Penggunaan pET

Pada sistem ini (penggunaan pET), gen target diklon ke dalam plasmid pET dibawah
kendali promotor T7 bakteriofag. Kemudian ekspresi diinduksi dengan menyediakan sumber
T7 polimerase RNA dalam sel inang, yang mana vektor spesifiknya adalah pET-17b.

Gambar: peta plasmid circular pET-17b

Untuk melakukan ligasi pET digunakan 2 enzim restriksi yang sama dengan saat
meligasi rVP28, yaitu HindIII dan SacI. Namun, untuk meligasi ke dalam vektor ekspresi
diperlukan dua enzim berbeda untuk mengecek orientasi insert pada vektor. Jika orientasi
salah maka gen tidak dapat terekspresi.
Sel kompeten yang digunakan adalah E.coli BL21(DE3)pLysS. E.coli BL21 tidak
memiliki lon protease dan mempunyai sedikit protease ompT di membran luar yang dapat
mendegradasi protein saat purifikasi. Sel bakteri tersebut berisi kromosom penyisipan gen T7
RNA polimerase di bawah kendali promotor proU yang diinduksi. Selain itu, media
menginduksi ekspresi dari T7 RNA polimerase; ini memungkinkan transkripsi genom DNA
insert dari promotor T7 dalam plasmid pET. Sel tersebut juga tidak memiliki gen T7 RNA
polimerase sehingga jika gen yang diinsertkan mengkode protein yang toksik bagi sel, maka
saat sel tidak diinduksi untuk memproduksi protein tersebut, sel tidak akan dengan sendirinya
menghasilkan protein itu. Ekspresi dilakukan dengan memindahkan plasmid ke host yang
mengandung copy dari T7 RNA polymerase di bawah kontrol lacUV5 dan ekspresi diinduksi
oleh IPTG.
Pada transformasi ini, sel kompeten perlu diinkubasi dalam CaCl2 terlebih dahulu. Hal
tersebut untuk mengkondisikan sel bakteri agar dapat menerima plasmid pET yang telah
diligasi rVP 28 sebelumnya. Langkah awal dalam proses kompeten sel yaitu hasil inkubasi
koloni tunggal E.coli pada suhu 37oC didinginkan pada es selama 10 menit. Lalu disentrifuge
pada koloni tersebut dengan kecepatan 4000rpm pada suhu 4oC untuk mendapatkan pelet
yang merupakan sel E.coli yang densitasnya lebih tinggi dari LB broth sehingga nantinya
dapat mengendap. Kemudian pellet diresuspensi dengan 1,5 ml CaCl 2 dingin. Cl- dapat
masuk ke dalam sel sehingga sel hipertonis dan air masuk ke dalam sel. Masuknya air
tersebut dapat diikuti dengan DNA yang telah berada di permukaan luar sel. Disamping itu,
CaCl2 dingin juga dapat menyebabkan terganggunya struktur membran sel sehingga
membentuk pori sehingga nantinya dapat dimasuki oleh DNA sirkuler ketika proses
transformasi.

Gambar 1: Hasil inkubasi Gambar 2: Hasil Gambar 3: Hasil inkubasi

24 jam kontol positif pada
24 jam transforman inkubasi 24 jam LBA + chloramphenicol +
pada LBA + transforman pada LBA + ampicilin
chloramphenicol + ampicilin chloramphenicol +
ampicilin

Media yang digunakan adalah Luria Bertani Agar + ampisilin + chlorampenicol.

Luria Bertani Agar merupakan medium yang cocok untuk perbanyakan sel. Chlorampenicol
merupakan antibiotic yang menghambat sintesis protein di ribosom E.coli. Pada media,
bakteri yang tidak memiliki chloramphenicol resistant tidak akan dapat hidup. E.coli BL21
pLysS memiliki pACYC184 yang di dalamnya terdapat chloramphenicol resistant sehingga
hanya E.coli BL21 pLysS saja yang dapat hidup di media tersebut. Jadi, chloramphenicol
disini berfungsi untuk mencegah kontaminasi.
Pada gambar 1 dan 2 terlihat ada koloni yang tumbuh, itu menandakan bahwa ada sel
yang berhasil dimasuki oleh pET. Gambar 1 merupakan gambar LBA (Luria Bertani Agar)

1
yang diinokulasi dengan campuran transformasi, sedangkan pada gambar 2 merupakan
10

9
gambar LBA (Luria Bertani Agar) yang diinokulasi campuran transformasi. Dari proporsi
10
inokulasi tersebutlah didapat atau dihasilkan koloni yang tumbuh pada gambar 2 lebih banyak
daripada gambar 1. Kontrol positif yang digunakan adalah sel E.coli yang telah
ditransformasi dengan pET ataupun pET yang telah terinsert oleh gen rVP28. Kontrol positif
tersebut nantinya digunakan pada saat elektroforesis hasil koloni PCR sebagai standar untuk
rVP28 yang terinsert dalam pET .

Screening

Band 1: 10(-0,0851x9,1+4,3084) =3419bp

Band 2: 10(-0,0453x12+3,742) = 1579bp

Band 3: 10(-0,0851x18,1+4,3084) = 586bp

SAMPEL KEL 9
MARKER 1000BP

MARKER 100BP

UNTUK PERHITUNGANE LIATO DI WORD YG TAK KIRIM JUDULE

“RESTRIKSI BARU”. ITU PERHITUNGANE CANTUMNO DI LAMPIRAN

E Coli BL21 (DE3) pLysS memiliki plasmid pLysS dan juga plasmid pET-17b (yang
telah disisipkan). Oleh karena itu, setelah mengisolasi sel kompeten, hasil isolasi tersebut
harus mengandung pET-17b dan pLysS. Berikut adalah gambaran dari peta plasmid pET-17b
dan pLysS.

Dalam praktikum kali ini, praktikan melakukan proses restriksi dengan menggunakan
enzim HindIII dan EcoRI dengan bertujuan untuk mengetahui apakah sel-sel tersebut
memiliki rVP28 sebagai insert. Disini digunakan EcoRI karena EcoRI memiliki kemampuan
untuk memotong pada sisi gen yang resisten terhadap chloramphenicol di plasmid pLysS.
Haltersebut juga dapat membuktikan bahwa E.Coli yang dianalisis adalah E Coli BL21
(DE3) pLysS. Sebenarnya pembatasan EcoRI di pET-17b adalah cukup dekat untuk SacI,
mengingat bahwa untuk proses restriksi menggunakan gen rVP28 digunakan enzim restriksi
SacI. Namun, perbedaannya tidak sangat berpengaruh, sehingga EcoRI masih bisa
menggantikan SacI untuk memeriksa apakah sel itu disisipkan di antara HindIII dan SacI.
Perlakuan inkubasi untuk proses restriksi dengan menggunakan HindIII dan EcoRI
dilakukan selama 1 jam pada suhu 37˚C karena kedua enzim tersebut dikenal bekerja secara
optimal pada suhu itu. Hasil restriksi nantinya dapat dilihat melalui sumur dari proses
elektroforesis. Praktikan menggunakan dua jenis penanda, 1 kb dan 100 pb, untuk
mendapatkan resolusi yang lebih baik untuk ukuran fragmen yang lebih kecil dari 1000 bp.
Pada marker 1kb terdapat 14 band tapi hanya ada 9 band pada gel, 5 terpisahkan dengan baik
dan sisanya muncul sebagai smear. Band yang tidak muncul di gel, kemungkinan juga itu
karena terjebak dengan penanda lainnya pada marker yang berukuran lebih besar.
Pada elektroforesis, selain untuk melihat hasil restriksi plasmid, praktikan juga
meload-kan Uncut pada sumur. Uncut tersebut berguna untuk membandingkan plasmid saat
sebelum dan sesudah direstriksi. Namun sayangnya hasil foto dari elektroforesis praktikan
tidak terlihat begitu jelas. Namun yang pasti hasil dari restriksi praktikan, memberikan 3 pita
yang berukuran 4159bp (band1), 1579bp (band2), dan 396bp (band3). Gen rVP28 akan
memberikan 650 bp jika dipotong oleh SacI + HindIII dan secara teoritis 700 pb jika
dipotong oleh EcoRI + HindIII. Karena ukuran band3 tidak terlalu berbeda dari rVP28, dapat
dikatakan bahwa band3 adalah rVP28.
Berdasarkan peta pLysS, restriksi EcoRI + HindIII akan memberikan 1522bp dan
3364bp fragmen. Panjang ini hampir sama dengan band2 dan band1, sehingga ada
kemungkinan bahwa band2 dan band1 dihasilkan dari pLysS pembatasan oleh EcoRI HindIII.
Keterangan: Data Terlampir