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Reacción en cadena de la
polimerasa
1 INTRODUCCIÓN

Reacción en cadena de la polimerasa (RCP), técnica de biología molecular


mediante la cual un pequeño fragmento de ácido desoxirribonucleico (ADN) se
clona o duplica varias veces para obtener copias múltiples. La RCP puede
utilizarse para identificar individuos a partir de cantidades mínimas de tejidos o
sangre, para diagnosticar enfermedades genéticas y para investigar la
evolución.

La RCP fue ideada por el bioquímico estadounidense Kary B. Mullis en 1983 y


desarrollada posteriormente por Mullis y su colaborador Fred A. Faloona en la
Cetus Corporation de Emeryville, California. Aunque la utilidad de esta técnica
no se reconoció inmediatamente, en 1991 su uso ya se había generalizado. En
1993 Mullis obtuvo el Premio Nobel de Química por este trabajo.

La RCP opera en forma de ciclos. Cada ciclo duplica la cantidad de ADN, por lo
que permite obtener hasta mil millones de copias de un solo fragmento en
unas pocas horas. La técnica es sencilla y pueden utilizarla científicos sin
demasiada formación en biología molecular. Los elementos necesarios para
llevarla a cabo se comercializan en forma de juego, y se utilizan en medios
muy variados, desde la investigación forense hasta el diagnóstico clínico.

2 FUNCIONAMIENTO DE LA RCP

La reacción en cadena de la polimerasa imita el fenómeno de replicación o


reproducción del ADN que ocurre de forma natural en las células vivas. La
mayor parte del ADN es de doble cadena (es decir, cada cadena de ADN está
apareada con otra complementaria). Durante la replicación las dos cadenas se
separan y una enzima (una proteína que inicia reacciones químicas)
especializada llamada polimerasa hace una copia de cada una de las cadenas,
utilizando la original como plantilla o modelo. Normalmente este proceso de
copia tiene lugar cuando la célula se divide y da lugar a la formación de un par
de cadenas hijas por cada una de las cadenas parentales (véase Genética).

La polimerasa necesita otros dos ingredientes para copiar ADN. El primero es


una reserva de los cuatro bloques básicos que constituyen la molécula de ADN,
llamados nucleótidos o bases. El segundo es una fibra corta de ADN copiado,
que se llama cebador oligonucleotídico; está formado por varios nucleótidos
que inician la replicación. La RCP utiliza estos mismos ingredientes para copiar
ADN en una ampolla.

La reacción tiene lugar en tres fases. Durante la primera o desnaturalización la


plantilla o fragmento original de ADN se calienta hasta una temperatura de 90º
a 95 ºC durante 30 segundos; esto provoca la separación de las dos cadenas.
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En la segunda fase, llamada templado, la temperatura de la mezcla se rebaja


hasta 55 ºC durante 20 segundos para que los cebadores oligonucleotídicos se
enlacen con el ADN escindido. En la tercera fase o de polimerización, la
temperatura de la mezcla se eleva hasta 75 °C para que la polimerasa copie
rápidamente la molécula de ADN.

Estas tres fases tienen lugar en la misma ampolla y constituyen un ciclo


completo de RCP, que se realiza en menos de dos minutos. Teóricamente, el
ciclo de RCP se puede repetir sin límite, pero la polimerasa, los nucleótidos y
los cebadores suelen renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que
duran menos de tres horas, bastan para producir mil millones de copias de
ADN.

La polimerasa utilizada en los primeros experimentos de RCP resultaba


fácilmente destruida por el calor, lo que obligaba a añadir más enzima en cada
ciclo para sustituir a la inactivada por las elevadas temperaturas de la primera
fase. Pero en las versiones modernas de la RCP se utiliza una polimerasa
termoestable llamada Taq. Inicialmente se extraía de Thermus aquaticus, una
bacteria termófila que vive en los manantiales de agua caliente del Parque
nacional de Yellowstone (Estados Unidos). Como la polimerasa Taq no resulta
destruida por las elevadas temperaturas a las que transcurre la RCP, basta con
añadirla una vez, al principio de la reacción. La polimerasa Taq se fabrica ahora
con bacterias modificadas genéticamente.

El uso de la RCP exige mucho cuidado. Lo más importante es evitar la


contaminación de la mezcla reactiva. Es tan sensible, que permite multiplicar
accidentalmente cantidades mínimas de ADN contaminante. Se utilizan
procedimientos especiales para evitar la contaminación.

3 APLICACIONES

Como bastan pequeñas cantidades de muestras de ADN relativamente poco


refinadas, la RCP se ha convertido en un valioso instrumento de investigación
en biología y medicina clínica y forense (aplicación del conocimiento científico
al trabajo de investigación policial).

En la investigación biológica la RCP ha acelerado el estudio de la función de los


genes, la cartografía genética y la evolución. En la investigación de la función
de los genes se utiliza la RCP para obtener copias de genes individuales, cuyas
actividades pueden estudiarse y definirse con mayor precisión. La cartografía
genética (véase Proyecto Genoma Humano) recurre a la RCP para obtener
copias múltiples de regiones determinadas del ADN humano. Estas regiones
pueden examinarse a continuación para comprobar si están vinculadas con
enfermedades genéticas, como la fibrosis quística.

También se ha beneficiado de la RCP el estudio de la evolución. Los científicos


la han utilizado para estudiar el ADN de insectos atrapados hace miles de años
en gotas de ámbar. Aun cuando gran parte de ese ADN ha perdido su
estructura, se conserva todavía intacta una cantidad suficiente para ser
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multiplicada mediante la RCP para comparar el resultado con el observado en


insectos actuales.

En medicina, la RCP resulta particularmente útil en el diagnóstico prenatal de


enfermedades genéticas. Las muestras de ADN obtenidas del feto mediante
amniocentesis (extracción de una pequeña cantidad de líquido del útero
materno) se analizan ahora en sólo unas horas. Antes era necesario cultivar
células fetales en un medio nutritivo especial durante varias semanas para
poder realizar análisis bioquímicos. La RCP también se ha utilizado en células
tomadas de embriones de sólo unas horas de edad fertilizados in vitro (en un
tubo de ensayo) para determinar si están exentos de enfermedades. A
continuación, el embrión se implanta en el útero materno para iniciar un
embarazo normal.

Otras aplicaciones médicas de la RCP son la identificación de virus, bacterias y


células cancerosas en tejidos humanos. Puede utilizarse incluso con células
individuales aplicando una variante llamada RCP in situ para identificar tipos
celulares específicos.

En medicina forense la RCP ha revolucionado la identificación de delincuentes.


Las pruebas de tipificación de ADN basadas en RCP pueden crear ‘huellas
dactilares’ (véase Pruebas de ADN) que identifican sin ambigüedad a cualquier
persona. Estas pruebas permiten también excluir o implicar a sospechosos
basándose en pequeñas cantidades de sangre, piel, pelo o semen recogidas en
el escenario del delito.

La RCP se ha utilizado para seguir la pista a residuos industriales y otros


productos. Se añaden en origen pequeñas cantidades de ADN de un tipo
conocido a lotes de explosivos, derivados del petróleo, venenos, y otros
residuos, que quedan así definitivamente etiquetados. Estas etiquetas de ADN
pueden recuperarse a partir de fangos u otros contaminantes recogidos en vías
de agua públicas (véase Contaminación del agua), por ejemplo, y multiplicarse
mediante RCP para comparar el resultado con las listas que mantienen los
fabricantes de las etiquetas. Una coincidencia es una prueba con mucho peso
que puede inculpar al responsable de la contaminación.

1. Evolución de las técnicas de estudio de los polimorfismos de ADN


La Hemogenética Forense nace a principios de siglo, cuando Karl Landsteiner
describe el sistema ABO de los hematíes y Von Durgen y Hirschfeld descubren su
transmisión hereditaria. Esta ciencia surgió como una rama de la Criminalística
cuyo objetivo era la identificación genética tanto en casos de investigación
criminal como en estudios biológicos de la paternidad. Inicialmente, las
investigaciones se centraban en el estudio de antígenos eritrocitarios (sistema
ABO, Rh, MN), proteínas séricas, enzimas eritrocitarias y sistema HLA. Con el
estudio de dichos marcadores podía incluirse o excluirse una persona como
posible sospechoso por poseer una combinación genética igual o diferente a la
del vestigio biológico hallado en el lugar de los hechos.
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Pero fue a mediados de siglo cuando gracias al descubrimiento del ADN y de su


estructura y al posterior avance en las técnicas de análisis de dicha molécula la
Hemogenética Forense evolucionó considerablemente hasta el punto de que hoy
en día puede hablarse de una nueva subespecialidad dentro de la Medicina
Forense: la Genética Forense. Dicha ciencia estudia básicamente unas regiones
del ADN que presentan variabilidad entre los distintos individuos, es decir,
estudia regiones polimórficas del ADN. Así, analizando un determinado número
de regiones polimórficas, la probabilidad de que dos individuos sean
genéticamente iguales es prácticamente nula (excepto en el caso de gemelos
univitelinos).
Aunque la Ciencia poseía las herramientas necesarias para el estudio del ADN, su
aplicación en la resolución de casos judiciales no se produjo hasta 1985, cuando
el Ministerio del Interior Británico solicitó la ayuda de Alec J. Jeffreys, profesor
de Genética de la Universidad de Leicester. Los primeros casos de Criminalística
fueron resueltos gracias a la técnica de los RFLPs (Fragmentos de Restricción de
Longitud Polimórfica). Jeffreys descubrió la existencia de unas regiones
minisatélites hipervariables dispersas por el genoma humano que al ser tratadas
con enzimas de restricción generaban fragmentos de longitud variable. Estudios
posteriores realizados el mismo Jeffreys demostraron que las diferencias en el
tamaño de estos fragmentos se debían a que estas regiones consistían en un
determinado número de repeticiones en tándem de una secuencia central, el
cual variaba de unos individuos a otros.
El primer locus de ADN polimórfico fué descubierto por Wyman y White en 1980
usando una sonda de ADN arbitraria. De esta manera observaron fragmentos de
más de 15 longitudes diferentes en una pequeña muestra de individuos.
Posteriormente se encontraron otros loci hipervariables como en la secuencia del
gen de la insulina humana, en el oncogen “ras”, en el pseudogen de la zeta-
globina y en el gen de la mioglobina. Estos loci hipervariables constaban de
repeticiones en tándem de una secuencia de oligonucleótidos (11 a 60 pb), de
manera que las diferentes longitudes de los fragmentos originados dependían del
número de dichas repeticiones y se les denominó VNTR (“Variable Number of
Tandem Repeat”).
Tras el descubrimiento de los primeros VNTRs se vio que éstos podían ser
aplicados a la medicina forense y sustituir a los marcadores clásicos.

En un principio la manera de estudiar dichos marcadores se hizo por medio de la


técnica llamada hibridación con sondas o Southern blot. Esta técnica consta
básicamente de las siguientes etapas:
1. Digestión del ADN con enzimas de restricción tras conseguir extraer un
ADN de alta molecularidad.
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2. Separación de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis


en gel de agarosa.
3. Desnaturalización de los fragmentos separados y cortados.
4. Transferencia de las cadenas simples a una membrana de nitrocelulosa o
nylon y fijación de las mismas por medio de calor (80ºC).
5. Prehibridación con sondas de ADN inespecífico para bloquear los lugares
de unión inespecíficos que pudiera haber en la membrana.
6. Marcaje de la sonda con nucleótidos radioactivos (32 P normalmente).
7. Hibridación de la sonda marcada y desnaturalizada con los fragmentos de
ADN fijados a la membrana, y lavado de la membrana para eliminar el
exceso de sonda o aquellas que hayan hibridado mal.
8. Revelado en placa radiográfica e interpretación de los resultados.

El tipo de sondas utilizadas puede ser de dos tipos:


Sondas Mono-locus (SLP): son específicas para una región de un determinado
cromosoma. Se unen a secuencias largas de nucleótidos y presentan mayor
variabilidad que las sondas multi-locus. Como resultado se observan una o dos
bandas por individuo, según sea homocigoto o heterocigoto. El patrón de
bandas obtenido con estas sondas se denomina perfil unilocus de ADN o “DNA
profiling”
Sondas Multi-locus (MLP): hibridan con secuencias minisatélites presentes en
varios loci de diferentes cromosomas. Son sondas de 10 a 15 nucleótidos que se
repiten múltiples veces y tras el revelado se observan de 10 a 20 bandas por
persona. Este patrón de múltiples bandas se conoce como huella genética
multilocus o “DNA fingerprint”.
Sondas multilocus Sondas unilocus
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Las sondas multi y mono-locus presentan una serie de ventajas e inconvenientes


con respecto a una serie de parámetros como son:
Información aportada: las sondas multi-locus tienen una mayor capacidad
discriminativa al aparecer múltiples bandas. No obstante, las mono-locus son
más específicas ya que el fragmento de ADN con el que hibridan es de mayor
tamaño.
Cantidad y calidad del ADN: cuando se usan sondas multi-locus se requiere
aproximadamente un microgramo de ADN sin degradar mientras que en el caso
de las mono-locus se necesita menos de 100 ng y este ADN no necesariamente
debe estar en perfecto estado, siempre y cuando el fragmento complementario
a la sonda esté intacto.
Especificidad entre especies: las sondas multi-locus permiten su uso sobre el
ADN humano y de cientos de animales superiores, mientras que las mono-locus
son exclusivas de ADN humano.
A pesar de que el análisis SLP ha sido y es bastante útil en estudios de
paternidad no puede decirse lo mismo de su aplicación a la Criminalística ya que
presenta una serie de inconvenientes como son:
La cantidad de ADN que se necesita está entre 20 y 100 ng, cantidad difícil de
conseguir en casos de criminalística en los que los indicios biológicos
encontrados son mínimos.
En cuanto a la calidad del ADN, en la práctica forense es muy difícil encontrar
en estado no degradado toda la cantidad de ADN que se necesita para un
análisis con sondas mono-locus.
El tiempo requerido para este tipo de análisis es de dos o tres días.
El hecho de que se requieran cantidades elevadas de ADN hacen que
normalmente, con el primer análisis se consume la totalidad de la muestra,
con lo que se dificultan contrapericias y una posterior revisión del caso.
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Todas estas limitaciones fueron superadas gracias a la aplicación en Genética


Forense de una técnica, la Reacción en Cadena de la Polimerasa (“PCR”), que
supuso una revolución en muchos campos de la Biología y de la Medicina.
El estudio de indicios biológicos por PCR ha permitido la resolución de un gran
número de casos en Criminalística que hasta entonces eran desestimados por no
poseer la suficiente cantidad de muestra para su análisis por RFLP. Con el uso de
la PCR muestras tan mínimas como pueden ser un pelo con raíz, una minúscula
mancha de sangre o semen e incluso caspa son suficientes en muchos casos
para llevar a cabo un análisis de identificación genética.

2. Análisis por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)


2.1 General
La reacción en cadena de la polimerasa (conocida como PCR por sus siglas en
inglés, Polymerase Chain Reaction) permite amplificar más de un millón de
veces un ADN obtenido a partir de una región seleccionada del genoma, siempre
y cuando se conozca una parte de su secuencia de nucleótidos. Esta técnica fue
ideada en 1989 por Kary B. Mullis que obtuvo el premio Nobel de Química en
1993 por dicho invento.
Para la PCR se utilizan dos oligonucleótidos sintéticos de unos 15-20 nucleótidos
que son complementarios a las zonas flanqueantes de la región que se quiere
amplificar. Estos oligonucleótidos (habitualmente conocidos por su nombre en
inglés, "primers") actúan como cebadores para la síntesis in vitro de ADN la cual
está habitualmente catalizada por una enzima llamada Taq polimerasa. Dicha
enzima se aísla de una bacteria termófila, denominada Thermus Aquáticus, que
es capaz de crecer a temperaturas elevadas (79 - 85 º C). A esta temperatura
dicha enzima es capaz de mantener una media de extensión de más de 60
nucleótidos por segundo en regiones ricas en uniones G-C. La temperatura
optima a la que actúa la Taq polimerasa permite el uso de elevadas
temperaturas para la unión de los primers y para la extensión, de esta manera se
aumenta el nivel de exigencia de la reacción y se reduce la extensión de los
primers unidos inespecíficamente al ADN.
La reacción se lleva a cabo en una serie de ciclos cada uno de los cuales incluye
tres fases o pasos:
1. DESNATURALIZACIÓN: Para que comience la reacción es necesario que el
ADN molde se encuentre en forma de cadena sencilla. Esto se consigue aplicando
temperaturas de 90 a 95ºC que producen la rotura de los puentes de hidrógeno
intercatenarios y por lo tanto la separación de ambas cadenas. Para conseguir la
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completa separación de las hebras de toda la muestra esta temperatura debe


mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente éste
tenderá a renaturalizarse rápidamente, evitando así una eficiente hibridación de
los primers y una posterior extensión.
2. HIBRIDACIÓN: Esta fase se denomina también fase de “annealing” o de
emparejamiento. Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la
temperatura hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se
pueda producir la unión de los primers a las secuencias flanqueantes del
fragmento que se va a amplificar. La temperatura de fusión o annealing (Tm,
“melting temperature”) depende de varios factores y es relativamente específica
para cada primer. La longitud de los primers y la secuencia son críticas en la
designación de los parámetros de una amplificación, una fórmula simple para
calcular la Tm es la siguiente:
Tm = 4(G+C) + 2 (A+T).
No obstante, cada primer exige una serie de estudios experimentales para
determinar su temperatura de annealing específica ya que si la
temperatura es muy baja la unión se hará de forma inespecífica y si es
muy alta no se producirá una unión completa.
3. EXTENSIÓN: Durante este paso la Taq polimerasa incorpora nucleótidos
en el extremo 3' del primer utilizando como molde la cadena de ADN
previamente desnaturalizada. La temperatura a la que se lleva a cabo este paso
suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la que la Taq polimerasa alcanza su
máxima actividad. Normalmente una extensión de 20 segundos es suficiente para
fragmentos menores de 500 pb, y 40 segundos para fragmentos por encima de
1.2Kb.
Un factor importante en el transcurso de las diferentes fases es el tiempo de
rampa. Este se define como el tiempo invertido en pasar de una temperatura a
otra y depende del diseño y de las características del aparato donde se realiza
automáticamente este proceso, el termociclador. En las nuevas generaciones de
termocicladores este factor se ha ido optimizando para hacerlo mínimo.

2.2 Componentes de la PCR


2.2.1 BUFFER DE AMPLIFICACIÓN Los buffer de PCR que se utilizan
normalmente contienen KCl, Tris y MgCl2. El MgCl2 es el componente que más
influye en la especificidad y rendimiento de la reacción ya que los iones Mg2+ son
necesarios para la actividad de la Taq polimerasa, es decir, actúan como
cofactores de la polimerasa.
La concentración óptima de MgCl2 está en torno a 1.5 mM si se emplean
concentraciones de 200 mM de cada uno de los dNTPs. No obstante, a veces es
necesario probar con diferentes cantidades de Mg ya que un exceso del mismo
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origina una acumulación de productos inespecíficos y una cantidad insuficiente


hace que disminuya el rendimiento de la amplificación.
2.2.2 PRIMERS A la hora de elegir unos primers para amplificar un determinado
fragmento de ADN hay una serie de reglas a seguir:
La longitud de cada uno de los primers debe estar comprendida entre 18 y 24
bases ya que se ha comprobado que primers de mayor longitud (30-35 bases) no
aumentan el rendimiento y los primers cortos carecen de suficiente
especificidad.
Ambos primers deben tener una Tm similar (como mucho la diferencia entre
ambas temperatura debe ser de 5ºC).
La relación bases púricas: bases pirimidínicas debe ser 1:1 (o como mucho
40-60%).
La secuencia de los primers debe comenzar y terminar con 1-2 bases
púricas.
Para evitar la formación de dímeros de primers es necesario comprobar que
los primers no contengan secuencias complementarias entre sí.
Los dímeros de primers consisten en fragmentos de doble cadena cuya longitud
es muy próxima a la de la suma de los primers y se producen cuando un primer es
extendido a continuación del otro. El mecanismo exacto por el que se forman
estos dímeros no está completamente determinado. La observación de que
primers con los extremos 3' complementarios favorecen su formación sugiere que
el paso inicial se debe a interacciones transitorias que aproximan los extremos
complementarios. Algunas polimerasas, incluida la Taq, han mostrado una débil
actividad polimerizadora no dirigida por un ADN patrón, la cual puede unir
nucleótidos adicionales al doble extremo apareado. Si esta actividad puede
producirse sobre una hebra sencilla de oligonucleótidos, resultaría una buena
oportunidad para que la extensión formara un corto solapamiento en el extremo
3' con el otro primer, suficiente para promover la formación del dímero.

2.2.3 DESOXINUCLEÓTIDOS TRIFOSFATOS Las concentraciones de dNTPs que


suelen usarse están en torno a 200 µM para cada uno de ellos. En un volumen de
reacción de 25 µl con esta concentración de dNTPs se sintetizarían entre 6-6.5 µg
de ADN. La concentración de dNTPs y de MgCl2 va relacionadas ya que el Mg se
une a los dNTPs con lo que concentraciones elevadas de dNTPs inhibirían la
reacción al no tener la Taq polimerasa suficiente Mg como para incorporar
dNTPs. Para una concentración de 200 µM de cada dNTP se suele añadir MgCl 2 a
una concentración de 1.5 mM.

2.2.4 TAQ-POLIMERASA Las cantidades óptimas de Taq polimerasa necesarias


para la síntesis de ADN están alrededor de 2 unidades en 25 µl de volumen final
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de reacción. La actividad de este enzima se ve influenciada por la concentración


de dNTPs, de Mg2+ y de algunos iones monovalentes de manera que
concentraciones elevadas de los mismos inhiben dicha actividad.
Por otro lado, pequeñas concentraciones de KCl estimulan la actividad sintética
de la Taq en un 50-60% con un máximo aparente cuando su concentración es de
50 mM. Existen algunos datos relacionados con la influencia de ciertos reactivos
que se emplean antes de la amplificación y que alteran la actividad de la Taq.
Por ejemplo concentraciones 1M de urea estimulan la actividad, el SDS a bajas
concentraciones que la inhibe al igual que concentraciones mayores del 10% de
etanol.
2.2.5 ADN MOLDE O “TEMPLATE" Es el ADN del cual queremos copiar un
determinado fragmento, es, por tanto, el ADN que la Taq polimerasa utiliza como
molde para la síntesis de nuevas cadenas polinucleotídicas. La cantidad de ADN
necesaria para la PCR depende de varios factores:
Del marcador que se va a amplificar: hay marcadores cuyos primers son más
específicos o bien cuyas condiciones de amplificación están mejor optimizadas
que las de otros. Por esta razón puede darse el caso de que cierta cantidad de
ADN (sobre todo cuando jugamos con cantidades mínimas) amplifique para unos
marcadores pero no para otros. Por ello, cuando en un laboratorio se va a utilizar
un nuevo marcador es necesario hacer un estudio de validación en él que se
incluye un estudio de sensibilidad. De dicho estudio de sensibilidad puede
sacarse como conclusión cuál es la mínima cantidad de ADN que amplifica en
condiciones estándar. De manera general, para casi todos los STR utilizados en
Genética Forense la cantidad óptima de ADN que asegura un rendimiento
adecuado está en torno a los 5 ng.

Calidad del ADN: Cuando se trabaja con ADN cuya calidad es óptima no suele
haber problemas en la amplificación y cantidades del mismo por encima e incluso
por debajo de los 5 ng rinden buenos resultados. El problema aparece cuando la
calidad del ADN obtenido no es la idónea, bien porque esté degradado o bien
porque dicho ADN vaya ligado a una serie de contaminantes que pueden inhibir la
actividad de la polimerasa. Si el ADN está degradado por la acción de enzimas de
restricción el que obtengamos o no resultado en la amplificación va a depender
de que el fragmento a amplificar haya sido dañado o no. En el caso en el que
tengamos ADN sin degradar pero unido a una serie de contaminantes habría que
intentar diluir al máximo la muestra para disminuir dichos contaminantes, pero
siempre dentro de un rango de ADN que no esté por debajo del límite de
sensibilidad de la PCR. El problema de las cantidades mínimas de ADN y la
presencia de contaminantes o inhibidores de la Taq es un hecho habitual en
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Criminalística y requiere un estudio pormenorizado de la muestra antes de la


amplificación.

ADYUVANTES DE LA PCR Son elementos que mejoran el rendimiento y la


especificidad de la PCR. Aunque algunos autores han recomendado el uso del
DMSO y del glicerol, el adyuvante más extendido y utilizado es el BSA. A
concentraciones por encima de 0.8 µg/µl el BSA incrementa la eficiencia de la
PCR ya actúa como una proteína captadora de iones que pueden ser inhibidores
de la Taq polimerasa.
La PCR ofrece una serie de ventajas, frente al uso de las técnicas de análisis
genético utilizadas con anterioridad, como son:
Su capacidad para obtener resultados en casos en los que la cantidad de ADN
es mínima o en casos en los que el ADN esté parcialmente degradado.
Genera en un espacio corto de tiempo un elevado número de copias de la
secuencia de ADN que es objeto de estudio, lo cual permite utilizar técnicas de
visualización más sencillas y rápidas que el uso de sondas marcadas
radioactivamente.
Permite la determinación y agrupación alélica en clases discretas, lo que
facilita la elaboración de bases de datos al ser la estandarización inmediata y
posibilitar la aplicación de métodos bioestadísticos y programas elaborados.
El uso de marcadores microsatélites de pequeño peso molecular aumenta las
probabilidades de obtener resultados positivos de amplificación cuando el ADN se
encuentra degradado ya que puede ser que dichos fragmentos no hayan sido
digeridos. Esta ventaja es de gran importancia en Criminalística ya que
normalmente los indicios biológicos encontrados han estado sometidos a diversos
factores (calor y humedad) que favorecen el crecimiento bacteriano.
Sin embargo, una de las grandes ventajas de la PCR que es su elevada
sensibilidad puede, en ocasiones, convertirse en un gran problema ya que se
podría coamplificar un ADN extraño o ajeno al que nos interesa. No obstante, en
los laboratorios de Genética Forense las medidas de precaución que se toman
para evitar problemas de contaminación por manipulación son extremas.
Una vez amplificado el ADN, los fragmentos resultantes son separados en función
de su tamaño por medio de un proceso de electroforesis. Actualmente se
utilizan dos tipos de electroforesis en los laboratorios de Genética Forense:

Electroforesis en geles verticales de poliacrilamida


Electroforesis capilar
La electroforesis capilar es una técnica relativamente novedosa en el campo de
la Genética Forense pero que está poco a poco sustituyendo a los sistemas de
electroforesis vertical. En este caso el proceso electroforético es llevado a cabo
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en un capilar de silica de unas 50 µ m de diámetro, lo cual hace que la cantidad


de calor generado sea menor y que puedan aplicarse voltajes mayores. Para que
puedan ser analizados por electroforesis capilar los primers o los
dideoxinucleótidos (en el caso de la secuenciación) deben ser marcados
fluorescentemente con unas moléculas denominadas fluorocromos que emiten
fluorescencia a una determinada longitud de onda cuando son excitados por
láser. El equipo en el que se realiza el proceso lleva acoplado un ordenador
encargado de traducir los datos de emisiones fluorescentes en secuencias o
fragmentos con sus correspondientes alelos asignados. La electroforesis capilar
presenta una serie de ventajas frente a los sistemas de electroforesis vertical
como son:
Rapidez: ya que permite el análisis simultáneo de varios loci aunque éstos
posean alelos con tamaños solapantes.
Sensibilidad: hace posible detectar cantidades muy pequeñas de ADN
amplificado.
Los resultados se obtienen de manera informatizada, lo que evita problemas de
interpretación de los resultados y facilita el análisis de los mismos a través de
programas informáticos.

Ejemplo de un caso de criminalística resuelto


utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida.
Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse
como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre
encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans)
del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de
la víctima (V)
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Caso de estudio biológico de la paternidad realizado con


electroforesis capilar. Cada pico corresponde a un alelo,
el hijo (H) debe poseer un alelo de la madre (M) y otro
del padre (P) para que la paternidad sea compatible

HIBRIDACIÓN DEL DNA

Cuando el DNA renaturalizado se forma a partir de moléculas de DNA de


distinto origen la renaturalización se conoce como hibridación. Una
característica importante de la hibridación es que no sólo se puede
producir entre dos DNA distintos, sino también entre DNA y RNA,
siempre que sus secuencias de nucleótido sean complementarias.
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La ingeniería genética es una técnica que consiste en la introducción de genes


en el genoma de un individuo que carece de ellos.
Se realiza a través de las enzimas de restricción que son capaces de "cortar"
el ADN en puntos concretos. Se denomina ADN recombinante al que se ha
formado al intercalar un segmento de ADN extraño un un ADN receptor. Por
ejemplo, la integración de un ADN vírico en un ADN celular.

La ingeniería genética incluye un conjunto de técnicas biotecnológicas, entre


las que destacan:

• la tecnología del ADN recombinante: con la que es posible aislar y


manipular un fragmento de ADN de un organismo para introducirlo en
otro.
• La secuenciación del ADN: Técnica que permite saber el orden o
secuencia de los nucleótidos que forman parte de un gen.
• la reacción en cadena de la polimerasa (PCR): con la que se consigue
aumentar el número de copias de un fragmento determinado de ADN,
por lo tanto, con una mínima cantidad de muestra de ADN, se puede
conseguir toda la que se necesite para un determinado estudio.
• las aplicaciones de la ingeniería genética: Son numerosas las
aplicaciones prácticas y comerciales de la ingeniería genética.

Se abre un campo que nos ofrece además la posibilidad de utilizar plantas y


animales transgénicos así como microorganismos modificados genéticamente
para producir fármacos u otros productos de utilidad para el hombre,entre los
que se pueden citar: la insulina humana, la hormona del
crecimiento,interferones, la obtención de nuevas vacunas o la clonación de
animales. Una puerta abierta que no nos debe hacer olvidar el impacto
perjudicial que un uso inadecuado podría provocar en el ser humano y en el
propio planeta.

La ingeniería genética puede definirse como un conjunto de


técnicas, nacidas de la Biología molecular, que permiten
manipular el genoma de un ser vivo.
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Esta tecnología nos


permite obtener fragmentos de ADN en cantidades ilimitadas, que llevará
además el gen o los genes que se desee. Este ADN puede incorporarse a las
células de otros organismos (vegetales, animales, bacterias...) en los que se
podrá "expresar" la información de dichos genes. (De una manera muy simple
podemos decir que "cortamos" un gen humano y se lo "pegamos" al ADN de una
bacteria; si por ejemplo es el gen que regula la fabricación de insulina, lo que
haríamos al ponérselo a una bacteria es "obligar" a ésta a que fabrique la
insulina. Por lo tanto en la tecnología del ADN recombinante podemos
diferenciar cuatro etapas básicas:

1. Corte específico del ADN en fragmentos pequeños y manejables


mediante la utilización de un tipo de enzimas conocidas como enzimas de
restricción que pueden considerarse como las "tijeras moleculares".
Estas enzimas se aislaron en bacterias y se identifican con distintos
nombres, siendo lo característico de ellas estos dos principios:
o Cada enzima de restricción reconoce una secuencia específica de
nucleótidos y corta en ese punto cada una de las cadenas de ADN.
o Los extremos libres que quedan se llaman extremos pegajosos,
porque pueden unirse a otros fragmentos de ADN que hayan sido
cortados por la misma enzima de restricción.

En los siguientes dibujos puede verse como actuarían estas


enzimas.

En este esquema se indica el lugar en el que corta la enzima de


restricción. Se aprecia la actuación en ambas hebras.
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En este esquema se ve el resultado de la actuación de la enzima de


restricción.
Ha quedado rota la molécula de ADN, quedando unos bordes pegajosos por
donde puede unirse este ADN, con otro aunque sea de una especie
diferente.

2. En la siguiente animación puede verse "en vivo" la actuación de las


enzimas de restricción.

Los fragmentos obtenidos después de la actuación de las distintas enzimas de


restricción, se pueden separar por tamaños, es decir, según el número de pares
de nucleótidos que llevan, mediante la técnica de electroforesis y así estudiar
los distintos trozos. Según donde se hallen las secuencias de reconocimiento,
un gen determinado puede estar fragmentado en varios trozos, o bien un trozo
puede contener varios genes, posibilidades que hay que confirmar.

En el proceso de la electroforesis se prepara una mezcla de fragmentos de


ADN y se ponen en distintas soluciones. Los fragmentos se desplazan en
relación inversa con su tamaño, los fragmentos más pequeños se mueven
rápidamente, mientras que los grandes lo hacen muy lentamente.
17

TECNOLOGÍAS GENÉTICAS

Los científicos han desarrollado una serie de técnicas bioquímicas y genéticas


mediante las cuales el ADN puede ser separado y transferido de una célula a
otra. Algunos de esos métodos de laboratorio ayudan a los investigadores a
estudiar las propiedades de los genes en la naturaleza (permiten, por ejemplo,
comparar los ADN de diferentes animales para establecer distancias
evolutivas). Otras técnicas de ADN constituyen herramientas básicas en el
campo de la ingeniería genética (alteración de genes de un organismo). Esas
herramientas son utilizadas en la industria para desarrollar productos
comerciales tales como cosechas más resistentes a la desecación o a las
plagas, microorganismos capaces de descomponer compuestos contaminantes
como hidrocarburos o petróleo, o capaces de producir determinados
compuestos útiles en medicina en grandes cantidades como la insulina, el
interferón o determinadas vacunas.

ADN recombinante

Las moléculas de ADN de cualquier forma de vida tienen la misma estructura y


están constituidas por las mismas cuatro bases nitrogenadas, por lo que los
científicos han utilizado esas similitudes para introducir uno o más genes de un
organismo en otro diferente. Estos nuevos genes llegan a ser funcionales en el
organismo receptor y a producir la proteína deseada. Esta tecnología del ADN
recombinante es la que se ha utilizado para obtener grandes cantidades de
determinadas proteínas como la insulina, necesaria para los enfermos
diabéticos. Inicialmente la insulina se obtenía del ganado vacuno, pero era un
18

proceso demasiado largo y costoso. El primer paso para obtener insulina


utilizando la tecnología del ADN recombinante fue conocer la secuencia de
nucleótidos del gen en la célula humana y emplear enzimas de restricción
(proteínas especializadas que actúan como tijeras moleculares) para cortar la
doble hélice de ADN y obtener el gen completo que codifica dicha proteína.
Posteriormente, este fragmento de ADN es ligado a un vector, es decir, a otra
molécula de ADN que permite transportar los genes de un organismo a otro. El
vector que contiene el gen de insulina es introducido en una bacteria, como
por ejemplo Escherichia coli, que producirá en unas pocas horas millones de
células que contienen copias exactas del gen productor de insulina insertado
por los científicos. El proceso de fabricar muchas células con ADN idéntico se
conoce como clonación.

Genotecas o librerías de ADN

Una librería de ADN es un almacén de información genética que se mantiene


en una bacteria como los libros en una biblioteca. Esas bacterias son clones
creados con la tecnología del ADN recombinante y suponen una fuente
constante de fragmentos de ADN necesarios para multitud de investigaciones.
Una genoteca puede contener el genoma completo de un organismo troceado
en pequeños fragmentos. Por ejemplo, para crear una librería del genoma
humano todos sus cromosomas deben cortarse en pequeñas piezas que serán
unidas al azar en vectores (por ejemplo plásmidos o bacteriófagos) e
introducidos en una población de bacterias.

Electroforesis

Esta técnica permite separar fragmentos de ADN en función de su tamaño al


aplicar una corriente eléctrica a un gel en el interior del cual se ha introducido
una mezcla de fragmentos. Éstos comienzan a moverse desde el polo negativo
al polo positivo de tal modo que los fragmentos más pequeños se mueven más
rápido que los más grandes. Cuando la corriente cesa, los fragmentos de ADN
se han distribuido a lo largo del gel, situándose los más pequeños más cerca
del polo positivo, adoptando una apariencia similar a un código de barras. Cada
barra contiene un fragmento de ADN de un tamaño determinado.
Adicionalmente puede utilizarse una secuencia complementaria de un ADN
como sonda para buscar un fragmento específico en el patrón de bandas. Por
ejemplo, los científicos pueden usar el ADN encontrado en la sangre presente
en la escena de un crimen como sonda para buscar fragmentos
complementarios en electroforesis conteniendo ADN obtenido de diversas
personas sospechosas.

Secuenciación de ADN
19

Una vez que un fragmento interesante de ADN se ha aislado o identificado, los


científicos necesitan determinar si la secuencia de nucleótidos de dicho
fragmento es un gen conocido o qué clase de proteína puede estar
produciendo. Esta técnica permite determinar la secuencia específica (el orden
preciso de bases nucleótidas) de un fragmento de ADN. La mayoría de los tipos
de secuenciación utilizan la técnica de extensión de oligonucleótido ideada por
el británico Frederick Sanger. Esta técnica se puede utilizar por ejemplo para
detectar mutaciones relacionadas con enfermedades tales como la fibrosis
quística, o bien para alterar la secuencia de un gen y estudiar la función de la
proteína resultante.

La tecnología denominada huella de ADN (DNA fingerprinting) permite comparar


muestras de ADN de diversos orígenes, de manera análoga a la comparación de huellas
dactilares. En esta técnica los investigadores utilizan también las enzimas de restricción
para romper una molécula de ADN en pequeños fragmentos que separan en un gel al que
someten a una corriente eléctrica (electroforesis); de esta manera, los fragmentos se
ordenan en función de su tamaño, ya que los más pequeños migran más rápidamente que
los de mayor tamaño. Se puede obtener así un patrón de bandas o huella característica de
cada organismo. Se utiliza una sonda (fragmento de ADN marcado) que hibride (se una
específicamente) con algunos de los fragmentos obtenidos y, tras una exposición a una
película de rayos X, se obtiene una huella de ADN, es decir, un patrón de bandas negras
característico para cada tipo de ADN.

Un procedimiento denominado secuenciación de ADN permite determinar el orden


preciso de bases nucleótidas (secuencia) de un fragmento de ADN. La mayoría de los
tipos de secuenciación de ADN se basan en una técnica denominada extensión de
oligonucleótido (primer extension) desarrollada por el biólogo molecular británico
Frederick Sanger. En esta técnica se lleva a cabo una replicación de fragmentos
específicos de ADN, de tal modo que el extremo del fragmento presenta una forma
fluorescente de una de las cuatro bases nucleótidas. Los modernos secuenciadores de
ADN parten de la idea del biólogo molecular estadounidense Leroy Hood, incorporando
ordenadores y láser en el proceso.

Gilbert no pensaba en un principio descubrir un método de secuenciación (determinación


de la secuencia de bases de un ácido nucleico). La idea surgió mientras realizaba
experimentos para romper las cadenas de ADN en puntos concretos. Una cadena de ADN
está compuesta por unidades estructurales denominadas nucleótidos. Cada nucleótido
contiene una de las cuatro bases: adenina (A), citosina (C), guanina (G) y timina (T). La
citosina sólo se puede unir con la guanina, y la adenina sólo con la timina. Gilbert sabía
que el sulfato de dimetilo, un veneno industrial, rompe las cadenas de ADN en los lugares
donde existen las bases A o G, y que la hidracina, un compuesto gaseoso, debilita los
lugares de las bases C y T. Tras realizar experimentos con diferentes combinaciones,
desarrolló cuatro compuestos químicos que rompían el ADN sistemáticamente en los
20

lugares de las cuatro bases. Separando los fragmentos de ADN en función de su longitud
a través de un gel fino, fue capaz de capturar sus imágenes en papel fotográfico. Así se
consiguió un mapa completo del orden de las bases de la cadena original de ADN. Al
mismo tiempo que Gilbert perfeccionaba su método, el bioquímico británico Frederick
Sanger desarrolló una técnica diferente para determinar la secuencia. Ambas técnicas se
han utilizado ampliamente.

Los científicos ya han completado la secuenciación del material genético de varios


microorganismos incluyendo la bacteria Escherichia coli. En 1998 se llevó a cabo el reto de
la secuenciación del genoma de un organismo pluricelular, un gusano nematodo conocido
como Caenorhabditis elegans. En el año 2000 se descifró el material genético de la mosca
del vinagre (Drosophila melanogaster) y de la planta Arabidopsis thaliana, entre otros
organismos. Pero el acontecimiento más importante, dentro de este grupo de
investigaciones, fue el desciframiento del genoma humano llevado a cabo en febrero de
2001, de manera independiente, por el consorcio público internacional Proyecto Genoma
Humano y la empresa privada Celera Genomics.

Manipulación de ácidos nucleicos

Tanto el ADN como el ARN pueden ser aislados desde tejidos o células de humanos o de
animales de experimentación empleando técnicas bioquímicas estándar. Posteriormente,
dichos ácidos nucleicos pueden ser manipulados de diversas formas y con diversos
propósitos los que incluyen desde protocolos experimentales a exámenes de laboratorio de
diagnóstico genético.

Corte del ADN mediante enzimas de restricción:


Las enzimas de restricción (ERs) se usan como tijeras moleculares para cortar el ADN en
sitios específicos. Estas endonucleasas reconocen una secuencia específica del ADN y lo
cortan cerca o dentro del sitio de reconocimiento. Las ERs de uso más frecuente en el
laboratorio reconocen secuencias de 4 a 6 pares de bases. Para un ADN en particular una
ER producirá un número determinado de fragmentos dependiendo del número y de la
localización de sus sitios de reconocimiento. Por esta razón las ERs constituyen una
herramienta muy valiosa para caracterizar secuencias génicas. El análisis del patrón de
digestión de determinados genes es una herramienta útil en el estudio de mutaciones ya
que al modificarse la secuencia de un gen los sitios de corte resultan modificados.
Actualmente el diagnóstico de algunas enfermedades genéticas como la hemocromatosis se
efectúa analizando el patrón de digestión de un trozo de ADN específico. Las ERs son
también de gran utilidad para "clonar" fragmentos de ADN, tal como se describe más
adelante.

Separación de fragmentos de ADN por tamaño:


Es posible separar una mezcla de moléculas de ADN mediante electroforesis en un gel de
21

agarosa. Para ello se someten las moléculas de ADN que están inmersas en el gel a la fuerza
de un campo eléctrico: como los fragmentos de ADN tienen carga negativa (por sus grupos
fosfato) todos se mueven en la misma dirección hacia el ánodo, migrando más
rápidamente los fragmentos más pequeños.
Las moléculas de ADN separadas se pueden visualizar mediante su tinción con bromuro de
etidio, un colorante que se intercala entre las bases del ADN y que emite fluorescencia
cuando se irradia con luz ultravioleta.
Para determinar el tamaño del fragmento de ADN de interés se carga en el mismo gel una
mezcla de fragmentos de ADN de tamaño conocido (estándar), los cuales sirven como
referencia de peso molecular (Figura 3).

Este método se utiliza normalmente para separar fragmentos de ADN producidos por
cortes con ERs y permite determinar el tamaño de los fragmentos generados. Si se analiza
el mismo ADN con otras ERs se puede generar el llamado "mapa de restricción" de un gen
con la localización de los sitios de reconocimiento de varias enzimas. Este mapa se puede
comparar con el mapa de restricción de otras muestras de ADN, permitiendo, por ejemplo,
la detección de deleciones u otros reordenamientos de un gen.

"Clonamiento" del ADN: ¿Que significa "clonar" un fragmento de ADN?


Es la manipulación genética que permite copiar ADN in vivo produciendo numerosas
moléculas idénticas o "clones" del mismo. Con las técnicas de biología molecular actuales
es posible aislar un ADN con la secuencia de interés y propagarlo en un organismo
adecuado. Esto permite obtener cantidades ilimitadas del gen de interés, lo que facilita
enormemente su estudio.
La metodología general para clonar ADN se ilustra en la figura 5.

Un fragmento de ADN, obtenido generalmente por corte del ADN con ERs, se une
covalentemente por medio de la enzima ADN ligasa a un vector o plásmido, que ha sido
digerido con la misma enzima de restricción utilizada para preparar el ADN de interés. De
esta manera se genera una molécula nueva y única denominada recombinante. El vector
utilizado contiene por un lado, secuencias que le permiten replicarse (origen de
replicación) y por otro lado, secuencias para su posterior selección (por ejemplo genes que
confieren resistencia a antibióticos específicos).
El paso siguiente consiste en introducir la molécula de ADN recombinante a un
microorganismo adecuado. Para ello se usa generalmente una cepa de laboratorio de la
bacteria Escherichia coli. Las bacterias que llevan el ADN recombinante son seleccionadas
por su resistencia al antibiótico codificado por el plásmido. Las bacterias que incorporan el
vector lo replican, por lo que contienen varias copias del mismo plásmido recombinante.
Como es posible cultivar cantidades casi ilimitadas de estas bacterias se puede amplificar
la molécula recombinante, y por lo tanto purificar grandes cantidades del plásmido.
Con la misma metodología es posible obtener plásmidos recombinantes que permitan
expresar en gran cantidad una proteína de interés. En este caso se requiere que el vector
contenga secuencias que dirijan en forma eficiente la transcripción y traducción del gen en
bacterias. De esta manera se puede producir grandes cantidades de proteínas
recombinantes, incluso a nivel industrial. Ejemplo de ello es la producción entre otros de
insulina y factor de crecimiento recombinante los cuales ya están disponibles para uso
clínico.
22

Transferencia e hibridación de ácidos nucleicos: Southern y Northern:


La técnica de hibridación Southern se utiliza comúnmente para identificar genes en el
genoma humano. El ADN digerido con una ER, y separado por electroforesis es
desnaturado por tratamiento con álcali y luego transferido a una membrana o soporte
(Figura 6).

Figura 6. Transferencia e Hibridación Southern. En este ejemplo el ADN A


corresponde al ADN genómico de un individuo normal, y el ADN B
corresponde al ADN genómico de un individuo con una enfermedad
genética. La sonda utilizada para detectar al gen X hibrida con un fragmento
de mayor tamaño en el ADN B debido a que como consecuencia de un
reordenamiento del ADN en la región del gen X ha cambiado la localización
de los sitios de reconocimiento de la enzima de restricción utilizada en la
digestión del ADN.

Luego se incuba la membrana con una "sonda" marcada radioactivamente que es


complementaria al fragmento de ADN que se quiere detectar. Como sonda se puede
utilizar ARN purificado, ADN obtenido por clonamiento, o un oligonucleótido sintético.
Como el ADN de la membrana se encuentra desnaturado (se han separado las dos hebras
del ADN) es capaz de aparearse con el fragmento de ADN complementario, proceso que se
denomina hibridación.
23

Posteriormente, se lava el exceso de sonda no hibridada y es posible detectar el fragmento


que contiene la secuencia deseada exponiendo la membrana a una película radiográfica.
Esta técnica se denomina transferencia e hibridación Southern en honor a su descubridor.
Esta técnica ha sido de gran utilidad para identificar genes asociados con enfermedades de
transmisión genética, en particular para detectar polimorfismos en los fragmentos de
restricción de diversos genes, como por ejemplo en la enfermedad coreica de Huntington y
en la fibrosis quística.
La variante del método aplicada al análisis de ARN se denomina "Northern". En ella se
utilizan sondas de ADN que hibridan con secuencias de ARN complementarias. Esta es una
herramienta muy útil para el estudio de los productos de la transcripción génica (ARN
mensajero) y de su regulación ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la
abundancia de especies de ARN en diferentes condiciones experimentales o comparar
condiciones clínicas normales o patológicas.

Secuenciación del ADN:


El método más utilizado para secuenciar ADN es el de los didesoxinucleótidos desarrollado
por Sanger y cols. en 1977. Este consiste en sintetizar ADN in vitro en presencia de
nucleótidos artificiales (didesoxinucleotidos), que impiden la extensión de la cadena de
ADN cuando se incorporan a la hebra en crecimiento. La reacción se realiza
simultáneamente en 4 tubos, cada uno de los cuales contiene una mezcla de nucleótidos y
un didesoxinucleotido (ddA, ddG, ddC ó ddT). De esta manera se obtiene en cada tubo una
población de moléculas de ADN de distintos tamaños que pueden ser analizados mediante
electroforesis en gel (Figura 7). Para detectar el ADN se utilizan nucleótidos marcados o
fluorescentes. Para visualizar el ADN los geles se exponen a un film de rayos X o se
procesan en instrumentos capaces de medir fluorescencia. La secuencia es "leída"
siguiendo los fragmentos de menor a mayor tamaño (Fig. 7).
24

Figura 7. El método de los didesoxinucleótidos para la secuenciación del ADN. Con este
método se obtiene una población de fragmentos de ADN de distinto largo, cada uno de los
cuales contiene en su extremo 3' un tipo particular de didesoxinucleótido (ddG, ddA, ddT
óddC). Los productos se separan por electroforesis en gel. La secuencia del ADN es leída
desde los fragmentos más pequeños a los más grandes. En este ejemplo se muestra las
autorradiografías de geles de secuencia de una región codificante del gen supresor de
tumor p53 en dos muestras de ADN: a) muestra de ADN de un individuo normal; b)
muestra de ADN de un individuo con un tumor vesicular. Las secuencias obtenidas
difieren en un nucleótido, el que se indica con una punta de flecha, lo que genera un
cambio de codón en la secuencia de ADN del individuo con cáncer: en lugar de un codón
TCC (Ser) en la posición 241 la secuencia leída es TTC (Phe).
25

LA HUELLA GENETICA.

Los recientes avances en Biología, especialmente en el conocimiento de la estructura y


funciones del ADN han producido una verdadera revolución en las técnicas de
identificación individual por lo que la Medicina Legal y la Antropología Forense pueden
hoy disponer de unas poderosas herramientas de trabajo que permiten resolver con mucha
seguridad algunos de los complicados problemas que se nos plantean. La propiedad del
polimorfismo del ADN ha permitido además, su aplicación en muchos campos de la
investigación científica que vamos a revisar brevemente.

Cada célula de nuestro organismo posee 46 cromosomas (23 pares) formados por ADN
(ácido desoxirribonucleico) que contienen en sus complejas estructuras el Código genético.
Este ADN está formado por nucleótidos dispuestos en una doble cadena helicoidal y
compuestos a su vez por un azúcar, pentosa (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base
nitrogenada. Estos azúcares y fosfatos son iguales, mientras que las bases son diferentes, lo
que permite distinguir cuatro tipos de nucleótidos cuyas bases les dan nombre: adenina
(A), guanina (G), citosina (C) y timina (T). Las bases se unen unas con otras de una manera
especial, las A con las T, y las G con las C (A-T, G-C) por medio de puentes de Hidrógeno,
dos y tres respectivamente. La mitad del ADN del genoma humano es no codificante y de
éste, la mitad es repetitivo (aprox. un 25 % del ADN total). A su vez, la mitad de éste, lo
forman secuencias repetidas de dos clases: SINES o elementos dispersos cortos de 500 bp
y LINES o elementos dispersos largos, de más de 500 bp.

La otra mitad es el ADN repetido en tandem, parte del cual son los llamados satélites (I,
II, III y IV) y los minisatélites, formados por escasos bp, que son los que tienen más
capacidad individualizadora. Las unidades en tandem son de 15 a 20 bases que se pueden
repetir de 200 a 1.400 veces.

Jeffreys y col. (Nature, 314, 1985) señalan que el genoma humano contiene muchas
regiones minisatélites dispersas en tandem, muy polimórficas debido a la variación
alélica que se produce al repetirse. Precisamente éste es el motivo de que las pruebas
basadas en la repetición de los tandem de una secuencia permitan detectar muchos loci
muy variables simultáneamente lo que proporciona así una huella genética
específicamente individual muy útil en el análisis de materiales diversos.

Las moléculas de ADN que constituyen los cromosomas son de gran longitud midiéndose
en Kilobases (Kb). Cada Kb equivale a 1.000 pares de bases (bp). Para darnos idea de esta
longitud señalaremos que el cromosoma X mide 150.000 Kb y el Código genético una
longitud de 3.000 millones de bases.

Los análisis de ADN se basan en la propiedad que tienen sus cadenas de ser rotas por
métodos físicos o químicos a nivel de las uniones de Hidrógeno, obteniéndose así
segmentos de ADN de cadena simple con capacidad para ser duplicados formándose ADN
de doble cadena. Para analizar el polimorfismo del ADN usamos las llamadas sondas o
segmentos de ADN marcados con algún elemento radiactivo (P32), enzimas u otros,
consiguiendo que se unan éstos con el ADN complementario (hibridación).

Al cortar el ADN por los lugares adecuados, podemos detectar diferencias en la longitud de
los fragmentos (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) y polimorfismos
VNTR (Variable Number of Tandem Repeats).
26

Las sondas utilizadas pueden ser multilocus con las que se consigue el llamado "DNA
fingerprint" al unirse la sonda a muchos loci. Y pueden ser monolocus o unilocus que
detectan loci VNTR individuales muy polimorfos.

APLICACIONES Los exámenes tradicionales de manchas de sangre en los


Laboratorios de Medicina Legal, o los de manchas de semen, raíces de pelos o cabellos,
tratan de determinar el sistema ABO, Hemoglobina (Hb), Peptidasa, Fosfoglucomutasa,
Rh, Anhidrasa carbónica, ADA, AK, Fosfatasa ácida eritrocítica y otros más. Pero tienen la
limitación de que los materiales analizados han de ser recientes. Al mes, estos productos
han sufrido una a veces insalvable degradación. Otras muestras como las de semen que
contienen enzimas proteolíticas, o bien debido a la actividad bacteriana, pueden producir
múltiples errores.

En cambio el ADN puede servir como huella genética y ser analizado en muestras de gran
antigüedad como veremos más adelante. De manchas de sangre y semen de 3 a 5 años de
antigüedad es perfectamente posible obtener ADN suficiente para aislar huellas genéticas
capaces de determinar la identificación individual.

La violación ha sido uno de los delitos más frecuentes en todos los tiempos, una forma de
agresión sexual en la guerra y en la paz. Castigada por los Códigos penales antiguos y
modernos, ha planteado con frecuencia tremendas dudas a la Justicia sobre el hecho de si
hubo o no hubo consentimiento por parte de la víctima, además de averiguar quién fué
realmente el agresor. Los exámenes externos permitieron casi siempre comprobar la
existencia de rotura del himen en las vírgenes, el estado de las carúnculas mirtiformes, con
la excepción de los llamados "hímenes complacientes" cuya notable elasticidad permite la
"inmisio penis" sin producir lesión visible. La presencia de semen en la cavidad vaginal, las
lesiones del cuerpo de la víctima y el caso extremo pero no infrecuente de la muerte
violenta de ésta tras la violación o precediendo a ésta, complicaron más las situaciones.

Hasta hace pocos años se determinaba el HLA, antígeno que está presente en todas las
células del organismo y que constituye una huella notable, con la probabilidad de 1/40.000
de que dos personas no emparentadas presenten el mismo resultado. Pero el HLA tiene el
inconveniente de ser sumamente frágil, pudiendo destruirse en cuestión de horas, lo que a
menudo sucede en los casos de violación hasta que la víctima es examinada.

El estudio del ADN por medio de "sondas", permite interrogar al Código genético de las
secreciones del delincuente y recibir una respuesta muy precisa. JEFFREYS, GILL y
WERRETT (Nature, 316, 1985) realizando investigaciones detalladas en el Home Office
Forensic Service, llegaron a este descubrimiento. En el semen del violador como en el de
toda célula de cualquier persona, está contenida su huella genética, una huella tan
precisa o más que la huella dactilar tradicional que permite llegar a la identificación
individual con gran exactitud y precisión.

La probabilidad de que haya dos huellas iguales es de 1/6.300.000.000. Por eso se dice
con razón huella genética como se dice huella dactilar a los dibujos de las yemas de
los dedos que también son específicas de cada persona.

Hay otras huellas específicas en el organismo humano que permiten al Antropólogo


Forense llegar a la identificación del cuerpo o fragmentos de él, por ejemplo, los senos
frontales (su forma, tamaño y disposición), las Líneas de Harris o líneas de detención del
crecimiento de los huesos largos, en especial de las tibias; la estructura, forma, tamaño,
27

número y disposición de los dientes, la fórmula dentaria (la cavidad bucal ha sido llamada
por eso la "caja negra" de nuestro cuerpo comparándola a la que llevan los aviones y que
permite averiguar la causa de los desastres aéreos), el HLA, el grupo sanguíneo, etc.

Pero la huella genética procedente del alfabeto genético permite estudiar desde este
punto de vista tejidos orgánicos como la raíz de los pelos, los leucocitos de la sangre, los
espermatozoides, la piel, el líquido amniótico o cualquier célula humana y encontrar en el
núcleo de la misma el patrón genético que caracteriza a cada individuo.

El investigador estudia la muestra tomada de la vagina de la mujer violada y el semen del


sospechoso, los compara y dictamina si se trata de la misma persona, realizando para ello
la hibridación del material sospechoso y del testigo, marcando la localización de los
minisatélites y viendo si se corresponden unos con otros.

Cinco mm3 de sangre o semen bastan para identificar a un culpable. El examen de


Laboratorio permitirá ver en el ADN extraído varias decenas de bandas parecidas a los
códigos de barras utilizados en los productos comerciales, de diverso espesor y longitud
nunca iguales en dos personas, que proceden a partes iguales del padre y de la madre del
sujeto analizado.

La investigación de la paternidad después de violación o incesto puede ser establecida


por la determinación de grupos eritrocíticos, grupos HLA y enzimas eritrocíticos,
efectuados en células de líquido amniótico o de vellosidades coriales. MANGIN y col.
(J.Med.Leg.Droit Médicale, 34, 1991) estudiaron 10 casos de aborto consecutivo a agresión
sexual (violación e incesto). En todos los casos pudieron determinar la huella genética del
feto y comparando con la huella genética de la madre, se pudo determinar el alelo
transmitido por el padre al feto. Posteriormente se practicó la búsqueda de este alelo en el
material genético del sospechoso. Esto fué posible en 8 de los 10 casos. En un caso el
sospechoso fué descartado. En el décimo caso no se pudo hacer la comparación por no
hallarse al agresor.

Hay dificultades en los casos de los fetos macerados. Es fácil en los casos de preñez
reciente cuando se puede disponer de tejidos trofoblásticos. La degradación del ADN fetal
en fetos macerados ha hecho a veces imposible el análisis. Sin embargo en algunos casos
aún es posible obtener buen material para el análisis, del vértice del pulmón y del encéfalo
por ser zonas más protegidas por las estructuras óseas.

El ADN es muy útil para la determinación de la paternidad. Sabiendo que en cualquier


persona la mitad del genoma procede del padre y la otra mitad de la madre, en el supuesto
de que haya dos individuos sospechosos de ser el padre de una criatura, bastará comparar
las bandas halladas en las huellas genéticas del hijo, de la madre y de los sospechosos. Las
bandas correspondientes a la madre se eliminan y quedan las del verdadero padre. Se
comparan éstas con las del sospechoso o sospechosos y aparecerá con claridad si es alguno
de ellos por la coincidencia visible que se produce en el espesor y situación de estas bandas.
La probabilidad de error será de una entre un millón en los exámenes con sonda
multilocus y si se hace con sonda monolocus repitiendo dos o tres veces se alcanza la
misma probabilidad.

Debido a que en ocasiones la muestra que hay que analizar viene alterada o es escasa, el
método de sondas RFLP no basta para llegar a resultados valorables. KARY MULLIS ideó
otra técnica llamada PCR o Reacción en cadena de la polimerasa, por medio de la cual, con
28

muy escasa cantidad de ADN se logran excelentes resultados. Consiste en amplificar


segmentos de ADN por síntesis enzimática de secuencias específicas de ADN, utilizando el
fragmento Klenow de la ADN-polimerasa. Se perfecciona posteriormente el método
utilizando la Taq-polimerasa obtenida a partir de una bacteria termófila.

El PCR es tan sumamente sensible que permite analizar incluso muestras degradadas. Esta
técnica presenta muchas posibilidades en Criminalística y Ciencias antropológicas en
general.

VERBOVAYA e IVANOV (1991) aislaron ADN de manchas frescas de sangre, sometiéndolo


a examen rutinario: digestión con endonucleasas de restricción particulares,
fraccionándolo luego por agarosa-gel-electroforesis. Visualizaron con rayos ultravioleta
tiñendo con Bromuro de etidio (EtBr) el gel. Así aparece un patrón de banda específico
para el sexo, que depende sólo de la enzima de restricción utilizada. La técnica es excelente
para la determinación del sexo en el ADN en casos criminales. También se puede realizar la
determinación del sexo utilizando la reacción PCR.

EL ADN Y LA HUELLA GENETICA EN OTRO TEJIDOS

En los estudios del ADN en diferentes tejidos se ha podido observar que el procedente del
músculo cardiaco, bazo y hueso es el menos degradado, mientras que el que procede el
hígado es el que más fácilmente se degrada.

No existe una correlación estricta entre el estado de degradación del ADN y la data de la
muerte. Se ha encontrado ADN de elevado peso molecular en la pulpa dentaria en casos en
los cuales las condiciones en que quedó el cadáver fueron muy adversas.

S. PÄÄBO (Nature, 314, 1985) estudió 23 momias egipcias obteniendo de ellas ADN. En
uno de los casos se trataba de un niño en el que el ADN pudo ser clonizado
molecularmente en un vector plásmido. En este clonus encontró dos elementos de la
familia Alu de la secuencia humana repetitiva de ADN. Este análisis demostró que
muestras de ADN de momias (3,4 Kb) pueden ser clonizadas y que los fragmentos de ADN
parece que contienen muy pocas o ningunas modificaciones postmortem.

Las muestras estudiadas variaron desde las procedentes de la VI Dinastía (-2370 -2160
a.C.) hasta las de los tiempos romanos tardíos. Previamente rehidrataba las muestras de
tejido momificado (revitalización) y hacía cortes microscópicos tiñéndolos con los métodos
clásicos y con Bromuro de etidio que permite detectar pequeñas cantidades de ADN.

Halló núcleos en células de cartílagos de la oreja (en una cabeza de mujer del Museo
egipcio de Berlín) y de epidermis y tejido subcutáneo de la cabeza de un hombre del Museo
Viktoria de Uppsala. Si bien existían pirimidinas modificadas en el segundo caso, lo que
hacía imposible su clonización, en cambio en un niño de un año momificado, procedente
del Museo egipcio de Berlín, estaban excelentemente conservados los núcleos. La prueba
del C14 en este caso dió una antigüedad de 2430+120.

La conservación histológica de los tejidos momificados fué mucho mejor en los tejidos
superficiales y partes periféricas del cuerpo que en las más profundas, observación que
también hicieron DANSELS y col. (1970) y CRADEL y col. (1981), debido probablemente a
la imbibición con natrón y la consiguiente deshidratación.
29

Los trabajos de todos estos autores han demostrado que el ADN puede ser estable durante
largos periodos de tiempo (miles de años) al menos en ciertos restos humanos y en
condiciones especiales de momificación.

De gran valor antropológico es el estudio del ADN en huesos y dientes antiguos. Las
enormes posibilidades que brinda para la investigación de estos restos son evidentes.

Así HAGELBERG y col. estudiando huesos muy antiguos de 300 a 5.000 años encontraron
aún ADN estable en ellos (Ancient bone DNA amplified, Nature 342, 1989).

LEE y col. (Genetic markers in human bone, J.For.Sc.36, 1991) aislaron ADN de muestras
de tejido óseo humano esponjoso y compacto. Fueron utilizadas para visualizarlo, técnicas
como la espectrofotofluorometría y las tinciones con Bromuro de etidio en minigeles, así
como para estimar la cantidad y el grado de degradación del ADN. El extenso polimorfismo
detectado por este tipo de análisis de ADN está en relación con el número variable de
tandems de repetición (VNTR) dentro de las secuencias de ADN repetitivo en el genoma
humano (HUANG y col. Advances in Forensic Sc. 3 vol. Chicago 1990).

LEE y col. (J.For.Sc.36:320, 1991) para obtener ADN de huesos toman muestras de 10 a 20
mg de hueso esponjoso y 75 a 100 mg de hueso compacto. Las diversas etapas de
tratamiento de estos materiales pueden resumirse así:

1. Inmersión y agitación en agua destilada fría (15 min).

2. Pase por etanol (15 min).

3. Pase por éter etílico (15 min).

4. Secado de la muestra.

5. Inmersión en N líquido por 15-30 segundos para congelarla.

6. Reducción a fino polvo.

7. Extracción del ADN de este polvillo utilizando el método que se emplea para las
manchas de sangre que es el siguiente:

8. Incubación durante una noche a 37ºC con 400 L Extraction Buffer (10 mM Tris, 10 mM
EDTA) y 100 mM (ClNa) pH 8, conteniendo 2% SDS (Sodium dodecyl sulfato) y 4.1 sigma
unidades de Proteinasa K seguido por lo menos de dos extracciones con ClH (pH 8), fenol y
formol equilibrados conteniendo alcohol isoamílico (24:1 v/v).

9. El ADN se precipita con etanol 100 %, se lava con etanol 70 % y se redisuelve en TE (10
mM Tris y 1 mM Na2 EDTA, pH 7.8) buffer.

El ADN fué obtenido de 10 a 20 veces en mayor cantidad en tejido esponjoso que en


compacto. Por lo menos se necesitan 50 mg o más de hueso compacto para obtener ADN.
Con menos no se consiguieron resultados.
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La aplicación de esta técnica al estudio del diente ha dado excelentes resultados debido a la
sorprendente estabilidad del ADN contenido en la cavidad pulpar. La razón es que en ella
el ADN está protegido, de manera que la contaminación y la acción bacteriana son
mínimas o nulas.

SCHWARZ (1991) sometió a dientes extraídos a diversas condiciones ambientales: varios


pH (3, 7, 10), temperaturas diversas (4ºC, 25ºC, 37ºC, incineración), humedad (20%, 66%,
98%), varios tipos de suelos (arena, piso del jardín y otros), agua de mar, dientes
enterrados y tiempo diverso (una semana a seis meses). Además examinó dientes extraídos
hacía 16 a 19 años conservados a la temperatura de la habitación.

Aisló el ADN de las muestras en gel con objeto de determinar la concentración e integridad
del ADN. Observó que la pulpa dentaria es un material muy rico en ADN. Realizó el tipo de
análisis de ADN que hemos llamado RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism).
La incineración produjo la completa pérdida de HMW y un ADN de bajo peso molecular.
Pero en la mayoría de los casos obtuvo suficiente ADN para hacer un análisis de RFLP,
obteniendo de 15 a 20 microgramos de HMWDNA de la pulpa dentaria.

OTRAS APLICACIONES

Además de las propias de la Criminalística que hemos ido citando como es el examen de
indicios hallados en el lugar del crimen (semen, manchas de sangre, cabellos en la mano de
la víctima, fragmentos de la piel del agresor bajo las uñas por arañazos de defensa de la
víctima, etc.), en los que la huella genética puede conducir a la identificación del agresor
o bien a descartar a un acusado inocente, el estudio del ADN es muy útil en Arqueología y
Paleopatología. Materiales humanos antiguos han demostrado su valor diagnóstico para
estudios diacrónicos en genes polimorfos de poblaciones neolíticas y paleolíticas, así como
el del estudio del ADN contenido en virus de aquellos tiempos.

Se ha empleado para determinar la procedencia y descendencia de los antiguos pobladores


del Valle del Nilo, así como las relaciones entre las familias faraónicas y las diversas
dinastías.

El polimorfismo del ADN ha revolucionado el análisis genético humano, no sólo en el


campo del diagnóstico de la identidad individual sino en el origen de las enfermedades del
pasado y la evolución de las mismas a través del tiempo.

En Antropología está permitiendo estudiar el pedigree de determinados grupos de


población, así como distinguir las uniones entre consanguíneos, la endogamia, etc.

En el campo de la Evolución de las especies tiene un enorme interés y a medida que se


avance en su conocimiento, la huella genética nos permitirá llegar a saber quiénes
fueron los antepasados directos o indirectos de una especie dada, así como la relación
entre las diversas especies y su posición filogenética.

El quagga es un miembro ya extinguido de la familia del caballo. HOGUCHI y col.


(Nature, 312, 1984) examinaron músculos desecados de una pieza de Museo perteneciente
a un quagga, especie de cebra (Equus quagga) extinguido en 1883. De estos músculos
obtuvieron ADN de bajo peso molecular. La muestra correspondía a un ejemplar muerto
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hacía 140 años que se encontraba conservado en el Museo de Historia Natural de Mainz
(Alemania). En la comparación con el ADN obtenido de una cebra actual (Equus zebra) se
obtuvo la misma señal de hibridación.

En Antropología Forense es un método prometedor si funciona sobre todo el tipo de


análisis PCR sobre ADN obtenido en huesos. Un caso frecuente que se presenta es el de
determinar si un fragmento de hueso o un hueso (supuesta reliquia de un santo por
ejemplo) pertenece realmente a ese santo cuyos restos en su mayor parte se encuentran
bien identificados y documentados en un sarcófago de un monasterio. La comparación del
ADN en ambos restos puede confirmar o por el contrario descartar que se trate de la
misma persona.

De la misma forma se pueden estudiar restos dispersos de cadáveres en una gran catástrofe
y saber si pertenecen a la misma persona o a personas distintas.

PORVENIR DE LA HUELLA GENETICA

Se ha dicho que la huella genética puede llegar a substituir a la huella dactilar. Esta
idea es errónea. Cada una tiene sus aplicaciones específicas. Y si bien el estudio de la huella
genética ha sido un avance revolucionario en determinados casos como es el estudio del
semen o la sangre para identificar a la persona a quien pertenece, no tiene nada que ver
con el hallazgo de huellas dactilares sobre la superficie de un arma u otro objeto donde el
criminal haya puesto sus manos.

Es como si quisiéramos comparar un plato con un paraguas. Se trata de dos métodos


diferentes, complementarios en muchos casos para la investigación forense.

WERRETT menciona el caso de dos mujeres violadas y asesinadas en una población. Un


joven fué acusado de ser el culpable de ambas violaciones. Se comparó su huella genética
con el ADN del semen hallado en el cuerpo de ambas mujeres que era de una misma
persona. Resultó que el joven tenía una huella genética diferente a la del semen del
culpable y fué exculpado, al menos de las violaciones. Se propuso entonces el estudio de la
huella genética de todos los hombres de la región, en total 3.300. Dice WERRRETT que
aún están realizando estos análisis cada uno de los cuales dura por lo menos dos semanas.

Aquí se plantea el problema de la voluntariedad como ocurre con la prueba de la


alcoholemia. La ley no puede obligar a nadie a dejarse practicar esta prueba. El hecho de
negarse sin embargo, puede hacer sospechoso a un individuo. Si el violador está entre los
3.300 varones examinados, será perfectamente detectado por medio del estudio de la
huella genética sin duda alguna.

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