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Reacción en cadena de la
polimerasa
1 INTRODUCCIÓN
La RCP opera en forma de ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, por lo
que permite obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento en
unas pocas horas. La técnica es sencilla y pueden utilizarla científicos sin
demasiada formación en biología molecular. Los elementos necesarios para
llevarla a cabo se comercializan en forma de juego, y se utilizan en medios
muy variados, desde la investigación forense hasta el diagnóstico clínico.
2 FUNCIONAMIENTO DE LA RCP
3 APLICACIONES
Calidad del ADN: Cuando se trabaja con ADN cuya calidad es óptima no suele
haber problemas en la amplificación y cantidades del mismo por encima e incluso
por debajo de los 5 ng rinden buenos resultados. El problema aparece cuando la
calidad del ADN obtenido no es la idónea, bien porque esté degradado o bien
porque dicho ADN vaya ligado a una serie de contaminantes que pueden inhibir la
actividad de la polimerasa. Si el ADN está degradado por la acción de enzimas de
restricción el que obtengamos o no resultado en la amplificación va a depender
de que el fragmento a amplificar haya sido dañado o no. En el caso en el que
tengamos ADN sin degradar pero unido a una serie de contaminantes habría que
intentar diluir al máximo la muestra para disminuir dichos contaminantes, pero
siempre dentro de un rango de ADN que no esté por debajo del límite de
sensibilidad de la PCR. El problema de las cantidades mínimas de ADN y la
presencia de contaminantes o inhibidores de la Taq es un hecho habitual en
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TECNOLOGÍAS GENÉTICAS
ADN recombinante
Electroforesis
Secuenciación de ADN
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lugares de las cuatro bases. Separando los fragmentos de ADN en función de su longitud
a través de un gel fino, fue capaz de capturar sus imágenes en papel fotográfico. Así se
consiguió un mapa completo del orden de las bases de la cadena original de ADN. Al
mismo tiempo que Gilbert perfeccionaba su método, el bioquímico británico Frederick
Sanger desarrolló una técnica diferente para determinar la secuencia. Ambas técnicas se
han utilizado ampliamente.
Tanto el ADN como el ARN pueden ser aislados desde tejidos o células de humanos o de
animales de experimentación empleando técnicas bioquímicas estándar. Posteriormente,
dichos ácidos nucleicos pueden ser manipulados de diversas formas y con diversos
propósitos los que incluyen desde protocolos experimentales a exámenes de laboratorio de
diagnóstico genético.
agarosa. Para ello se someten las moléculas de ADN que están inmersas en el gel a la fuerza
de un campo eléctrico: como los fragmentos de ADN tienen carga negativa (por sus grupos
fosfato) todos se mueven en la misma dirección hacia el ánodo, migrando más
rápidamente los fragmentos más pequeños.
Las moléculas de ADN separadas se pueden visualizar mediante su tinción con bromuro de
etidio, un colorante que se intercala entre las bases del ADN y que emite fluorescencia
cuando se irradia con luz ultravioleta.
Para determinar el tamaño del fragmento de ADN de interés se carga en el mismo gel una
mezcla de fragmentos de ADN de tamaño conocido (estándar), los cuales sirven como
referencia de peso molecular (Figura 3).
Este método se utiliza normalmente para separar fragmentos de ADN producidos por
cortes con ERs y permite determinar el tamaño de los fragmentos generados. Si se analiza
el mismo ADN con otras ERs se puede generar el llamado "mapa de restricción" de un gen
con la localización de los sitios de reconocimiento de varias enzimas. Este mapa se puede
comparar con el mapa de restricción de otras muestras de ADN, permitiendo, por ejemplo,
la detección de deleciones u otros reordenamientos de un gen.
Un fragmento de ADN, obtenido generalmente por corte del ADN con ERs, se une
covalentemente por medio de la enzima ADN ligasa a un vector o plásmido, que ha sido
digerido con la misma enzima de restricción utilizada para preparar el ADN de interés. De
esta manera se genera una molécula nueva y única denominada recombinante. El vector
utilizado contiene por un lado, secuencias que le permiten replicarse (origen de
replicación) y por otro lado, secuencias para su posterior selección (por ejemplo genes que
confieren resistencia a antibióticos específicos).
El paso siguiente consiste en introducir la molécula de ADN recombinante a un
microorganismo adecuado. Para ello se usa generalmente una cepa de laboratorio de la
bacteria Escherichia coli. Las bacterias que llevan el ADN recombinante son seleccionadas
por su resistencia al antibiótico codificado por el plásmido. Las bacterias que incorporan el
vector lo replican, por lo que contienen varias copias del mismo plásmido recombinante.
Como es posible cultivar cantidades casi ilimitadas de estas bacterias se puede amplificar
la molécula recombinante, y por lo tanto purificar grandes cantidades del plásmido.
Con la misma metodología es posible obtener plásmidos recombinantes que permitan
expresar en gran cantidad una proteína de interés. En este caso se requiere que el vector
contenga secuencias que dirijan en forma eficiente la transcripción y traducción del gen en
bacterias. De esta manera se puede producir grandes cantidades de proteínas
recombinantes, incluso a nivel industrial. Ejemplo de ello es la producción entre otros de
insulina y factor de crecimiento recombinante los cuales ya están disponibles para uso
clínico.
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Figura 7. El método de los didesoxinucleótidos para la secuenciación del ADN. Con este
método se obtiene una población de fragmentos de ADN de distinto largo, cada uno de los
cuales contiene en su extremo 3' un tipo particular de didesoxinucleótido (ddG, ddA, ddT
óddC). Los productos se separan por electroforesis en gel. La secuencia del ADN es leída
desde los fragmentos más pequeños a los más grandes. En este ejemplo se muestra las
autorradiografías de geles de secuencia de una región codificante del gen supresor de
tumor p53 en dos muestras de ADN: a) muestra de ADN de un individuo normal; b)
muestra de ADN de un individuo con un tumor vesicular. Las secuencias obtenidas
difieren en un nucleótido, el que se indica con una punta de flecha, lo que genera un
cambio de codón en la secuencia de ADN del individuo con cáncer: en lugar de un codón
TCC (Ser) en la posición 241 la secuencia leída es TTC (Phe).
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LA HUELLA GENETICA.
Cada célula de nuestro organismo posee 46 cromosomas (23 pares) formados por ADN
(ácido desoxirribonucleico) que contienen en sus complejas estructuras el Código genético.
Este ADN está formado por nucleótidos dispuestos en una doble cadena helicoidal y
compuestos a su vez por un azúcar, pentosa (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base
nitrogenada. Estos azúcares y fosfatos son iguales, mientras que las bases son diferentes, lo
que permite distinguir cuatro tipos de nucleótidos cuyas bases les dan nombre: adenina
(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). Las bases se unen unas con otras de una manera
especial, las A con las T, y las G con las C (A-T, G-C) por medio de puentes de Hidrógeno,
dos y tres respectivamente. La mitad del ADN del genoma humano es no codificante y de
éste, la mitad es repetitivo (aprox. un 25 % del ADN total). A su vez, la mitad de éste, lo
forman secuencias repetidas de dos clases: SINES o elementos dispersos cortos de 500 bp
y LINES o elementos dispersos largos, de más de 500 bp.
La otra mitad es el ADN repetido en tandem, parte del cual son los llamados satélites (I,
II, III y IV) y los minisatélites, formados por escasos bp, que son los que tienen más
capacidad individualizadora. Las unidades en tandem son de 15 a 20 bases que se pueden
repetir de 200 a 1.400 veces.
Jeffreys y col. (Nature, 314, 1985) señalan que el genoma humano contiene muchas
regiones minisatélites dispersas en tandem, muy polimórficas debido a la variación
alélica que se produce al repetirse. Precisamente éste es el motivo de que las pruebas
basadas en la repetición de los tandem de una secuencia permitan detectar muchos loci
muy variables simultáneamente lo que proporciona así una huella genética
específicamente individual muy útil en el análisis de materiales diversos.
Las moléculas de ADN que constituyen los cromosomas son de gran longitud midiéndose
en Kilobases (Kb). Cada Kb equivale a 1.000 pares de bases (bp). Para darnos idea de esta
longitud señalaremos que el cromosoma X mide 150.000 Kb y el Código genético una
longitud de 3.000 millones de bases.
Los análisis de ADN se basan en la propiedad que tienen sus cadenas de ser rotas por
métodos físicos o químicos a nivel de las uniones de Hidrógeno, obteniéndose así
segmentos de ADN de cadena simple con capacidad para ser duplicados formándose ADN
de doble cadena. Para analizar el polimorfismo del ADN usamos las llamadas sondas o
segmentos de ADN marcados con algún elemento radiactivo (P32), enzimas u otros,
consiguiendo que se unan éstos con el ADN complementario (hibridación).
Al cortar el ADN por los lugares adecuados, podemos detectar diferencias en la longitud de
los fragmentos (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) y polimorfismos
VNTR (Variable Number of Tandem Repeats).
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Las sondas utilizadas pueden ser multilocus con las que se consigue el llamado "DNA
fingerprint" al unirse la sonda a muchos loci. Y pueden ser monolocus o unilocus que
detectan loci VNTR individuales muy polimorfos.
En cambio el ADN puede servir como huella genética y ser analizado en muestras de gran
antigüedad como veremos más adelante. De manchas de sangre y semen de 3 a 5 años de
antigüedad es perfectamente posible obtener ADN suficiente para aislar huellas genéticas
capaces de determinar la identificación individual.
La violación ha sido uno de los delitos más frecuentes en todos los tiempos, una forma de
agresión sexual en la guerra y en la paz. Castigada por los Códigos penales antiguos y
modernos, ha planteado con frecuencia tremendas dudas a la Justicia sobre el hecho de si
hubo o no hubo consentimiento por parte de la víctima, además de averiguar quién fué
realmente el agresor. Los exámenes externos permitieron casi siempre comprobar la
existencia de rotura del himen en las vírgenes, el estado de las carúnculas mirtiformes, con
la excepción de los llamados "hímenes complacientes" cuya notable elasticidad permite la
"inmisio penis" sin producir lesión visible. La presencia de semen en la cavidad vaginal, las
lesiones del cuerpo de la víctima y el caso extremo pero no infrecuente de la muerte
violenta de ésta tras la violación o precediendo a ésta, complicaron más las situaciones.
Hasta hace pocos años se determinaba el HLA, antígeno que está presente en todas las
células del organismo y que constituye una huella notable, con la probabilidad de 1/40.000
de que dos personas no emparentadas presenten el mismo resultado. Pero el HLA tiene el
inconveniente de ser sumamente frágil, pudiendo destruirse en cuestión de horas, lo que a
menudo sucede en los casos de violación hasta que la víctima es examinada.
El estudio del ADN por medio de "sondas", permite interrogar al Código genético de las
secreciones del delincuente y recibir una respuesta muy precisa. JEFFREYS, GILL y
WERRETT (Nature, 316, 1985) realizando investigaciones detalladas en el Home Office
Forensic Service, llegaron a este descubrimiento. En el semen del violador como en el de
toda célula de cualquier persona, está contenida su huella genética, una huella tan
precisa o más que la huella dactilar tradicional que permite llegar a la identificación
individual con gran exactitud y precisión.
La probabilidad de que haya dos huellas iguales es de 1/6.300.000.000. Por eso se dice
con razón huella genética como se dice huella dactilar a los dibujos de las yemas de
los dedos que también son específicas de cada persona.
número y disposición de los dientes, la fórmula dentaria (la cavidad bucal ha sido llamada
por eso la "caja negra" de nuestro cuerpo comparándola a la que llevan los aviones y que
permite averiguar la causa de los desastres aéreos), el HLA, el grupo sanguíneo, etc.
Pero la huella genética procedente del alfabeto genético permite estudiar desde este
punto de vista tejidos orgánicos como la raíz de los pelos, los leucocitos de la sangre, los
espermatozoides, la piel, el líquido amniótico o cualquier célula humana y encontrar en el
núcleo de la misma el patrón genético que caracteriza a cada individuo.
Hay dificultades en los casos de los fetos macerados. Es fácil en los casos de preñez
reciente cuando se puede disponer de tejidos trofoblásticos. La degradación del ADN fetal
en fetos macerados ha hecho a veces imposible el análisis. Sin embargo en algunos casos
aún es posible obtener buen material para el análisis, del vértice del pulmón y del encéfalo
por ser zonas más protegidas por las estructuras óseas.
Debido a que en ocasiones la muestra que hay que analizar viene alterada o es escasa, el
método de sondas RFLP no basta para llegar a resultados valorables. KARY MULLIS ideó
otra técnica llamada PCR o Reacción en cadena de la polimerasa, por medio de la cual, con
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El PCR es tan sumamente sensible que permite analizar incluso muestras degradadas. Esta
técnica presenta muchas posibilidades en Criminalística y Ciencias antropológicas en
general.
En los estudios del ADN en diferentes tejidos se ha podido observar que el procedente del
músculo cardiaco, bazo y hueso es el menos degradado, mientras que el que procede el
hígado es el que más fácilmente se degrada.
No existe una correlación estricta entre el estado de degradación del ADN y la data de la
muerte. Se ha encontrado ADN de elevado peso molecular en la pulpa dentaria en casos en
los cuales las condiciones en que quedó el cadáver fueron muy adversas.
S. PÄÄBO (Nature, 314, 1985) estudió 23 momias egipcias obteniendo de ellas ADN. En
uno de los casos se trataba de un niño en el que el ADN pudo ser clonizado
molecularmente en un vector plásmido. En este clonus encontró dos elementos de la
familia Alu de la secuencia humana repetitiva de ADN. Este análisis demostró que
muestras de ADN de momias (3,4 Kb) pueden ser clonizadas y que los fragmentos de ADN
parece que contienen muy pocas o ningunas modificaciones postmortem.
Las muestras estudiadas variaron desde las procedentes de la VI Dinastía (-2370 -2160
a.C.) hasta las de los tiempos romanos tardíos. Previamente rehidrataba las muestras de
tejido momificado (revitalización) y hacía cortes microscópicos tiñéndolos con los métodos
clásicos y con Bromuro de etidio que permite detectar pequeñas cantidades de ADN.
Halló núcleos en células de cartílagos de la oreja (en una cabeza de mujer del Museo
egipcio de Berlín) y de epidermis y tejido subcutáneo de la cabeza de un hombre del Museo
Viktoria de Uppsala. Si bien existían pirimidinas modificadas en el segundo caso, lo que
hacía imposible su clonización, en cambio en un niño de un año momificado, procedente
del Museo egipcio de Berlín, estaban excelentemente conservados los núcleos. La prueba
del C14 en este caso dió una antigüedad de 2430+120.
La conservación histológica de los tejidos momificados fué mucho mejor en los tejidos
superficiales y partes periféricas del cuerpo que en las más profundas, observación que
también hicieron DANSELS y col. (1970) y CRADEL y col. (1981), debido probablemente a
la imbibición con natrón y la consiguiente deshidratación.
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Los trabajos de todos estos autores han demostrado que el ADN puede ser estable durante
largos periodos de tiempo (miles de años) al menos en ciertos restos humanos y en
condiciones especiales de momificación.
De gran valor antropológico es el estudio del ADN en huesos y dientes antiguos. Las
enormes posibilidades que brinda para la investigación de estos restos son evidentes.
Así HAGELBERG y col. estudiando huesos muy antiguos de 300 a 5.000 años encontraron
aún ADN estable en ellos (Ancient bone DNA amplified, Nature 342, 1989).
LEE y col. (Genetic markers in human bone, J.For.Sc.36, 1991) aislaron ADN de muestras
de tejido óseo humano esponjoso y compacto. Fueron utilizadas para visualizarlo, técnicas
como la espectrofotofluorometría y las tinciones con Bromuro de etidio en minigeles, así
como para estimar la cantidad y el grado de degradación del ADN. El extenso polimorfismo
detectado por este tipo de análisis de ADN está en relación con el número variable de
tandems de repetición (VNTR) dentro de las secuencias de ADN repetitivo en el genoma
humano (HUANG y col. Advances in Forensic Sc. 3 vol. Chicago 1990).
LEE y col. (J.For.Sc.36:320, 1991) para obtener ADN de huesos toman muestras de 10 a 20
mg de hueso esponjoso y 75 a 100 mg de hueso compacto. Las diversas etapas de
tratamiento de estos materiales pueden resumirse así:
4. Secado de la muestra.
7. Extracción del ADN de este polvillo utilizando el método que se emplea para las
manchas de sangre que es el siguiente:
8. Incubación durante una noche a 37ºC con 400 L Extraction Buffer (10 mM Tris, 10 mM
EDTA) y 100 mM (ClNa) pH 8, conteniendo 2% SDS (Sodium dodecyl sulfato) y 4.1 sigma
unidades de Proteinasa K seguido por lo menos de dos extracciones con ClH (pH 8), fenol y
formol equilibrados conteniendo alcohol isoamílico (24:1 v/v).
9. El ADN se precipita con etanol 100 %, se lava con etanol 70 % y se redisuelve en TE (10
mM Tris y 1 mM Na2 EDTA, pH 7.8) buffer.
La aplicación de esta técnica al estudio del diente ha dado excelentes resultados debido a la
sorprendente estabilidad del ADN contenido en la cavidad pulpar. La razón es que en ella
el ADN está protegido, de manera que la contaminación y la acción bacteriana son
mínimas o nulas.
Aisló el ADN de las muestras en gel con objeto de determinar la concentración e integridad
del ADN. Observó que la pulpa dentaria es un material muy rico en ADN. Realizó el tipo de
análisis de ADN que hemos llamado RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
La incineración produjo la completa pérdida de HMW y un ADN de bajo peso molecular.
Pero en la mayoría de los casos obtuvo suficiente ADN para hacer un análisis de RFLP,
obteniendo de 15 a 20 microgramos de HMWDNA de la pulpa dentaria.
OTRAS APLICACIONES
Además de las propias de la Criminalística que hemos ido citando como es el examen de
indicios hallados en el lugar del crimen (semen, manchas de sangre, cabellos en la mano de
la víctima, fragmentos de la piel del agresor bajo las uñas por arañazos de defensa de la
víctima, etc.), en los que la huella genética puede conducir a la identificación del agresor
o bien a descartar a un acusado inocente, el estudio del ADN es muy útil en Arqueología y
Paleopatología. Materiales humanos antiguos han demostrado su valor diagnóstico para
estudios diacrónicos en genes polimorfos de poblaciones neolíticas y paleolíticas, así como
el del estudio del ADN contenido en virus de aquellos tiempos.
hacía 140 años que se encontraba conservado en el Museo de Historia Natural de Mainz
(Alemania). En la comparación con el ADN obtenido de una cebra actual (Equus zebra) se
obtuvo la misma señal de hibridación.
De la misma forma se pueden estudiar restos dispersos de cadáveres en una gran catástrofe
y saber si pertenecen a la misma persona o a personas distintas.
Se ha dicho que la huella genética puede llegar a substituir a la huella dactilar. Esta
idea es errónea. Cada una tiene sus aplicaciones específicas. Y si bien el estudio de la huella
genética ha sido un avance revolucionario en determinados casos como es el estudio del
semen o la sangre para identificar a la persona a quien pertenece, no tiene nada que ver
con el hallazgo de huellas dactilares sobre la superficie de un arma u otro objeto donde el
criminal haya puesto sus manos.