Sebenta Praticas Biologia Celular 2010-11

BIOLOGIA CELULAR
AULAS PRÁTICAS
1º ANO
2010/2011
Protocolos Práticos Biologia Celular
SEGURANÇA EM LABORATÓRIO
1. INTRODUÇÃO
Embora todo o trabalho efectuado no laboratório de Biologia seja

potencialmente perigoso, e as pessoas que nele trabalham estejam sujeitas a
numerosos riscos e perigos, é importante ter a noção de que a grande a
maioria doa acidentes que ocorrem em laboratório não se devem a
procedimentos que são tecnicamente perigosos em si mesmos mas a faltas de
atenção e cuidado com o que se está a fazer.
É muito importante ter a noção de que a falta de atenção com o trabalho no

laboratório poderá muito provavelmente resultar, não só em fracos resultados
experimentais, mas também em possíveis acidentes.
O trabalho em laboratório envolve uma grande diversidade de riscos, sendo

necessário um conhecimento sério e aprofundado dos materiais, técnicas e
equipamentos utilizados assim como dos riscos que envolvem e atitudes a
adoptar de forma a minimizá-los.
O objectivo desta aula é o de alertar e familiarizar os alunos com os principais

perigos e riscos associados com o trabalho no laboratório de Biologia, assim
como com a forma de os reduzir ao mínimo através da utilização de boas
práticas de trabalho que permitam a realização de um bom trabalho de forma
segura.
2. ATITUDE A ADOPTAR NO LABORATÓRIO
Ser responsável.
 Planear sempre o trabalho a realizar, conhecer bem todos os procedimentos

e estar consciente dos potenciais riscos associados, e adoptar as atitudes
adequadas de modo a evitá-los.
1
3. REGRAS DE SEGURANÇA
 Não é permitido comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos no laboratório.

Manter os dedos, lápis e outros materiais afastados da boca e face.
 Dentro do laboratório deve usar sempre uma bata, de forma a proteger-se a

si próprio e o seu vestiário de contaminações acidentais com culturas,
corantes ou outros produtos químicos.
 Usar luvas apropriadas sempre que se manipulam produtos potencialmente

perigosos; as luvas deverão ser substituídas sempre que contaminadas ou
danificadas; deverão ser retiradas no fim do trabalho ou sempre que este for
interrompido, de modo a evitar a contaminação de objectos do laboratório ou
fora dele, como as maçanetas das portas, interruptores, telefones, etc.
 No início de cada aula, proceder à desinfecção da área de trabalho,

utilizando um desinfectante impregnado em papel absorvente. Este
procedimento deve ser repetido no final do trabalho laboratorial.
 Manter perto da área laboratorial somente o material estritamente necessário

(papel e lápis) para registo das observações. Conservar sempre a bancada
limpa e arrumada.
 No início e no fim de cada aula lavar as mãos com um antisséptico. Proceder

da mesma forma sempre que suspeite ter contactado com materiais
contaminados.
 Para pipetar, utilizar sempre um dispositivo de pipetagem. A pipetagem à

boca é proibida.
 Mudar de luvas e lavar as mãos sempre que haja contaminação evidente

com o produto derramado.
 Conhecer a localização e funcionamento dos sistemas de segurança

(telefone, saídas de emergência, extintores, chuveiros).
 Colocar todo o material utilizado durante o trabalho nos locais apropriados:

● Material reutilizável: Em contentores apropriados para posterior lavagem
e tratamento; material contendo substâncias potencialmente perigosas
deverá ser previamente tratado de forma apropriada.
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● Material não reutilizável:
- Vidro e metal cortante (lâminas de bisturi, agulhas de seringa): em lixo

próprio devidamente rotulado.
- Material contaminado com produtos biológicos: Em lixo próprio para

autoclavar/incinerar.
- Substâncias químicas perigosas: em locais apropriados, de acordo com o

composto em questão e em contentores devidamente rotulados.
- Não despejar nos canos qualquer material perigoso/infeccioso.
 Todos os materiais para guardar ou incubar deverão ser devidamente

rotulados, com indicação de conteúdo, nome do utilizador e data.
4. PRINCIPAISRISCOS ASSOCIADOS AO TRABALHO DE LABORATÓRIO E

PRECAUÇÕES A TOMAR:
4.1 Equipamento de vidro
Riscos:
O material de vidro é o mais utilizado no laboratório, e a fonte mais comum de
acidentes, resultantes de cortes provocados por vidro partido, incluindo:
- cortes provocados pela introdução de tubos de plástico em tubos ou pipetas

de vidro
- cortes provocados por vidro partido e outros materiais cortantes colocados

de forma imprópria em contentores de lixo normal
Precauções:
- Antes de usar, inspeccionar o material de vidro de forma a garantir que se
encontra em perfeitas condições – sem quebras, falhas ou rachas.
- Colocar o vidro partido e os materiais de vidro não reutilizáveis (por ex.

Pipetas) em contentores de lixo próprios. Não utilizar os contentores de
lixo geral. Recolher vidros partidos imediatamente e de forma muito
cuidadosa.
- Não guardar ou deixar material de vidro na beira de bancadas ou prateleiras.
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- Cuidado com o vidro quente. Colocar num local em que não possa ser
acidentalmente tocado até arrefecer.
4.2 Equipamento eléctrico
Não utilizar fichas e tomadas partidas ou danificadas.
4.3 Equipamento de aquecimento: Bicos de Bunsen, placas e banhos de

aquecimento
Riscos:
Queimaduras provocadas por superfícies e líquidos quentes, vapores ou
chamas.
Precauções:
- Todos os aparelhos de aquecimento (com excepção dos banhos) deverão
ser mantidos afastados de materiais e substâncias inflamáveis.
- Os bicos de Bunsen nunca deverão ser usados perto de contentores abertos

de líquidos inflamáveis, nem em ambientes onde estejam presentes
concentrações apreciáveis de vapores inflamáveis.
- A chama poderá não ser visível em condições de luz muito intensa. Nunca
deixar uma chama acesa sem vigilância.
- O vapor dos banhos de aquecimento poderá provocar queimaduras. Ter

atenção, especialmente quando se abrem as tampas de banhos a
temperaturas elevadas.
4.4 Fontes de luz ultravioleta
Riscos:
Queimaduras e danos graves na pele e nos olhos.
Precauções
- Utilizar protecção adequada para os olhos – óculos ou máscaras de material
opaco aos raios UV.
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4.5 Outros Equipamentos

Relativamente a todos os equipamentos utilizados no laboratório, ler sempre o
manual de instruções cuidadosamente antes de os utilizar, tendo especial
atenção aos riscos associados e ao modo de os utilizar de modo a garantir a
segurança e a manutenção dos aparelhos em bom estado.
5. SEGURANÇA QUÍMICA
Os riscos associados à manipulação e utilização de substâncias químicas são

essencialmente de dois tipos, que se especificam em seguida:
- Riscos físicos
- Riscos para a saúde
Riscos Físicos
As substâncias químicas que representam riscos físicos são geralmente

identificadas pela presença, nos rótulos, dos seguintes símbolos e letras, que
se relacionam com as propriedades das substâncias:
- Símbolo do Fogo – “F”: Muito inflamável; “F+”: Extremamente inflamável
Substâncias que usam o símbolo do fogo: substâncias

inflamáveis, combustíveis ou piróforas. Todas estas
substâncias apresentam um risco elevado de provocar
incêndio no laboratório.
- Símbolo de Explosão – “E”: Explosivo
- Símbolo “O” em chamas – “O”: Oxidante
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Riscos para a Saúde
Uma substância química é considerada nociva para a saúde quando existem

evidências de que pode provocar efeitos nocivos, crónicos ou agudos, em
pessoas ou animais expostos a esse produto.
Os produtos perigosos para a saúde, apenas representam um risco quando

entram em contacto com o organismo, o que pode ocorrer, para as substâncias
químicas, por três vias:
- Inalação
- Absorção pela pele ou entrada através de feridas
- Ingestão
Os efeitos provocados pelas substâncias químicas no organismo relacionam-se

com a sua toxicidade (capacidade de uma substância causar um efeito nocivo)
e com a dose (quantidade) a que o organismo é exposto.
CLASSIFICAÇÃO DOS PRODUTOS QUÍMICOS DE ACORDO COM OS

PRINCIPAIS TIPOS DE RISCOS PARA A SAÚDE:
Corrosivos – “C” – Podem queimar, irritar ou atacar

destrutivamente os tecidos vivos.
Prejudiciais (“Xn”)/Irritantes (“Xi”) – Por contacto causam

vermelhidão ou inchaço da pele ou olhos, mas não causam
danos tecidulares permanentes (prejudiciais – danos menores
que produtos tóxicos; irritantes – danos menores que produtos
corrosivos) .
Sensibilizantes – Provocam reacção alérgica cutânea ou respiratória.
Tóxicos (“T) / Muito tóxicos - venenos (“T+”) – Causam a

morte ou danos muito graves, mesmo em doses reduzidas.
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Carcinogéneos – Podem provocar cancro.
Teratogéneos – Afectam o desenvolvimento embrionário normal, podendo

causar malformações congénitas ou morte do feto.
Radioactivos – Estes produtos representam uma classe especial de produtos

químicos, cuja utilização apresenta riscos específicos pelo que requer um
conhecimento e preparação técnica especiais. Nunca deverão ser utilizados
antes de adquiridos esses conhecimentos.
6. PREVENÇÃO DE INCÊNDIOS
A prevenção de incêndios é tão importante como o desenvolvimento de meios

de os combater. É essencial ter a noção da necessidade de evitar práticas
perigosas no laboratório e dos perigos colocados por um fogo que atinge
proporções descontroladas.
6.1 Medidas de Prevenção
- Conhecer a localização dos alarmes de incêndio, extintores e mangueiras
- Trabalhar com produtos inflamáveis em hotes
- Utilizar fósforos, fontes de aquecimento, aparelhos eléctricos e outras

possíveis fontes de ignição de forma cuidadosa
6.2 Medidas de emergência em caso de incêndio
- Activar o sistema de alarme e ligar o 112
- Ajudar qualquer pessoa que se encontre em perigo, desde que tal não
ponha em risco a sua própria segurança
- Evacuar o edifício o mais rápido possível, de forma calma e ordenada
- Não usar os elevadores
- Fechar as portas e se possível as janelas, à medida que se abandonam as

salas
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7. PRIMEIROS SOCORROS
7.1 Queimaduras químicas
No caso de queimaduras provocadas pelo contacto de produtos químicos

nocivos com a pele ou olhos, seguir os seguintes procedimentos:
- Utilizar protecção adequada de modo a não ser também afectado
Pele:
- Remover qualquer peça de roupa que cubra a zona afectada
- Lavar a zona afectada com água abundante durante pelo menos 15 minutos
- Não aplicar gorduras nas zonas afectadas
- Cobrir com um penso seco e estéril
- No caso de a área afectada cobrir uma extensão larga, ligar 112 e pedir
ajuda
Olhos
- Abrir as pálpebras de modo a assegurar uma lavagem eficaz
- Lavar com água abundante no sentido do nariz para a orelha durante pelo
menos 15 minutos
- Remover lentes de contacto tão depressa quanto possível
- Ligar 112
7.2 Ingestão de produtos químicos
- Ligar 112
- Se a vítima estiver consciente e for capaz de engolir, dar-lhe a beber água

ou leite
7.3 Inalação de produtos químicos
- Evacuar a área e mover a vítima para local arejado
- Ligar 112
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8. MSDS
Todos os produtos químicos são acompanhados de um folheto denominado

MSDS (Material Safety Data Sheet), elaborado de modo a fornecer tanto a
quem os utiliza como ao pessoal de emergência todas as informações
referentes aos procedimentos adequados para a utilização e manuseamento do
produto em questão. Os MSDS incluem informações como propriedades físicas
e químicas, toxicidade, perigos para a saúde, primeiros socorros, reactividade,
armazenamento, detritos, equipamento de protecção e procedimentos de
emergência. Todas estas informações são essenciais para trabalhar em
condições de segurança, assim como em caso de acidente.
Os MSDS acompanham sempre os produtos comercializados e deverão ser

mantidos no laboratório de forma acessível a todos os que trabalhem com os
produtos em questão.
Qualquer pessoa que manuseie qualquer produto químico deverá ler o MSDS
correspondente, de modo a familiarizar-se com os perigos e precauções que
deverá ter ao utilizá-lo.
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Aula 2
MICROSCÓPIO ÓPTICO
INTRODUÇÃO
O limite inferior para o olho humano distinguir dois objectos é da ordem dos 0,1
mm. É compreensível, por isto mesmo, a revolução que o microscópio induziu
na biologia, uma vez que permitiu descobrir um novo mundo. Tal como é visível
na Figura 1.1, o microscópio óptico, ou de campo claro, permite-nos visualizar
células com tamanhos na ordem de 1 µm (10 -6 m), e distinguir detalhes nessas
células na ordem dos 250 nm (0,25 µm).
Figura 1.1 - Limites de utilização de diversos tipos de microscópios
O microscópio óptico é composto por um sistema de lentes de vidro distribuído

de modo a que a luz emitida pela fonte de luz se concentre no plano da
amostra e depois seja de novo concentrada e ampliada de forma a ser
visualizada no olho do observador. Para tal, como é descrito no diagrama da
Figura 1.2, o condensador, situado após a fonte de luz e antes da amostra,
concentra a luz que vai incidir sobre esta. O sistema objectiva - ocular é
responsável pela ampliação e projecção da luz que atravessa a amostra para o
10
olho. Por esta razão, a ampliação obtida é dada pelo produto da ampliação
descrita na objectiva e da ampliação descrita na ocular.
Ampliação total = Ampliação da objectiva x Ampliação da ocular
Figura 1.2 – Esquema de formação da imagem no microscópio óptico. A imagem

observada é ampliada, invertida e virtual
Estando a ampliação total do microscópio dependente das ampliações parciais

da objectiva e da ocular, era legítimo afirmar que a capacidade de aumento do
microscópio óptico seria virtualmente infinita. No entanto, a ampliação útil é na
realidade na ordem das 1000 X. Este facto é compreensível com a introdução
do conceito de resolução. Para melhor compreender este conceito observe a
Figura 1.3. Verifica-se que, apesar de teoricamente ser possível ampliar
indefinidamente a imagem, a partir de determinados limites essa ampliação não
é acompanhada por melhoria de resolução, deixando de ser útil. Uma lente
pode ampliar uma imagem sem aumentar a sua resolução.
11
Figura 1.3 - Efeito da ampliação e da resolução na imagem obtida
É possível calcular o limite de resolução (r) de um microscópio recorrendo à

equação,
0 , 61×λ
r=
A .N .
em que  é o comprimento de onda (c.d.o.) da luz incidente e A.N. é a abertura

numérica definida pela equação,
A . N .=N⋅senU
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com N o índice de refracção do meio compreendido entre a amostra e a

objectiva e U o semi-ângulo de abertura do cone luminoso que após passar
pela amostra atinge a objectiva (Figura 1.4).
Figura 1.4 - Representação gráfica do significado dos parâmetros N e U para

o cálculo da Abertura Numérica
Assim para a luz visível, cujo c.d.o. varia entre 400 nm e 700 nm, e para a
maior abertura numérica teórica (1,5) o limite de resolução seria de cerca de
160 nm. Na prática, o valor de A.N. máximo é de 1,3 ficando o limite de
resolução com o valor de 250 nm para um c.d.o. de 550 nm.
Para aprender a trabalhar com o microscópio convém saber a localização e

nome dos seus principais constituintes (Figura 1.5).
Figura 1.5 - Principais constituintes do microscópio óptico
13
PARTE EXPERIMENTAL
Observações microscópicas
Ligar a fonte luminosa
Colocar a amostra na platina (lamela para cima)
Com o auxílio do condensador e do diafragma obter uma boa iluminação

(Subir o condensador para a objectiva de imersão em óleo ou baixar para
objectivas de baixa ampliação)
Rodando o parafuso macrométrico aproximar a platina o mais perto possível

da objectiva de 10X
Rodando novamente o parafuso macrométrico, puxar a platina para baixo até

obter uma imagem nítida da amostra
Depois da amostra estar focada com a objectiva de 10X, focar com a

objectiva de 40X. Com o auxílio do parafuso micrométrico podem-se obter
diferentes planos das estruturas a observar
Se pretender utilizar a objectiva de 100X, rodar a objectiva de 40X e, sobre a

preparação, colocar uma gota de óleo de imersão. Focar, já com a objectiva
de 100X, utilizando o parafuso micrométrico. O uso de óleo de imersão
melhora o valor da Abertura Numérica por influenciar o valor de N obtendo-
se uma maior resolução na observação da amostra (Figura 1.7).
Figura 1.7 - Efeito da adição do óleo de imersão sobre a dispersão da luz
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OBJECTIVOS:
 Compreender o âmbito de aplicação da microscopia óptica (noção de

escala microscópica).
 Conseguir nomear os principais constituintes do m. o. e saber utilizá-lo.
 Saber descrever o funcionamento do microscópio óptico (m. o.).
 Compreender os factores que influenciam a ampliação e a resolução.
 Perceber a utilização do óleo de imersão.
15
Aula 3
MEDIÇÃO COM OCULAR MICROMÉTRICA
Medições em preparações microscópicas
As observações em microscopia envolvem muitas vezes a medição do objecto

de estudo. A medição pode ser realizada após calibração, de cada objectiva,
com auxílio de uma ocular micrométrica e uma lâmina graduada.
Calibração
(mm)
Figura 1.6 - Representação esquemática da calibração
Colocar a ocular micrométrica em posição no tubo do microscópio e instalar

a lâmina graduada na platina do microscópio.
Rodar a ocular micrométrica de modo a que as escalas da ocular e da lâmina

fiquem paralelas e se sobreponham parcialmente (ver Figura 1.6).
Deslocar a lâmina para que o início da graduação das duas escalas se

sobreponha (0 e 0,0).
Verificar em que outro ponto do campo as escalas se sobrepõem igualmente.

No exemplo da Figura 1.6, verifica-se que 80 divisões da ocular
correspondem a 0,45 mm (450 m) da lâmina, i.e., 1 divisão = 450/80 = 5,6
16
m. Este valor só é válido para a objectiva utilizada, sendo pois necessário
proceder à calibração para cada uma das outras objectivas.
Para a medição de um objecto desconhecido, determina-se primeiro o

número de divisões, por ex. 4, e multiplica-se pelo valor micrométrico
previamente determinado, por ex. 5,6, obtendo-se a dimensão 22,4 m.
OBJECTIVOS:
 Saber fazer medições ao m. o. recorrendo a uma ocular micrométrica e

lâmina graduada.
 Saber converter as Unidades de medida (µm, nm, Å).
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Aula 4
DIVERSIDADE CELULAR
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL
- Zaragatoa ou palito
- Pinça
- Bisturi
- Lâminas e lamelas
- Soro fisiológico
- Solução de azul de metileno
- Escherichia coli
- Saccharomyces cerevisiae
- Bolbo de cebola
- Folha de Elodea
Notas importantes:
 Antes de efectuar cada preparação limpe bem a lâmina e a lamela com

álcool
 Para cada desenho a efectuar não se esqueça de indicar:
a) a ampliação com que observou a preparação
b) a legenda, com indicação da amostra observada, os pormenores
relevantes e sempre que possível, as dimensões
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
1. Cultura de Escherichia coli
Colocar uma gota da cultura de E. coli que lhe foi fornecida sobre uma
lâmina, cobrir com uma lamela e observar ao microscópio (ver Figura 2.1)
Figura 2.1 - Colocação da lamela
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Começar por focar a preparação com a objectiva de 10 X e em seguida

mudar para a objectiva de 40 X e voltar focar. Rodar o revólver no sentido da
objectiva de 100 X e colocar uma gota de óleo de imersão sobre a lamela.
Lenta e cuidadosamente, rodar a objectiva de 100 X até esta ficar na
posição correcta e focar a preparação – usar apenas o parafuso
micrométrico e fazendo pequenos movimentos
Desenhar o que observa.
2. Células de Saccharomyces cerevisiae (fermento de padeiro)
Com a ajuda de um palito colocar uma pequena amostra de S. cerevisiae

sobre uma lâmina. Juntar uma gota de soro fisiológico e misturar bem.
Colocar uma lamela e observar
Desenhar o que observa com a objectiva de 100X.
3. Epiderme interna da escama do bolbo da cebola ( Allium cepa)
Separar duas escamas carnudas que formam o bolbo da cebola e com a

ajuda de uma pinça destacar um pequeno quadrado da epiderme interna
que recobre a parte côncava que ficou a descoberto. Proceder como
indicado na Figura 2.2
Figura 2.2 - Recolha da epiderme do bolbo de cebola
Colocar sob uma gota de soro fisiológico em cima de uma lâmina. Cobrir com
uma lamela. Observar ao microscópio, primeiro com a objectiva de 10X,
depois com a objectiva de 40X. Repetir o processo, mas desta vez com azul
de metileno.
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Desenhar o que observa.
Nota: especímenes não corados são muitas vezes melhor visualizados com
menos luz. Tente reduzir a iluminação ajustando o diafragma do microscópio.
Examine então com a objectiva de maior ampliação.
4. Folha de uma planta aquática (Elodea canadiensis)
Destacar uma folha de Elodea e fazer um pequeno corte na epiderme

superior da folha com o auxílio do bisturi. Adicionar uma gota de soro
fisiológico. Cobrir com uma lamela
Desenhar o que observa com as objectivas de 40X e 100X.
5. Células de gengiva
Friccionar ligeiramente a gengiva 3 a 4 vezes com a ponta de uma

zaragatoa. Aplicar sobre uma gota de azul de metileno, espalhando bem.
Cobrir com uma lamela e desenhar o que observa.
OBJECTIVOS:
 Compreender o conceito de célula.

 Diferenciar células procariotas de eucariotas.
 Diferenciar células animais e vegetais.
 Compreender os limites de resolução do microscópio óptico e do
microscópio electrónico.
 Saber escolher a ampliação adequada ao objecto que pretende observar.
 Saber registar e legendar a observação realizada.
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Aula 5
CITOQUÍMICA E HISTOQUÍMICA
INTRODUÇÃO
A observação de células ao microscópio óptico de fundo claro apresenta dois

problemas: as pequenas dimensões das células e a ausência de contraste
entre os constituintes celulares. Outro obstáculo à qualidade da observação é a
opacidade da amostra à luz. De forma a superar estes factores, utilizam-se as
técnicas denominadas técnicas citológicas ou técnicas citoquímicas, que
permitem uma melhor visualização dos componentes celulares.
I. TIPOS DE PREPARAÇÕES
1. Preparações temporárias ou extemporâneas
Destinam-se à observação momentânea de uma amostra de material biológico

no seu estado natural. Para tal, a amostra é colocada num ambiente o mais
semelhante possível às condições nas quais ela se encontra in vivo (água doce
ou salgada, soro fisiológico, etc) e depois colocada entre lâmina e lamela. Este
tipo de líquidos que não alteram as condições do material a observar
designam-se líquidos indiferentes. Embora evitem a formação de artefactos
na amostra, este tipo de preparação não permite observar estruturas celulares
com grande detalhe.
Estas preparações podem contudo ser contrastadas com substâncias que não
alteram as características do material biológico. Estas substâncias são
denominadas corantes vitais (azul de metileno, vermelho neutro, vermelho
Congo, Sudão III, etc.) e a sua utilização permite a coloração de estruturas
celulares mantendo as funções vitais da célula durante algum tempo.
A coloração de preparações temporárias pode fazer-se de dois modos:
 Imersão: o corante é adicionado ao meio de montagem
21
 Irrigação: o meio de montagem com a amostra entre lâmina e

lamela é substituído por capilaridade. Esta técnica permite também
proceder à substituição de um meio de montagem por outro em
preparações temporárias.
2. Preparações definitivas
Permitem conservar o material biológico entre lâmina e lamela durante longos

períodos de tempo.
De modo a permitir esta conservação, o material biológico é submetido a uma

sequência de tratamentos destinados a desidratar e a fixar as células a ser
observadas.
 Fixação: tratamentos físicos (calor, frio) ou químicos (metanol, ácido

acético, etc.) tendo como finalidade preservar as estruturas do material a
observar.
 Desidratação: usualmente obtida através da passagem do material

biológico por álcoois ou acetonas de concentração crescente (este
tratamento visa a remoção da água dos tecidos a observar). É
fundamentalmente utilizada na obtenção de preparações definitivas de
tecidos, não tendo igual importância no caso de se tratar de células
isoladas.
 Inclusão e corte: processo normalmente utilizado em histoquímica.

Consiste na inserção da amostra numa matriz de um material que a
mantenha estável e sem deformações. A substância mais utilizada como
matriz é a parafina fundida. Depois de solidificada, a amostra é cortada
em sucessivas camadas muito finas utilizando um micrótomo. Essas
finas “fatias” são então montadas em lâmina.
 Coloração: os cortes são tratados com corantes.
 Fase final de montagem: após a coloração, as amostras são de novo

desidratadas e cobertas com um meio de montagem (usualmente o
Bálsamo do Canadá).
22
II. COLORAÇÃO
Uma das técnicas mais usadas para incrementar o contraste das preparações
biológicas é a coloração. Utilizam-se substâncias, geralmente de natureza
orgânica, que coram estruturas celulares em geral ou em particular - corantes.
No estudo de células isoladas, este método é designado como citoquímica. Se
estiverem em estudo tecidos, designa-se como histoquímica.
 Coloração simples: utilização de um único corante para pôr em

evidência estruturas celulares (ex: azul de metileno).
 Coloração combinada: utilização de diferentes corantes para pôr em

evidência e distinguir estruturas celulares diferentes (ex: hematoxilina -
eosina).
 Coloração diferencial: envolve o uso, no processo de coloração de

um agente de diferenciação que permite distinguir diferentes
composições da mesma estrutura celular (ex: coloração Gram).
As especificidades dos corantes são variadas, assim como os mecanismos de

ligação às moléculas biológicas:
a) Forças electrostáticas: corantes com carga positiva podem ligar-se a

estruturas celulares com carga negativa e vice-versa.
b) Acidofilia: os corantes acidófilos são substâncias de natureza básica

que se ligam a estruturas celulares ácidas (ácidos nucleicos, proteínas).
c) Basofilia: os corantes basófilos são substâncias de natureza ácida que

se ligam a estruturas celulares básicas.
d) Mordentes: substâncias que favorecem a ligação de corantes sem

carga eléctrica a determinadas estruturas celulares, possibilitando ou
aumentando a eficácia da coloração. Alguns mordentes utilizados em
citoquímica são o cobre, o ferro, o iodo.
Exemplos de corantes utilizados em microscopia óptica
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Corantes gerais
Básicos:
 Hematoxilina
 Fucsina básica
 Violeta de cresilo
Ácidos:
 Eosina
 Laranja G
 Azul de anilina
Corantes para citoquímica
 Ácido periódico-Schiff: corante para glúcidos

 Corante de Feulgen: DNA e RNA
 Negro Sudão (Sudão III): lípidos
 Enzimas
Corantes para imunocitoquímica
 Fluoresceína
 Rodamina
 Enzimas
 Ouro coloidal
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL
- Culturas em meio sólido de Escherichia coli

- Corantes: violeta cristal e safranina
- Lugol
- Álcool a 95%
- Óleo de imersão
- Soro fisiológico estéril
- Lâminas para microscópio
- Palitos
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- Pinças
- Bico Bunsen
- Microscópio
- Varetas de vidro
- Pipeta de Pasteur
- Pompete
1. Preparação de esfregaços
Marcar a lâmina, no lado oposto onde é efectuado o esfregaço, com as

iniciais do organismo a testar e o nome do grupo
Flamejar a lâmina, arrefecer e transferir duas gotas de soro fisiológico estéril

para o centro da lâmina
Recolher com o auxílio de uma ansa, (esterilizada à chama e arrefecida),

uma pequena quantidade de massa bacteriana e colocar na lâmina
Espalhar de forma a obter uma distribuição homogénea. Evitar fazer

esfregaços densos
Deixar secar e fixar a preparação à chama, para de seguida se executar a

coloração.
2. Método de Coloração: coloração diferencial de Gram
Cobrir o esfregaço com violeta cristal. Deixar actuar durante 30 segundos
Retirar o excesso de corante com água destilada, mantendo a lâmina em

posição oblíqua, segura pela pinça
Cobrir a lâmina com lugol (Gram's Iodine) e deixe actuar durante 1 minuto
Lavar a preparação com água

Descorar a lâmina com álcool etílico 95%, durante 10 a 20 segundos, até
desaparecimento completo da cor
Lavar a preparação com água
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Aplicar o corante de contraste, safranina e deixar actuar durante 30

segundos
Lavar com água e deixar secar
Colocar uma gota de óleo de imersão e observar a preparação ao

microscópio na objectiva de imersão
Registar as formas e cores das células observadas.
3. Observação de preparações definitiva
Observar as diferentes preparações definitivas, registando os tipos de células

e componentes celulares observados, assim como as cores associadas.
OBJECTIVOS:
 Compreender o que é a Citoquímica e qual a sua utilidade.

 Distinguir preparações temporárias de definitivas. Saber enumerar os
passos necessários à elaboração destes dois tipos de preparações.
 Conhecer os métodos de coloração de preparações temporárias (imersão e
irrigação).
 Distinguir os vários tipos de coloração (simples, combinada e diferencial).
 Diferenciar os vários corantes quanto aos mecanismos de ligação às
moléculas biológicas e classificá-los quanto à sua natureza.
 Conhecer a técnica de preparação de esfregaços
 Saber executar a coloração de Gram, perceber em que se baseia e qual a
sua utilidade.
 Inferir sobre a vantagem da utilização de corantes (comparação das
preparação de E. coli corada com a realizada na aula anterior).
 Distinguir cocos de bacilos.
26
Aula 6
OSMOSE
INTRODUÇÃO
A célula tem necessidade de trocar substâncias com o meio exterior e com
outras células, de forma a assegurar o seu metabolismo. As trocas realizam-se
através da membrana plasmática, que separa o meio intracelular do
extracelular.
De uma forma geral, as células vivas são constituídas por 75-85% de água,
pelo que a compreensão dos mecanismos de difusão (movimento de solutos a
favor do gradiente de concentração) e osmose (movimento de água através de
uma membrana semi-permeável) é fundamental para o estudo da biologia
celular.
Osmose - passagem de água através de uma membrana semi-permeável

que separa duas soluções com concentrações diferentes. A água movimenta-
se da solução com menor concentração de soluto (i.e., aquela em que existe
maior número de moléculas de água) para a solução com maior concentração
(i.e., menor número de moléculas de água).
A pressão osmótica de uma solução é a pressão que deve ser aplicada para
impedir que a entrada de água por osmose ocorra (Figura 5.1).
Figura 5.1 - Determinação da pressão osmótica
27
A pressão osmótica é determinada pelo número de partículas em solução,

independentemente da sua natureza (moléculas ou iões). O número de
partículas por unidade de volume (litro) é dado pela osmolaridade. O termo
osmol designa a concentração em número de partículas.
Meio hipertónico - quando comparado com outro, tem maior concentração de

soluto (em número de partículas).
Meio hipotónico - quando comparado com outro, tem menor concentração de

soluto (em número de partículas).
A. Em células animais
A ausência de parede celular torna as células animais mais vulneráveis ao

fenómeno da osmose. Assim, em meio hipotónico, a água tende a entrar e as
células aumentam de volume, podendo mesmo “rebentar” – lisar (Figura 5.2).
O fenómeno inverso ocorre em meio hipertónico, com as células perdendo
água e ficando “encolhidas” – crenadas (Figura 5.2). Daqui a importância de se
manter as células animais sempre em meio isotónico.
Hipotónica Isotónica Hipertónica
Figura 5.2 - Preparações de glóbulos vermelhos em soluções com

diferentes osmolaridades
28
B. Em células vegetais
Em meio hipotónico, a célula vegetal tende a absorver água e a acumulá-la no

vacúolo, ficando túrgida. A parede celular impede que a célula aumente de
volume e rebente. Esta turgidez origina a rigidez mecânica característica da
maioria das plantas. Quando colocadas em meio hipertónico, as células
perdem água (através do vacúolo), ocorrendo o fenómeno de plasmólise
(Figura 5.3).
Meio hipotónico Meio hipertónico
Figura 5.3 – Comportamento de uma célula vegetal em soluções com

diferentes osmolaridades
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL
- Folhas frescas de Elodea

- Lâminas
- Lamelas
- Soro fisiológico
- NaCl 0,5M
- NaCl 0,4M
- NaCl 0,3M
- NaCl 0,2M
- NaCl 0,1M
29
- NaCl 0,05M
- Papel absorvente
- Pipetas Pasteur
- Microscópio
Colocar uma folha de Elodea sobre uma lâmina, cobrir com uma gota de soro
fisiológico e montar com uma lamela. Observar ao microscópio
Utilizando o método de irrigação (Figura 5.4), substituir o meio de montagem

por cada uma das soluções de NaCl que lhe foram fornecidas (0,5M; 0,4M;
0,3M; 0,2M; 0,1M e 0,05M)
Observar cada preparação ao microscópio
Para cada solução utilizada, registar as alterações que observar, fazendo um

esquema legendado
Deverá determinar e indicar, para cada caso, se a solução utilizada é

hipotónica, hipertónica ou isotónica.
Solução NaCl Lamela

Papel
Lâmina
Figura 5.4 - Técnica da irrigação: O primeiro meio de montagem é retirado

por absorção com papel, ao mesmo tempo que se coloca a nova
solução de montagem, com o auxílio de uma pipeta de Pasteur
30
OBJECTIVOS:
 Distinguir osmose de difusão simples.

 Compreender o conceito pressão osmótica.
 Distinguir meios hipotónicos, isotónicos e hipertónicos.
 Perceber as alterações produzidas em células animais e vegetais quando
colocadas em meios de diferentes osmolaridades.
 Compreender a técnica utilizada (irrigação) na determinação da solução
isotónica para as células de Elódea.
31
Aula 7
MITOSE
INTRODUÇÃO
O ciclo celular consiste na sequência contínua e ordenada de processos que
ocorrem numa célula desde o crescimento até à sua divisão em duas células
filhas. Este ciclo pode ser dividido em Interfase e Mitose.
A interfase representa a maior parte do ciclo celular (fases G1, S e G2). Nesta
fase, o ADN encontra-se descondensado (cromatina interfásica) e dá-se o
processo de replicação (fase S).
A mitose (fase M) é o processo celular que rege a repartição do material

genético entre células eucarióticas em divisão. Ao entrar na mitose, o ADN é
condensado, os cromossomas individualizam-se e inicia-se um processo que
garante a distribuição do material genético de uma célula (que foi duplicado na
fase S) em partes iguais para as células filhas.
Os acontecimentos que ocorrem na mitose são classicamente divididos em
cinco fases, das quais as quatro primeiras correspondem à divisão nuclear e a
última à divisão do citoplasma.
Profase Metafase
32
4
3
Anafase Telofase
Figura 7.1 - Fases da Mitose
Na Profase, dá-se a condensação dos cromossomas (cada um com dois

cromatídeo), o desaparecimento da membrana nuclear e a formação do fuso
mitótico.
Na Metafase, dá-se o alinhamento dos cromossomas no plano equatorial do

fuso mitótico, ao nível do centrómero. Cada cromatídeo fica ligado a um dos
polos do fuso mitótico (é aqui que se garante a divisão do material genético em
duas partes iguais).
Na Anafase, a interação dos centrómeros com o fuso mitótico leva à migração

de cada cromatídeo para um dos polos da célula. Formam-se dois conjuntos de
cromossomas idênticos. É a fase mais curta da mitose.
Na Telofase, os cromossomas descondensam-se, o fuso mitótico desaparece

e a membrana nuclear reconstitui-se em torno de cada um dos dois conjuntos
de cromossomas. Dá-se o aparecimento do nucléolo.
Na Citocinese, ocorre a divisão do citoplasma com a distribuição dos

organelos e outros constituíntes celulares pelas duas células filhas. Este
processo tem início durante a telofase.
Nas plantas, a divisão nuclear e celular ocorre em áreas específicas,

meristemas, localizados nas extremidades de caules e raízes e no câmbio. O
meristema apical é a região que contém a maior percentagem de células em
mitose.
33
Região de divisão
celular
Figura 7.2 - Secção longitudinal da extremidade de uma raíz
PARTE EXPERIMENTAL
1. Observação de figuras de mitose em ápices radiculares de Allium cepa
MATERIAL
- Microscópio óptico
- Lâminas
- Pinça de madeira
- Bico de Bunsen
- Ápices radiculares de Allium cepa (cebola)
- HCl 1N
- Orceína acética
Colocar o ápice radicular de Allium cepa em HCl 1N, durante 3min
Adicionar 3 gotas de orceína acética e deixar repousar 5 min
34
Aqueçer suavemente até concentrar o corante em torno do ápice, sem deixar

secar
Repitir a operação, mais duas vezes, após adicionar uma gota de orceína
acética
Transferir o material para uma lâmina limpa, adicionar uma gota de orceína
acética e colocar a lamela. Com a ponta do dedo aplicar uma pequena
pressão sobre a lamela, de forma a obter uma única camada de células.
2. Observação de figuras de mitose em preparações definitivas de cortes

histológicos de Ascaris
MATERIAL
- Microscópio óptico
- Preparação definitiva de cortes histológicos de Ascaris corados com azul de
toluidina
Ligar o microscópio
Colocar a preparação definitiva na platina
Focar a uma ampliação 100X e observar a 400X ou 1000X. Use as imagens

da Figura 7.1 como ajuda para identificar as fases do ciclo celular nas quais
se encontram as células
Desenhar e legendar uma célula em cada fase
Contar em diferentes campos de observação o número de células que se

encontra em cada fase da mitose e apontar os dados na Tabela 7.1
Considerando que o número de células em cada fase da mitose é

directamente proporcional ao tempo que cada célula passa em cada uma
destas fases, determinar a fracção de tempo (%) que as células do tecido
35
observado passam em cada fase do ciclo celular que observou. Anotar os

valores obtidos na Tabela 7.1
Tabela 7.1
Fase da % de tempo
Número de células
Mitose em cada fase
Interfase ____________%
Profase ____________________________________________ ____________%
Metafase ____________________________________________ ____________%
Anafase ____________________________________________ ____________%
Telofase ____________________________________________ ____________%
Total ____________________________________________ 100%
OBJECTIVOS:
 Compreender o processo da mitose e a sua integração no ciclo celular.

 Perceber a função da mitose e em que células ocorre.
 Descrever as várias fases da mitose. Identificá-las em preparações de
células animais e vegetais.
 Compreender o cálculo da duração relativa de cada uma das fases do ciclo
celular.
36
AULA 8
MEIOSE
INTRODUÇÃO
A meiose constitui um tipo de ciclo celular especializado, através do qual os
organismos produzem células com metade do material genético (haplóides “n”)
destinadas à reprodução sexual.
O ciclo celular meiótico, à semelhança do ciclo celular mitótico, engloba a

interfase meiótica, que se subdivide nas fases G1, S e G2, e a meiose. Durante
a meiose ocorrem duas divisões sucessivas - meiose I e meiose II – sem a
ocorrência de uma fase S intercalar. Apesar de cada uma das divisões
meióticas ser também formalmente dividida em profase, metafase, anafase e
telofase, os acontecimentos que têm lugar durante cada uma das divisões
meióticas I e II são distintos.
A meiose I compreende a profase I, que é a fase mais longa e complexa, a

metafase I, a anafase I e a telofase I. Nesta primeira divisão ocorrem os
processos de recombinação entre cromossomas homólogos: formam-se os
bivalentes, estruturas que garantem a diversidade genética de todos os
organismos sexuados através do mecanismo de “crossing-over”. No final da
meiose I cada par de cromossomas homólogos da célula-mãe (2n) é
separado, de modo a dar origem a duas células haplóides (n) cada uma delas
com 23 cromossomas. A meiose I denomina-se por isso divisão reducional.
A meiose II compreende a profase II, a metafase II, a anafase II e a telofase

II. Corresponde a uma divisão equacional, em que ocorre a separação dos
cromatídeos das células resultantes da meiose I originando 4 células haplóides.
Nos animais superiores, a meiose ocorre nos órgãos sexuais tanto masculinos
como femininos, num processo que se denomina respectivamente
espermatogénese e oogénese. A fertilização é o processo que resulta da fusão
de duas células sexuais haplóides. A combinação da meiose e da fertilização
no ciclo de vida é a base da reprodução sexuada.
i ose I
se II
37
Me
I
M
Figura 8.1 - Representação esquemática da meiose
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL
- Microscópio e Preparações definitivas de Lilium sp.
Identificar e desenhar (ampliação de 400X) células em cada uma das fases da

meiose. Para tal, guie-se pelas fotografias da Figura 8.2:
Profase I Metafase I Anafase I Telofase I
38
Intercinese Metafase II Anafase II Telofase II
Figura 8.2 - Fases da meiose
OBJECTIVOS:
 Distinguir meiose e mitose quanto a) à função, b) ao tipo de células em que

ocorre e c) fases que a compõem.
 Distinguir células haploides de diploides.
 Compreender o fenómeno de “crossing-over” e suas consequências.
 Conhecer as causas do aumento da variabilidade genética em organismos
com reprodução sexuada versus assexuada.
 Identificar as diferentes fases da meiose nas preparações observadas na
aula.
AULA 9
EXTRACÇÃO DE DNA PLASMÍDICO
INTRODUÇÃO
39
O DNA genómico bacteriano é geralmente circular com tamanho que varia

entre algumas centenas de kb (1 kb = 1000 pares de bases) e
aproximadamente 10000 kb, contendo cada célula uma cópia. Na bactéria,
além do DNA genómico, existem outros elementos genéticos como
plasmídeos, transposões e vírus. Os plasmídeos de ocorrência natural
apresentam uma variação de tamanho entre 1 kb e algumas centenas de kb. A
maioria são circulares e possuem replicação autónoma, sendo repartidos entre
as células quando há divisão celular (transmissão vertical). Os plasmídeos
podem ainda ser transferidos por conjugação ocorrendo a sua passagem de
uma célula para a outra (transmissão horizontal).
Os plasmídeos contêm genes essenciais para a sua manutenção na célula e
ainda genes que em determinados ambientes, conferem vantagem selectiva ao
hospedeiro. Esta vantagem pode ser conferida através de genes de resistência
a antibióticos, por processos de virulência, pela produção de toxinas, por
processos de restrição / modificação, entre outros.
Em laboratório, os plasmídeos são frequentemente utilizados como vectores de
clonagem, permitindo a expressão de genes de outros organismos pela
bactéria (ex. produção de insulina).
O objectivo desta aula prática, é a extracção de DNA plasmídico (plasmídeo

pBR322 que confere resistência ao antibiótico ampicilina - ver Figura 10.1) de
uma estirpe de Escherichia coli recorrendo à técnica de lise alcalina.
40
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL
- Cultura de Escherichia coli em meio LB líquido com ampicilina.
- Solução 1: Glucose 50 mM
EDTA 10mM
TrisHCl 25 mM (pH 8)
- Solução 2 (preparar no momento): NaOH 0,2 M

SDS 1%
- Solução 3: KAc 3 M (pH 4,8 ajustado com ácido

acético glacial)
- Etanol absoluto.
- Etanol 70%.
- Tampão TE (com RNase) Tris HCl 10mM (pH8)
EDTA 1 mM
RNAse 20 g / ml
Inocular a estirpe de E. coli contendo o plasmídeo em 10 ml de meio LB

com ampicilina e incubar durante a noite a 37ºC com agitação.
Pipetar 1 ml para um tubo eppendorf e centrifugar 1 min a 15000 rpm, a
4ºC. Remover completamente o sobrenadante, com micropipeta, e adicionar
100 l de solução 1. Ressuspender e incubar 3 min em gelo.
Adicionar 200 l de solução 2. Misturar suavemente por inversão e manter
durante 3 min à temperatura ambiente.
Adicionar 150 l de solução 3. Misturar por inversão e colocar em gelo
durante 3 min.
Centrifugar o lisado durante 5 min a 15000 rpm, a 4ºC. Transferir o
sobrenadante para novo tubo e adicionar 900 µl de etanol absoluto (a -20ºC).
Deixar 15 min a -20ºC. Centrifugar 15 min a 4ºC e remover o sobrenadante.
Lavar o sedimento de DNA plasmídico com 500 µl de etanol a 70%
(-20ºC).
Centrifugar 3 min a 15000 rpm. Remover o sobrenadante e secar o pellet
de DNA plasmídico a 60ºC, 5 min.
41
Ressuspender o sedimento de DNA em 50 µl de TE com RNase.

Conservar a -20ºC.
OBJECTIVOS:
 Perceber que os plasmídeos fazem parte do genoma extracromossomático.
 Compreender a função dos plasmídeos nas bactérias que os possuem.
Saber que a sua transmissão além de vertical é também horizontal.
 Perceber a importância dos plasmídeos em processos como a clonagem.
 Saber executar e explicar cada uma das etapas do protocolo de extracção
de DNA plasmídico.
42
AULA 10
DIGESTÃO DE DNA PLASMÍDICO E
ELECTROFORESE EM GEL DE AGAROSE
INTRODUÇÃO
As endonucleases são enzimas que reconhecem sequências de bases no DNA
sendo capazes de hidrolisar (digerir) as cadeias de DNA em locais específicos.
Estas enzimas são quase exclusivamente produzidas por procariotas sendo-
lhes imputada uma função protectora ‘in vivo’ contra ácidos nucleicos invasores
como é, por exemplo o caso dos bacteriófagos.
Em laboratório, as endonucleases são ferramentas importantes em processos
de clonagem de genes, execução de mapas físicos e outros.
O objectivo desta aula prática é a digestão do plasmídeo pBR322 com a

enzima de restrição XmnI. Este plasmídeo possui dois locais contendo a
sequência de bases que XmnI reconhece ( 5'- GAANN NNTTC- 3') (ver Figura
10.1), produzindo-se, após a hidrólise, dois fragmentos lineares de DNA com
1.9 Kb e 2.4 Kb, respectivamente. A separação e visualização destes
fragmentos serão feitas por electroforese.
XmnI
1.9 Kb
pBR322
4.3 Kb
XmnI
Amp R
Figura 10.1- Mapa de restrição do plasmídeo pBR322 com a enzima XmnI.
43
A electroforese é uma técnica capaz de separar moléculas com carga (pela

aplicação de um campo eléctrico) em função do seu peso molecular e/ou carga
eléctrica das moléculas. A separação de ácidos nucleicos que se encontram
carregados negativamente (grupos fosfato) é geralmente efectuada em géis de
agarose. A agarose forma uma matriz porosa (cujo tamanho do poro pode ser
controlado) através da qual migram as moléculas de ácidos nucleicos. A
velocidade de migração depende da massa (função do número de pares de
bases (pb)), da conformação das moléculas, da concentração da matriz de
agarose utilizada, do campo eléctrico aplicado ao sistema e ainda da
composição do tampão utilizado na electroforese. Após a electroforese, os
ácidos nucleicos no gel de agarose tornam-se visíveis por acção do brometo de
etídeo (adicionado previamente ao gel de agarose). Este composto intercala-se
nas cadeias de ácidos nucleicos e fluoresce quando submetido à radiação
ultravioleta.
Quando se faz uma electroforese de ácidos nucleicos em gel de agarose é
indispensável a utilização de um marcador de pesos moleculares para o cálculo
do peso molecular da amostra. Um marcador de pesos moleculares é
constituído por uma série de fragmentos de DNA de peso conhecido; por
interpolação é possível relacionar o peso molecular da amostra com as bandas
do marcador.
A
B
Figura 10.2- (A) Marcador de pesos moleculares; (B) esquema da electroforese realizada
com o produto da digestão de pBR322 com XmnI
44
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL
- DNA plasmídico (pBR322) (extraído na aula anterior)

- Tampão de enzima 10 X
- BSA 10 X
- Enzima XmnI 5U / l
- Agarose
- Tampão TAE 50 X: 242 g Tris base
57,1 ml ácido acético glacial
100 ml EDTA 0,5 M (pH 8.0)
H2O até perfazer 1l
Ajustar pH a 8,0
- Brometo de etideo
- Marcador de pesos moleculares
- Solução STOP (tampão de aplicação):
Sacarose 40%
Azul de bromofenol 0,25%
Xilenocianol 0,25%
1. Digestão de DNA plasmídico com a enzima de restrição XmnI
Fazer a mistura de digestão (em tubo eppendorf) adicionando cada um dos

reagentes indicados na tabela pela ordem apresentada.
Água 10,5 µl
Tampão de enzima 10 X 2 µl
BSA 10X 2 µl
DNA plasmídico 5 µl
Enzima de restrição XmnI 0,5 µl
45
Misturar cuidadosamente e incubar a 37ºC durante 1h.

Retirar os tubos da estufa e adicionar 2 µl de solução STOP a cada tubo.
Conservar a 4ºC.
2. Visualização dos produtos de digestão por elecroforese em gel de
agarose.
Preparar um gel de agarose 0,8% em tampão TAE 1X. Para tal pesar a
agarose necessária para um volume final de 50 ml e colocar num recipiente
adequado. Adicionar o tampão (TAE 1X) até atingir o volume desejado. Ferver em
microondas até obter uma mistura homogénea. Deixar arrefecer a mistura líquida
até atingir aproximadamente 50ºC e adicionar 1 l de brometo de etídeo.(MUITO
IMPORTANTE usar luvas para manipular este reagente). Deitar a agarose dentro do
molde contendo um pente adequado ao volume e número de amostras que
pretende aplicar. Deixar solidificar  30 min.
Remover o pente e colocar o gel na tina de electoforese. Adicionar tampão
(TAE 1X) à tina de electroforese até cerca de 1 mm acima da superfície do gel.
Aplicar 5 l do marcador de pesos moleculares no primeiro poço e 5 l no
último poço do gel.
Iniciar a electroforese por aplicação de um campo eléctrico (100 V 20 min).
Após a corrida retirar o gel da tina e colocar em cima do transiluminador
(fonte de radiação ultravioleta). MUITO IMPORTANTE usar óculos de protecção
contra UV.
Fotografar o gel.
OBJECTIVOS:
 Perceber o que são endonucleases (enzimas) de restrição. Saber qual a
sua função ‘in vivo’ e perceber a sua utilização ‘in vitro’ (ferramentas
moleculares).
 Compreender a técnica de electroforese.
 Saber para que serve um marcador de pesos moleculares e como permite
calcular o peso molecular das bandas da amostra.
46
 Perceber o processo utilizado para a visualização de ácidos nucleicos em

gel de agarose.
 Saber realizar uma reacção de digestão de um DNA plasmídico. Conhecer
as condições óptimas de actuação das enzimas de restrição.
 Conseguir interpretar um perfil de digestão de DNA plasmídico.
47
AULA 11
QUANTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
INTRODUÇÃO
As proteínas encontram-se envolvidas na maioria dos processos biológicos que
ocorrem dentro da célula, sendo por vezes necessário quantificá-las.
A espectrofotometria nas regiões visível e ultra-violeta, é uma técnica que

permite determinar a concentração de substâncias em solução. Esta técnica
baseia-se na proporcionalidade directa existente entre a quantidade de luz
absorvida por uma dada solução e a sua concentração, definida pela Lei de
Lambert-Beer:
A = C l
A: Absorvância
: Coeficiente de extinção molar
C: concentração da solução absorvente
l: Percurso óptico na solução absorvente
Para avaliar a concentração de uma substância, determina-se a relação entre

as concentrações conhecidas de várias soluções dessa substância e as
absorvâncias registadas a um dado comprimento de onda (construção da
curva de calibração).
Para traçar a curva de calibração e determinar a equação da recta, procede-se

da seguinte forma:
1. Soluções padrão: preparar diferentes soluções de concentrações conhecidas
2. Executar o procedimento experimental escolhido para quantificar a

substância padrão
3. Traçar em papel milimétrico o gráfico “Absorvância vs. (concentração da

solução padrão)”
4. Determinar a gama de concentrações onde é válida a Lei de Lambert-Beer

(onde há proporcionalidade directa entre A e C)
48
5. Calcular a equação da recta resultante (regressão linear)
A = m. C + b
Quantificação de proteínas
Existem vários métodos para quantificar as proteínas presentes em amostras

biológicas ou em soluções de proteínas preparadas no laboratório. Alguns
desses métodos baseiam-se na formação de complexos corados entre
reagentes específicos e as ligações peptídicas ou determinados aminoácidos.
Outros métodos exploram as propriedades espectroscópicas intrínsecas das
proteínas (absorvância a 280 nm).
O método de Bradford baseia-se na formação de interacções iónicas ou

hidrofóbicas entre um corante (azul de Coomassie G-250) (Figura 11.1) e
alguns aminoácidos, originando um complexo azul, que apresenta uma
absorvância máxima a 595 nm.
Figura 11.1 - Azul Coomassie G250 (forma desprotonada)
O método de Bradford é suficientemente sensível para detectar quantidades de

proteína de 1 µg/mL, sendo um método rápido e simples, permitindo num curto
espaço de tempo analisar várias amostras.
Para amostras com maior concentração de proteína pode usar-se o Método de
Lowry (mg/dL) ou Método do Biureto (g/dL).
49
PARTE EXPERIMENTAL
MATERIAL
- Espectrofotómetro
- Cuvettes para espectrofotómetro
- Micropipetas
- Papel milimétrico
- Calculadora
- Solução de albumina sérica bovina (BSA) a 0,1 mg/mL
- Reagente de Bradford
- Amostra desconhecida
1. Construção da curva de calibração
O método de Bradford apresenta uma resposta linear numa gama de

concentrações de proteína entre 1 e 20 µg/mL. A construção de uma curva que
relacione a concentração de proteína com a absorvância a 595 nm, permite
determinar a concentração de proteína existente numa amostra.
Preparar 7 tubos com a seguinte composição:
Tubo Volume de solução Volume de água [BSA]

(número) BSA 0.1 mg/mL (µL) (µL) (mg/L)
1 (Branco) 0 800 0
2 10 790 1.25
3 20 780 2.5
4 50 750 6.25
5 100 700 12.5
6 200 600 25
7 250 550 31.25
Adicionar 200 µL do reagente comercial de Bradford a cada tubo
Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. Medir a absorvância de cada

tubo a 595 nm
Representar graficamente a absorvância medida a 595 nm versus a

concentração de proteína em µg/mL e traçar a correspondente curva de
calibração
Calcular a equação da recta da zona linear da curva de calibração
50
A (595nm) = m . [proteína] + b
2. Quantificação da concentração de proteínas numa amostra desconhecida
Pipetar para um tubo (nº 8) 800 µL da amostra desconhecida
Adicionar 200 µL do reagente comercial de Bradford
Incubar 5 minutos à temperatura ambiente. Medir a absorvância a 595 nm
Determinar a concentração de proteína na amostra, utilizando a equação que

determinou.
OBJECTIVOS:
 Compreender a importância de quantificar proteínas.

 Perceber sumariamente o funcionamento da técnica de espectrofotometria.
Compreender e aplicar a lei de Lambert-Beer.
 Conhecer os conceitos de branco e solução padrão.
 Saber elaborar uma curva de calibração. Compreender a necessidade da
sua utilização.
 Identificar a gama de concentrações onde é válida a lei de Lambert-Beer.
 Saber calcular a equação da recta que expressa a relação entre a
absorvância e a concentração de proteína.
 Saber usar a equação da recta para calcular a concentração de proteína
duma solução desconhecida.
 Saber executar o método de Bradford. Compreender qual o seu fundamento
e as suas limitações.
 Conhecer outros métodos de quantificação de proteínas.
51

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BIOLOGIA CELULAR

Embora todo o trabalho efectuado no laboratório de Biologia seja

É muito importante ter a noção de que a falta de atenção com o trabalho no

O trabalho em laboratório envolve uma grande diversidade de riscos, sendo

O objectivo desta aula é o de alertar e familiarizar os alunos com os principais

2. ATITUDE A ADOPTAR NO LABORATÓRIO

 Planear sempre o trabalho a realizar, conhecer bem todos os procedimentos

 Não é permitido comer, beber, fumar ou aplicar cosméticos no laboratório.

 Dentro do laboratório deve usar sempre uma bata, de forma a proteger-se a

 Usar luvas apropriadas sempre que se manipulam produtos potencialmente

 No início de cada aula, proceder à desinfecção da área de trabalho,

 Manter perto da área laboratorial somente o material estritamente necessário

 No início e no fim de cada aula lavar as mãos com um antisséptico. Proceder

 Para pipetar, utilizar sempre um dispositivo de pipetagem. A pipetagem à

 Mudar de luvas e lavar as mãos sempre que haja contaminação evidente

 Conhecer a localização e funcionamento dos sistemas de segurança

 Colocar todo o material utilizado durante o trabalho nos locais apropriados:

● Material não reutilizável:

- Vidro e metal cortante (lâminas de bisturi, agulhas de seringa): em lixo

- Material contaminado com produtos biológicos: Em lixo próprio para

- Substâncias químicas perigosas: em locais apropriados, de acordo com o

- Não despejar nos canos qualquer material perigoso/infeccioso.

 Todos os materiais para guardar ou incubar deverão ser devidamente

4. PRINCIPAISRISCOS ASSOCIADOS AO TRABALHO DE LABORATÓRIO E

4.1 Equipamento de vidro

- cortes provocados pela introdução de tubos de plástico em tubos ou pipetas

- cortes provocados por vidro partido e outros materiais cortantes colocados

- Colocar o vidro partido e os materiais de vidro não reutilizáveis (por ex.

- Não guardar ou deixar material de vidro na beira de bancadas ou prateleiras.

4.2 Equipamento eléctrico

Não utilizar fichas e tomadas partidas ou danificadas.

4.3 Equipamento de aquecimento: Bicos de Bunsen, placas e banhos de

- Os bicos de Bunsen nunca deverão ser usados perto de contentores abertos

- O vapor dos banhos de aquecimento poderá provocar queimaduras. Ter

4.4 Fontes de luz ultravioleta

4.5 Outros Equipamentos

Os riscos associados à manipulação e utilização de substâncias químicas são

As substâncias químicas que representam riscos físicos são geralmente

- Símbolo do Fogo – “F”: Muito inflamável; “F+”: Extremamente inflamável

Substâncias que usam o símbolo do fogo: substâncias

- Símbolo de Explosão – “E”: Explosivo

- Símbolo “O” em chamas – “O”: Oxidante

Riscos para a Saúde

Uma substância química é considerada nociva para a saúde quando existem

Os produtos perigosos para a saúde, apenas representam um risco quando

Os efeitos provocados pelas substâncias químicas no organismo relacionam-se

CLASSIFICAÇÃO DOS PRODUTOS QUÍMICOS DE ACORDO COM OS

Corrosivos – “C” – Podem queimar, irritar ou atacar

Prejudiciais (“Xn”)/Irritantes (“Xi”) – Por contacto causam

Sensibilizantes – Provocam reacção alérgica cutânea ou respiratória.

Tóxicos (“T) / Muito tóxicos - venenos (“T+”) – Causam a

Carcinogéneos – Podem provocar cancro.

Teratogéneos – Afectam o desenvolvimento embrionário normal, podendo

Radioactivos – Estes produtos representam uma classe especial de produtos

A prevenção de incêndios é tão importante como o desenvolvimento de meios

6.1 Medidas de Prevenção

- Conhecer a localização dos alarmes de incêndio, extintores e mangueiras

- Trabalhar com produtos inflamáveis em hotes

- Utilizar fósforos, fontes de aquecimento, aparelhos eléctricos e outras

6.2 Medidas de emergência em caso de incêndio

- Activar o sistema de alarme e ligar o 112

- Evacuar o edifício o mais rápido possível, de forma calma e ordenada

- Não usar os elevadores

- Fechar as portas e se possível as janelas, à medida que se abandonam as