.

1 Latar Belakang
Bakteri memiliki beberapa bentuk yaitu basil (tongkat), kokus, dan spirilum. Bakteri yang
berbentuk tongkat maupun kokus dibagi menjadi beberapa macam. Pada bentuk basil
pembagiannya yaitu basil tunggal, diplobasil, dan tripobasil. Sedangkan pada kokus dibagi
monokokus (satu buah bakteri berbentuk kotak), diplococcus, sampai staphylococcus
(bentuknya mirip buah anggur. Khusus pada spirul hanya dibagi 2 yaitu setengah
melengkung dan tidak melengkung.
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram
tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan
pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008). Hal ini bertujuan
untuk memberikan warna pada bakteri pada akhirnya dapat diidentifikasi dengan mudah.
Selain itu, ada endospore yang bisa diwarnai. Endospora adalah organisme yang dibentuk
dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki kemungkinan untuk tetap
berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).
Teknik pewarnaan gram haruslah sesuai prosedur karena dapat mengakibatkan kesalahan
identifikasi data apakah gram positif atau gram negatif sehingga diperlukan adanya
praktikum ini dilakukan agar mengetahui jalannya mekanisme pewarnaan gram.

1.2 Perumusan Masalah

Rumusan masalah adalah faktor-faktor apa sajakah yang berpengaruh terhadap
keberlangsungan pewarnaan pada bakteri dan endospora, bagaimanakah karakteristik dari
ketiga spesimen, serta bagaimana teknik pengecatan
1.3 Tujuan
Tujuan praktikum adalah mempelajari proses pewarnaan struktur sel bakteri, mempelajari
bentuk-bentuk dan struktur sel bakteri dan memahami pentingnya setiap langkah dalam
prosedur pewarnaan dan memahami reaksi kimia di dalam prosedur tersebut

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
Metode pengecatan pertama kali ditemukan oleh Christian gram pada tahun 1884.  Dengan
metode ini, bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua, yaitu bakteri gram positif dan gram
negatif yang didasarkan dari reaksi atau sifat bakteri terhadap cat tersebut.  Reaksi atau sifat
bakteri tersebut ditentukan oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan gram tidak
bisa dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel seperti Mycoplasma
sp. (Tryana, S.T, 2008).
Struktur bakteri terbagi menjadi dua yaitu:
1. Struktur dasar (dimiliki oleh hampir semua jenis bakteri)
Meliputi: dinding sel, membran plasma, sitoplasma, ribosom, DNA, dan granula
penyimpanan
2. Struktur tambahan (dimiliki oleh jenis bakteri tertentu)
Meliputi kapsul, flagelum, pilus, fimbria, klorosom, Vakuola gas dan endospora

Gambar Struktur Dasar Bakteri

Gambar Bakteri Gram Positip dan Bakteri Gram Negatif

(Edukasi, 2008).
Staphylococcus adalah bakteri Gram-positif yang berbentuk bola. Bakteri ini ada yang
berkoloni dan berbentu seperti buah buah anggur. Pada tahun 1884, Rosenbach menjelaskan
ada dua jenis warna staphylococci yaitu: Staphylococcus Aureus yang berwarna kuning dan
Staphylococcus albus yang berwarna putih. Beberapa karakterististik yang dimiliki
Staphylococcus Aureus diantaranya hemolytic pada darah agar, catalase-oxidase-positif dan
negatif, dapat tumbuh pada suhu berkisar 15 sampai 45 derajat dan lingkungan NaCl pada
konsentrasi tinggi hingga 15 persen dan menghasilkan enzim coagulase. Selain itu,biasanya
S. Aureus merupakan patogen seperti bisul, styes dan furunculosis beberapa infeksi (radang
paru-paru, radang kelenjar dada, radang urat darah, meningitis, saluran kencing osteomyelitis
dan endocarditis serta menyebabkan keracunan makanan yaitu dengan melepakan
enterotoxins menjadi makanan sehingga menjadi toksik dengan melepasan superantigens ke
dalam aliran darah (Kenneath, 2008).
Bacillus subtilis merupakan bakteri gram-positif yang berbentuk batang,dan secara alami
sering ditemukan di tanah dan vegetasi. Bacillus subtilis tumbuh di berbagai mesophilic suhu
berkisar 25-35 derajat Celsius. Bacillus subtilis juga telah berevolusi sehingga dapat hidup
walaupun di bawah kondisi keras dan lebih cepat mendapatkan perlindungan terhadap stres
situasi seperti kondisi pH rendah (asam), bersifat alkali, osmosa, atau oxidative kondisi, dan
panas atau etanol Bakteri ini hanya memilikin satu molekul DNA yang berisi seperangkat set
kromosom. DNAnya berukuran BP 4214814 (4,2 Mbp) (TIGR CMR). 4,100 kode gen
protein. Beberapa keunggulan dari bakteri ini adalah mampu mensekresikan antibiotik dalam
jumlah besar ke luar dari sel (Scetzer, 2006).
Menurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae
yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam
jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan
melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan
patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta
hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan
limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses
manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008). Endospore adalah
organisme yang dibentuk dalam kondisi yang stres karena kurang nutrisi, yang memiliki
kemungkinan untuk tetap berlanjut di lingkungan sampai kondisi menjadi baik (Ncbi, 2008).
Bakteri juga dapat dibedakan melalui teknik pewarnaan gram. Teknik pewarnaan gram
tersebut dapat menghasilkan warna merah dan ungu. Bakteri gram negatif ditandai dengan
pewarnaan ungu sedangkan yang positif berwarna merah (Textbook, 2008).

BAB III
METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat
Praktikum “Pewarnaan Sel (Bakteri dan Jamur) dan Pewarnaan dan Endospora” dilaksanakan
pada hari Rabu 24 September 2008 pukul 13.00-16.00 WIB di Laboratorium Mikrobiologi,
Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Brawijaya,
Malang.
3.2 Cara Kerja
3.2.1 Pewarnaan Bakteri
Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan
aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai
homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri yang telah jadi ditetesi gram A
selama 1 menit, dicuci denan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram B
selama 1 menit, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Kemudian ditetesi gram D
selama 30 detik, dicuci dengan air mengalir, dan dikeringanginkan. Lalu diamati dengan
mikroskop dengan perbesaran 1000 x, kemudian dicatat bentuk dan warna sel bakteri
3.2.2 Pewarnaan Endospora
Gelas objek dan gelas penutup dibersihkan dengan alkohol 70% kemudian ditetesi dengan
aquades steril. Kemudian dibuat apusan dari biakan miring dan disuspensikan sampel sampai
homogen, lalu difiksasi di atas api bunsen. Apusan bakteri digenangi dengan pewarna malakit
hijau lalu dipanaskan preparat di atas penangas air mendidih sampai muncul uap air (10
menit) dan dijaga jangan sampai pewarna kering. Kemudian dicuci dengan air mengalir,
dikeringanginkan, diwarnai dengan safranin (1-2 menit) lalu dicuci dengan air mengalir dan
dikeringanginkan lagi. Kemudian diamati ada tidaknya spora dalam sel (bentuk, letak, ukuran
terhadap sel vegetatif) menggunakan mikroskop dengan perbesaran.

BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Analisis Prosedur
Pewarnaan Bakteri an Endospora dilakukan dengan menggunakan 8 isolat bakteri untuk 8
kelompok yang bertujuan untuk mengidentifikasi bentuk kedelapa bakteri tersebut dan
termasuk dalam bakteri gram positif atau negatif dan letak endosporanya. Proses perwarnaan
dilakukan dengan membersihkan gelas objek dan gelas penutup dengan alkohol 70% untuk
sterilisasi agar tidak kontaminasi. Kemudian ditetesi aquades steril untuk meletakkan bakteri
dan dibuat preparat apusan dari biakan miring agar mudah diamati dan difiksasi. Sampel
disuspensikan sampai homogen agar bakteri dapat menyebar di gelas objek dan tidak
menumpuk. Kemudian difiksasi di atas api bunsen yang bertujuan untuk membunuh bakteri
secara cepat dengan tidak merubah bentuk dan struktur bakteri, melekatkan bakteri di atas
objek gelas dan meningkatkan sifat salinitas pewarna (Tortora, 2002). Proses pewarnaan
bakteri dengan cara apusan bakteri yang telah dibuat kemudian ditetesi dengan gram A
selama 1 menit, gram B selama 1 menit, gram C selama 1 menit, dan gram D selama 30 detik.
Setelah perlakuan pewarnaan, preparat selalu dicuci dengan air mengalir dan
dikeringanginkan, kecuali setelah pewarnaan gram B preparat dicuci dengan gram C
kemudian dikeringanginkan. Hal ini dilakukan karena gram C mengandung alkohol yang
bertujuan untuk melunturkan cat sebelumnya. Gram A mengandung kristal violet yang
berwarna ungu merupakan cat primer yang akan mewarnai bakteri, pewarnaan dilakukan 1
menit agar cat ini dapat melekat sempurna pada dinding bakteri. Gram B mengandung garam
iodin merupakan cat mordan yang berfungsi melekatkan atau memfiksasi cat primer yang
diserap bakteri, dilakukan selama 1 menit agar pengikatan warna oleh bakteri menjadi lebih
kuat. Gram C mengandung alkohol sehingga tidak berwarna dan berfungsi untuk
melunturkan cat sebelumnya, dilakukan selama 1 menit agar cat dapat luntur secara sempurna
dan tidak ada yang tersisa. Gram D mengandung safranin sehingga bewarna merah yang
merupakan cat sekunder atau kontras berfungsi untuk memberikan warna bakteri non target,
dilakukan selama 30 detik agar bakteri yang catnya telah luntur dapat terwarnai (Heritage,
2000). Pencucian dengan air mengalir dimaksudkan agar cat dapat hilang secara sempurna
dan tidak tersisa, dikeringanginkan bertujuan agar warna melekat pada bakteri dan segera
kering sehingga bila diwarnai lagi warna sebelumnya tidak tercampur dengan warna yang
baru. Kemudian dilihat di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000 x agar dapat mengamati
bentuk dan warna sel bakteri. Bakteri gram positif akan berwarna ungu, sedangkan bakteri
gram negatif akan berwarna merah.
Proses pewarnaan endospora dilakukan setelah fiksasi dan setelah dibuat apusan preparat.
Kemudian preparat digenangi malakit hijau yang berfungsi sebagai pewarna primer yang
digunakan untuk melumuri fiksasi panas dan dipanaskan sampai menggepul. Preparat
dipanaskan di atas penangas air mendidih sampai timbul uap air (10 menit) bertujuan
membantu warna menembus dinding endospora dan dijaga jangan sampai pewarna kering.
Kemudian dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan bertujuan menghilangkan
malakit hijau dari seluruh bagian sel endospora. Pewarnaaan dengan safrani (1-2 menit)
bertujuan sebagai counterstain yang digunakan untuk melumuri bagian warna dari sel yang
lain daripada endospora (Prescot, 2002). Kemudian dicuci dengan air mengalir agar warna
safranin luntur dan dikeringanginkan agar warna cepat kering.
4.2 Data Hasil Penelitian
No.
Nama dan Gambar
Karakteristik
Gram
1.

Staphlococcus aereus

2.

Bacillus subtilis

3.

Escherichia coli

4.3 Analisis Hasil

Pewarnaan bakteri dilakukan pada isolat staphylococcus aereus adalah gram positif yang
berbentuk kokus atau lingkaran sterik dengan diameter sel mencapai 1µm, koloninya
berbentuk seperti buah anggur (Textbook, 2008). Pada bacillus subtilis, koloninya
bergerombol sedikit erpisah-pisah bahkan membentuk rantai panjang (hasil pengamatan).
Pada Eschericia coli, koloninya tersusun rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan
endospora, pada saat diwarnai menunujukkan warna merah.
1.Staphylococcus aureus.

Gambar. Staphylococcus aerreus

Staphylococcus aereus pada pewarnaan gram diketahui berwarna ungu sehingga termasuk
bakteri gram positif. Bakteri ini berbentuk basil. Koloninya tersususn berjajar seperti rantai
memenjang. Jenis ini memiliki endospora yang terletak pada sentral. Staphylacoccus aereus
adalah gram positif yang berbentuk kokus atau lingkaran seperti sterik dengan diameter sel
mencapai 1 µm, dan koloninya seperti buah anggur. Perananya adalah dapat menghasilkan
racun sebagai penyebab sindrom trauma yang diderita oleh pria, wanita dan anak-anak.
Sindrom racun trauma tersebut berupa kejang, pingsan, turunnnya tekanan darah (Textbook,
2008).
Klasifikasi Staphylococcus aureus.
Kingdom : Bakteri
Filum : Firmicutes
Kelas : Cocci
Famili : Staphylococcaaceae
Genus : Staphylacoccus
Spesies : Staphylacoccus aereus (it is, 2008)
2.Bacillus subtilis

Gambar Pengamatan Bacillus subtilis (1000 x)

Pada pengamatan dengan menggunakan mikroskop nampak Bacillus subtilis berbentuk basil
(batang) dan merupakan bakteri gram positif. Jenis ini memiliki endospora yang letaknya di
tengah. Bacillus subtilis merupakan bakteri yang berbentuk batang yang Gram-positif (Perez
2000). Bakteri ini tersusun atas peptidoglycan, yang merupakan polimer dari sugars dan asam
amino. Peptidoglycan yang yang ditemukan di bakteri yang dikenal sebagai murein. Sel
membentuk tembok penghalang antara lingkungan dan bakteri sel yang berguna untuk
mempertahankan bentuk sel dan withstanding sel yang tinggi internal tekanan turgor
(Schaechter 2006).
Habitat endospora bakteri ini adalah tanah. Mikroba tersebut dalam bentuk spora yang
kekurangan nutrisi. Organisme ini dapat menghasilkan antibiotik selama sporulation.
Contohnya polymyxin, difficidin, subtilin, dan mycobacillin. Banyak dari mikroba Bacillus
dapat menurunkan Polymers seperti protein, pati, dan pektin, sehingga bakteri ini merupakan
penyumbang penting kepada siklus karbon dan nitrogen. Akan tetapi apabila terkontaminasi,
dapat menyebabkan pembusukan. Berdasarkan pewarnaan sel vegetatif didapatkan warna
kemerahan dan warna endosporanya adalah hijau (Schaechter 2006).
Klasifikasi Bacillus subtilis.
Kingdom : Bakteri
Filum : Firmicutes
Kelas : Bacilli
Order : Bacillales
Famili : Bacillaceae
Genus : Bacillus
Spesies : Bacillus subtilis (itis, 2008)

3.Escherichia coli

Gambar 5. Pengamatan Escherichia coli. (1000 x)

Berdasarkan hasil pengamatan bakteri Eschericia coli. Berbentuk basil (batang) yang pendek.
Bakteri tersebut pada saat diwarnai menunjukkan warna merah. Koloninya tersusun seperti
rantai memanjang. Pada bakteri ini tidak ditemukan endospora. Menurut Kenneath tahun
(2008), Escherichia coli termasuk dalam famili Enterobacteraceae yang termasuk gram
negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E. coli hidup dalam jumlah besar di dalam
usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaan manusia dan melindunginya dari bakteri
patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.coli merupakan patogen berbahaya yang
menyebabkan penyakit diare dan sindrom diare lanjutan serta hemolitik uremic (hus).
Peranan yang mengguntungkan adalah dapat dijadikan percobaan limbah di air, indikator
pada level pencemaran air serta mendeteksi patogen pada feses manusia yang disebabkan
oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).
Klasifikasi Escherichia coli.
Kingdom : Bakteria
Filum : Proteobacteria
Kelas : Gamma Proteobacteria
Order : Enterobacteriales
Famili : Enterobacteriaceae
Genus : Escheriachia
Spesies : E. coli (itis, 2008)
4.Pewarnaaan endospora
Komponen endospora mempunyai resistan terhadap agen kimia yang kuat pada spore coat,
yang terdiri dari cross-linked keratin. Identifikasi dapat dilakukan dengan melihat morfologi,
lokasi, dan ukuran endospora. Beberapa endospora mempunyai diameter lebih besar daripada
sel, dimana sel tersebut akan nampak menggembang pada letak endosporanya (Ncbi, 2008).
Letak endospora yang berbeda diantara spesies bakteri dapat digunakan untuk identifikasi.
Tipe utama diantara terminal, subterminal dan sentral. Tipe sentral atau tengah merupakan
lokasi dari sel vegetatif yang letaknya tepat di tengah. Tipe terminal memiliki penngertian
letak el vegetatif diantara ujung dan pinggir dari sel vegetatif. Tipe subterminal berarti lokasi
endosporanya diantara tengah dan pinggir dari sel vegetatif. Endospora dapat berukuran lebih
besar ataupunkecil dari sel vegetatif yang terdiri dari lapisan protein yang terbuat dari keratin.
Spora ini memiliki resistensi yang tinggi terhadap pewarnaan, prosedur pewarnaan dengan
malakit hijau adalah dengan pemanasan. Endospora merupakan metode pertahanan hidup
yang bukan bertujuan untuk reproduksi. Contohnya Bacillus subtilis memiliki endospora
yang terletk di subterminal (Ncbi, 2008). Hasil pengamatan pada endospora Bacillus subtilis
berbeda dengan literatur karena terdapat kesalahan pengamatan dan pengidentifikasian.
Ada beberapa faktor yang mempengaruhi pewarnaan bakteri yaitu fiksasi, peluntur warna,
subtrat, intensifikasi pewarnaan dan penggunaan zat warna penutup. Prinsip yang selalu harus
diingat dan dipatuhi adalah (Edukasi, 2008) :
Selalu mensterilkan ose, pada saat akan dipakai dan setelah dipakai.
Letakkan ose pada tempatnya, jangan diletakkan di sembarang tempat (misal di atas meja)
Jangan memegang mata (ujung) ose dengan tangan.
Usahakan tidak banyak bicara pada saat kerja

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Teknik pembuatan sediaan apusan (preparat) dapat dilakukan dengan mensuspesikan biakan
bakteri dengan aquades, kemudian difiksasi. Pewarnaan struktur sel bakteri dilakukan dengan
cat gram A, gram B, gram C, dan gram D. pewarnaan endospora dengan menggunakan
malakit. Bentuk sel bakteri yang ditemukan adalah basil (Bacillus subtilis., Escherichia coli.,
Staphylococcus aereus), dan kokus (tidak ada). Bakteri yang termasuk gram positif adalah
Bacillus subtillis. dan gram negartif Eschericia coli dan Staphylococcus aereus. Lama
pewarnaan dan langkah-langkah urutan pewarnaan harus diperhatikan. Etanol terhindin adap
bakteri dapat menyebabkan tereksistasinya lapisan lipid sehingga memperbesar daya serap
atau permiabilitas dinding sel gram negatif. Jadi kompleks ungu kristal iodium yang telah
memasuki dinding sel selama langkah awal dalam proses pewarnaan dapat tereksistasi.
Karena itu organisme gram negatif pewarnaan kehilangan warna tersebut, disebabkan
kandungan lipidnya yang lebih rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi terdehidrasi
selama perlakuan dengan etanol.
5.2 Saran
Sebaiknya pada saat praktikum benar-benar diperhatikan prosedur pewarnaan terutama pada
lama waktu dan urutan pewarnaan agar tidak terjadi kesalahan dan warna yang terlalu tebal.
Pada saat pengembalian isolat juga diperhatikan apakah isolat tersebut benar-benar sudah
diangkat sehingga preparat apusan yang dihasilkan baik.