Professional Documents
Culture Documents
Fen-Edebiyat Fakültesi
Kimya Bölümü / Biyokimya Anabilim Dalı
İçindekiler
Deney I
Amino Asitlerin Titrasyon Eğrileri Ve İzoelektrik Nokta Tayini ……………….…....3
Deney II
Amino Asitlerin Kağıt Kromatografisi İle Ayrılmaları………………………….......7
Deney III
Amino Asitlerin Ve Proteinlerin Bazı Özelliklerinin İncelenmesi .…………………11
Deney IV
Tampon Çözeltiler…………………………………………………..……..…………….19
Deney V
Katekolün Oksidasyonuna Polifenol Oksidaz Enziminin Etkisi………………………...23
Deney VI
Proteinlerin Saflaştırılması Ve Karakterizasyonu…………………………………….....32
Deney VII
Proteinlerin Kantitatif Tayini………………………………………………...………….39
Deney VIII
Proteinlerin Elektroforez İle Ayrılmaları Ve Molekül Ağırlıklarının Tayini………....…45
Deney IX
Proteinlerin N- Terminal Amino Asitlerinin İnce Tabaka Kromatografisi İle Belirlenmesi……54
Deney X
Memeli Dokularından DNA İzolasyonu Ve Bazı Özelliklerinin İncelenmesi………..…60
Kapak resmi: İnsan insülin parçalayıcı enziminin beta-amiloid (mavi) ile verdiği
kompleksin yapısı
Her labarotuvardan önce o gün yapılacak olan deneyi mutlaka dikkatle okuyunuz. Her
deneyden önce bir kısa sınav yapılacaktır. Bu sınav sonucunda sıfır almış olan öğrenci o
deneye alınmaz.
Öğrenciler deneyleri guruplar halinde yapmaktadırlar ancak her bir öğrenci kendi
yorumlarını, kendi hazırladığı deney raporu ile sunmalıdır. Birbirinin aynı olan raporlar
kabul edilmez. Aynı şekilde çalışma sorularına cevap verilmemiş deney raporları da
kabul edilmez. Deneylerin değerlendirilmesinde en önem verilen kısım tartışma kısmıdır.
Mutlaka her bir deneyin neden gerçekleştiği (veya neden gerçekleşmediği) konusunda
kendi açıklamalarınızı ekleyiniz.
Her dönemde bir ara sınav yapılır. Laboratuvar kısa sınavlarının %10’u deney
raporlarının %20’si ve ara sınavın %70’i alınarak öğrencinin vize notu saptanır. Ara
sınavdan sonra yapılan deneyler için de laboratuvar kısa sınavlarının %10’u deney
raporlarının %20’si ve finalin %70’i alınarak öğrencinin final notu saptanır.
DENEY I
Amfoterik maddeler olan amino asitlerde iki fonksiyonel grup bulunur. Bunlar
karboksilik asit (-COOH) ve amino (-NH2) gruplarıdır. Bu fonksiyonel gruplar nötral
ortamda iç tuz oluştururlar.
Nötral Ortamda:
(İç Tuz)
Asidik Ortamda:
(Katyon)
Bazik Ortamda:
(Anyon)
Amino asitlerde titre edilebilir en az iki grubun olması, en az iki denge sabiti (K) ve iki
iyonizasyon sabiti (Ki) olduğu anlamına gelir. İzoelektrik nokta (pI), aminoasitte
bulunan artı ve eksi yüklerin birbirine eşit olduğu, yani amino asidin net yükünün 0
olduğu pH değeridir, yani K1 ve K2’nin dengede olduğu noktadır.
KÂĞIT
Şekil 1.2- Glutamik asidin titrasyon eğrisi Şekil 1.3- Histidinin titrasyon eğrisi
KİMYASALLAR
YÖNTEM
Hazırlanmış olan 0.1N Glisin çözeltisinden bir başka behere 20 mL daha alınır ve pH
metre yardımı ile pH ölçümü yapılır. Daha sonra 0.1N NaOH ile titre edilir. Her 1mL baz
ilavesinden sonra beher karıştırılarak pH ölçümü yapılır. İşleme pH göreceli olarak sabit
kalıncaya kadar devam edilir.
VERİLERİN KULLANIMI
Milimetrik grafik kağıdı kullanarak x eksenine eklenen asit ve eklenen baz hacmini, y
eksenine ise ölçülen pH değerlerini koyarak grafiği çiziniz ve grafikten pKa ve pKb
değerlerini ve pI değerini bulunuz. Grafik üzerinden elde ettiğiniz verileri teorik değerler
ile karşılaştırınız.
ÇALIŞMA SORULARI
DENEY II
Kromatografi bir karışımdaki maddelerin iki faz arasında farklı dağılması esasına
dayanan bir ayırma yöntemidir. Sistemdeki fazlardan biri sabit (stasyoner) faz, diğeri ise
hareketli (mobil) faz olarak adlandırılır. Sabit faz genellikle destek ortamı oluşturmak
amacı ile kullanılırken, hareketli faz, karışımı oluşturan bileşenleri taşımak amacı ile
kullanılır. Karışımı oluşturan bileşenler hareketli ve sabit faz ile farklı oranlarda
etkileşerek farklı hızlarda yürürler. Bu esasa dayalı olarak ayırma yapan yöntemlere
kromatografik yöntemler denir ve ayırmayı sağlayan kuvvete göre adsorpsiyon, dağılım,
iyon değişim, jel geçirgenlik ve afinite (ilgi) olmak üzere beş sınıfa ayrılır.
Karışımı oluşturan bileşenler renkli ise kâğıt üzerinde yürüdükleri yerlerde yuvarlağa
yakın lekeler şeklinde görülürler. Eğer renksiz iseler üzerlerine bir reaktif püskürtülerek
ya da UV ışığı altında renk göstermeleri ile görünür hale getirilirler. Leke büyüklüğü ve
renk şiddeti kullanılarak kantitatif veya semi-kantitatif analiz yapılabilir.
KİMYASALLAR
Asetik asit, n-butanol, ninhidrin, aspartik asit, lösin, valin, arjinin, prolin, fenilalanin,
HCl, Whatman No.1 kromatografi kâğıdı.
YÖNTEM
n-butanol: asetik asit: su (65:15:25) karışımı hareketli faz olarak hazırlanır. Kromatografi
tankına 10 mL (yaklaşık 1 cm yüksekliğinde olacak şekilde) çözücü konulur ve tankın
ağzı kapatılır. Tankın çözücü buharı ile dengeye gelmesi için kromatografi kâğıdı
yerleştirilinceye kadar kapağı açılmaz.
Size verilen 5cm x 8cm boyutundaki Whatman No:1 Kromatografi kağıdının kısa
kenarından 1.2 cm uzaklığında kurşun kalemle bastırmadan çok hafif bir çizgi çizilir ve
bu çizgi üzerinde 1cm aralıkla 4 nokta işaretlenir.
Aspartik Asit
Lösin
Valin
Arjinin
Prolin
Fenilalanin
Örnek
ÇALIŞMA SORULARI
DENEY III
I- AMİNO ASİTLER
Amino asitler yapılarında en az bir karboksil ve bir amino grubu içeren organik
bileşiklerdir. Tabiatta bulunan yaklaşık 300 amino asidin 20 tanesi protein yapısına girer.
Protein yapısına giren amino asitler L, α- aminoasitlerdir. Amino asitler peptid (amid)
bağları ile bağlanarak polipeptid ve proteinleri oluştururlar. Amino asitler polar
olmayan organik çözücülerde çok az, etanolde az, suda çok çözünürler ve nötral çözeltiler
verirler.
II- PEPTİDLER
III- PROTEİNLER
100’den fazla aminoasit içeren polipeptidlere protein adı verilir. Bazen belirli bir
biyolojik fonksiyonu gerçekleştirmek üzere, belirli bir konformasyonu almış olmak şartı
ile 100’den daha az sayıda amino asit içeren polipeptidlere de protein adı verilebilir.
Canlı hücrelerin kuru ağırlığının yarısından fazlasını proteinler oluşturur. Proteinler
organizmada enzimlerin, hormonların, reseptörlerin, bağışıklık sistemi ve pıhtılaşma
faktörlerinin yapısında bulunurlar. Yapı ve hareket sistemi içinde görev alırlar.
Denatüre olan proteinlerde kuaterner, tersiyer ve kısmen sekonder yapılar bozulur ancak
primer yapı bozulmaz. Eğer polipeptid zincirinde kopmalar meydana geliyorsa buna
degradasyon adı verilir ve geri dönüşümsüzdür.
KİMYASALLAR
Glisin, arjinin, glutamik asit, fenilalanin, tirozin, triptofan, histidin, sistein, sistin, kazein,
yumurta albümin, sülfat asidi, nitrat asidi, hidroklorik asit, sodyum hidroksit,
cıva(II)klorür, sodyumnitroprussiyat, bakır(II)sülfat, bakır(II)asetat, kadmiyum sülfat ve
bizmut(II)nitrat.
YÖNTEM
4 ayrı tüpe az miktarda glisin, arjinin, glutamik asit ve fenilalanin alınır. Üzerine eşit
miktarda destile su ilave edilir ve karıştırılır. Amino asitlerin çözünürlükleri kaydedilir.
Oluşan çözeltilerin pH’ları pH kâğıdı ile tayin edilir.
Ksantoprotein Reaksiyonu:
Fenil halkası içeren aromatik amino asitler derişik nitrat asidi ile muamele edildiklerinde
sarı renkli nitro türevlerine dönüşürler. Nitrat asidinin cilde temas etmesiyle oluşan
sararmanın sebebi budur.
Millon Reaksiyonu:
Fenol içeren bileşikler bu reaksiyonu verir. Tirozin amino asidi fenol grubu içeren tek
amino asit olduğundan bu reaksiyon tirozine özgüdür. Önce tirozinin fenol grubu reaktif
çözeltisindeki nitrik asit tarafından nitratlanır. Daha sonra nitratlanmış tirozin molekülü
çözeltideki cıva (I) ve cıva (II) iyonları ile kırmızı renk verir.
Ayrı tüplerdeki 3 mL tirozin ve kazeinin sulu çözeltilerine birkaç damla millon reaktifi
eklenir ve tüpler kaynar su banyosunda ısıtılır. Renk oluşumu kaydedilir.
Nitroprussiyat Reaksiyonu
Sülfidril grupları içeren bileşikler ağır metaller ve sodyum nitroprussiyat ile koyu renkli
kompleksler oluştururlar. Sistein serbest –SH grupları içerdiğinden bu reaksiyonu verir.
Sistin serbest –SH grubu içermediğinden bu reaksiyonu vermez.
2 tüpe ayrı ayrı sistein, sistin ve kazein çözeltileri alınır ve üzerlerine az miktarda %10
NaOH ve aynı hacimde %2 sodyum nitroprussiyat çözeltisi eklenir. Renk değişimi
kaydedilir. Kazein tüpüne bir miktar derişik HCl eklenir ve gözlemler kaydedilir.
Triptofan Reaksiyonu
İki ayrı tüpteki az miktarda triptofan ve glisin çözeltileri üzerine eşit hacimde derişik
asetik asit konulur. Bu karışımın üzerine damla damla, tabaka oluşturacak şekilde derişik
sülfat asidi ilave edilir. Turuncu-mor halka oluşumu triptofan varlığını belirtir. Bu
triptofana özgü bir denemedir.
Ninhidrin
Ninhidrin Serbest NH2 Grubu Mor
Reaksiyonu
Triptofan, Tirozin,
Ksantoprotein Kaynar HNO3 Sarı
Fenilalanin
Der. HCl içinde p-
Ehrlich Reaksiyonu Triptofan Mavi
dimetilamino benzaldehit
Sakaguchi α- Naftol, NaOCl veya
Arjinin Kırmızı
Reaksiyonu NaOBr
Nitroprussiyat Sodyum nitroprussiyat,
Sistein Kırmızı
Reaksiyonu NaOH
Sodyum-1,2-naftokinon-4-
Sullivan reaksiyonu Sistein Kırmızı
sülfonat ve NaHSO4
Kurşun Sülfür NaOH, Seyreltik Kurşun
Sistein Siyah
Reaksiyonu asetat
Hopkins-Cole
Glioksilik asit, Sülfürik Asit Triptofan Mor
Reaksiyonu
Sülfanilik asit, HCl, Sodyum Histidin: Sarı
Pauly Reaksiyonu Histidin, Triptofan
karbonat, Sodyum nitrit Triptofan: Mor
Proteinlerin Denatürasyonu:
Isının etkisi: Bir tüpe az miktarda yumurta albümin çözeltisi alınır ve bir süre sıcak su
banyosunda tutulur. Gözlemler kaydedilir.
Konsantre asitlerin etkisi: Bir tüpe az miktarda yumurta albümin çözeltisi alınır ve
üzerine hacminin iki katı kadar derişik nitrik asit ilave ederek gözlemler kaydedilir.
Ağır metal tuzlarının etkisi: 4 ayrı tüpe az miktarda yumurta albümin çözeltisi alınır ve
üzerlerine az miktarda bakır(II)asetat, kadmiyumsülfat ve bizmut(II)nitrat ilave edilerek
gözlemler kaydedilir.
Biüret reaksiyonu:
İki veya daha fazla peptid bağı ihtiva eden bileşikler alkali bakır sülfat ile menekşe veya
mor renkli kompleksler oluştururlar. Rengin koyuluğu proteindeki peptid bağlarının
sayısına bağlıdır. Bu test, peptid bağlarını belirlediğinden amino asitlerle reaksiyon
vermez. Bu reaksiyon ayrıca azot veya karbon atomuna bağlı iki karbonil grubu ihtiva
eden bileşiklerle de pozitif sonuç verir. Bu test proteinlerin kantitatif olarak tayini için de
kullanılmaktadır ancak bu amaçla kullanılan biüret reaktifi sodyum potasyum tartarat,
bakır sülfat ve potasyum iyodür içerir.
Üç ayrı tüpe az miktarda glisin, yumurta albümin ve kazein çözeltileri alınır. Tüplere aynı
hacimde %10 NaOH çözeltisi ve beşer damla %1 CuSO4 çözeltisi eklenir ve renk
değişimi kaydedilir.
ÇALIŞMA SORULARI
DENEY IV
TAMPON ÇÖZELTİLER
Zayıf bir asidin kendisini ve anyonunu (konjuge bazını) veya zayıf bir bazın kendisini ve
katyonunu (konjuge asidini) yan yana içeren çözeltilere tampon çözeltiler adı verilir.
Tampon çözeltiler az miktarda asit veya baz ilavesiyle belirgin bir pH değişimi
göstermezler. Bir çözeltinin tampon etkisini gösterebilmesi için ayrı ayrı hem H+ iyonu
veren hem de H+ iyonu alan tanecikleri yeterli konsantrasyonda içermesi gereklidir.
Tampon çözeltiler sabit pH aralıklarında çalışmak üzere hazırlanırlar.
Henderson-Hasselbalch Denklemi
(A-: Tuz / HA: Asit)
Tampon çözeltiyi oluşturan maddeler her oranda değil sadece belirli bir oranda en iyi
tampon etkisini gösterirler. A-/HA oranı bire eşit olduğunda log1 = 0 olacağından pH
değeri de pKa değerine eşit olur. Bu pH değerine tamponun optimum pH değeri denir.
Bu pH değerinin dışındaki değerlerde tamponun etkisi zayıflar. Tamponlar optimum pH
değerlerinin bir birim altı ve bir birim üstündeki pH aralıklarında en etkili olarak
kullanılabilirler
Organizma sıvılarının asit baz dengesinin asit tarafına kaymasına asidoz, alkali tarafına
kaymasına ise alkaloz denir. Asit metabolizma ürünleri artarsa, oluşan H+ iyonları HCO3-
/CO2 tarafından tutulur ve H2CO3 meydana gelir. Bunun dissosiasyonu ile oluşan H+
iyonları diğer tamponlarca tutulur. Bir kısmı da karbondioksit ve suya dönüşür.
Karbondioksidin artması nedeniyle pH 7.4’ün altına düşer. HCO3- konsantrasyonunun
azalması ile meydana gelen bu duruma metabolizma asidozu denir. Diyabette, açlıkta ve
karbonhidratsız rejimlerde görülen asidozlar buna örnektir. HCO3- konsantrasyonunun
artması ile metabolizma alkalozu meydana gelir. Aşırı sodyum bikarbonat alınması ve
şiddetli kusma sonucu midede HCl kaybı ile oluşan alkalozlar buna örnektir.
KİMYASALLAR
YÖNTEM
ÇALIŞMA SORULARI
1- Bir tampon litrede 0.01 mol laktik asit (pKa=3.86) ve 0.05 mol sodyum laktat
içermektedir.
a- Tamponun pH değerini hesaplayınız.
b- 1 L tampona 5 mL 0.5 M HCl eklendiğinde pH değişimi ne olur?
DENEY V
Küçük bir grup katalitik RNA moleküllerinin haricinde tüm enzimler protein
yapısındadırlar. Katalitik aktiviteleri genellikle proteinin doğal yapısında olmasına
bağlıdır. Eğer bir enzim denatüre olur veya alt ünitelerine ayrılırsa katalitik aktivitesi
genellikle kaybolur.
Bazı enzimler aktivite göstermek için bir veya daha fazla anorganik iyona veya kompleks
organik veya metallorganik bileşiklere ihtiyaç gösterirler. Bu iyon ya da bileşiğe
kofaktör adı verilir. Organik bileşik enzimin protein kısmı ile çok sıkı bir şekilde
bağlanmış ise prostetik grup, çok sıkı bağlanmamış ve dissosiye olabiliyorsa koenzim
adını alır. Katalitik olarak etki gösteren tam enzime holoenzim denir. Holoenzimin
protein kısmına ise apoenzim adı verilir.
Enzimin etki ettiği bileşiğe substrat adı verilir. Enzimin katalizlediği reaksiyonu
proteinin tamamı değil, sadece “aktif bölge” adı verilen belirli bir bölgesi etkiler.
Böyle bir reaksiyon genel kimyasal reaksiyon mekaniğine ve kinetiğine uyar. Diğer
katalizörlerde de olduğu gibi enzimler reaksiyonun yönünü değiştirmezler sadece
reaksiyonun hızına etki ederler. Reaksiyona ilerleyebileceği daha düşük aktivasyon
enerjili ara yollar sunarak reaksiyonu hızlandırırlar.
olur.
şeklinde yazılabilir.
Burada Km, kontrollü şartlarda reaksiyonun maksimum hızının yarısına eşit hız veren
substrat konsantrasyonudur ve Michaelis-Menten sabiti olarak adlandırılır.
Maksimum hız toplam enzim konsantrasyonu ile orantılı olduğu kadar, başlangıç hızıyla
da orantılıdır. Böylece Vmaks = K3 [E0] olduğundan denklem 4’te yerine konulursa
aşağıdaki denklem elde edilir.
eşitliği bulunur.
Denklem 6’ya göre V0 ile [S] arasında çizilen grafik aşağıdaki gibi olur. Bu eğriye
Michaelis-Menten eğrisi denir.
Y eksenine 1/V0, X eksenine de 1/[S] değerleri yerleştirilerek çizilen grafikte elde edilen
doğrunun eğimi Km/Vmaks’a ve Y eksenini kesen nokta 1/Vmaks’a eşit olur. Km değeri de
grafikte gösterildiği şekilde bulunabilir. Bu eğriye Lineweaver-Burk eğrisi adı verilir.
Eğer V0 değerine karşı V0/[S] grafiği çizilecek olursa bu eğriye Eadie-Hofstee eğrisi
elde edilir.
Enzim ünitesi (U): 25°C’de 1 dakikada optimum şartlarda 1µmol substratı ürüne çeviren
enzim miktarıdır.
Spesifik aktivite (U/mg protein): 1 mg protein başına enzim ünitesidir. Enzimin saflık
derecesinin bir göstergesidir.
Molar Aktivite: Bir tek enzim molekülü tarafından birim zamanda ürüne çevrilen
substrat molekülü sayısıdır. Dönüşüm sayısı olarak da adlandırılır.
Enzim miktarı çok küçük olduğundan direkt olarak ölçmek zordur. Optimum şartlarda
katalizledikleri reaksiyon hızları diğer şartlar sabit kalmak üzere, enzim konsantrasyonu
ile orantılıdır. Böylece enzim konsantrasyonu hız ölçülmesi ile tayin edilebilir.
Enzimle katalizlenmiş reaksiyonların hızı inhibitör adı verilen bazı maddeler tarafından
azaltılır veya tamamen durdurulur. Buna enzim inhibisyonu denir. Enzim inhibisyonu
geri dönüşümlü veya dönüşümsüz olabilir.
Polifenol oksidaz enzimi doğada yaygın olarak bulunan, bakır içeren bir enzimdir. Meyve
ve sebzelerde hasar görmüş bölgelerin hava ile teması sonucu kararması ve cildin
esmerleşmesi (melanin sentezi) gibi reaksiyonlardan sorumludur. Enzimin aktivitesi,
fenollerin katekollere orto-hidroksilasyonu ve katekollerin orto-kinonlara oksidasyonu
olacak şekilde ikiye ayrılabilir.
Spektrofotometrik ölçümde bir ışık kaynağı geniş bir spektrumda ışık yayar,
monokromatör belirli bir dalga boyundaki ışığı seçer ve örnek küvetine gönderir. Işık
küvetten geçerken absorblayıcı moleküllerin konsantrasyonuna bağlı olarak bir kısmı
absorblanır ve çözeltiden geçen ışık bir dedektör tarafından ölçülür.
Bu denemede amaç iki anahtar parametrenin bulunmasıdır. Bunlar maksimum hız (Vmaks)
ve Michaelis-Menten sabitidir (Km).
KİMYASALLAR
YÖNTEM
Ham enzimin hazırlanması: Patatesler soyulur ve bıçakla küçük parçalara ayrılır. Daha
sonra blender cihazı yardımıyla ve 200 mL pH 6 sitrik asit - fosfat tamponu varlığında
homojenize edilir. Enzimlerin aktivitesi sıcaklıktan etkilendiği için bu aşamadan
sonraki tüm işlemler hızlı bir şekilde ve buz üzerinde gerçekleştirilir. Elde edilen
homojenizat, bir buz banyosuna önceden yerleştirilerek soğutulmuş erlen ve huni
yardımıyla cam pamuğundan süzülür ve süzüntü deney süresince buz banyosunda tutulur.
2-7 numaralı tüplerin dakika başına verdikleri absorbans değeri ölçülecektir. Bu işlem
şöyle yapılır;
1 numaralı tüpe 500µL enzim konulur ve tüp iyice karıştırılarak içeriği iki
spektrofotometre küvetine aktarılır. Bu çözeltiler bizim şahit çözeltilerimiz olacaktır. İki
şahit küveti kullanılarak spektrofotometre 480 nm dalga boyunda sıfırlanır. Daha sonra 2
numaralı tüpe enzim konulur ve enzim konulduğu anda kronometre çalıştırılır. İçinde
enzim bulunan 2 numaralı tüp iyice karıştırılır, içeriği bir spektrofotometre küvetine
aktarılır ve spektrofotometreye yerleştirilir.
Bu sırada kronometre takip edilerek ilk enzimin konulmasından tam 30 saniye sonra 3
numaralı tüpe 500 µL enzim konulur ve iyice karıştırılarak içeriği bir spektrofotometre
küvetine aktarılır ancak spektrofotometreye yerleştirilmez. Kronometre 01:00 değerini
gösterdiğinde spektrofotometrenin gösterdiği absorbans değeri kaydedilir.
Spektrofotometrenin içindeki 2 numaralı çözeltiyi içeren küvet çıkarılır ve 3 numaralı
çözeltiyi içeren küvet yerleştirilir. Kronometredeki değer 01:30 değerini gösterdiğinde
spektrofotometrenin gösterdiği absorbans değeri kaydedilir. Küvetler değiştirilerek her
bir küvet için dakikada bir absorbans değeri ölçülür. Her bir küvet için 6 değer alınıncaya
kadar bu işlem devam eder. Daha sonra aynı işlemler 4-5 ve 6-7 numaralı tüpler için de
tekrarlanır. Her işlemin başında spektrofotometre şahit çözeltiler kullanılarak sıfırlanır.
VERİLERİN KULLANIMI
2-7 numaralı tüpler için 480 nm’de elde edilen absorbans değerleri ayrı ayrı, zamana
karşı grafiğe çizilir.
2-7 numaralı tüplerin her biri için katekol konsantrasyonları hesaplanır. Bulunan
başlangıç hızları ile substrat konsantrasyonları arasında Michaelis-Menten eğrisi çizilir.
Bu hız ve substrat konsantrasyonları için Lineweaver-Burk ve Eadie-Hofstee grafikleri
çizilerek Vmaks ve Km değerleri hesaplanır.
ÇALIŞMA SORULARI
DENEY VI
Bir proteinin yapısının ve özelliklerinin araştırılabilmesi için, o proteinin saf bir şekilde
elde edilmesi gerekir. Proteinler kolaylıkla denatüre olabildiklerinden ve biyolojik
materyallerde (örneğin vücut sıvılarında ve doku ekstraktlarında) kompleks bir karışım
halinde bulunduklarından, saflaştırılmaları oldukça zordur.
Proteinler saflaştırma işlemi sırasında her bir basamakta çeşitli kayıplara uğrarlar ve
aktiviteleri azalır. Ancak istenilen enzim her bir basamakta daha saf hale gelir, bu
nedenle daha derişik hale gelir ve spesifik aktivitesi artar. Enzimlerle çalışıldığında
ortamın pH’sı ve sıcaklığının çok iyi bir şekilde kontrol edilmesi gerekir.
Tuzla çöktürme işlemi sonunda ortamda bulunan tuzlar saflaştırma işleminin ileri
safhalarında ve protein karakterizasyonu işlemleri sırasında deneyleri bozarlar. Bu
nedenle tuzların ortamdan uzaklaştırılması gerekir. Bu amaçla jel filtrasyon, ultra
santrifüj ve diyaliz yöntemleri kullanılabilir. Büyüklük farkına dayanan bir ayırma
yöntemi olan diyaliz basit ve pahalı olmayan bir işlemdir.
KİMYASALLAR
YÖNTEM
Liziz tamponu: 9 M üre, 0.04 M Tris ve %0.1 SDS çözeltisinden oluşur. 0.484 g Tris ve
54.63 g üre 100 mL’lik bir balonjojeye alınır ve pH 7.4 Sørensen tamponu ile hacim
tamamlanır. Daha sonra homojenizata 1 mL %10 SDS çözeltisi ilave edilir.
Homojenizasyon
Çöktürme
Gerekli miktar tartıldıktan sonra, katı amonyum sülfat protein örneklerini içeren tüplere
eklenir, dikkatle karıştırılır ve santrifüjlenir. Santrifüj sonunda süpernatant dekante
edilerek atılır ve presipitat (çökmüş olan katı kısım) üzerinden deneye devam edilir.
Çözünürleştirme
Çöktürülmüş olan proteinlere az miktarda pH 7.4 Sørensen fosfat tamponu ilave edilir.
Dikkatle karıştırılarak proteinlerin mümkün olduğunca çok çözünmesi sağlanır. Daha
sonra tüpler santrifüj edilerek süpernatantlar alınır ve presipitatlar atılır.
Diyaliz
Tuzla çöktürülmüş olan proteinler daha önceden hazırlanmış olan diyaliz torbalarına,
torbanın en fazla 3/4’ü dolacak şekilde yerleştirilir ve diyaliz tamponu olarak destile su
kullanılarak diyaliz edilirler. 4 saate bir diyaliz tamponu değiştirilerek soğukta 2 gün
boyunca diyaliz edilirler. Diyaliz sona erdikten sonra diyaliz torbaları açılır ve
diyalizatlar temiz bir tüpe alınır.
ÇALIŞMA SORULARI
DENEY VII
Çok hızlı ve ucuz bir yöntemdir, az miktarda materyale ihtiyaç gösterir ayrıca protein
örneği üzerinde herhangi bir kimyasal modifikasyon yapılmadığından örnek geri
kazanılabilir. Ancak hassasiyeti düşüktür (0.05–2 mg protein/mL). Ayrıca farklı
miktarlarda tirozin ve triptofan içeriğine sahip proteinler aynı konsantrasyonda olsalar
bile farklı absorbans verirler. Yakın bir dalga boyunda maksimum absorbans
verdiklerinden nükleik asitler ve başka kromofor gruplarda etkileşim yapabilir.
Ayrıca uzak UV alanda da (190 nm) bu yöntem uygulanabilir. Peptid bağlarına bağlı
olarak absorbans verildiğinden amino asit kompozisyonunun değişiminden bağımsızdır
ve hassasiyeti yüksektir (0.01–0.05 mg). Ancak pek çok çözelti ve tampon bu bölgede
absorbans verdiğinden girişimler de artar. Ayrıca oksijen absorbsiyonundan ötürü
özelleşmiş cihazlara ihtiyaç duyar.
Sığır serum albümin (BSA) çözeltisi bu denemede sıklıkla standart olarak kullanılır.
Bu yöntem hem biüret hem de folin reaksiyonuna dayanır. Biüret reaksiyonunda alkali
şartlarda bakır, proteinlerin peptid bağları ile reaksiyona girerek Cu+ oluşturur. Folin-
Ciocalteau reaksiyonunda ise fosfomolibdotungstat, aromatik amino asitlerin Cu katalizli
oksidasyonu ile heteropolimolibden mavisine indirgenir. Sonuçta kısmen tirozin ve
triptofan bileşimine bağlı olan, şiddetli koyu bir mavi renk elde edilir.
Lowry yöntemi de tirozin ve triptofan içeriğine bağlıdır ancak proteinden proteine olan
farklılıklar orta seviyededir. 0.01 mg/mL hassasiyete sahiptir ve 0.01–1 mg/mL protein
içeren çözeltiler için kullanımı uygundur.
Bu yöntemin bir dezavantajı girişimlerin fazla oluşudur. Çeşitli tamponlar, ilaç aktif
maddeler, deterjanlar, EDTA, amonyum sülfat, Glisin, merkaptoetanol, nükleik asitler ve
şekerler gibi bir grup madde deneme ile girişim gösterir. Hücre ekstraktları ve kompleks
örnekler, örneğin perkloroasetik asit/ etanol çöktürmesi gibi bir temizleme basamağına
ihtiyaç gösterebilir. Günümüzde denemenin ihtiyaçlarına göre modifiye Lowry
yöntemleri kullanılmaktadır. Reaksiyon pH bağımlıdır, pH’nın 10–10.5 arasında olması
önemlidir. İnkübasyon basamağındaki süre kritik değildir 10 dakika ile birkaç saat
arasında değişebilir. Tüplerin iyi karıştırılması çok önemlidir, çünkü folin reaktifi alkali
ortamda kararsız olduğu için kısa bir süre aktivite gösterir. Deneme yüksek
konsantrasyonlarda lineer değildir, kalibrasyon eğrisinin buna göre hazırlanması gerekir.
Bradford Yöntemi
Bradford yöntemi Coomassie Brilliant Blue G250 (CBB) boyar maddesinin proteinlere
kovalent olmayan bağlanmasına dayanır. CBB’nin asidik çözeltideki proteine bağlanması
boyanın 465 nm’deki maksimum absorbsiyonunu 595 nm’ye kaydırır. 595 nm’deki
absorbsiyon doğrudan protein konsantrasyonlarına aittir.
Bu yöntem Lowry yöntemine göre daha hızlı, daha ucuz, daha kolay ve daha hassastır.
CBB’nin protein örneğine katılması ile 2 dakika gibi kısa bir zamanda renk oluşu ve bu
renk 1 saat sabit olarak kalır. 0.001 mg/mL protein ölçülebilir.
Yukarıdaki tablodan da görüldüğü gibi her kantitatif protein tayin yönteminin kendine
özgü avantajları ve dezavantajları bulunmaktadır. Bu sebeple bir protein tayini yöntemi
seçilirken yapılan çalışmanın özellikleri göz önünde bulundurulmalı ve çalışma
ortamındaki moleküllerle girişim yapmayacak, yeterli hassasiyette, ucuz ve uygulanabilir
bir yöntem seçilmelidir.
KİMYASALLAR
YÖNTEM
Basit absorbans
BSA Stok Çözeltisi: Serum fizyolojik içinde %0.2’lik 100 ml BSA çözeltisi hazırlanır.
Serum Protein
BSA Stok Absorbans
Tüp no Fizyolojik Konsantrasyonu
(mL) (280 nm)
(mL) (µg/mL)
1 0 3.0
2 0.5 2.5
3 1.0 2.0
4 1.5 1.5
5 2.0 1.0
Lowry
Protein stok çözeltisi: Serum fizyolojik içerisinde 2 mg/mL BSA çözeltisi hazırlanır. Bu
çözelti protein stok çözeltisi olarak kullanılacaktır.
Folin reaktifi: 1N Fosfomolibdat ve fosfotungstik asit çözeltisi (Bu çözelti hazır halde
verilecektir.)
Protein Komp.
Serum %8’lik Absorb. Protein
Tüp Stok Oluş. Folin
İyice karıştırılır ve 30 dk. İnkübe edilir
100°C’de 10 dk. inkübe edilir ve oda
Bradford
Bradford reaktifi: Coomassie Brilliant Blue G-250 etanol içinde çözünerek hazırlanır.
(Bu çözelti hazır halde verilecektir.)
Protein stok çözeltisi: 2 mg/mL ovalbümin stok çözeltisi 0.1mg/mL olacak şekilde
seyreltilerek hazırlanır.
Absorb.
Tüp Protein Stok Çöz. Destile Bradford Protein Kons.
(595
Karıştırılır ve 10 dk.
No (µL) su (µL) Reaktifi (µL) (µg/mL)
nm)
inkübe edilir
1 0 800 200
2 20 780 200
3 40 760 200
4 60 740 200
5 80 720 200
6 Örnek (2) 798 200
VERİLERİN KULLANIMI
Bradford yöntemi kullanılarak, bir önceki denemede elde edilen tüm ekstraktların protein
konsantrasyonları tayin edilir ve µg/mL cinsinden aşağıdaki tabloya kaydedilir.
Yumurta Yumurta
Karaciğer Karaciğer
Sarısı Akı
%20 Tuz %80 Tuz
%50 Tuz %50 Tuz
1. Grup
2. Grup
3. Grup
Yumurta Akı Yumurta Karaciğer
Aseton Sarısı Aseton Aseton
1. Grup
2. Grup
3. Grup
ÇALIŞMA SORULARI
DENEY VIII
PROTEİNLERİ ELEKTROFOREZ İLE AYRILMASI VE
MOLEKÜL AĞIRLIKLARININ TAYİNİ
Elektroforez, bir elektrik alan altındaki moleküllerin, bu alanda farklı hareket etmeleri
esasına dayanılarak yapılan bir ayırma yöntemidir. Bu elektrik alan altında pozitif yük
taşıyan proteinler katoda, negatif yük taşıyan proteinler anoda doğru göç ederler. Bu
göçün hızı çeşitli faktörlerden etkilenir;
Bu elektroforez yöntemi de çeşitli alt gruplara ayrılır. PAGE’de yatay, dikey kasetler ve
dikey diskler kullanılabilir. Kasetler farklı boyutlarda olabilir. Kaset boyutu
büyüdüğünde yapılan ayırmanın çözünürlüğü ve gücü artar ancak işlem süresi uzar ve
jelin çalışılması zorlaşır.
b- Denatüre edici şartlar altında SDS-PAGE: SDS anyonik bir deterjandır. Negatif
yüklü SDS molekülleri protein molekülünü kaplar ve proteinlerin net yükünü
maskeler. Tüm proteinler negatif yükle kaplanmış olduklarından ayırma yüke
göre değil sadece molekül boyutuna bağlıdır.
Şekil 8.4- İki boyutlu elektroforez ile elde edilmiş jel görüntüsü
Şekilde iki boyutlu poliakrilamid jel elektroforezi sonucunda elde edilen bir jel
gösterilmektedir. Buradaki her bir nokta bir protein veya polipeptide karşılık gelir.
KİMYASALLAR
YÖNTEM
Çözeltilerin hazırlanması:
1.5 M Tris-HCl çözeltisi (pH 8.8): 18.15 g tris baz tartılır ve bir miktar destile suda
çözüldükten sonra pH’sı 6 N HCl ile 8.8’e ayarlanır ve son hacmi 100 mL’ye
tamamlanarak +4 oC’de saklanır.
1 M Tris-HCl çözeltisi (pH 6.8): 12.11 g tris baz tartılır ve bir miktar destile suda
çözüldükten sonra pH’sı 6 N HCl ile 6.8’e ayarlanır ve son hacmi 100 mL’ye
tamamlanarak +4 oC’de saklanır.
SDS-PAGE jel kasetinin hazırlanması: İçinde jelin polimerize olacağı kuru ve temiz
cam levhalar aralarına plastik ayırıcı konularak üst üste konulur. Kıskaçlar takılarak
döküm standına yerleştirilir.
Hazırlanan üst jel çözeltisine TEMED ve APS ilave edilerek iyice karıştırılır ve jel
kasedine dökülür. Döküldükten hemen sonra örneklerin tatbik edileceği kuyuların
oluşması için tarak yerleştirilir ve polimerleşme tamamlanıncaya kadar beklenir.
Polimerleşme tamamlandıktan sonra tarak kuyuların bozulmamasına dikkat edilerek
çıkartılır.
Taze olarak hazırlanmış 1500 mL SDS-PAGE yürütme tamponu, öncelikle üst tampon
haznesi dolacak şekilde ve platin elektrotların ıslanmamasına dikkat edilerek tampon
haznesine doldurulur. Üst tampon haznesi dolduktan sonra PAGE yürütme tamponun
kalan kısmı tampon haznesinin altında jeller ile temas edecek seviyeye kadar yükselir ve
alt tampon haznesini oluşturur. Platin elektrotların kuruluğu kontrol edildikten sonra
doğru kutupların üst üste gelmesine dikkat edilerek güç kablolarını taşıyan kapak
kapatılır. (Kapaktaki + ucun ( kırmızı) soğutma aparatındaki + uca (kırmızı) ve – ucun
(siyah) soğutma aparatındaki – uca (siyah) denk gelmesine dikkat edilir).
Elektroforez işlemi tamamlandıktan sonra jel kasedi soğutma aparatından ayrılır, plastik
ayırıcılar çıkarılır ve cam levhalar açılarak jel içinde 500 mL fiksasyon çözeltisi bulunan
bir kaba alınır. Bu aşamada jelin kırılmaması ve parçalanmaması için çok dikkatli
olunmalıdır.
Jellerin boyanması:
Jel önce fiksasyon çözeltisi içinde bir gece boyunca bekletilir. Burada amaç proteinlerin
jele sabitlenerek boyama sırasında protein kayıplarının önlenmesi ve iyi bir boyamanın
sağlanmasıdır.
Fiksasyon çözeltisi uzaklaştırıldıktan sonra jellere boya çözeltisi ilave edilir ve 2 gün
boyunca (veya spotların görünür hale gelinceye dek) jellerin boyanması sağlanır. Bu
aşamada bir orbital çalkalayıcı kullanılarak jellerin hafifçe çalkalanması sağlanır.
Böylece boya çözeltisi jeldeki protein molekülleri ile bağlanır. Ancak boya jelin protein
olmayan kısımlarına da bağlanır (spesifik olmayan bağlanma).
Boya çözeltisinden çıkarılan jeller ayrı bir kaba konulurlar ve boya çıkarma çözeltisi ile
muamele edilirler. Boya çıkarma çözeltisi jel üzerindeki spesifik olarak bağlanmamış
Coomassie boyasını uzaklaştırılarak arka planın renginin koyu maviden, açık maviye
(veya şeffafa) doğru değişmesini sağlar ve protein bantlarının daha net bir şekilde
görülmesini sağlar.
VERİLERİN KULLANIMI
DENEY IX
PROTEİNLERİN N- TERMİNAL AMİNOASİTLERİNİN İNCE
TABAKA KROMATOGRAFİSİ İLE BELİRLENMESİ
Yukarıda anlatıldığı gibi proteinlerin parçalara ayrılmaları için proteaz adı verilen
enzimler kullanılır. Bazı proteazlar peptid bağını sadece belli bir amino asitten sonra
(veya önce) ve bu sayede tahmin edilebilir bir şekilde kırarlar.
Proteinlerin amino asit dizi analizlerinin tayini için Edman yöntemi kullanılır. Bu
yöntemde N- terminal amino asidi fenilizotiyosiyanat ile reaksiyona sokulur. Bu amino
asit feniltiyohidantoin oluşturarak peptid zincirinden ayrılır ve kromatografik yöntemlerle
tayin edilir. Her seferinde sadece N- terminalindeki amino asit ayrıldığı ve zincirin geri
kalan kısmı korunduğu için bu işlem tekrar tekrar yapılarak zincirdeki bütün amino asitler
tanımlanabilir. Edman yöntemi tamamen otomatik cihazlar yardımıyla
gerçekleştirilebilir. Ancak her bir döngüde bazı yan ürünler açığa çıktığından 50-60
amino asit sonrasında tayinde hatalar artar. Bu nedenle proteinlerin daha önceden
proteazlarla parçalanması gerekir.
KİMYASALLAR
Aspartik asit, lösin, valin, arjinin, prolin, sistein, sistin, glisin, Na2CO3, 2,4-
dinitroflorobenzen, HCl, kloroform, benzil alkol, glasiyel asetik asit.
YÖNTEM
50 mL’lik bir erlen içinde 20 mg amino asit %5’lik 10 mL Na2CO3 çözeltisinde çözülür.
Üzerine 0.5 mL 2,4-dinitroflorobenzen (DNFB) ilave edilir. DNFB bazı insanlarda
alerjik reaksiyonlara sebep olabileceğinden çalışma sırasında eldiven takılmalı ve
dikkatli olunmalıdır. Karışım 40°C sıcaklıkta 30 dakika devamlı karıştırılarak tutulur.
Sıcaklığın 40 °C’nin üzerine çıkmamasına dikkat edilir. Isıtma sonunda çözeltinin rengi
turuncuya döner. Reaksiyona girmemiş olan DNFB bir pipet yardımıyla uzaklaştırılır.
Daha sonra 1.5 mL derişik HCl dikkatle ilave edilir. Türev bu aşamada çöker. Eğer
çökelme olmazsa erlen buz banyosunda soğumaya bırakılır. Çökelti bir test tüpüne
alınarak az miktarda aseton içinde çözülür.
Mobil faz olarak (kloroform: benzil alkol: glasiyel asetik asit) ; (45:20:1) karışımı
kullanılır. Mobil faz 1 cm yüksekliğinde olacak şekilde kromatografi tankına konulur.
Bir TLC (thin layer chromatography; ince tabaka kromatografisi) plakasına kurşun
kalemle plakayı zedelememeye dikkat ederek alttan 3 cm yükseklikte bir çizgi çekilir. 2
cm aralıkla bu çizgi üzerinde tatbik noktaları işaretlenir. Hazırlanmış olan amino asit
türevleri bu noktalara tatbik edilir. Bütün örnekler tatbik edildikten sonra TLC plakasının
kuruması beklenir ve kromatografi tankına yerleştirilir. Mobil fazın plaka üzerinde üstten
2 cm kalıncaya kadar yürümesi beklenir. Plaka tanktan çıkarılır, mobil fazın yürüme
sınırı kurşun kalem ile işaretlenir. Çeker ocakta kurutulur. Her bir aminoasidin ve
türevinin Rf değerleri hesaplanır.
ÇALIŞMA SORULARI
DENEY X
Şekil 10.1- DNA ve RNA yapısında yer alan azotlu bazların yapıları
Nükleik asitler nükleotidlerin 3′, 5′-fosfodiester köprüleri ile bir araya gelmesinden
oluşmuştur. Bu zincirlerde fosfodiester köprüleri ile bağlanmış şeker molekülleri nükleik
asitlerin iskeletini oluşturur.
DNA ikili sarmalında adenin-timin (A-T) ve guanin-sitozin (G-C) bağları kurulur. DNA
ikili sarmalını bir arada tutan kuvvetler, nükleotid zincirleri arasındaki A-T ve G-C
çiftleri arasındaki hidrojen köprüleri (yatay interaksiyon) ve nükleotid zincirleri
üzerindeki bazlar arasındaki etkileşimlerdir (dikey interaksiyon).
DNA sarmalını oluşturan zincirlerin birindeki veya her ikisindeki bazlardan bir veya bir
kaçının kopması sonucu nükleotid zincirde kısalma meydana geliyorsa bu olaya
DNA’nın degradasyonu denir. Degradasyon gerçekleştiğinde 260 nm’deki absorbansta
azalma meydana gelir.
DNA erimesi sıcaklık 90-100 °C’nin üzerine çıkılmadığı sürece geri dönüşümlüdür. Eğer
80°C’ye ısıtılmış bir DNA çözeltisi, oda sıcaklığında yavaş yavaş soğumaya bırakılırsa
iki sarmal tekrar birleşerek DNA ikili sarmalını oluştururlar (hibridizasyon). Ancak aynı
DNA oda sıcaklığında değil de bir buz banyosunda ani soğutmaya bırakılacak olursa
DNA sarmalarında hibridizasyon gerçekleşmez ve nükleotid zincirleri birleşmezler.
Ayrıca DNA boyunda kısalmalar, yani DNA degradasyonu meydana gelebilir. Eğer
degradasyon meydana gelmediyse bu çözeltiler yeniden ısıtılıp yavaş yavaş soğumaya
bırakılırlarsa DNA ikili sarmalını yeniden oluşturabilirler.
Yukarıda anlatıldığı gibi nükleik asitler 260 nm dalga boyunda absorbans piki verirler.
Bu absorbans değeri kullanılarak nükleik asidin konsantrasyonu tayin edilebilir. 260 nm
dalga boyunda, 1 cm’lik kuartz küvetlerde 1’lik bir absorbans 50µg/mL DNA
konsantrasyonuna karşılık gelir. Tek zincirli DNA veya RNA içinse bu değer 40
µg/mL’dir.
Nükleik asitlerin saflığını tayin etmek için nükleik asit çözeltilerinin absorbanslarının
240-300 nm arasında ölçülmesi gerekir. Proteinler 280 nm’de pik verdiklerinden A260 nm/
A280 nm oranından yararlanılarak saflık tayini yapılabilir. DNA için bu oran 1.8, RNA
içinse 2.0 olmalıdır. Eğer bu verilen değerlerden daha düşük değerler elde ediliyorsa, bu
örneğin proteinlerle kontamine olduğunu gösterir. Kontaminasyon bir kimyasal karışım
içinde düşük miktarlarda (genellikle istenmeyen) başka maddelerin var olmasıdır.
Her ne kadar hemen hemen tüm hücreler DNA içerseler de bazı dokularda bu miktar çok
az olduğundan bu tip dokular DNA izole etmek için iyi bir kaynak değildirler. Bazı
dokular ise yüksek deoksiribonükleaz aktivitesine sahip olduklarından DNA izolasyon
esnasında küçük parçalara ayrılır. Bu nedenle DNA elde etmek için yüksek DNA ve
düşük nükleaz aktivitesine sahip dokular tercih edilmelidir. Bu amaçla en iyi kaynaklar
timus ve lenf en iyi dokulardır. Dalak, testis ve yumurtalıklarda DNA elde etmek için
kullanılabilirler.
KİMYASALLAR
YÖNTEM
Çözeltilerin hazırlanması:
DNA’nın İzolasyonu:
DNA izolasyonunun yapılacağı dokudan yaklaşık 10 g alınır ve 100 mL ekstraksiyon
çözeltisi ilave edilir. Daha sonra kısa sürelerle ve DNA içeren çözeltinin ısınmamasına
dikkat edilerek homojenizatörde homojenize edilir. DNA’nın bozulmaması için bu
işlemler soğukta yapılmalı ve kullanılan çözeltiler önceden soğutulmuş olmalıdır.
Homojenize hale getirilmiş olan çözeltiye 1 mL %10 SDS ilave edilir. Hafifçe alt üst
edilerek çözelti karıştırılır (SDS deterjan olduğundan köpürmemesine dikkat edilir). Daha
sonra 4000 rpm’de 5 dakika santrifüj edilir. Üstteki çözelti (süpernatant) dikkatle alınır
ve temiz bir santrifüj tüpüne hacim 4 mL olacak şekilde aktarılır.
Süpernatanta yaklaşık 8 mL soğuk etanol yavaş yavaş ilave edilir ve tüpteki değişim
gözlenir. Daha sonra 4000 rpm’de 1-2 dakika santrifüj edilir. Santrifüj sonunda üstteki
süpernatant dekante edilir ve beyaz renkli DNA presipitatı alınır. Etanol kalıntısını
uzaklaştırmak için 1-2 mL 0.1 M EDTA çözeltisi ile, karıştırılmadan kalıntılar yıkanır,
yıkama çözeltisi dekante edilerek uzaklaştırılır ve daha sonra yeterli miktarda
ekstraksiyon çözeltisinde çözülür. Çözünmeyen kısımlar santrifüj ile uzaklaştırılır. Elde
edilen DNA çözeltisi derin dondurucuda uzun süre saklanabilir.
DNA’nın Erimesi:
4 cam tüpe elde edilen DNA çözeltisinden yaklaşık 5’er mL alınır. Tüplerden bir tanesi
oda sıcaklığında bekletilirken diğer üçü 80°C sıcaklıktaki su banyosunda 10 dakika
bekletilir. Bu sürenin sonunda bir tüp oda sıcaklığında, bir tüp buz banyosunda ve bir tüp
de –80°C soğutucuda 5 dakika tutulur. Soğutulmuş olan tüplerin oda sıcaklığına gelmesi
beklenir ve 4 tüpün absorbans değerleri 260 nm’de ekstraksiyon çözeltisi kör olarak
kullanılarak ölçülür.
ÇALIŞMA SORULARI