi în Tabelul II.4.
Cromatograma extractului PES înregistrată la 280 nm, obŃinută prin analiza LC-
MS (B). Valorile m/z ale semnalelor indică prezenta compuşilor de tip catechinic.
Aceşti compuşi sunt prezenŃi ca monomeri, dimeri şi trimeri după cum sunt
prezentaŃi în Tabelul II.5.

Prin analiza HPLC a PE (Fig.II.13.A) s-a obŃinut cromatograma cu semnale

intense de-a lungul a mai mult de 16 min de eluŃie.Aceste semnale corespund
flavan-3 olilor monomerici şi proantocianidinelor dimerice şi trimerice. Acest
fingerprint cromatografic este datorat complexităŃii proantocianidinelor ce au o
masă moleculară mare.
Compuşii au fost identificaŃi pe baza timpilor de retenŃie (tR), spectrul UV
(obŃinut cu DAD) şi spectrul MS (obŃinut cu detectorul ESI). Structura compuşilor
identificaŃi a fost desemnată pe baza datelor de literatură (Pati şi col, 2006; Amico
şi col, 2004). Pentru catechină şi epicatechină identificarea a fost făcută de
asemenea prin compararea cu tR, spectrele UV şi MS obŃinute prin analiza HPLC-
MS a standardelor respective.
Compuşii identificaŃi asociaŃi valorilor m/z obŃinute, precum şi cantitatea în
care sunt prezenŃi în extract sunt prezentaŃi în Tabelul II.4. Fragmentarea MS a
fost luată în considerare pentru elucidarea structurilor prezentate după cum se
arată în Tabelul II.4.
 Tabel II.4.
Timpii de retenŃie ai compuşilor identificaŃi în extractul PE în concordanŃă cu Fig.
II.13.(A), asociaŃi cu valorile m/z a semnalelor din cromatogramă, precum şi
cuantificarea acestor compuşi determinată prin LC-MS.

Peak label Retention time Attribution m/z ratio for the base peak [M- Concentration
Numărul (tR) (min) Atribuirea H]- and other fragmentation [M- (mg(CE)/kg
semnalului Timpul de H]- ions aliquotsa)
retenŃie raportul m/z pentru semnalul de ConcentraŃia
bază [M-H]- precum şi a altor ioni (mg(CE)/kg
[M-H]- obŃinuŃi prin fragmentare probăa)
1 6.7 Gallic acid 169 74±0.200
2 8.03 Galloyl glucose 331 26±0.200
3 9.3 Non identified 203, 365, 857, 905 86±0.200
4 9.8 Procyanidine 577
94±0.200
dimmer
5 10.3 Procyanidine 331,432, 577
89±0.200
dimer
6 10.5 Trimer 274, 483, 577, 865 87±0.300
7 11.3 Catechin 289 397±0.300
8 11.7 Procyanidine 577
193±0.300
dimmer
9 12.2 Trimer (E)C 289,577, 865
coelutes with 149±0.300
12.33
10 12.33 (E)C-(E)CG 289,443,577,729,865
dimer coelutes 173±0.300
with 12.2
11 12.7 Trimer (E)C 865, 729
coelutes with
171±0.300
(E)C-(E)CG
dimer
12 13.1 Epicatechin 289 581±0.300
13 14.02 Procyanidine 577
234±1.000
dimmer
14 14.7 Trimer 865 193±1.100
15 15.7 (E)CG 441 120 ±1.100
IS 22.5 IS Coumaric acid 163
a
Bazată pe determinarea spectrofotometrică (UV-DAD) şi raportată la catechină. Valorile sunt exprimate în
mg/Kg extract din sâmburi de struguri uscaŃi

Caracterizarea prin HPLC-MS a flavan-3-olilor şi a procianidinelor din

extractul păstrat (PES )
Fig.II.13.B prezintă cromatograma extractului PES păstrat timp de 6 luni la
4ºC. Comparată cu Fig.II.13.A, mai puŃine semnale se identifică şi cel mai
puternic dintre ele are tR=6.7 min.
 Identificarea compuşilor din PES s-a făcut, ca în cazul extractului proaspăt,
prin corelarea cu caracteristicile (timpul de retenŃie LC-MS, spectrul UV-Vis şi
tipul de fragmentare) compuşilor standard pentru catechină şi epicatechină, şi cu
datele din literatură pentru ceilalŃi compuşi. Tabelul II.5. prezintă compuşii
corespunzători semnalelor obŃinute, împreună cu fragmentele ionice, spectrul UV-

Peak label Retention Attribution m/z ratio for the base UV-Vis Concentration
Numărul time (tR) Atribuirea peak [M-H]- and other absorption (mg(CE)/kg
semnalului (min) fragmentation [M-H]- maxima aliquotsa)
Timpul de ions Maximele ConcentraŃia
retenŃie raportul m/z pentru de absorbŃie (mg(CE)/kg
semnalul de bază [M- în UV-Vis probăa)

Vis şi analiza cantitativă pentru extractul păstrat.

Tabel II.5
Timpii de retenŃie a compuşilor din extractul PES, după cum se prezintă în
Fig.II.13(B), identificaŃi pe baza maximelor de absorbŃie a spectrelor UV-Vis şi a
valorilor m/z; cuantificarea acestor compuşi a fost făcută prin LC-MC.
 H]- precum şi a altor
ioni [M-H]- obŃinuŃi
prin fragmentare
16 6.7 Gallic acid 189 217, 272
oxidation 52±0.200
product
17 9.2 Non 203, 351, 365, 723 220, 278
identified
13±0.200
oxidation
products
18 10.3 Oxidation 139,419, 577, 940 280
products of
13±0.200
procyanidine
dimers
19 10.5 Oxidation 249, 609, 915 280
products of
15±0.300
procyanidine
trimer
7 11.3 Catechin 289 280 14±0.300
12 13.1 Epicatechin 289 280 28±0.300
20 16.1 Non 197, 808 220, 272
identified
17±0.300
oxidation
products
IS 22.5 IS Cumaric 163
acid
a
Bazată pe determinarea spectrofotometrică (UV-DAD) şi raportată la catechină. Valorile sunt exprimate în
mg/Kg extract din sâmburi de struguri uscaŃi

II.3.2.CompoziŃia în polifenoli a extractului enzimatic LE

Aceste experimente au fost parŃial finanŃate de proiectul TD 392/2007 şi a

fost realizat în colaborare cu Departmentul de Chimie Organică a FacultăŃii de
Inginerie în BioştiinŃe a UniversităŃii din Ghent, Belgia.

Scop şi obiective

S-a demonstrat deja că boabele de soia sunt bogate în izoflavone şi pentru

acest experiment a fost făcută analiza LC-UV-DAD şi LC-ESI -MS unui extract
metanolic (LE). Compuşii separaŃi au fost analizaŃi şi cantitativ.

Rezultate

Fig.II.14. prezintă cromatograma LC-MS a extractului LE înregistrată la

280 nm. Compuşii au fost identificaŃi pe baza timpului de retenŃie (tR), spectrul
UV şi spectrul MS (obŃinut cu detectorul ESI). Structura compuşilor identificaŃi a
fost determinată pe baza literaturii de specialitate (Klejdus şi col, 2004; Otieno şi
Shah, 2007; Deavours şi Dixon, 2005).
Fig.II.14. Cromatograma extractului LE la 280 nm obŃinută prin analiză LC-MS,
arătând prezenŃa daidzeinei (D) şi genisteinei (G), cei mai semnificativi compuşi
identificaŃi în acest extract.

Compuşii majori identificaŃi au fost daidzeina (tR=28,16) şi genisteina

(tR=34,81), izoflavone cunoscute a fi importanŃi compuşi bioactivi în boabele de
soia. Maximele de absorbŃie pentru daidzeină au fost la 248 nm şi 308 nm iar
pentru genisteină la 260 nm.
Raportul m/z pentru fragmentul de bază [M-H]-, a fost 253 pentru daidzeină
şi 269 pentru genisteină. Analiza cantitativă pe baza determinării UV-DAD a
arătat că LE conŃine 4 mg/kg probă pentru daidzeină şi.10 mg/kg probă pentru
genisteină.

II.3.3. InteracŃiunea dintre lipoxigenaza pură şi din extract şi catechina pură

şi dintr-un extract polifenolic ca model de studiu al modulării echilibrului
oxidant/antioxidant în condiŃii abiotice şi biotice

Scop şi obiective
 Efectul inhibitor al antioxidanŃilor asupra lipoxigenazei, depinde de starea
fizico-chimică a substratului şi de tipul de lipoxigenază, şi se schimbă complet în
funcŃie de condiŃiile de reacŃie (Noguchi şi col, 2002). Prin spectroscopie UV-Vis
am evaluat interacŃiunea dintre extractul de lipoxigenaze LE şi compuşii de tip
catechinic din extractul apos din sâmburii de struguri atât în condiŃii abiotice, cât
şi în condiŃii biotice-cultură de leucocite. Deşi condiŃiile in vitro nu reprezintă în
proporŃie de 100% condiŃiile in vivo, acest studiu îşi propune evaluarea proceselor
oxidative ce au loc prin interacŃiunea celulelor cu molecule cu valoare nutriŃională
nu doar în stare pură dar şi ca extracte primare. DependenŃa de doză şi de timpul
de incubare a oxidării catechinelor la chinone este implicată în modificarea
echilibrului antioxidant/prooxidant determinat de aceşt flavan-3-oli. Rezultatele
prezentate aici coroborate cu cele ale altor grupuri de cercetare, pot oferi
informaŃii utile pentru găsirea de antioxidanŃi ce se pot adăuga în produsele
alimentare, şi pot constitui de asemenea o bază pentru studiul inhibiŃiei
lipoxigenazei de către compuşii de tip catechinic.

Rezultate

Datele prezentate dovedesc prin spectroscopie UV-Vis, formarea

chinonelor ca produşi de oxidare a extractelor bogate în compuşi catechinici.
Starea acestor compuşi a fost evaluată în condiŃii abiotice şi în mediul biotic extra-
şi intracelular. Ca prooxidant s-a folosit lipoxigenaza standard din boabele de soia
precum şi un extract primar bogat în aceste enzime (Chedea şi col, 2008), din
cauza interesului manifestat pentru inhibarea acestei enzime de diferite clase de
polifenoli.
Literatura de specialitate prezintă o multitudine de date evidenŃiind
capacitatea antioxidantă a catechinelor ca o însuşire esenŃială a utilizării acestora
în prevenirea unor boli. Cu toate acestea alte studii au demonstrat că şi ca
prooxidant aceste flavonoide ar putea contribui la efectele benefice asupra
sănătăŃii, prin faptul că se activează enzimele detoxifiante (Azam şi col, 2004;
Lee-Hilz şi col, 2006).
Diferite tipuri de oxidare au fost determinate, în cazul nostru, prin obŃinerea
de maxime de absorbŃie UV-Vis diferite pentru produşii de reacŃie. Am arătat
astfel că modelul de oxidare este diferit în cazul moleculelor standard comparativ
cu cel al extractelor.
Produşii de oxidare a catechinei atât ca moleculă pură (CS), cât şi ca extract
(PE) s-au format în mediul extracelular şi în cel intracelular.
• În condiŃii abiotice lipoxigenaza (pură) prezintă un puternic efect
prooxidant asupra cetechinei pure şi a polifenolilor din extract. Oxidarea
enzimatică a catechinei şi a polifenolilor ia loc cu formare de dimeri.
• SituaŃia este diferită în cazul culturii celulare. În mediul extracelular
catechina şi polifenolii sunt oxidaŃi în prezenŃa lipoxigenazei standard pure
dar nu se mai formează dimeri. Aceasta demonstrează faptul că reactivitatea
polifenolilor şi a lipoxigenazei este modulată de celule prin aparatul
enzimatic. Hong şi col (2002) au arătat că stabilitatea EGCG a crescut în
pezenŃa celulelor, acest efect putând fi cauzat de proteine şi alte molecule
antioxidante prezente în celulă. În cazul nostru autooxidarea catechinelor şi
a polifenolilor din extract are loc în mediul extracelular. Autooxidarea
flavonoidelor are loc de obicei în soluŃii alcaline apoase şi este însoŃită de
producerea de radicali anionici, superoxidul şi peroxidul de hidrogen
(Dangles şi col, 2000). In condiŃii tipice de culturi celulare la pH 7.2–7.4,
EGCG se autooxidează rapid ducând la formarea a doi compuşi cu structură
dimerică (Hong si col, 2002). În matricea intracelulară s-a observat
formarea chinonelor ca rezultat al interacŃiunii dintre catechine şi
lipoxigenază (Table II.6). Studiul de faŃă arată că chinonele formate prin
oxidarea catechinelor sunt implicate în modularea echilibrului
antioxidant/prooxidant la nivel celular în prezenŃa sau absenŃa lipoxigenazei
ca inductor de stres oxidativ.
 Table II.6.
Formarea chinonelor (exprimată prin maximele de absorbŃie UV-Vis) în cultura
celulară prin oxidarea polifenolilior determinată prin spectroscopie UV-Vis şi stres
mitochondrial (testul MTT). Creşterea (↑), scăderea (↓) sau condiŃiile neschimbate
(NC) sunt comparate cu celulele netratate, (% of control)

3hrs 24hrs
Exp.variant Quinone MTT Effect Quinone MTT Effect
formation assay formation assay
CS ↑* ↓ AOX + Hq ↑* ↑ ProOX + Hq
CS+LS ↑* ↑ ProOX + Hq ↓* ↓(very AOX + Lq
little)
CS+LE ↑* ↑* ProOX + Hq ↓ ↑ ProOX + Lq
1/2CS ↑* ≅ with NE+ Hq ↓* ↓ AOX + Lq
the
control
1/2CS+LS NC ↑ ProOX + Lq ↓* ↑ ProOX + Lq
1/2CS+LE ↑* ↑ ProOX + Hq ↓* ↑* ProOX + Lq
PE ↑ ↑* ProOX + Hq ↓ ↑* ProOX + Lq
PE+LS NC ↑* ProOX + Lq ↓* ↓ AOX + Lq
PE+LE ↑* ≅ with NE+ Hq ↓* ↑* ProOX + Lq
the
control
1/2PE ↑* ↑* ProOX + Hq NC ↓* AOX + Lq
1/2PE+LS ↑* ↑ ProOX + Hq ↓* ↓ AOX + Lq
1/2PE+LE ↓* ↑ ProOX + Lq ↑* ↓ AOX + Hq
* semnificativ statistic pentru p<0.05 . Hq- High quinone; Lq- Low quinone; AOX- Antioxidant;
ProOX-Prooxidant, NE – No effect, NC- non-changed

Alături de activitatea lor antioxidantă catechinele prezintă şi efect prooxidant

având potenŃial de oxidare la chinone şi semichinone ceea ce duce la alte cicluri
redox şi producerea de specii reactive de oxigen precum şi la alchilarea tiolior,
ADN-ului şi a proteinelor (Galati şi O’Brien, 2004; van der Woude şi col, 2006).
Deoarece flavonoidele au tendinŃa de a acŃiona mai degrabă ca antioxidanŃi decât
ca prooxidanŃi, un stres oxidativ generat de producerea de chinone, la o primă
privire nu ar putea explica proprietăŃile curative a acestor compuşi. În cazul nostru
în principiu, cantitatea mare de chinone generează un efect prooxidant, însă
această situaŃie s-a constatat şi atunci când cantitatea de chinone a fost scăzută.
Interesant este faptul că în stare pură catechina este oxidată intracelular producând
o cantitate însemnată de chinone şi care generează un efect antioxidant. Această
situaŃie a fost observată şi când pentru 24 de ore la jumătate de doză PE a fost
incubat cu leucocitele iar apoi LE a fost adăugat pentru încă 1 oră. Extractul PE a
avut o mai bună acŃiune asupra activităŃii prooxidante a LE, când a fost incubat
pentru o perioadă mai lungă (24 de ore versus 3ore) şi la jumătate de doză.
Am demonstrat prin spectroscopie UV-Vis, că chinonele sunt implicate în
modularea activităŃii lipoxigenazei în celule ca rezultat al oxidării catechinelor.
Această concluzie este în acord cu cele ale lui Sadik şi col. (2003) şi Banerjee
(2006). O modificare covalentă ireversibilă a LOX din soia generată de flavonoide
a fost sugerată de Sadik şi col. (2003), când în timpul formării radicalilor peroxil a
acizilor graşi polinesaturaŃi prin acŃiunea lipoxigenazei, flavonoidele sunt co-
oxidate la semi-chinone sau chinone, care la rândul lor se leagă la grupările
sufhidril şi amino ale enzimei cauzând inhibarea acesteia (Banerjee, 2006).

II.4. EVALUAREA UNOR CAROTENOIDE CA INHIBITORI DE

LIPOXIGENAZĂ

Scop şi obiective

Este cunoscut că anumiŃi compuşi care sunt antioxidanŃi, cum ar fi β-

carotenul (Lomnitski şi col, 1993), în adiŃie la α-tocopherol şi L-ascorbat (Packer,
1992; Buettner, 1993), sunt capabili să inhibe LOX din diverse sisteme.
Scopul acestui studiu a fost evaluarea efectului unor carotenoide, standard
şi în extract asupra activităŃii lipoxigenazei standard oxidând acidul linoleic.

Rezultate

Figura II.15 prezintă curba de cinetică Michaelis-Menten considerată

standard pentru formarea hidroperoxizilor (HPOD) prin reacŃia lipoxigenazei de
oxidare a acidului linoleic. Graficul prezintă o fază exponenŃială urmată de
atingerea echilibrului în faza de platou. Calcularea activităŃii enzimatice specifice
(ESA) a fost făcută pentru faza de creştere exponenŃială (I).

0.9

0.8

0.6
Abs

0.4

0.3
0 200 400 600
Time [sec]

Fig.II.15. Curba cinetică pentru LOX-1 pură inregistrată la 234 nm.

 În primele secunde ale reacŃiei ESA a fost de 5819*10-3 AU/mg*s şi
362*10-3 AU/mg*s după 200 s când formarea de HPOD este terminată.
A

C
Fig.II.16. Curba cinetică pentru activitatea LOX-1-pură înregistrată la 234 nm în
prezenŃa carotenoidelor pure: luteina + formula chimică a luteinei (A), β-carotene
+ formula chimică a β-carotenului (B) şi zeaxantina+ formula chimică a
zeaxantinei (C).

Adăugând β-caroten, luteină şi zeaxantină în amestecul de reacŃie (Fig.

II.16. A, B şi C) forma curbei cinetice se modifică. Trei tipuri de grafice, fiecare
dintre ele specific unui carotenoid, au fost inregistrate. Fiecare reprezentare poate
fi împărŃită în două faze: una corespunzătoare primelor 30 de secunde de reacŃie şi
a doua pentru intervalul de timp 30 sec - 600 sec.
Pentru luteină (Fig.II.16A) şi β-caroten (Fig.II.16B) prima etapă a reacŃiei
este caracterizată printr-o creştere foarte rapidă a vitezei de reacŃie urmată de o
scădere la fel de rapidă. A doua etapă este reprezentată de o uşoară scădere a
vitezei pentru β-caroten (Fig.II.16B) şi de o uşoară creştere pentru luteină
(Fig.II.16A). În cazul zeaxantinei pentru faza întâi a curbei cinetice se observă tot
o creştere foarte rapidă dar pentru primele 5 sec, apoi o descreştere rapidă pentru
următoarele 6 sec urmată de o nouă uşoară creştere şi o scadere rapidă a vitezei de
reacŃie. În decursul fazei a 2-a nu se observă activitate enzimatică (Fig.II.16C).
Deşi luteina şi zeaxantina sunt izomeri nu prezintă acelaşi comportament
inhibitor în cazul oxidării acidului linoleic de către LOX (Fig.II.16A şi II.16C). În
primele secunde ale reacŃiei, cinetica în prezenŃa luteinei este identică cu cea în
prezenŃa β-carotenului (Fig.II.16A şi II.16B).
 0.75

0.7
Abs

0.65

0.63
0 200 400 600
Time [sec]

Fig.II.17. Curba cinetică a activităŃii LOX-1 înregistrate la 234 nm în prezenŃa

extractului din Physalis alkekengi.

Fig.II.17 prezintă cinetica LOX-1 în prezenŃa extractului de Physalis. Faza I

este identică cu cea a zeaxantinei (Fig. II.17 şi Fig.II.16 C).
Datorită faptului că luteina şi β-carotenul au aceeaşi formă a curbei cinetice
pentru prima fază a reacŃiei LOX-1, am asociat această asemănare cu cea a
structurii lor chimice. Comparând structurile luteinei şi a β-carotenului poate
fi remarcat faptul că lanŃul polienic de 9 legături conjugate este elementul comun
ambelor molecule. CorelaŃia acestor însuşiri comune ale curbelor cinetice şi ale
structurilor chimice ne-a dus la concluzia că în primele secunde ale oxidării
acidului linoleic de către LOX-1 se produce o modificare a structurii
carotenoidelor la nivelul sistemului polienic cum a fost arătat şi de Kennedy şi
Liebler (1991). Rezultatele obŃinute de Serpen şi Gökmen (2005) sugerează că β-
carotenul reacŃionează cu radicalul linoleil (L ) la începutul lanŃului de reacŃii
prevenind formarea de diene conjugate (LOO , LOO- and LOOH). Din timp ce L
revine la forma iniŃială LH, enzima nu poate completa ciclul de reacŃie şi astfel
rămâne în stare inactivă Fe(II) (Serpen şi Gökmen, 2005).
AbsorbŃia la 234 nm înregistrează formarea de duble legături conjugate prin
producerea de hidroperoxizi prin oxidarea acidului linoleic de către LOX-1 şi de
asemenea cele date de lanŃul polienic al carotenoidelor, deci ESA este influenŃată
de aceste două elemente.
 În timpul fazei I a reacŃiei ESA pentru carotenoidele saponificate descreşte
în ordinea descreşterii numărului de duble legături în lanŃul polienic după cum
urmează Zeaxantină, P.A., β-caroten şi Luteină.
 CONCLUZII GENERALE

În concordanŃă cu scopul şi obiectivele acestui studiu, am folosit sisteme

experimentale diverse pentru a demonstra comportamentul catalitic al
lipoxigenazei pure şi a extractului îmbogăŃit în lipoxigenze în condiŃii abiotice şi
biotice, influenŃa diverşilor parametrii de reacŃie asupra activităŃii enzimatice,
considerând de asemenea interacŃiunile dintre enzimă şi diferitele clase de
inhibitori luate în lucru.
Concluziile principale ale acestor variante experimentale pot fi enumerate
după cum urmează:
1. Fiecare lipoxigenază preferă un anumit pH pentru a avea o activitate
optimă, dependent de stadiul de extracŃie, diluŃie şi raportul enzimă/substrat, când
acidul linoleic a fost utilizat ca unic substrat. Am găsit că LOX-1 are activitate
maximă la pHm= 9.0, LOX-2 la pHm=6.8 şi LOX-3 la pHm=7.1 DependenŃa
bilaterală a activităŃii LOX-1 de pHm şi E/LS sugerează posibilitatea de modulare
a activităŃii acestor enzime prin modificarea parametrilor menŃionaŃi. Pentru a
inhiba activitatea LOX este recomandat un nivel ridicat al raportului
enzimă/substrat şi un pHm scăzut.
2. Experimentele cu lipoxigenaza pură din boabele de soia LOX-1 şi din
extractele din boabe de soia (cu sau fără degresare) au avut ca rezultat diferite
tipuri de curbe cinetice: de tip “convenŃional” corespunzând la LOX-1 pură şi
extractelor primare din boabele de soia, prezentând o fază exponenŃială urmată de
o fază de platou (1). Pentru extractele degresate (2) graficele au prezentat 3 faze
distincte incluzând o fază rapidă exponenŃială (15 sec), urmată de o perioadă de
“lag” pentru ca în final să aibă o nouă creştere până la atingerea fazei de echilibru
(platou).
3. Extractul primar conŃine în principal LOX-1, dar şi LOX-3, într-un raport
aproximativ de 3:1. LOX-2 în acest extract se găseşte în cantităŃi foarte mici.
Degresarea inhibă aproape complet activitatea LOX-1 la pH acid. Presupunem că
degresarea elimină substratul (acidul linoleic) ce se găseşte în extractul primar şi
acesta este un mecanism simplu de inhibare a LOX-1. Prin restabilirea pH-ului la
neutru sau alcalin, o parte din activitatea enzimatică a fost restabilită, fapt ce poate
fi explicat prin conversia oxidativă a Fe2+ la Fe3+, ce se găseşte în LOX-1 activă.
Cele trei extracte degresate (E2, E3 şi E4) aduse la pH 6.8 şi 7.1 au avut, în general
o imagine asemănătoare a activităŃii lor lipoxigenazice: activitate scazută a LOX-1
şi LOX-2, dar crescută pentru LOX-3, pentru E3 chiar mult mai intensă decât
pentru E1.
4. Am analizat prin GC-MS produşii de reacŃie în cazul LOX din porumb
recombinată. Acidul linoleic luat ca substrat dă doar doi produşi de reacŃie formaŃi
prin autooxidare, în cantităŃi echivalente, în timp ce foto-oxidarea generează un
amestec de patru derivaŃi cu radicalul OOH la atomii de carbon 9, 10, 12 sau 13.
Folosind fosfolipide (lecitina) ca substrat pentru RM9-LOX, am identificat produşi
ca 9- şi 13-hidroperoxizi. Rezultatele GC-MS au arătat de asemenea că
hidroperoxizii rezultaŃi au fost în cantitate mai mică de 1% din totalul produşilor
de reacŃie în cazul oxidării PC şi prin urmare această reacŃie nu este specifică,
enzima noastră recombinată neavând în acest caz activitate oxidantă faŃă de PC.

5. Parametrii cinetici ai, KM şi vmax au fost calculaŃi pentru LOX-1 din

boabele de soia pură, oxidând acidul linoleic la două intervale ale concentraŃiei (5-
100 µM şi 10-200 µM) fie în etanol fie în prezenŃa 13-HPOD şi a Tween 20.

În prima situaŃie vmax=40µM/s*mg enz. şi KM=20 µmol iar pentru al doilea

caz vmax=48µM/s*mg enz. şi KM=25 µmol. AdiŃia lui Tween 20 şi a HPOD-ului au
crescut viteza de reacŃie dar şi KM. Creşterea KM poate fi explicată atât prin
formarea unui complex LOX-HPOD cât şi prin formarea unui acid linoleic micelar
prin adăugarea Tween-ului, substratul fiind mult mai disponibil pentru reacŃie,
detergentul având un rol important în acest caz.
6. Saturând mediul de reacŃie a LOX cu O2 sau adăugând clorură de sodium
nu s-a îmbunătăŃit viteza de reacŃie. La concentraŃii de substrat scăzute, adăugarea
O2 în mediul de reacŃie a scăzut viteza oxidării, conversia substratului la produsul
de reacŃie fiind încetinită prin saturarea cu oxigen.
7. Studiind influenŃa quercetinei pure asupra oxidării linoleatului de sodium
de către LOX-1 pură s-a arătat că viteza reacŃiei scade când concentraŃia de
inhibitor descreşte (de la 100 la 10 µM) şi KM creşte în aceleaşi condiŃii. Valoarea
mai ridicată a constantei de inhibiŃie indică o bună corelaŃie între afinitatea scăzută
a inhibitorului faŃă de enzimă şi viteza de reacŃie. Cel mai bun protocol
experimental pentru inhibarea lipoxigenazei a fost acela când inhibitorul a fost
adăugat înaintea substratului în amestecul de reacŃie.
8. Aceste studii au demonstrat că LOX poate fi inhibată de quercetină în
funcŃie de diverşi factori, cum ar fi, pH-ul şi concentraŃia de quercetină. Valorile
pH-ului pot influenŃa interacŃiunile moleculare dintre LOX-1 pură şi quercetină,
pH-ul alcalin favorizând forma ionică a quercetinei ce interacŃionează cel mai bine
cu lipoxigenaza. InhibiŃia lipoxigenazei, ca rezultat al interacŃiunii intermoleculare
dintre enzimă şi quercetină, este dependentă de concentraŃia inhibitorului. Această
interacŃiune a fost demonstrată prin semnalul spectrului UV-Vis având absorbŃia
specifică la at λ=321 nm după 60 min de reacŃie dintre lipoxigenază şi quercetină,
indicând formarea unui complex intermolecular LOX-quercetină. Când
concentraŃia de inhibitor creşte, formarea acestui nou compus este stimulată; cel
mai puternic semnal înregistrându-se în cazul quercetinei 100µM urmată de
50µM.
9. Efectul inhibitor al izoflavonelor din soia asupra activităŃii lipoxigenazei
a fost confirmat. Cinetica lor specifică şi caracteristicile de inhibiŃie sunt diferite,
genisteina fiind mult mai activă decât daidzeina (ca şi compuşi puri). Extractul
izoflavonic din boabele de soia, cu concentraŃie controlată de genisteină şi
daidzeină (mai mare decât a standardelor) a arătat un potenŃial inhibitor similar
standardelor. Rezultatele noastre indică o acŃiune sinergică a acestor două
componente ale extractului.
 10. Activitatea lipoxigenazei în prezenŃa catechinei, epicatechinei şi a
procianidinelor în mediu abiotic şi biotic a fost de asemenea studiată. Un mediu
prooxidant în exteriorul şi interiorul celulei a fost indus de LOX şi a fost observată
oxidarea polifenolilor cu formare de quinone şi dimeri. Catechina este mult mai
oxidată ca moleculă pură decât în extractul polifenolic. Am observat o perturbare a
echilibrului prooxidant/antioxidant indusă diferit de lipoxigenaza pură şi de
extractul lipoxigenazic şi dependentă de timpul de incubare a polifenolilor.
RelaŃiile doză-efect şi timp-efect a fost observată.
11. Evaluarea acŃiunii inhibitorii a carotenoidelor asupra lipoxigenazei
standard a fost făcută în sistem abiotic. Extractul carotenoidic (conŃinând luteină şi
ß-caroten) are o acŃiune inhibitorie asupra LOX-1 similară cu cea a compuşilor
standard. Structura carotenoidică ce prezintă un lanŃ polienic mai lung induce o
activitate enzimatică mai intensă în primele secunde ale reacŃiei. Această situaŃie
nu este valabilă după 600s de reacŃie, cauza putând fi distrugerea structurii prin
cooxidarea carotenoidelor alături de reacŃia clasică a LOX.

Parte din rezultatele prezentate au fost publicate în revista de

specialitate cotată ISI, Journal of Food Biochemistry, sau au fost acceptate
spre publicare (2 articole în Journal of Food Biochemistry). Parte din
rezultate au fost de asemenea prezentate în cadrul unor conferinŃe şi
simpozioane naŃionale şi internaŃionale.